Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D
9 sierpnia 2017
Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie do badania zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym. W tym miejscu opisujemy protokół wideomikroskopii poklatkowej pierwotnych komórek kory mózgowej, który umożliwia szczegółowe badanie faz odgrywanych podczas progresji linii od pierwotnych nerwowych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i gleju.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja zachowań komórek podczas progresji linii od nerwowych komórek macierzystych do neuronów lub komórek glejowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie neurorozwoju, takie jak rola symetrycznych i asymetrycznych podziałów komórek, wydłużenie cyklu komórkowego i tempo wzrostu komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na obserwację linii komórkowej przez długi czas.
Pozwala to na obserwację przejścia od neurogenezy do genezy glejowej w obrębie jednej linii i bezpośrednie połączenie subliniowych neuronalnych i glejowych komórek progenitorowych. Zacznij od usunięcia mózgów z 5 do 10 zarodków e14 na szalce Petriego z zimnym podłożem preparacyjnym. Użyj kleszczy, aby ostrożnie wyciągnąć skórę i czaszkę oraz odizolować mózgi.
Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczy preparacyjnych, aby usunąć opony mózgowe. Następnie podziel kresomózgowie pośrodku, aby oddzielić półkule. Aby wyizolować grzbietowo-boczną kresomózgowie, przetnij wzdłuż krzywej grzbietowo-przyśrodkowej oraz granicy pallio i subpallium.
Przenieś grzbietowo-boczne kresomózgowie do probówki o pojemności 2 ml z podłożem preparacyjnym na lodzie, aż wszystkie mózgi zostaną wypreparowane. Po mikropreparacji grzbietowo-bocznej kresomózgowia umieść tkankę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Następnie odwirować probówkę zawierającą pobraną tkankę w zimnym podłożu preparacyjnym przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 340 razy G, aby wytrącić tkankę.
Po wirowaniu usuń supernatant pipetą i dodaj 1 ml 37 stopni Celsjusza 0,05% trypsyny-EDTA do trawienia chemicznego. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodaj 2 ml pożywki proliferacyjnej, aby zahamować aktywność trypsimu.
Następnie wypoleruj końcówkę szklanej pipety Pasteura nad palnikiem gazowym lub palnikiem Bunsena przez kilka sekund, aby nieznacznie zwęzić otwór. Asperate FCS w celu pokrycia końcówki pipety. Następnie mechanicznie odłącz komórki za pomocą wypolerowanej ogniowo i pokrytej FCS pipety Pasteura, pipetując w górę i w dół, uważając, aby uniknąć generowania pęcherzyków.
Odwirować zdysocjowane komórki przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 340 razy G. Usunąć supernatant za pomocą pipety, a następnie dodać jeden milimetr pożywki proliferacyjnej i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety. Usunąć PBS z płytki poddanej wstępnej obróbce za pomocą poli-D-lizyny. Następnie narysuj znak na spodzie tabliczki, który może służyć jako odniesienie do określenia punktu zerowego.
Po ponownym zawieszeniu komórek w pożywce proliferacyjnej, należy przygotować rozcieńczenie zawiesiny komórek jeden do jednego, używając 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Załaduj do szkiełek komory liczącej i policz liczbę niebarwionych żywotnych komórek. Niezdolne do życia komórki będą niebieskie.
Rozcieńczyć komórki w pożywce proliferacyjnej, aby uzyskać od 10 do szóstych komórek na milimetr. Dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby zobrazować komórki transdukowane retrowirusem, umieść płytkę kultury tkankowej w komorze obrazowania podłączonej do kontrolerów temperatury i dwutlenku węgla, aby utrzymać komórki w stałych warunkach 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Wybierz pozycję na osi xy, która ma służyć jako punkt zerowy, i skalibruj punkt zerowy. Wybierz od 10 do 15 pozycji na dołek, które mają być obrazowane w 10-krotnym powiększeniu. Ustaw oprogramowanie tak, aby wymagało obrazów kontrastu fazowego co pięć minut, a obrazów fluorescencyjnych co trzy godziny, aby zmniejszyć fototoksyczność.
Sprawdź i dostosuj ostrość w ciągu pierwszych trzech godzin eksperymentu, ponieważ może się ona zmieniać, gdy temperatura się równoważy. Po siedmiu dniach przerwij akwizycję i przejdź do immunocytochemii po obrazowaniu. Uruchom oprogramowanie do śledzenia komórek i wybierz nazwę użytkownika.
Kliknij wybierz swoją nazwę użytkownika i kontynuuj. Przeglądaj i wybierz folder roboczy tTt, aby zapisać drzewa pochodzenia, statystyki i wyeksportowane obrazy. Następnie wybierz eksperyment, który chcesz przeanalizować i załadować.
Jeśli obrazy zostały wcześniej przekonwertowane przez konwerter plików dziennika, kliknij konwerter plików dziennika i określ liczbę sekund między dwoma kolejnymi punktami czasowymi w oknie konwertera plików dziennika. Kliknij konwertuj pliki dziennika, aby wyświetlić cały eksperyment. Wybierz i załaduj żądane obrazy ręcznie lub za pomocą opcji wyświetlanej w programie.
Wybierz plik, otwórz, nową kolonię. Kliknij śledzenie, a następnie rozpocznij śledzenie, aby rozpocząć śledzenie w wybranej pozycji. Pojawi się okno filmu.
Wybierz komórkę za pomocą okręgu śledzenia i naciśnij zero. Oprogramowanie przejdzie do następnej klatki. Kontynuuj przesuwanie okręgu śledzenia wokół komórki ścieżki za pomocą myszy i klikaj zero w każdej klatce, aby dodać znacznik ścieżki w komórce.
Użyj pierwszego i trzeciego, aby przejść do poprzedniej lub następnej klatki. Aby usunąć znacznik ścieżki, po prostu kliknij odpowiednią pozycję, aby ją zaznaczyć i naciśnij zero. Jeśli komórka została podzielona, wybierz śledzenie, zatrzymaj przyczynę, dzielenie i kontynuuj śledzenie jednej komórki potomnej, zaznaczając jedną z komórek w oknie edytora komórek, a następnie wybierz śledzenie, rozpocznij śledzenie.
Aby śledzić drugą komórkę potomną, zaznacz ją w edytorze komórek i naciśnij F2. Jeśli komórka obumarła podczas mikroskopii wideo, wybierz apoptozę. Jeśli komórka opuści pole obserwacji lub zmiesza się z sąsiednimi komórkami, uniemożliwiając śledzenie, wybierz opcję Utracona. Aby zatrzymać śledzenie i kontynuować później, kliknij przerwij.
W oknie edytora komórek podczas śledzenia zostanie wygenerowane drzewo. Aby zapisać drzewo pochodzenia, wybierz plik, zapisz, bieżące drzewo w oknie edytora komórek. Aby wyeksportować film z danymi śledzenia, wyłącz tryb śledzenia i w oknie filmu wybierz opcję eksportuj film.
Ustaw zakres formatów klatek, liczbę klatek na sekundę i szybkość transmisji bitów. Kliknij Rozpocznij eksport. Poniższe mikrofotografie pokazują kontrast fazowy w obrazach fluorescencyjnych GFP pierwotnej hodowli komórek kory mózgowej.
Ekspresja GFP jest nieobecna w pierwszych godzinach obrazowania. Liczba komórek wykazujących ekspresję GFP wzrasta z czasem, a intensywność fluorescencji GFP wzrasta, jak wskazuje żółta strzałka na tych obrazach. Ten obraz o większym powiększeniu w ramkowym obszarze poprzedniego obrazu pokazuje szczegółowo komórki wyrażające GFP.
Te obrazy kontrastu fazowego pokazują przykład podziału komórki. Widoczne jest tutaj zaokrąglenie komórek progenitorowych, po którym następuje zwężenie błony komórkowej, a na końcu zakończenie mitozy. Jest to przykład pojedynczego drzewa linii komórkowej.
Kolorowe strzałki wskazują różne tryby podziału komórek, symetryczny podział proliferacyjny jest pokazany żółtą strzałką. Podział asymetryczny jest oznaczony niebieską strzałką. Symetryczny podział końcowy jest pokazany czerwoną strzałką, a X oznacza śmierć komórki.
Liczby wskazują długość cyklu komórkowego komórek progenitorowych. Tę technikę można wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pokazać zachowania komórek podczas progresji linii komórkowej komórek macierzystych do neuronów lub komórek glejowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół wideomikroskopii poklatkowej, mający na celu obserwację zachowań komórkowych w pierwotnych komórkach kory mózgu. Metoda ta umożliwia badaczom analizę progresji linii komórkowych od neuralnych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i komórek glejowych, dostarczając wiedzy na temat procesów neurorozwojowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Rozwój neurologiczny
- Zachowanie komórkowe
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Obrazowanie na żywo jest skuteczną metodą badania dynamiki komórkowej.
- Badanie koncentruje się na przechodzeniu komórek macierzystych neuronów w różne typy komórek.
- Metoda ta umożliwia długoterminową obserwację linii komórkowych.
- Pomaga ona w zrozumieniu kluczowych kwestii dotyczących podziału komórek i tempa ich wzrostu.
Cel badania
- Obserwacja zachowań komórek podczas progresji linii komórkowej z neuralnych komórek macierzystych w neurony lub komórki glejowe.
- Badanie implikacji symetrycznych i asymetrycznych podziałów komórkowych.
- Umożliwienie szczegółowego śledzenia neurogenezy i gliogenezy.
Zastosowane metody
- Wykorzystaną platformą jest wideomikroskopia poklatkowa pierwotnych komórek kory mózgowia.
- Pierwotne neuralne komórki macierzyste są izolowane z embrionów e14 zgodnie ze szczegółowymi protokołami sekcji.
- Komórki są hodowane i obserwowane w kontrolowanych warunkach temperatury i CO2 podczas obrazowania.
- Obrazy są rejestrowane w określonych odstępach czasu, aby zminimalizować fototoksyczność, a oprogramowanie wspomaga śledzenie linii komórkowych.
Główne wyniki
- Śledzenie linii komórkowych ujawnia przesunięcia z neurogenezy w stronę gliogenezy w czasie.
- Przedstawiono dane ilościowe dotyczące żywotności komórek oraz wyników śledzenia.
- Wzrost liczby komórek wykazujących ekspresję GFP wskazuje na pomyślne śledzenie i obserwacje różnicowania.
- W trakcie eksperymentu zarejestrowano mechanistyczne wglądy w podziały, śmierć oraz śledzenie linii komórkowych.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje solidną metodę obrazowania na żywo w celu zbadania rozwoju linii neuralnych.
- Protokół ten umożliwia badaczom udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące neurorozwoju, co może pomóc w zrozumieniu powiązanych z nim chorób.
- Wyniki badania mogą stanowić podstawę dla przyszłych badań nad procesami różnicowania komórek w układzie nerwowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej w systemie hodowli 2D umożliwia wysokorozdzielcze śledzenie decyzji dotyczących losów progenitorów neuronalnych, co wspomaga mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów neurorozwojowych. Podejście to dostarcza ilościowych danych na poziomie pojedynczych komórek w zakresie trybów podziału i progresji linii komórkowych, co zasila wczesne etapy odkrywania leków oraz potoki badań translacyjnych. Zdolność tej metody do manipulowania ekspresją genów i wizualizacji wyników zwiększa pewność prognostyczną podczas selekcji projektów w badaniach i rozwoju (R&D) skoncentrowanych na OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację losów komórek progenitorowych i determinacji linii komórkowych w rozdzielczości pojedynczych komórek.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie wyników podziałów symetrycznych od asymetrycznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów neurorozwojowych poprzez manipulację genami i śledzenie wyników w czasie rzeczywistym.
- Dostarcza ilościowych danych dotyczących cyklu komórkowego i podziałów, co pozwala na dobór celów w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewy i rozwój testów analitycznych
- Ustanawia zwalidowane, powtarzalne systemy hodowli 2D do późniejszego screeningu fenotypowego.
- Zapewnia zestandaryzowane protokoły obrazowania i śledzenia w celu rzetelnego opracowania testów.
- Generuje ilościowe wyniki dotyczące żywotności, podziałów i różnicowania komórek do oceny związków.
- Umożliwia skalowalne, gotowe do wdrożenia na platformach przepływy pracy dla testów opartych na komórkach OUN.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie śledzenia linii komórkowych in vitro z procesami neurorozwojowymi istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez powiązanie losów komórek z interwencjami molekularnymi.
- dostarcza wglądu w mechanizmy neurogenezy i gliogenezy istotne dla modeli chorób OUN.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o prognostyczne wyniki śledzenia linii komórkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda obrazowania na żywo integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w badaniach nad liniami neuronalnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie trybów podziału komórek i specyfikacji losów w progenitorach neuronalnych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania w celu weryfikacji gotowości testu oraz badania związków.
- Analityka: Dostarcza drzewa linii komórkowych, parametry cyklu komórkowego oraz statystyki trybów podziału do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki linii komórkowych in vitro ze ścieżkami neurorozwojowymi istotnymi dla przebiegu chorób.
- Wykorzystanie instytucjonalne: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do manipulacji genetycznych i śledzenia żywych komórek w ramach programów badawczych nad OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów neurorozwojowych i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania i śledzenia na żywo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio w odkrywaniu leków na OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów neurorozwojowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji komórek neuronalnych, obrazowaniu żywych komórek oraz obsłudze oprogramowania do śledzenia linii komórkowych.
- Wymaga dostępu do kontrolowanych komór obrazujących oraz infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej.
- Konieczna jest standaryzacja odstępów między obrazowaniem a kryteriów śledzenia w ramach zespołów.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do innych systemów progenitorowych poprzez modyfikację protokołu w zakresie źródła tkanki i warunków hodowli.
- Potencjalne ograniczenia obejmują zmienność w preparatach komórek pierwotnych oraz fototoksyczność wywołaną obrazowaniem.
