Name: Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę przesiewową białek dziedziczących w drożdżach S. cerevisiae. Technika pozwala identyfikować białka wywołujące trwałą pamięć fenotypową w sposób niezależny od uprzednich założeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sohini Chakrabortee, Sandrze Jones, Davidowi Garcii, Bhupinderowi Bhullarowi, Amelii Chang, Richardowi She, i Susan Lindquist za pomoc w opracowaniu testów użytych w tym artykule, a także recenzentom za ich przemyślane komentarze.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwsze priony drożdży zostały zidentyfikowane na podstawie ich niezwykłych fenotypów i kłopotliwych wzorców dziedziczenia. Charakterystykę tych prionów wykorzystano następnie do zbudowania algorytmów i narzędzi obliczeniowych do badań przesiewowych w poszukiwaniu dodatkowych białek prionowych. Opisana tutaj metoda jest natomiast eksperymentalna i opiera się na przejściowej nadekspresji w celu wytworzenia trwałej zmiany - stabilnego stanu - kodowanego w konformacji białka. Jeśli jednak skuteczność "wysiewu" składania pr...

Systemy biologiczne często doświadczają przejściowych wahań obfitości białka. Nie jest jasne, czy mają one trwały wpływ na kształtowanie fenotypu organizmu lub przyszłych pokoleń. Najbardziej znane przykłady tej biologii obejmują rzadką klasę białek, priony, które napędzają pojawienie się cech dziedzicznych bez modyfikacji genomu. Zamiast tego, te proteinaceous i infectious cząstki przenoszą fenotypy poprzez samonapędzające się zmiany w konformacji białek1,2. Ten rodzaj dziedziczenia został odkryty jako przyczyna niezwykłych wzorców dziedziczenia wyniszczającej choroby neurodegeneracyjnej. Jednak badania na organizmach od grzybów po ssaki3,4,5,6,7,8,9,10 ujawniły, że pierwiastki podobne do prionów mogą nadawać wartość adaptacyjną. Niemniej jednak priony są postrzegane jako fascynująca, ale rzadka osobliwość biologiczna.
Ta dominująca mądrość jest częściowo utrzymywana, ponieważ charakterystyka dziedziczenia opartego na białkach od dawna jest ograniczona przez mały zestaw przykładów. Niedawne systematyczne badania przesiewowe znacznie poszerzyły ten obraz, identyfikując kilka nowych bona fide prionów11 i prawie dwa tuziny domen białkowych12 o zdolności do napędzania konwersji konformacyjnej podobnej do prionów. Ponieważ jednak podejścia te generalnie koncentrowały się na silnych odchyleniach sekwencji aminokwasów, odkryte priony mają wspólne właściwości biochemiczne prionów drożdży założycielskich [PSI+]13,14, [URE3]15, oraz [RNQ+]11,16. Należą do nich: 1) domeny modułowe, które są bogate w długie odcinki polimerowe asparaginy (N) i glutaminy (Q), 2) składanie się w konformację amyloidu [PRION+]17,18,19, oraz 3) całkowite poleganie na funkcji disaggregazy Hsp104 w celu wiernego rozmnażania od matki do córki13,20,21. Rzeczywiście, wiele prionów działających w dobrej wierze, w tym [GAR+], [Het-s], a nawet oryginalny prion (PrPSc), zostałoby pominiętych przy tak rygorystycznych kryteriach. Być może ważniejsze jest to, że nie byliby w stanie uchwycić żadnych nowych mechanizmów dziedziczenia opartego na białkach22. Tak więc prawdziwy biologiczny zakres takich zjawisk może być znacznie bardziej powszechny w przyrodzie, niż wcześniej zakładano.
Aby zbadać to pytanie, zastosowano strategię o wysokiej przepustowości obejmującą cały proteom. Cechą charakterystyczną wszystkich prionów, w tym PrPSc, [GAR+] i [Het-s], jest to, że przejściowa nadekspresja białek przyczynowych silnie zwiększa szybkość pozyskiwania prionów15,23,24,25,26. Wykorzystaliśmy tę cechę, aby systematycznie pytać, w całym drożdżowym ORFeome, czy stabilne stany epigenetyczne oparte na białkach mogą być inicjowane przez przejściowe indukowanie nadekspresji poszczególnych białek. Powszechnie wiadomo, że nadekspresja białek może zmieniać fenotypy27. Jednak białka prionowe są niezwykłe, ponieważ ich tymczasowa nadprodukcja powoduje zmianę fenotypu, która jest dziedziczna przez wiele setek pokoleń po początkowej nadekspresji. Wcześniej wykorzystaliśmy tę cechę, a także niezwykłe wzorce dziedziczenia elementów genetycznych opartych na białkach, aby zidentyfikować dziesiątki białek, które są zdolne do dziedzicznego ponownego okablowania krajobrazów fenotypowych bez zmiany genome28. Chociaż niektóre zidentyfikowane białka były wcześniej znane jako priony, większość nie była, co podkreśla siłę tego podejścia w odkrywaniu nowych form dziedziczenia opartego na białkach.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>chlorek manganu</td><td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>bromek etydyny</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>kwas 5-fluoroorotyczny</td><td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 LYS2 met15&Delta; 0 ura3 i Delta; 0)</td><td>Winston i wsp., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Szczep drożdży</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha; (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 lys2&Delta; 0 MET15 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston i wsp., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Szczep drożdży</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz i wsp., 2014b</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid FLEXGene biblioteka</td><td>Hu i wsp., 2007</td><td>Nie dotyczy</td><td>Biblioteka plazmidów</td></tr><tr><td>Dekstroza (glukoza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Rafinoza</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>Składnik mediów</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Naukowy</td><td>BP1422-2</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>pepton</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>baktopepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>Składnik podłoża</td></tr> drożdże zasada <tr><td>azotowa bez aminokwasów</td><td>BD</td><td>291920</td> Składnik <td>podłoża</td></tr><tr><td>agar</td><td>IBI Scientific IB49172</td><td></td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Siarczan adeniny</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Histydyna</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>RNaza I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowana enzymatyczna DNaza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzymatyka</td></tr><tr><td>zymoliaza 100T (enzym lityczny drożdży)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Czytnik</td></tr><tr><td>mikropłytek</td><td>enzymatycznych BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Układarka do mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>BioStack3</td><td>Tabliczka sprzętowa</td></tr><tr><td> napełniacz</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Robot do obsługi cieczy</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Sprzęt</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Kodowanie informacji biologicznej, która jest dostępna dla przyszłych pokoleń, zazwyczaj odbywa się poprzez zmiany w sekwencji DNA. Długotrwałe dziedziczenie zakodowane w konformacji białka (a nie w sekwencji) od dawna było postrzegane jako zmiana paradygmatu, ale rzadkie. Najlepiej scharakteryzowanymi przykładami takich elementów epigenetycznych są priony, które posiadają zachowanie samoorganizujące się, które może napędzać dziedziczną manifestację nowych fenotypów. Wiele archetypowych prionów wykazuje uderzające odchylenie sekwencji bogatej w N/Q i łączy się w fałd amyloidowy. Te niezwykłe cechy stanowiły podstawę dla większości badań przesiewowych mających na celu zidentyfikowanie nowych białek prionowych. Jednak co najmniej trzy znane priony (w tym prion założycielski, PrPSc) nie posiadają tych cech biochemicznych. W związku z tym opracowaliśmy alternatywną metodę badania zakresu dziedziczenia opartego na białkach w oparciu o właściwość działania masowego: przejściowa nadekspresja białek prionowych zwiększa częstotliwość, z jaką uzyskują one konformację samoczynną. W artykule opisano metodę analizy zdolności drożdży ORFeome do wywoływania dziedziczenia na podstawie białek. Korzystając z tej strategii, odkryliśmy wcześniej, że >1% białek drożdży może napędzać pojawienie się cech biologicznych, które są długotrwałe, stabilne i pojawiają się częściej niż mutacje genetyczne. Podejście to może być stosowane w przypadku wysokiej przepustowości w całym ORFeomes lub jako ukierunkowany paradygmat przesiewowy dla określonych sieci genetycznych lub bodźców środowiskowych. Tak jak genetyczne badania przesiewowe definiują liczne szlaki rozwojowe i sygnałowe, tak techniki te zapewniają metodologię badania wpływu dziedziczenia opartego na białkach na procesy biologiczne.

Wiadomo, że nadekspresja białek drastycznie zmienia fenotypy komórkowe27. W rzeczywistości, stosując podejście oparte na wstępnym przesiewie, przy użyciu zaledwie dziesięciu stresorów odtworzono powtarzalnie setki nowych fenotypów wynikających z nadekspresji klonów z ORFeomu drożdży. Opisane powyżej testy pozwalają jednak ocenić, czy komórki zachowują jakiekolwiek długotrwale stabilne fenotypy po tej nadekspresji. Jednym z białek zdolnych do zakodowania takiego sta...

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego fenotypowania drożdży jest poszukiwanie białek wywołujących trwałą pamięć fenotypową po ustąpieniu ekspresji, co służy jako wskaźnik dziedziczenia opartego na białkach. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie prionów drożdżowych, takie jak liczba białek zdolnych do wywoływania tego typu dziedziczenia. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezstronnego przesiewania wielu białek i szlaków sygnałowych.Rozpocznij tę procedurę od hodowli odpowiednich komórek drożdży w płytce 96-dołkowej w temperaturze 30 °C, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Obejrzyj kultury wizualnie, aby potwierdzić, że są one nasycone; komórki powinny być widoczne gołym okiem na dnie każdego dołka. Użyj robota do obsługi cieczy, aby przygotować płytki 384-dołkowe, zawierające 45 µL odpowiedniego medium na dołek.Najpierw należy nalać Scal-URA do dołków płytki 384-dołkowej. Następnie do dołków drugiej płytki należy nalać Scal-URA wraz z wybranym stresorem; w tym doświadczeniu jako stresor zastosowano 20 millimolar chlorku manganu. Po trzecie, do kolejnej płytki należy nalać SD-URA, który nie indukuje ekspresji plazmidu, wraz z chlorkiem manganu.Umieść płytkę 96-dołkową zawierającą hodowle na robocie do obsługi cieczy i zaszczep w układzie jeden do czterech po 1 µL z każdego dołka płytki 96-dołkowej do czterech oddzielnych dołków w każdej płytce 384-dołkowej wypełnionej innym medium. Natychmiast umieść płytki z komórkami w stosownym magazynie płytek w temperaturze pokojowej i przy atmosferycznym stężeniu dwutlenku węgla. Ustaw protokół na 72-godzinną ciągłą pętlę, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm za pomocą czytnika mikro płytek.Po pomiarach wzrostu przenieś jeden mikrolitr na studzienkę kultur indukowanych w medium SCal-URA, w których wystąpiła nadekspresja białka, na nowe płytki 384-dołkowe zawierające 45 mikrolitrów na studzienkę medium ST-URA, które nie umożliwia ekspresji białka z plazmidu. Równolegle wykonaj analogiczne szczepienia drugiego zestawu płytek 384-dołkowych zawierających 45 mikrolitrów na studzienkę medium ST-URA z kultur hodowanych w medium ST-URA w obecności stresora. Umieść płytki w komorze nawilżanej i inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 30 °C do osiągnięcia stanu nasycenia.Po 48 godzinach wykorzystaj płytki do ponownego zaszczepienia 1 µL na dołek w płytkach 384-dołkowych zawierających 45 µL na dołek pożywki ST-URA. Następnie wykonaj oddzielne ponowne zaszczepienie 1 µL na dołek z tej samej płytki źródłowej do osobnej płytki 384-dołkowej zawierającej 45 µL na dołek pożywki ST-URA z dodatkiem stresora. Natychmiast umieść płytki z komórkami w mikrostackerze w temperaturze pokojowej i przy atmosferycznym stężeniu dwutlenku węgla, a następnie ustaw protokół w ciągłej pętli przez 48 godzin, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm za pomocą czytnika płytek mikrodołkowych.Po zakończeniu pomiarów wzrostu należy użyć oprogramowania czytnika płytek, aby wyeksportować pomiary gęstości optycznej przy 600 nanometrach w funkcji czasu w formie tabeli XY. Pogrupować kolumny pomiarów gęstości optycznej dla każdego powtórzenia biologicznego i obliczyć średnią. Utworzyć wykres XY gęstości optycznej przy 600 nanometrach w funkcji czasu w celu wygenerowania krzywych wzrostu.W przypadku kultur, które wykazały istotne różnice w tempie wzrostu w odpowiedzi na dany stresor, w zależności od nadekspresji białek przodków, pobierz 1 µL z każdego powtórzenia biologicznego, rozcieńcz w 10 mL wody, a następnie wysiej 50 µL na płytki zawierające 5-FOA. Inkubuj w temperaturze 30 °C przez trzy dni. Jeśli w wyniku tego procesu na płytce pojawi się zbyt wiele lub zbyt mało kolonii, odpowiednio dostosuj czynnik rozcieńczenia.Optymalna liczba kolonii na płytce wynosi od 100 do 200. Wybierz od ośmiu do 32 pojedynczych kolonii za pomocą autoklawowanych wykałaczek i przenieś je do płytek 96-dołkowych zawierających 150 µL SDCSM na dołek. Umieść płytki w komorze nawilżonej i inkubuj do osiągnięcia fazy nasycenia przez 48 do 72 godzin w temperaturze 30 °C.Użyj tych kultur do inokulacji dwóch nowych zestawów płytek 96-dołkowych zawierających 150 µL SDCSM na dołek, zarówno z obecnością, jak i bez obecności stresora. Umieść płytki w automatycznym podajniku mikro płytek i ustaw protokół pomiaru gęstości optycznej przy 600 nm w ciągłej pętli przez 48 h. Po 48 h przeanalizuj dane w sposób opisany wcześniej i potwierdź, że istotne różnice w przyroście zaobserwowane wcześniej utrzymują się po utracie plazmidu.Komórki utrzymujące indukowane fenotypy są następnie badane pod kątem klasycznych cech dziedziczenia opartego na białkach, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przesiew pod kątem dziedziczenia opartego na białkach wykazał, że przejściowa nadekspresja ramki odczytującej PSP1 indukuje odporność na chlorek manganu, która była utrzymywana w komórkach przez setki pokoleń, długo po ustąpieniu nadekspresji. Algorytmy przewidujące priony oceniły koniec C-końcowy PSP1 jako umiarkowanie przypominający priony.W przeciwieństwie do tego, algorytmy nie przewidziały niemal żadnych istotnych cech sekwencji przypominających priony w większości białek indukujących odzyskanych podczas przesiewu, co obrazuje ta reprezentatywna analiza. Pomiary wzrostu szczepów i SDCSM z chlorkiem manganu, znormalizowane względem odpowiadającej im kontroli ujemnej PSP1 naiwnej, wskazały, że hamowanie dysagregazy HSP104 nie upośledza zależnej od PSP1 odporności na chlorek manganu, podczas gdy usunięcie chaperonu HSP70 oraz genu PSP1 dziedzicznie eliminuje ten fenotyp. Wszystkie przetrwalniki z pojedynczych tetrad krzyżówek między szczepami posiadającymi zależny od PSP1 stan fenotypowy a szczepami naiwnymi wykazują odporność na chlorek manganu, co wskazuje na niemendlowski charakter dziedziczenia tego fenotypu.Porównanie zakaźności w transformacji białkowej pomiędzy lizatami kontrolnymi (mock) a lizatami zawierającymi PSP1 jako materiałem transmisyjnym wykazało, że ponad 53% naiwnych komórek transformowanych zaszczepionym PSP1 nabyło odpowiadający fenotyp oporności na chlorek manganu. Po opanowaniu techniki, procedurę tę można przeprowadzić w ciągu kilku tygodni, wliczając etapy inkubacji, a przygotowanie większości etapów przesiewowych zajmuje mniej niż dwie godziny dziennie, nawet przy dużej liczbie płytek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wcześniej dokładnie zaplanować zakres testów oraz wziąć pod uwagę skalę eksperymentu.Jest to szczególnie istotne dla osób rozpoczynających naukę tej techniki. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak te opisane w protokole tekstowym, aby ustalić, czy fenotypy zaobserwowane podczas przesiewania wykazują rzeczywisty, prionopodobny wzorzec dziedziczenia. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny epigenetyki do zgłębienia szerokiego zakresu biologii prionów w sacralis service CI. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat projektowania wysokoprzepustowego przesiewania w celu wykrycia nowych form dziedziczenia opartego na białkach u drożdży, zarówno w sposób bezstronny, jak i celowany.Należy pamiętać, że niektóre stresory chemiczne, takie jak czynniki uszkadzające DNA, mogą być niezwykle niebezpieczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej.

high-throughput-screening-for-protein-based-inheritance-s

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Modele proteinopatii drożdży są cennymi narzędziami do oceny toksyczności i agregacji białek związanych z chorobą. W tym miejscu przedstawiamy metody badań przesiewowych bibliotek wariantów Hsp104 pod kątem supresorów toksyczności. Protokół ten można dostosować do badań przesiewowych dowolnej biblioteki białek pod kątem supresorów toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Poznaj wysokoprzepustową metodę przesiewową białek dziedziczących w drożdżach S. cerevisiae. Technika pozwala identyfikować białka wywołujące trwałą pamięć fenotypową w sposób niezależny od uprzednich założeń.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów