Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych
25 października 2017
Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.
Ogólnym celem tego nowego systemu modelowego opartego na DNA jest zrozumienie podstawowych właściwości klasy polimerów półelastycznych, która opisuje również zachowanie kluczowej klasy biopolimerów. Ta nowa metoda pozwala nam badać kluczowe zagadnienia z zakresu miękkiej metafizyki, a w szczególności pozwala badać zachowanie półelastycznych włókien i ich ułożenie w sieci. Główną zaletą tej techniki jest to, że właściwości mechaniczne filamentów intravisive są dostępne eksperymentalnie i można je precyzyjnie dostroić.
Polimery półelastyczne są definiowane przez specjalne właściwości włókien, które wcześniej były traktowane tylko w ramach teoretycznych ze względu na brak przestrajalnych systemów eksperymentalnych. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w definiowaną ilość polimerów półelastycznych, może być również stosowana jako nowy hydrożel do badania migracji komórek w matrycach o różnej sztywności bez zmiany rozmiaru oczek pod warstwą. Najmniejsza powtarzająca się jednostka w nanorurce może być traktowana jako pierścień jednostkowy.
Kilka z tych pierścieni jednostkowych układa się w stos podczas hybrydyzacji. Prowadzi to do powstawania wydłużonych nanorurek. Aby rozpocząć, ponownie zawiesić liofilizowane oligonukleotydy w oczyszczonej wodzie i postępować zgodnie z dalszymi krokami ponownego zawieszania podanymi w odpowiedniej instrukcji firmy.
Dostosuj ilość wody, aby uzyskać końcowe stężenie 200 mikromolów. Określ stężenia pojedynczych nici DNA, aby zweryfikować wartości podane przez dystrybutora, ponieważ dokładna stechiometria ma kluczowe znaczenie dla procesu składania. Za pomocą mikropipety wymieszaj nici DNA o tym samym stężeniu w pojemniku odpowiednim dla termocyklera, aby utworzyć pożądane probówki DNA i spirali.
Zhybrydyzuj probówki DNA i spiralę w termocyklerze, korzystając z parametrów znajdujących się w protokole tekstowym. Przechowuj zhybrydyzowane probówki DNA i spirali do 3 tygodni w temperaturze 4 stopni Celsjusza bez wykrywalnej degradacji. Przed wykonaniem reologii należy ostrożnie rozcieńczyć próbkę do pożądanego stężenia końcowego, w razie potrzeby używając buforu do próbki.
Wybierz odpowiednią geometrię dla dynamicznego reometru ścinania. Następnie załaduj próbkę do reometru. Aby zapobiec potencjalnym skutkom parowania, należy pasywować granicę faz powietrze-woda próbki i środowiska za pomocą 1 z 3 technik.
Każdą z tych substancji należy otoczyć próbkę 2,5 mililitrami kąpieli buforowej do próbki. Lub dodać do próbki środek powierzchniowo czynny tuż poniżej stężenia micel. Alternatywnie można użyć strzykawki Hamilton, aby otoczyć próbkę lipidem, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu próbki z powietrzem.
Uszczelnić komorę na próbkę za pomocą nakrętki wyposażonej w mokre gąbki. I, jeśli to możliwe, użyj dodatkowej kąpieli wodnej, aby jeszcze bardziej zahamować parowanie. Rozpocznij pomiar za pomocą oprogramowania specyficznego dla reometru w temperaturze pokojowej, pozwalając próbce na zrównoważenie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
Czas równowagi ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić układowi termoflekcyjnemu osiągnięcie pełnego izotropowego stanu randomizowanego, ponieważ jest to jedyne potwierdzenie umożliwiające porównanie różnych pomiarów. Po pomiarze przetworzyć dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotuj 8 podwielokrotności po 12 mikrolitrów dla każdej próbki, używając od 1 do 4 mikromolowych DNA na nić, 12,5 milimolowego chlorku magnezu i 1x barwienia żelem kwasu nukleinowego.
Wykonaj również kontrolę negatywną bez DNA, ale uwzględnij barwienie żelem z kwasem nukleinowym. Przenieś podwielokrotności na płytkę PCR w czasie rzeczywistym i uszczelnij folią samoprzylepną. Odwirować płytkę o temperaturze 100 razy G przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby usunąć pęcherzyki gazu.
Bardzo ważne jest usunięcie pęcherzyków gazu, ponieważ może on rozszerzać się podczas pomiarów, a próbek nie można analizować. Po odwirowaniu załaduj szczelną płytkę do ilościowego systemu PCR w czasie rzeczywistym. Zaprogramuj program wyżarzania, aby denaturować DNA w temperaturze dziewięćdziesięciu stopni Celsjusza przez 10 minut i szybko obniżyć temperaturę do siedemdziesięciu dwóch stopni Celsjusza.
Wtedy temperatura powinna powoli spadać o 0,5 stopnia Celsjusza co trzydzieści minut. Po zaniku sygnału przyspiesz rampę temperatury. Upewnij się, że pokrywa cyklera nagrzewa się do co najmniej stu stopni Celsjusza, aby zapobiec kondensacji odparowanej próbki na folii samoprzylepnej.
Podczas montażu wzbudzić próbki laserem argonowo-jonowym o długości czterystu osiemdziesięciu ośmiu nanometrów i wykryć fluorescencję przy 550 nanometrach przy użyciu barwnika CY3. W przypadku innych barwników należy wybrać odpowiednią kombinację emisji wzbudzenia. Mierz sygnał fluorescencji tak często, jak to możliwe, aby zwiększyć ogólną jakość sygnału za pomocą wbudowanej kamery.
Przedstawiono reprezentatywne surowe dane z pomiarów reologicznych, które ujawniają elastyczność sieci. Pokazane tutaj jest przemiatanie czasu podczas czasu równowagi. Ten wykres ujawnia zachowanie sieci zależne od odkształcenia.
Na tym wykresie widoczne jest zachowanie sieci zależne od częstotliwości. W tym momencie wybierane są wartości przy określonej częstotliwości. Wartości dla specyficznej populacji spirali DNA zostały wykreślone w stosunku do stężenia.
Proces ten powtórzono dla wszystkich rurek DNA i helisy. Nachylenie zostało następnie wydobyte na wykresie logarytmicznym, na którym uzyskano wykładnik prawa potęgowego. Na koniec wartości zostały ponownie wykreślone w stosunku do trwałej długości dla każdego zmierzonego stężenia.
Wykresy te umożliwiają wyodrębnienie skali modułu plateau sprężystości w odniesieniu do długości stężenia i trwałości. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się miękką materią i fizyką polimerów do zbadania wpływu sztywności włókien na klasę polimerów półelastycznych. Postępując zgodnie z tą procedurą, można zająć się dodatkowymi efektami, takimi jak recytacja splątanych sieci, krzyżowanie się sieci w ogóle i proces tworzenia struktury.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hybrydyzować nanorurki DNA i jak mierzyć właściwości reologiczne ich sieci.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza modelowy system oparty na DNA do badania polimerów półsztywnych, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia zachowania biopolimerów. Metoda ta umożliwia eksperymentalny dostęp do właściwości mechanicznych tych polimerów, pozwalając na uzyskanie wiedzy na temat ich sztywności i organizacji sieciowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biopolimery
- Fizyka materii miękkiej
- Właściwości mechaniczne polimerów
Wstęp
- Polimery półelastyczne posiadają unikalne właściwości mechaniczne.
- Poprzednie badania nad tymi polimerami miały w przeważającej mierze charakter teoretyczny.
- Zrozumienie ich sztywności jest niezbędne dla wielu zastosowań biologicznych.
- Programowalne nanorurki z DNA zapewniają nowe podejście eksperymentalne.
Cel badania
- Zbadanie zachowania filamentów półelastycznych.
- Zbadanie ich organizacji w sieci.
- Stworzenie regulowanego systemu eksperymentalnego do badania właściwości mechanicznych.
Zastosowane metody
- Opracowanie programowalnych nanorurek z DNA.
- Eksperymentalne dostrajanie sztywności filamentów.
- Zastosowanie systemu do badania migracji komórek w hydrożelach.
- Analiza właściwości mechanicznych w odniesieniu do tworzenia sieci.
Główne wyniki
- Nanorurki DNA pozwalają na precyzyjną kontrolę sztywności filamentów.
- Uzyskano nową wiedzę na temat właściwości mechanicznych polimerów półelastycznych.
- Metodę tę można zastosować do badania zachowania komórek w macierzach o różnej sztywności.
- Wyniki eksperymentalne potwierdzają przewidywania teoretyczne dotyczące zachowania polimerów.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza nowych ram teoretycznych dla zrozumienia polimerów półelastycznych.
- Programowalne nanorurki DNA stanowią wartościowe narzędzie w biologii eksperymentalnej.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę w szerszych zastosowaniach z zakresu biofizyki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Programowalne nanorurki z DNA zapewniają regulowany system eksperymentalny do badania polimerów półsztywnych, rozwiązując kluczowy problem w modelowaniu mechaniki biopolimerów. Umożliwia to redukcję ryzyka mechanistycznego w walidacji celów poprzez powiązanie sztywności filamentów z zachowaniem sieci w warunkach istotnych dla środowisk komórkowych. Podejście to zwiększa wiarygodność predykcyjną w przedklinicznych modelach oddziaływań macierzy pozakomórkowej oraz systemach dostarczania leków opartych na hydrożelach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu długości persystencji na mechanikę filamentów i tworzenie sieci.
- Wartość operacyjna: Zapewnia stabilny, regulowany system przez wiele tygodni, co zmniejsza zmienność w początkowej fazie testowania hipotez.
- Wartość naukowa: Wspiera walidację funkcjonalnych celów poprzez modelowanie półelastycznych biopolimerów, takich jak aktyna, w kontrolowanej formie.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne wyniki reologiczne (moduł plateau sprężystości) skorelowane z długością persystencji i stężeniem.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane przygotowanie włókien o długości mikronowej z powtarzalną kinetyką polimeryzacji.
- Wartość naukowa: Ułatwia opracowywanie testów do przesiewania związków zmieniających mechanikę sieci polimerów półelastycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modelowanie mechaniki macierzy zewnątrzkomórkowej w celu badania migracji komórek w hydrożelach o regulowanej sztywności bez zmiany rozmiaru oczek sieci.
- Wartość operacyjna: Umożliwia długoterminowe przechowywanie (do 3 tygodni w 4°C) bez degradacji, co wspiera wielodniowe testy przedkliniczne.
- Wartość naukowa: Łączy pomiary długości uporządkowania pojedynczych cząsteczek z mechaniką sieci objętościowej w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
Integracja potoku i procesu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – dostarczając regulowaną platformę do analizy wpływu sztywności filamentów na wyniki biologiczne w testach zależnych od macierzy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zachowania polimerów półsztywnych poprzez precyzyjne eksperymentalne dostrajanie sztywności.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne odczyty reologiczne, umożliwiające wiarygodne przesiewanie związków w macierzach hydrożelowych.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie wykładników prawa potęgowego oraz zależności skalowania między modułem sprężystości, stężeniem a długością trwałości w celu przeprowadzenia porównań opartych na danych.
- Badania translacyjne: Łączy sztywność w skali molekularnej z mechaniką na poziomie sieci, istotną dla inżynierii tkankowej i badań nad migracją komórek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania mechaniki polimerów półsztywnych w wielu projektach z zakresu biofizyki i biomateriałów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad polimerami półelastycznymi poprzez zapewnienie regulowalnego i stabilnego systemu modelowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom hybrydyzacji, rozcieńczania i reometrii.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w projektowaniu biomateriałów poprzez przewidywanie mechaniki sieci na podstawie parametrów projektowania molekularnego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój formulacji hydrożeli w oparciu o zwalidowane zależności między strukturą a właściwościami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie hybrydyzacji DNA, reometrii oraz ilościowego oznaczania metodą fluorescencyjną.
- Wymaga dostępu do termocyklera, dynamicznego reometru ścinania oraz systemu real-time PCR w celu montażu i walidacji.
- Wymaga standaryzacji stężeń oligonukleotydów oraz warunków stężenia chlorku magnezu pomiędzy zespołami.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne przy przenoszeniu mechaniki nanorurek na naturalne systemy biopolimerowe lub hydrożele.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność zapobiegania parowaniu podczas reometrii oraz usuwania pęcherzyków gazu przed analizą qPCR.
