Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Ogólnym celem tych zabiegów jest zbadanie powstawania embrionalnej i okołoporodowej ściany aorty podczas prawidłowego rozwoju, a także zaburzeń w tym procesie podczas choroby. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju naczyń krwionośnych, takie jak, jakie jest źródło komórek, które przyczyniają się do rozwoju naczyń krwionośnych w zarodku i okołoporodowym. Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają na ocenę patogenezy i morfogenezy mięśni gładkich, które zachodzą w embrionalnych i okołoporodowych stadiach rozwoju.

Implikacje tych technik wynikają z terapii chorób naczyniowych, takich jak nadzastawkowe zwężenie zastawki aortalnej lub choroba okresowa, która powoduje nadmierną produkcję komórek sumo. Procedura umieszczenia mini pompy zostanie przeprowadzona przez dr Jiasheng Zhang, naukowca kierującego rdzeniem mikrochirurgii na Uniwersytecie Yale. Zacznij od ustawienia par godowych między dwu- a sześciomiesięcznymi myszami z Cre ER i myszami z cre reporterem.

Za pomocą metalowej sondy każdego ranka sprawdzaj, czy nie ma zatyczek dopochwowych, oddzielając samicę od samca po wykryciu czopka. W celu wczesnej indukcji zarodka należy wstrzyknąć tamoksyfen dootrzewnowo do wilgoci w ciąży. Aby oznaczyć komórki w środkowym i późnym okresie ciąży i prześledzić ich los lub klonalność u myszy po urodzeniu, wstrzyknąć progesteron do jamy dootrzewnowej ciężarnej wilgoci nieumiejętnie z tamoksyfenem w stosunku jednej do dwóch dawek.

Aby pobrać zarodki w odpowiednim dniu embrionalnym, oczyść brzuch ciężarnej wilgoci 70% etanolem i użyj nożyczek, aby otworzyć brzuch w celu usunięcia macicy. Zbierz zarodki z macicy za pomocą kleszczy i mikroskopu stereoskopowego, aby ostrożnie oddzielić je od łożyska i woreczka żółtkowego. Utrwal zarodki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie trzy płukania w PBS w celu usunięcia nadmiaru utrwalacza. Po trzecim płukaniu inkubować zarodki w 30% sacharozie w PBS, w pojedynczych 15-mililitrowych probówkach, aż zarodki opadną. Następnie napełnij plastikowe formy do zamrażania związkiem o optymalnej temperaturze cięcia do dwóch trzecich maksymalnej objętości i umieść jeden zarodek pionowo w każdej formie.

Po 10 minutach w temperaturze pokojowej zamroź tkanki pionowo w kąpieli z suchym lodem o zawartości 70% etanolu i ustaw temperaturę kriostatu na 22 stopnie Celsjusza. Podziel bloki tkankowe, aby wygenerować poprzeczne wycinki tkanki o grubości od 10 do 20 mikrometrów przez całą każdą aortę, rejestrując każdą sekcję na szklanym szkiełku mikroskopowym w miarę ich uzyskiwania. Po pobraniu wszystkich próbek wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed przechowywaniem w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Aby zabarwić próbki tkanek, rozmrozić szkiełka w temperaturze pokojowej, chronić je przed światłem, aby uniknąć wybielania fluoroforem i umyć szkiełka w 0,1% PBS twin 20. W celu analizy klonalnej należy zabarwić tkanki odpowiednim barwnikiem jądrowym i bezpośrednio zobrazować inne flurofory tęczowego reportera cre pod mikroskopem fluorescencyjnym. W celu mapowania losu, za pomocą mTmG cre reporter, wizualizuj ekspresję GFP poprzez bezpośrednie obrazowanie z barwieniem immunologicznym lub bez.

Aby wyhodować i wyprowadzić aortę zarodkową, umieść zarodek w pozycji leżącej na plecach i przymocuj wyprostowane kończyny do deski preparacyjnej pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie od brzucha przez mostek do górnej części klatki piersiowej. Wypreparuj najdrobniejsze płuca tchawicy, przełyk, wątrobę i jelita.

Użyj kleszczy, aby delikatnie pociągnąć serce brzusznie, używając nożyczek, aby wypreparować aortę z dala od grzbietowej części klatki piersiowej i jamy brzusznej. Przetnij aortę w bliższym korzeniu i dystalnej pozycji brzucha, aby ją uwolnić, a następnie umieść pobraną aortę w sterylnym, lodowatym PBS w kapturze do hodowli komórkowych. Po krótkim przemyciu przenieś aortę do jednego dołka na 24-dołkowej płytce, zawierającej pożywkę DMEM uzupełnioną 0,5% PBS i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na okres do 24 godzin.

Pod koniec inkubacji przemyj aortę dwa razy PBS i utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut. Po trzech kolejnych płukaniach PBS przenieś aortę do 1,5 mililitrowej rurki zawierającej 30% sakukryny PBS, aż tkanka opadnie. Do izolacji komórek mięśni gładkich aorty okołoporodowej użyj igły o rozmiarze 23, aby nakłuć lewą komorę myszy 0,5 dnia poporodowego i użyj plastikowej rurki do połączenia igły ze sterylną strzykawką zawierającą PBS, trzymaną pionowo w pozycji uniesionej, tak aby PBS przepływał do lewej komory grawitacyjnie.

Kiedy wątroba blednie, użyj kleszczy, aby usunąć tkankę przybyszową na zewnątrz aorty i zbierz aortę, jak właśnie pokazano. Odciąć tkankę aorty w 500 mikrolitrach roztworu trawiącego z ręcznym wstrząsaniem co pięć do 10 minut. Po 45 minutach przenieść probówkę do sterylnego kaptura do hodowli komórek i użyć pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby rozprowadzić zawiesinę tkankową, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie dodaj dwa mililitry DMEM i zbierz komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w trzech mililitrach pożywki do hodowli komórek mięśni gładkich i wysiać komórki na 35-milimetrową płytkę hodowlaną. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, odświeżając pożywkę do hodowli komórkowych co trzy dni.

Aby umieścić podskórną mini pompę osmotyczną, zacznij od ogolenia dolnej części pleców znieczulonej myszy za pomocą maszynek do strzyżenia i umieść mysz w pozycji leżącej na podgrzewanej płytce chirurgicznej. Wyszoruj plecy betadyną i alkoholem izopropylowym i umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie za pomocą skalpela wykonaj poziome nacięcie skóry o długości od 0,5 do jednego centymetra około trzech do pięciu centymetrów rostralnie do podstawy ogona, nie uszkadzając leżącego pod spodem mięśnia.

Wprowadzić hemostat do nacięcia i otworzyć i zamknąć szczęki hemostatu, aby utworzyć kieszonkę podskórną. Włożyć do kieszeni mini pompkę osmotyczną wypełnioną interesującym nas środkiem i użyć 6 o niewchłanialnych szwów, aby zamknąć nacięcie. Następnie pozwól myszy dojść do siebie dzięki monitorowaniu, aż do osiągnięcia pozycji leżącej mostka.

Zarodki zmutowane dla genu kodującego białko macierzy zewnątrzkomórkowej, elastyna gromadzą nadmiar komórek mięśni gładkich w wewnętrznych warstwach aorty, począwszy od 15,5 dnia zarodka. Analiza klonalna komórek mięśni gładkich za pomocą wielokolorowego reportera cre podczas tego procesu wskazuje, że komórki mają wiele kolorów, a zatem są poliklonalne. Barwienie immunologiczne eksplantowanych skrawków aorty ujawnia, że aorty embrionalne z mutacją elastyny w dniu 15,5 stają się hipermięśniowe i stenoodowe w ciągu 18 godzin od hodowli, proces ten jest osłabiany przez dodanie przeciwciała blokującego anty antegrynę beta trzy.

Komórki mięśni gładkich wyizolowane z aorty myszy typu dzikiego, które po urodzeniu 0,5 dnia wyrażają markery komórek mięśni gładkich, ale nie CD31. Ciągły wlew inhibitora integryny beta 3 do wilgoci w ciąży, począwszy od 13,5 dnia embrionalnego, znacznie osłabia zwężenie zastawki aortalnej i hipermuskularyzację u myszy z mutacją białka macierzy zewnątrzkomórkowej, elastyny. Ale nie zmieniaj aorty myszy typu dzikiego.

Po opanowaniu, technikę umieszczania mini pompy osmotycznej można wykonać w mniej niż 10 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po tych procedurach podejścia te można również ekstrapolować w celu zbadania mięśni gładkich zakodowanych, nienaczyniowych, takich jak tkanki przewodu pokarmowego lub obszary płuc. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać mapowanie dopasowania zarodka in vivo i analizę klonalną, posiewać eksplantowane aorty embrionalne, okołoporodowe komórki mięśni gładkich aorty aortalnej i podskórne mini pompy osmotyczne

Nie zapominaj, że praca z myszami, tamoksyfenem i stałym reduktorem może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tych procedur należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego oraz zachowanie szczególnej ostrożności.