Name: Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej w systemie hodowli 2D. Technika ta umożliwia śledzenie postępowania linii komórkowych od komórek macierzystych do neuronów i komórek glejowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) i FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Norte).

Wszystkie eksperymenty z udziałem żywych zwierząt opisane w tym protokole są przeprowadzane zgodnie z prawem krajowym i międzynarodowym i zostały zatwierdzone przez lokalną Uniwersytecką Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (CEUA/UFRN), na podstawie licencji 009/2014. Poniższy protokół jest wykonywany w sterylnym środowisku. Oczekuje się znajomości podstawowych kultur komórkowych.
1. Mikrodysekcja grzbietowo-bocznej kresomózgowia
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę preparacyjną (100 ml): 98,5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), 0,5 ml 5 M HEPES pH 7,4, 1 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml).</li>
	<li>Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę preparacyjną.</li>
	<li>Usunąć zarodki zarodkowe w 14. dniu (E14) ciężarnej myszy C57/Bl6 (Mus musculus) w znieczuleniu izofluranem. 
	UWAGA: Rozważ E0 jako dzień wykrycia czopa dopochwowego. Rozbior należy zakończyć nie później niż 1 godzinę po usunięciu z ciężarnej myszy. Protokół ten ma również zastosowanie do zarodków E11-E17.</li>
	<li>Usunąć zarodki przez histerektomię w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Przenieść zarodki na szalkę Petriego z zimnym podłożem preparacyjnym (4 °C).</li>
	<li>Usuń mózg z czaszki, przecinając wzdłuż podłużnej szczeliny. Liczba zarodków zwykle waha się od pięciu do dziesięciu. Każdy mózg E14 wytwarza około 2 x 106 komórek, w tym neurony progenitorowe i postmitotyczne (stosunek 1:1) 
	UWAGA: Użyj mikroskopu stereoskopowego do wykonania następujących czynności.</li>
	<li>Usuń opony mózgowe za pomocą kleszczy preparacyjnych. Podziel kresomózgowie pośrodku, aby oddzielić półkule. Aby wyizolować grzbietowo-boczną kresomózgowie, przeciąć wzdłuż krzywej grzbietowo-przyśrodkowej i granicy palijalno-podpalialnej za pomocą kleszczy preparacyjnych. Przenieść grzbietowo-boczną kresomózgowie do probówki o pojemności 2 ml z zimnym podłożem preparacyjnym (4 °C), aż wszystkie mózgi zostaną wypreparowane.</li>
</ol>
2. Dysocjacja komórek i powlekanie
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę proliferacyjną (50 ml DMEM + 10% FCS): 44 ml Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM), 5 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,5 ml 40% glukozy, 0,5 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml). Filtruj i sterylizuj pożywkę proliferacyjną.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę różnicującą (50 ml DMEM + 2% B27): 48 ml DMEM, 1 ml B27, 0,5 ml 40% glukozy, 0,5 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml). Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę różnicującą.</li>
	<li>Po mikropreparacji grzbietowo-bocznej kresomózgowia od myszy E14, odwirować probówkę z pobraną tkanką i zimnym podłożem preparacyjnym (przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 340 x g) w celu wytrącenia tkanki.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) trypsyny-EDTA (0,05%) w celu roztrawienia chemicznego. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 2 ml pożywki proliferacyjnej, aby zatrzymać aktywność trypsyny.</li>
	<li>Wypoleruj końcówkę szklanej pipety Pasteura nad palnikiem gazowym lub palnikiem Bunsena przez kilka sekund, aby nieznacznie zwęzić otwór. Umyj pipetę, zasysając FCS, aby pokryć końcówkę. Unikając pęcherzyków powietrza, należy mechanicznie rozdzielić komórki za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z powłoką FCS.</li>
	<li>Odwirować komórki (przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 340 x g). Usunąć supernatant za pomocą pipety. Dodać 1 ml pożywki do proliferacji i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek w stosunku 1:1 przy użyciu 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Niezdolne do życia komórki będą niebieskie. Policz liczbę żywotnych komórek (niebarwionych) za pomocą komory Neubauera.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki w pożywce proliferacyjnej, aby uzyskać 106 komórek/ml. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej (około 2,5 × 105 komórek/cm2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Nie używaj szkiełek nakrywkowych, ponieważ mogą się one przesuwać podczas eksperymentu i zmieniać pole obserwacji. Alternatywnie należy użyć płytek do hodowli tkankowych ze szklanym dnem. 
	UWAGA: Jeśli nie używasz wielokanałowej poddanej hodowli komórkowej, ważne jest, aby wstępnie potraktować płytki poli-D-lizyną (50 μg/ml) 2 godziny w temperaturze 37 °C. Płytki poddane działaniu PDL można przechowywać w temperaturze 4 °C po umyciu wodą destylowaną.</li>
</ol>
3. Transfekcja za pośrednictwem retrowirusa
UWAGA: To jest prosta metoda transfekcji tylko komórek progenitorowych. Jednak inne wektory wirusowe lub transfekcja chemiczna/elektryczna mogą być wykorzystane do wprowadzenia interesujących genów do hodowanych komórek.
<ol>
	<li>Aby manipulować ekspresją genów i oznaczać komórki fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, dodaj retrowirusy przenoszące plazmidy z genami będącymi przedmiotem zainteresowania 2 godziny po posiewie komórek. 
	UWAGA: Wektory retrowirusowe integrują się tylko z genomem dzielących się komórek. Dlatego ważne jest, aby infekować komórki, gdy proliferacja jest wysoka. 
	UWAGA: Użyliśmy plazmidu zawierającego sekwencję fuzji beta-aktyny / CMV (CAG) i wewnętrzne rybosomalne miejsce wejścia (IRES), a następnie sekwencję kodującą białko zielonej fluorescencji (GFP), oznaczoną jako pCAG-IRES-GFP44. Geny będące przedmiotem zainteresowania mogą być klonowane między promotorem CAG a IRES sequence37.</li>
	<li>Rozcieńczyć retrowirusa w pożywce różnicującej, aby uzyskać pożądaną liczbę cząstek na ml. Do każdego dołka dodać 500 μl pożywki różnicującej z retrowirusem. 
	UWAGA: Ilość użytych retrowirusów zależy od ich miana i powinna być obliczona tak, aby uzyskać od 50 do 100 zainfekowanych komórek na studzienkę. Miano to pozwala na identyfikację izolowanych klonów wykazujących ekspresję GFP, których pokrewieństwo można dodatkowo potwierdzić poprzez śledzenie obrazów kontrastu fazowego (patrz punkt 6). Miareczkowanie retrowirusa powinno być przeprowadzone przy użyciu tej samej populacji komórek45.</li>
</ol>
4. Wideomikroskopia poklatkowa
UWAGA: Ten krok wymaga odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z komorą inkubacyjną (zobacz Tabelę Materiałów).
<ol>
	<li>Po zakażeniu retrowirusem umieścić płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze podłączonym do regulatorów temperatury i CO2 . 
	UWAGA: Wstępne podgrzanie komory przez 3 godziny przed rozpoczęciem obrazowania może pomóc zminimalizować dryft i rozogniskowanie podczas akwizycji. 
	UWAGA: Komora powinna utrzymywać ogniwa w stałych warunkach 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wybierz pozycję na osi XY, która ma służyć jako punkt zerowy (XY = 0). Umożliwi to odniesienie do ponownego znalezienia pozycji w przyszłości, na przykład po badaniu immunocytochemicznym po obrazowaniu (patrz punkt 5). 
	UWAGA: Zaleca się narysowanie na tabliczce znaku, który może służyć jako odniesienie do określenia punktu zerowego.</li>
	<li>Wybierz pozycje, które mają być obrazowane przy 10-krotnym powiększeniu. 
	UWAGA: Wybierz 10-15 pozycji na studzienkę, aby zwiększyć prawdopodobieństwo zaobserwowania komórek transfekowanych retrowirusowo. 
	UWAGA: Długodystansowe obiektywy o dużym powiększeniu (20X lub 40X) mogą być używane do uzyskiwania obrazów o wyższej rozdzielczości. W zależności od odległości roboczej obiektywów mogą być wymagane płyty ze szklanym dnem.</li>
	<li>Pobieraj obrazy kontrastu fazowego co 5 minut i obrazy fluorescencyjne co 3 godziny, aby zmniejszyć fototoksyczność. Sprawdź i dostosuj ostrość w ciągu pierwszych 3 godzin eksperymentu, ponieważ może się ona zmienić, gdy temperatura się równoważy. Codziennie sprawdzaj i reguluj ostrość. 
	UWAGA: Obserwujemy, że ostrość stabilizuje się po pierwszych 24 godzinach. Wskazane jest jednak monitorowanie ostrości. Alternatywnie można skorzystać z programowego systemu autofokusa.</li>
	<li>Po 7 dniach należy przerwać pobieranie i przejść do immunocytochemii po obrazowaniu (patrz punkt 5).</li>
	<li>Po immunocytochemii wymień płytkę w inkubatorze mikroskopowym, znajdź punkt zerowy, zresetuj XYZ = 0 i ponownie załaduj eksperyment z zapisanymi pozycjami. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne każdej pozycji za pomocą odpowiednich filtrów fluorescencyjnych.</li>
</ol>
5. Immunocytochemia po obrazowaniu
<ol>
	<li>Po 7 dniach w hodowli utrwalić hodowlę komórkową 4% utrwalaczem paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: PFA jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w dygestoriach chemicznych.</li>
	<li>Płukać 0,5 ml PBS 0,1 M przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.</li>
	<li>Inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C w 0,5% trytonie i 10% normalnej surowicy koziej w PBS 0,1 M. 
	UWAGA: Użyj przeciwciała anty-Microtubule Associated Protein 2 (MAP2), aby potwierdzić fenotyp neuronalny (mysia IgG1, 1:1,000) i anty-GFP do znakowania transdukowanych komórek (przeciwciało kurze, 1:500). Inne przeciwciała mogą być używane do wykrywania komórek progenitorowych lub glejowych.</li>
	<li>Płukać 0,5 ml PBS 0,1 M przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 0,5% trytonie i 10% normalnej surowicy koziej w PBS 0,1 M i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Zalecane rozcieńczenie: 1:1,000.</li>
	<li>Płukać 0,5 ml PBS 0,1 M przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.</li>
	<li>W przypadku barwienia jąder inkubować komórki przez 5 minut z 0,1 μg/ml 4′6′-diamino-2-fenylindonu (DAPI) w PBS 0,1 M.</li>
	<li>Płukać 0,5 ml PBS 0,1 M przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.</li>
	<li>Przechowywać komórki w PBS 0,1 M i chronić przed światłem (np. owinąć płytkę folią).</li>
</ol>
6. Śledzenie komórek
UWAGA: Tutaj krótko opisujemy główne kroki do analizy danych z wideomikroskopii poklatkowej za pomocą oprogramowania The Tracking Tool (tTt), które jest dostępne pod linkiem podanym w Tabeli Materiałów.
UWAGA: Jeśli akwizycja obrazu odbywa się za pomocą innego oprogramowania, zaimportuj dane obrazu za pomocą konwertera tTt dostępnego w instalatorze tTt (link podany w Tabeli materiałów). Akceptowane są tylko formaty obrazów png, tif lub jpg. Postępuj zgodnie z instrukcjami pokazanymi na stronie Rysunek 1 A - B po uruchomieniu konwertera tTT.
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie tTt i wybierz nazwę użytkownika. Kliknij przycisk "dodaj użytkownika" i "kontynuuj" (Rysunek 2A). Przeglądaj i wybierz "TTTWorkFolder" (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Drzewa pochodzenia, statystyki i wyeksportowane obrazy zostaną zapisane w tym folderze. Następnie wybierz eksperyment, który chcesz przeanalizować i załaduj go (Rysunek 2B).</li>
	<li>Jeśli obrazy zostały wcześniej przekonwertowane przez tTt Converter, kliknij na "LogFileConverter" (Rysunek 3A) i określ liczbę sekund między dwoma kolejnymi punktami czasowymi w oknie LogFileConverter. Kliknij na "Konwertuj pliki dziennika dla całego eksperymentu" (Rysunek 1C).</li>
	<li>Z listy obrazów, które pojawiają się w oknie tTt, wybierz żądane obrazy, które ładują się ręcznie lub za pomocą opcji wyświetlanej w programie. Załaduj obrazy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Wybierz Plik> Otwórz > Nowej kolonii. Kliknij "Śledzenie", a następnie "Rozpocznij śledzenie", aby rozpocząć śledzenie w wybranej pozycji.</li>
	<li>Pojawi się okno filmu (Rysunek 4). Wybierz komórkę za pomocą okręgu śledzenia i naciśnij 0. Oprogramowanie przejdzie do następnej klatki. Kontynuuj pozycjonowanie okręgu śledzenia wokół śledzonej komórki za pomocą myszy i klikaj 0 w każdej klatce, aby dodać znacznik ścieżki w komórce.</li>
	<li>Użyj 1 i 3, aby przejść odpowiednio do poprzedniej lub następnej klatki. Aby usunąć znacznik śladu, po prostu kliknij odpowiednią pozycję, aby go zaznaczyć i naciśnij 0.</li>
	<li>Jeśli komórka jest podzielona, wybierz przycisk "podział" (czerwony prostokąt w Rysunek 4). Kontynuuj śledzenie jednej komórki potomnej, naciskając Shift+D. Aby śledzić drugą komórkę potomną, zaznacz ją w edytorze komórek i naciśnij F2.</li>
	<li>Jeśli komórka obumarła podczas mikroskopii wideo, wybierz "apoptoza" (niebieski prostokąt w <silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
	UWAGA: Chociaż oprogramowanie oznacza zdarzenie jako "apoptozę", inne mechanizmy mogą być odpowiedzialne za śmierć komórki.</li>
	<li>Jeśli komórka opuszcza pole obserwacji lub miesza się z sąsiednimi komórkami, uniemożliwiając śledzenie, wybierz "zagubiona" (zielony prostokąt w miejscu Rysunek 4).</li>
	<li>Aby zatrzymać śledzenie i kontynuować później, kliknij na "interrupt" (fioletowy prostokąt na Rysunek 4). 
	UWAGA: W oknie Edytor komórek zostanie wygenerowane drzewo podczas śledzenia. Aby zapisać drzewo pochodzenia, wybierz pozycję Plik > Zapisz > bieżące drzewo (w oknie Edytor komórek).</li>
	<li>Aby rozpocząć śledzenie innej komórki, kliknij komórkę prawym przyciskiem myszy lub wybierz komórkę za pomocą lewego przycisku myszy i kliknij Śledzenie > Rozpocznij śledzenie.</li>
	<li>Aby wyeksportować film z danymi śledzenia, oprogramowanie nie powinno być w "trybie śledzenia". Aby wyłączyć tryb śledzenia, wykonaj krok 6.10. W oknie Film wybierz opcję Eksportuj > filmu. Ustaw format, zakres klatek, liczbę klatek na sekundę i szybkość transmisji. Kliknij "Rozpocznij eksport".</li>
</ol>
7. Kwantyfikacje
UWAGA: Za pomocą danych z mikroskopii wideo można wykonać kilka pomiarów46. W tym miejscu opisujemy trzy możliwości, które zostały zilustrowane w dalszej części sekcji "reprezentatywne wyniki".
<ol>
	<li>Określ ilościowo przeżywalność komórek dla każdej linii komórkowej, dzieląc liczbę komórek żyjących w różnych punktach czasowych przez całkowitą liczbę komórek wygenerowanych przed osiągnięciem tych punktów czasowych w poszczególnych klonach37.</li>
	<li>Określ ilościowo proporcję symetrycznego progenitora (SP, obie komórki potomne nadal się proliferują), asymetrycznego (A, jedna komórka potomna nadal się proliferuje, a druga staje się postmitotyczna) lub symetrycznego zakończenia (ST, obie komórki potomne stają się postmitottyczne)15,38.</li>
	<li>Zmierz długość cyklu komórkowego, obliczając czas proliferacji komórek między ich powstaniem a podziałem15.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obserwacja w czasie rzeczywistym pierwotnych komórek kory mózgowej pozwala na analizę proliferacji komórek, sposobu podziału komórek, długości cyklu komórkowego, różnicowania komórek i przeżywalności komórek 3,14,15,37. Co ważniejsze, pozwala na badanie linii jednokomórkowych, prowadząc do identyfikacji faz pośrednich zachodzących podczas progresji od NSC do neuronów3. W...

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) generują neurony i komórki makroglejowe podczas rozwoju kory mózgowej. We wczesnej kortykogenezie NSC przechodzą kilka rund symetrycznego podziału komórek i rozszerzają pulę progenitorów. Następnie NSC dzielą się asymetrycznie, aby generować neurony bezpośrednio lub pośrednio przez intermediates1. Dopiero w środkowej i późnej kortykogenezie przodkowie przełączają się na generowanie astrocytów i oligodendrocytów2,3,4. Jednak pełne mechanizmy kontrolujące proliferację i różnicowanie komórek, a także wkład ograniczonych w losie prekursorów do generowania unikalnych typów neuronów lub komórek makrogleju, pozostają przedmiotem intensywnej debaty4,5,6. Potencjał poszczególnych korowych NSC do generowania neuronów, astrocytów i oligodendrocytów był szeroko badany in vitro i in vivo przy użyciu niezliczonych technik, takich jak: obrazowanie na żywo w hodowlach jednokomórkowych7,8,9,10,11,12,13; Obrazowanie na żywo w kulturach o dużej gęstości Cultures3,14,15; Obrazowanie na żywo w kulturach warstw16,17,18; Analiza klonalna z wykorzystaniem znakowania genetycznego za pośrednictwem wektora wirusowego w kulturach o dużej gęstości14,15,19,20,21; Analiza klonalna in vivo przy użyciu retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; oraz analiza klonalna in vivo z wykorzystaniem zwierząt transgenicznych<klasa sup="xref">34.
Każda z tych technik ma swoje wady i zalety. Na przykład śledzenie linii produkcyjnej in vivo jest podatne na błędy grupowania i rozdzielania3, co prowadzi do sprzecznych wniosków na temat potencjału poszczególnych przodków kory mózgowej. Co więcej, zarówno badania in vitro, jak i in vivo oparte na znakowaniu komórek progenitorowych we wczesnych punktach czasowych i późniejszej analizie linii komórkowych mogą mieć wpływ niewykryte wystąpienie śmierci komórki podczas progresji linii35. W związku z tym odpowiedni system do analizy potencjału pojedynczych NSC musi umożliwiać identyfikację wszystkich wygenerowanych komórek, a także odpowiednią charakterystykę losów komórek w obrębie linii. Połączenie pierwotnej hodowli komórkowej i obrazowania na żywo zapewnia to ustawienie. Korzystając z hodowli pojedynczej komórki i mikroskopii wideo poklatkowego, Temple i in. pokazali zmianę w linii poszczególnych prekursorów kory mózgowej od neurogenezy do glejogenezy11. Później użyli tego samego systemu, aby pokazać, że różne typy neuronów są generowane z jednego przodka kory mózgowej12. Jednak ten system przedstawia ważne zastrzeżenie: tylko 1% przodków korowych wyizolowanych we wczesnej kortykogenezie generuje klony 4 lub więcej potomstwa9. Po dodaniu FGF2 częstotliwość generowania przez komórki 4 lub więcej komórek wzrasta do 8 - 10%9. Niemniej jednak liczba ta jest zbyt mała, biorąc pod uwagę, że praktycznie wszyscy przodkowie kory mózgowej są proliferacyjni na tym etapie. Co więcej, nie można wykluczyć potencjalnego wpływu FGF2 na specyfikację losu36. Aby obejść te ograniczenia, użyliśmy hodowli komórkowych o dużej gęstości, które wspierają proliferację zarówno komorowych (eksprymujących Pax6), jak i podkomorowych (wyrażających ekspresję Tbr2) korowych komórek progenitorowych15. Co więcej, obserwacja tych kultur w czasie rzeczywistym wykazała, że kilka cech progresji linii NSC jest odtwarzanych w tych warunkach, takich jak między innymi sposób podziału komórek, wydłużenie cyklu komórkowego, potencjał pojedynczych komórek do generowania neuronów i gleju3,15. Ostatnio użyliśmy również tego systemu, aby pokazać, że sygnalizacja CREB wpływa na przeżycie komórek niedojrzałych neuronów kory mózgowej u myszy37. Dlatego uważamy, że wideomikroskopia poklatkowa pierwotnych mysich komórek kory mózgowej hodowanych w dużej gęstości jest potężnym i dostępnym narzędziem do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów progresji cyklu komórkowego, sposobu podziału komórek, przeżycia komórek i specyfikacji losu komórki. To ostatnie można osiągnąć przy użyciu transgenicznych zwierząt, co pozwala na identyfikację określonych losów komórek w czasie rzeczywistym38,39,40 lub za pomocą immunocytochemii po obrazowaniu3,38,41,42.
Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół przygotowania pierwotnej hodowli komórek kory mózgowej, wspierającej proliferację NSC i późniejszą generację neuronów i komórek makroglejowych. Omawiamy również zastosowanie transfekcji za pośrednictwem retrowirusa do manipulowania ekspresją genów pojedynczych komórek, które można zidentyfikować i śledzić na poziomie pojedynczej komórki za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo. Protokół ten może być wykorzystany do badania pierwotnych komórek kory mózgowej wyizolowanych od początku do końca kortykogenezy u gryzoni, ale może być wymagane kilka korekt zgodnie z stage14. NSC wyizolowane z innych źródeł mogą być również badane za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo kultur 2D, ale odpowiedni system hodowli powinien być określony poprzez porównanie zachowań komórek in vitro i in vivo38,43.

<table><tbody><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Zmodyfikowane podłoże orła (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>anty-MAP2, mysz</td><td>Sigma</td><td>M4403</td><td></td></tr><tr><td>anty-GFP kurczak</td><td>Aves</td><td>0511FP12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysz alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-kurczak alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTt</td><td>ETH Zurych</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop obserwatora komórkowego</td><td>Pipeta Pasteura Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td></td><td></td><td></td></tr> Oprogramowanie <tr><td></td> PBS <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The Tracking Tool (tTt)</td><td>link do</td><td>pobrania</td> https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html <td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2d

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Podczas rozwoju kory mózgowej, komórki progenitorowe przechodzą kilka rund symetrycznych i asymetrycznych podziałów komórkowych w celu wytworzenia nowych progenitorów lub neuronów postmitotycznych. Później niektórzy przodkowie przechodzą na los glejogeniczny, dodając do populacji astrocytów i oligodendrocytów. Za pomocą wideomikroskopii poklatkowej kultur komórkowych pierwotnej kory mózgowej możliwe jest badanie mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących tryb podziału komórek i parametry cyklu komórkowego komórek progenitorowych. Podobnie, los komórek postmitotycznych można badać za pomocą specyficznych dla komórki fluorescencyjnych białek reporterowych lub immunocytochemii po obrazowaniu. Co ważniejsze, wszystkie te cechy mogą być analizowane na poziomie pojedynczej komórki, co pozwala na identyfikację komórek progenitorowych zaangażowanych w generowanie określonych typów komórek. Manipulacja ekspresją genów może być również przeprowadzana za pomocą transfekcji za pośrednictwem wirusa, co pozwala na badanie zjawisk autonomicznych i nieautonomicznych komórek. Wreszcie, zastosowanie fuzyjnych białek fluorescencyjnych pozwala na badanie symetrycznego i asymetrycznego rozkładu wybranych białek podczas podziału oraz korelacji z losem komórek potomnych. W tym miejscu opisujemy metodę wideomikroskopii poklatkowej do obrazowania pierwotnych komórek mysich kory mózgowej przez okres do kilku dni i analizy sposobu podziału komórek, długości cyklu komórkowego i losu nowo wygenerowanych komórek. Opisujemy również prostą metodę transfekcji komórek progenitorowych, która może być zastosowana do manipulowania interesującymi genami lub po prostu oznaczania komórek białkami reporterowymi.

Pierwotne hodowle komórek kory mózgu izolowane z embrionów E14 zawierają zarówno komórki progenitorowe, jak i neuronalne. W okresie obrazowania progenitory przechodzą kilka rund podziałów komórkowych, co zwiększa liczbę komórek (Rysunek 5 i Wideo Rysunek 1).
Transfekcja retroviralna kilku komórek progenitorowych ułatwia identyfikację klonów komórkowych (Rysunek ...

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie do badania zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym. W tym miejscu opisujemy protokół wideomikroskopii poklatkowej pierwotnych komórek kory mózgowej, który umożliwia szczegółowe badanie faz odgrywanych podczas progresji linii od pierwotnych nerwowych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i gleju.

Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest obserwacja zachowań komórek podczas progresji linii komórkowych od neuralnych komórek macierzystych do neuronów lub komórek glejowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu neurorozwoju, takie jak rola symetrycznych i asymetrycznych podziałów komórkowych, wydłużanie cyklu komórkowego oraz tempo wzrostu komórek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji linii komórkowych przez długie okresy czasu.Pozwala to na obserwację przejścia z neurogenezy w gliogenezę w obrębie jednej linii komórkowej oraz na bezpośrednie porównanie sublinearnych progenitorów neuronalnych i glejowych. Należy rozpocząć od usunięcia mózgów z 5 do 10 embrionów e14 do szalki Petriego z zimnym medium do sekcji. Za pomocą pęsety należy ostrożnie usunąć skórę oraz czaszkę i wyizolować mózgi.Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym użyć pęsety anatomicznej, aby usunąć opony mózgowe. Następnie przeciąć telencephalon w połowie, aby rozdzielić półkule. Aby wyizolować grzbietowo-boczną część telencephalonu, należy naciąć wzdłuż krzywizny grzbietowo-przyśrodkowej oraz granicy między pallium a subpallium.Przenieś grzbietowo-boczne części telencefalonu do probówki o pojemności 2 mL z medium do sekcji, utrzymując je na lodzie do czasu wysekcjonowania wszystkich mózgów. Po mikrodysekcji grzbietowo-bocznej części telencefalonu umieść tkankę w stożkowej probówce o pojemności 15 mL. Następnie odwiruj probówkę z zebraną tkanką w zimnym medium do sekcji przez pięć minut w temperaturze 4 °C przy 340 ×g, aby wytrącić tkankę.Po wirowaniu usunąć nadosad za pomocą pipety i dodać 1mL 0,05% Trypsyny-EDTA o temperaturze 37°C w celu trawienia chemicznego. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37°C. Po inkubacji dodać 2mL pożywki do proliferacji, aby zahamować aktywność trypsyny.Następnie należy wypolerować końcówkę szklanej pipety Pasteura nad palnikiem gazowym lub palnikiem Bunsena przez kilka sekund, aby lekko zwęzić otwór. Należy zassać FCS, aby pokryć końcówkę pipety. Następnie komórki należy rozdzielić mechanicznie za pomocą wypolerowanej i pokrytej FCS pipety Pasteura, pipetując w górę i w dół, uważając przy tym, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza.Odwiruj zdysocjowane komórki przez pięć minut w temperaturze 4 °C przy 340 ×g. Usuń nadsącz za pomocą pipety, następnie dodaj 1 ml medium proliferacyjnego i resuspenduj komórki za pomocą pipety. Usuń PBS z płytki wstępnie potraktowanej Poly-D-Lysine. Następnie narysuj na dnie płytki znak, który posłuży jako punkt odniesienia do wyznaczenia punktu zero.Po ponownym zawieszeniu komórek w pożywce do proliferacji, przygotuj rozcieńczenie zawiesiny komórkowej w stosunku jeden do jednego, używając 0,4% roztworu błękitu trypanu. Nanieś próbkę na szkiełka z komorą licznikową i policz liczbę niebarwionych, żywych komórek. Komórki martwe będą zabarwione na niebiesko.Rozcieńczyć komórki w pożywce do proliferacji, aby uzyskać stężenie 10⁶ komórek na milimetr. Do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej dodać 500 µL zawiesiny komórkowej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C oraz 5% CO2. Aby obrazować komórki transdukowane retrowirusem, umieścić płytkę do hodowli tkankowej w komorze obrazującej połączonej z kontrolerami temperatury i CO2, aby utrzymać komórki w stałych warunkach 37 °C i 5% CO2.Wybierz punkt w osi xy, który będzie służył jako punkt zerowy, a następnie przeprowadź kalibrację punktu zerowego. Wybierz od 10 do 15 pozycji na każdą studzienkę do obrazowania przy 10-krotnym powiększeniu. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby obrazy w kontraście fazowym były rejestrowane co pięć minut, a obrazy fluorescencyjne co trzy godziny w celu zmniejszenia fototoksyczności.Sprawdzać i korygować ostrość w ciągu pierwszych trzech godzin eksperymentu, ponieważ może ona ulec zmianie podczas wyrównywania temperatury. Po siedmiu dniach przerwać akwizycję obrazów i przystąpić do immunocytochemii po obrazowaniu. Uruchomić oprogramowanie do śledzenia komórek i wybrać nazwę użytkownika.Kliknij wybór nazwy użytkownika i kontynuuj. Przejrzyj i wybierz folder roboczy tTt, aby zapisać drzewa genealogiczne, statystyki i wyeksportowane obrazy. Następnie wybierz eksperyment do analizy i wczytania.Jeśli obrazy zostały wcześniej przekonwertowane za pomocą konwertera tTt, kliknij log file converter i określ liczbę sekund między dwoma kolejnymi punktami czasowymi w oknie konwertera plików dziennika. Kliknij convert log files for whole experiment. Wybierz i załaduj żądane obrazy ręcznie lub korzystając z opcji wyświetlanej w programie.Wybierz plik, otwórz, nowa kolonia. Kliknij śledzenie, a następnie rozpocznij śledzenie, aby rozpocząć proces śledzenia w wybranej pozycji. Pojawi się okno filmu.Wybierz komórkę za pomocą okręgu śledzącego i naciśnij klawisz zero. Oprogramowanie przejdzie do następnej klatki. Kontynuuj pozycjonowanie okręgu śledzącego wokół śledzonej komórki za pomocą myszy i klikaj zero w każdej klatce, aby dodać znacznik śledzenia na komórce.Użyj klawiszy jeden i trzy, aby przejść do poprzedniej lub następnej klatki. Aby usunąć znacznik śledzenia, kliknij w odpowiednią pozycję i naciśnij zero. Jeśli komórka uległa podziałowi, wybierz tracking, stop reason, division, a następnie kontynuuj śledzenie jednej komórki potomnej, wybierając jedną z komórek w oknie edytora komórek, a następnie wybierz tracking, start tracking.Aby śledzić drugą komórkę potomną, należy zaznaczyć ją w edytorze komórek i nacisnąć klawisz F2. Jeśli komórka obumarła podczas mikroskopii wideo, należy wybrać opcję apoptosis. Jeśli komórka opuści pole obserwacji lub wymiesza się z sąsiednimi komórkami, co uniemożliwia śledzenie, należy wybrać opcję lost. Aby przerwać śledzenie i kontynuować je później, należy kliknąć interrupt.W oknie edytora komórek podczas śledzenia zostanie wygenerowane drzewo. Aby zapisać drzewo linii komórkowych, należy wybrać w oknie edytora komórek opcję plik, zapisz, aktualne drzewo. Aby wyeksportować film wraz z danymi śledzenia, wyłącz tryb śledzenia, a następnie w oknie filmu wybierz eksportuj film.Ustaw zakres klatek formatu, liczbę klatek na sekundę oraz przepływność bitową. Kliknij start eksportu. Poniższe fotomikrografie przedstawiają kontrast fazowy w obrazach fluorescencyjnych GFP hodowli pierwotnej komórek kory mózgowia.Ekspresja GFP nie występuje podczas pierwszych godzin obrazowania. Liczba komórek wykazujących ekspresję GFP wzrasta w czasie, a intensywność fluorescencji GFP rośnie, co wskazano żółtą strzałką na tych obrazach. Ten obraz o większym powiększeniu, przedstawiający obszar zaznaczony ramką na poprzednim zdjęciu, ukazuje szczegółowo komórki z ekspresją GFP.Te obrazy w kontraście fazowym przedstawiają przykład podziału komórki. Widoczne jest tutaj zaokrąglenie komórki progenitorowej, a następnie zwężenie błony komórkowej i na koniec zakończenie mitozy. Jest to przykład drzewa linii pojedynczej komórki.Kolorowe strzałki wskazują różne tryby podziału komórek: symetryczny podział proliferacyjny jest zaznaczony żółtą strzałką, podział asymetryczny niebieską strzałką, a symetryczny podział terminalny czerwoną strzałką; znak X oznacza śmierć komórki.Liczby wskazują długość cyklu komórkowego komórek progenitorowych. Technika ta może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykazać zachowanie komórek podczas progresji linii komórkowych od komórek macierzystych do neuronów lub komórek glejowych.

live-imaging-primary-cerebral-cortex-cells-using-2d-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hodowli neuronów korowych szczura w obecności warstwy zasilającej z gleju. Hodowane neurony wykazują polaryzację i tworzą synapsy; mogą zostać one oddzielone od gleju w celu wykorzystania w różnych zastosowaniach, takich jak elektrofizjologia, obrazowanie wapnia, testy przeżywalności komórek, immunocytochemia oraz izolacja RNA/DNA/białek.

Bilaminarna kokultura pierwotnych neuronów korowych i gleby szczura

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Ten film demonstruje protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek kory mózgowej z grzbietowo-bocznego kresomózgowia embrionów myszy.

Izolacja i hodowla komórek z zarodka myszy Grzbietowo-boczne kresomózgowie

Źródło: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronów. J. vis. exp. (2017){{}} . Film przedstawia proces przygotowania, obrazowania i śledzenia dorosłych nerwowych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w celu zbadania zachowań komórek, w tym podziału i różnicowania.

 Obrazowanie na żywo i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania linii neuronalnej w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych

Źródło: Landeira, BS,  i wsp., Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej przy użyciu systemu hodowli 2D. J. Vis. Exp. (2017)Film demonstruje zastosowanie obrazowania poklatkowego do śledzenia znakowanych fluorescencyjnie progenitorów kory mózgowej, monitorowania ich podziału i różnicowania oraz badania rozwoju linii w pierwotnych komórkach kory...

Obrazowanie poklatkowe transfekowanych pierwotnych komórek kory mózgowej myszy

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Poznaj metodę obrazowania na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej w systemie hodowli 2D. Technika ta umożliwia śledzenie postępowania linii komórkowych od komórek macierzystych do neuronów i komórek glejowych.

Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D

Przeglądaj więcej filmów