Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego fenotypowania drożdży jest badanie przesiewowe białek, które uniemożliwiają trwałą pamięć fenotypową o przekazanej ekspresji, jako wskaźnik zastępczy dla dziedziczenia opartego na białkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie prionów drożdżowych, takie jak liczba białek może nielegalnie dziedziczyć tego typu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można w bezstronny sposób badać wiele białek i szlaków.

Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania odpowiednich komórek drożdży na 96-dołkowej płytce w temperaturze 30 stopni Celsjusza, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Sprawdź wzrokowo kultury, aby potwierdzić, że kultury są nasycone, komórki powinny być widoczne gołym okiem, na dnie każdej studzienki. Użyj robota do obsługi cieczy, aby przygotować 384 płytki dołkowe, zawierające 45 mikrolitrów odpowiedniego podłoża na studzienkę.

Najpierw dozuj Scal-URA do studzienek płytki 384-dołkowej. Następnie dozuj Scal-URA plus interesujący nas stresor do studzienek drugiej płytki, 20 milimolów chlorku manganu jest używane jako stresor w tym eksperymencie. Po trzecie, dozuj SD-URA, który nie wywoła ekspresji plazmidu, oraz chlorek manganu na inną płytkę.

Opuść 96-dołkową płytkę zawierającą kultury na robota do obsługi cieczy i zaszczepij od jednego do czterech zestawów po jednym mikrolitrze z każdej studzienki 96-dołkowej płytki do czterech oddzielnych dołków każdej płytki 384-dołkowej wypełnionej innym podłożem. Natychmiast umieścić płytki z komórkami na układarce mikropłytek w temperaturze pokojowej i atmosferycznym dwutlenku węgla. Ustaw protokół na 72-godzinną ciągłą pętlę, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek.

Po pomiarach wzrostu przenieś jeden mikrolitr na studzienkę kultur indukowanych SCal-URA, które doświadczyły nadekspresji białka, na nowe płytki 384-dołkowe, zawierające 45 mikrolitrów na studzienkę pożywki ST-URA, która nie pozwala na ekspresję białka plazmidu. Równolegle należy przeprowadzić analogiczne inokulacje drugiego zestawu 384-dołkowej płytki zawierającej 45 mikrolitrów na studzienkę ST-URA z kultur, które były hodowane w ST-URA w obecności stresora. Umieść płytki w wilgotnej komorze i hoduj płytki przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza do nasycenia.

Po 48 godzinach użyj płytek do ponownego zaszczepienia jednego mikrolitra na studzienkę w 384 dołkach zawierających 45 mikrolitrów na studzienkę ST-URA. Następnie należy przeprowadzić oddzielną ponowną inokulację jednego mikrolitra na studzienkę z tej samej płytki źródłowej do oddzielnej płytki 384-dołkowej zawierającej 45 mikrolitrów na studzienkę ST-URA ze stresorem. Natychmiast umieść płytki z komórkami mikrostackera w temperaturze pokojowej i atmosferycznym dwutlenku węgla i ustaw protokół na 48-godzinną ciągłą pętlę, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek.

Po zakończeniu pomiarów wzrostu użyj oprogramowania czytnika płytek, aby wyeksportować czas w funkcji gęstości optycznej przy pomiarach 600 nanometrów jako tabelę XY. Zgrupuj kolumny pomiarów gęstości optycznej dla każdej kontrpróby biologicznej i oblicz średnią. Utwórz wykres XY czasu w funkcji gęstości optycznej przy 600 nanometrach, aby wygenerować krzywe wzrostu.

W przypadku kultur, które wybrały znaczące różnice we wzroście w odpowiedzi na dany stresor, w zależności od nadmiernej ekspresji białka przodków, należy pobrać jeden mikrolitr z każdej repliki biologicznej, rozcieńczyć w 10 mililitrach wody, a następnie umieścić 50 mikrolitrów na płytkach zawierających 5-FOA. Rośnie w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni. Jeśli spowoduje to zbyt wiele lub zbyt mało kolonii na płytkę, należy odpowiednio dostosować współczynnik rozcieńczenia.

Idealne jest od 100 do 200 kolonii na płytkę. Wybierz od ośmiu do 32 pojedynczych kolonii za pomocą wykałaczek do autoklawu i przypnij je do 96 dołków zawierających 150 mikrolitrów SDCSM na studzienkę. Umieść płytki w nawilżonej komorze i rośnij do nasycenia przez 48 do 72 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Użyj tych kultur do zaszczepienia dwóch nowych zestawów 96-dołkowych płytek zawierających 150 mikrolitrów na studzienkę SDCSM, zarówno z stresorem, jak i bez niego. Umieść płytki na układarce mikropłytek i ustaw protokół tak, aby mierzył gęstość optyczną przy 600 nanometrach w 48-godzinnej pętli ciągłej. Po 48 godzinach przeanalizuj dane, jak pokazano wcześniej i potwierdź, że znaczące różnice we wzroście obserwowane wcześniej utrzymują się po utracie plazmidu.

Komórki, które utrzymują indukowane fenotypy, są następnie testowane pod kątem klasycznych cech dziedziczenia opartego na białkach, jak opisano w protokole tekstowym. To badanie przesiewowe dziedziczenia oparte na białkach ujawniło przejściową nadekspresję otwartej ramki odczytu PSP1, napędza oporność na chlorek manganu, która utrzymywała się przez setki pokoleń w komórkach, długo po ustaniu nadmiernej ekspresji. Algorytmy predykcyjne prionów oceniły koniec PSP1 jako umiarkowanie podobny do prionu.

W przeciwieństwie do tego, algorytmy nie przewidziały praktycznie żadnych istotnych cech sekwencji podobnej do prionów z większości indukujących białek odzyskanych na ekranie, jak wykazano w tej reprezentatywnej analizie. Pomiary wzrostu szczepów i SDCSM z chlorkiem manganu, znormalizowane do odpowiedniej naiwnej kontroli PSP1 minus, wykazały, że hamowanie disaggregazy HSP104 nie upośledza zależnej od PSP1 oporności chlorku manganu, podczas gdy usunięcie białka opiekuńczego HSP70 i genu PSP1 dziedzicznie eliminuje ten fenotyp. Wszystkie zarodniki z pojedynczych tetrad krzyżówek między szczepami, posiadające stan fenotypowy zależny od PSP1 i szczepy naiwne, wykazują oporność na chlorek manganu, co wskazuje na niemendlowskie dziedziczenie fenotypu.

Porównanie zakaźności dla transformacji białek między imitowanymi lizatami a lizatami PSP1 zawierającymi lizaty jako materiał zakaźny wykazało, że ponad 53% naiwnych komórek transformowanych za pomocą wysiewanego PSP1 otrzymało odpowiedni fenotyp odporności na chlorek manganu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku tygodni, w tym etapy inkubacji, a przygotowanie większości etapów badań przesiewowych można wykonać w mniej niż dwie godziny dziennie, nawet przy dużej liczbie płytek. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby wcześniej dokładnie zaplanować, co chce się przetestować i pamiętać o skali eksperymentu.

Jest to szczególnie ważne dla początkujących w tej technice. Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak te opisane w protokole tekstowym, w celu określenia, czy fenotypy zaobserwowane w badaniu przesiewowym wykazują prawdziwy, podobny do prionów wzór dziedziczenia. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie epigenetyki do zbadania zakresu biologii prionów w CI usługi sakralnej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować wysokoprzepustowe badanie przesiewowe dla nowych form dziedziczenia opartego na białkach u drożdży, zarówno w sposób bezstronny, jak i ukierunkowany.

Nie zapominaj, że niektóre stresory chemiczne, takie jak czynniki uszkadzające DNA, mogą być niezwykle niebezpieczne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.