Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro
September 18th, 2017
Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.
Ogólnym celem tego przedklinicznego testu funkcjonalnego jest obserwacja i ilościowa ocena potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek macierzystych przeznaczonych do terapii regeneracyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej ukierunkowanej na naczynia krwionośne, takie jak sposób działania i skuteczność kandydatów na terapię komórkową. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona kluczowe elementy środowiska in vivo, zapewniając jednocześnie kontrolę i łatwą ocenę cech testów in vitro.
Implikacje tej nowatorskiej techniki rozciągają się w kierunku terapii komórkowej chorób niedokrwiennych, ponieważ w tej dziedzinie naprawdę brakuje wiarygodnych i łatwych w użyciu testów funkcjonalnych. Tę procedurę zademonstrują Farwah Iqbal, doktorant w moim laboratorium, a także Peter Szaraz, pracownik naukowy w moim laboratorium. Po wyizolowaniu aorty szczura i przygotowaniu pożywki zgodnie z protokołem tekstowym, pokryj 12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, najpierw umieszczając płytki na zimnej powierzchni, takiej jak okład z lodu.
Za pomocą pipet w lodówce dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę świeżo rozmrożonego ekstraktu z błony podstawowej lub BME do dołków płytki. Następnie, aby uniknąć nierównomiernej polimeryzacji BME, szybko zawiruj BME, aby zapewnić równomierne pokrycie. Umieszczenie pokrytych płytek w nawilżonym inkubatorze na 30 minut.
Włóż końcówki pipet o pojemności 1 000 mikrolitrów z powrotem do zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby zmniejszyć zmienność między jednostkami pierścieniowymi spowodowaną resztkami tkanki, umieść aortę w 10-centymetrowym naczyniu z 10 mililitrami świeżego HBSS i użyj dwóch zestawów kleszczy, aby ostrożnie oddzielić nadmiar tkanki łącznej i tłuszczowej. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby oddzielić pozostałe gałęzie tętnic międzyżebrowych połączonych z aortą i usunąć resztki zakrzepłej krwi z wnętrza aorty.
Umieść linijkę lub siatkę pod 10-centymetrową naczynią i za pomocą sterylnego skalpela i kleszczyków precyzyjnie wytnij odcinki aorty o szerokości od jednego do dwóch milimetrów. Aby osadzić pierścienie aortalne w BME po wyjęciu płytek pokrytych BME z inkubatora, użyj kleszczyków, aby ostrożnie podnieść poszczególne pierścienie aortalne i umieścić każdy z nich w środku dobrze pokrytego BME. Użyj schłodzonych końcówek pipet o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby dodać 300 mikrolitrów BME na wierzch każdego pierścienia aortalnego i równomiernie rozprowadzić BME wokół studzienki.
Gdy wszystkie pierścienie aorty zostaną osadzone, włóż je z powrotem do nawilżonego inkubatora na 30 minut. Następnie, po inkubacji, dodać 1 000 mikrolitrów wcześniej przygotowanej pożywki do wzrostu śródbłonka lub EGM, przykładając końcówkę pipety do ścianki dobrze kultury i powoli wydalając roztwór. Następnie inkubuj tkankę przez 24 godziny.
Zastępując pożywkę EGM zawierającą FBS co 48 godzin, należy użyć mikroskopii jasnego pola, aby śledzić rozwój sieci śródbłonka pierścienia aortalnego. Aby przygotować test pierścienia aortalnego, współhodowle MSC po użyciu mikroskopii jasnego pola do zobrazowania sieci śródbłonka szczura na początku badania, zasiaj od 10 do czwartego MSC na każdym osadzonym pierścieniu aortalnym. Utrzymuj co najmniej trzy studzienki pierścieni aortalnych bez MSC dla grupy kontrolnej.
Następnie zwizualizuj fluorescencyjnie znakowane MSCs w teście pierścienia aortalnego. Po 24-godzinnej inkubacji kokultur MSC w teście pierścienia aortalnego, użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby uwidocznić naprowadzanie, wydłużanie i integrację MSC z sieciami śródbłonka. Nakładaj obrazy fluorescencyjne MSC na obrazy komórek śródbłonka w jasnym polu, aby obserwować kolokalizację obu typów komórek.
W trzecim, piątym i siódmym dniu kokultur z mikroskopią jasnego pola zobrazuj sieci pierścieni aorty. Wykorzystaj obrazy do ilościowego określenia wpływu netto kokultur MSC na rozwój sieci śródbłonka. Po tygodniu testu pierścienia aortalnego z kohodowlą MSC, usuń pożywkę hodowlaną i powoli dodaj jeden mililitr PBS do każdej studzienki.
Inkubuj kokultury przez trzy minuty, a następnie usuń bufor przed powtórzeniem płukania jeszcze dwa razy. Dodaj 800 mikrolitrów wstępnie podgrzanego Dispase do każdej studzienki i inkubuj kultury w nawilżonych inkubatorach przez 15 minut. Po inkubacji odpipetować Dispase pięć do 10 razy, aby rozbić VME, i przenieść zawartość każdej studzienki do oddzielnych 15-mililitrowych probówek.
Dodaj 800 mikrolitrów świeżej, wstępnie podgrzanej Dispase do tych samych studzienek i pipetować, aż w basenie hodowlanym nie zaobserwuje się pozostałości BME. Przenieś zawiesiny komórek Dispazy do 15-mililitrowych probówek i użyj końcówek pipet, aby usunąć pierścienie aortalne unoszące się w zawiesinie komórki. Następnie dodać jedną objętość PBS uzupełnioną 3% FBS do zawiesiny komórek Dyspasy w celu inaktywacji Dezpazy.
Wirować zawiesiny komórek 400 razy g przez pięć minut. Ostrożnie usuń supernatant, pozostawiając trzy mililitry zawiesiny komórek w 15-mililitrowej probówce. Dodaj trzy mililitry wstępnie podgrzanej 0,5% trypsyny do zawiesiny komórek i energicznie ponownie zawiesij komórki.
Inkubować trypsynizowane roztwory komórkowe w nawilżanych inkubatorach przez 10 minut. Po inkubacji dodaj sześć mililitrów PBS uzupełnionego 3% FBS i ponownie zawiesij kilka razy. Następnie ponownie odkręć zawiesiny komórek.
Ostrożnie usuń cały supernatant, pozostawiając osad komórek w probówce i użyj jednego mililitra PBS uzupełnionego 3% FBS do ponownego zawieszenia komórek. Ekstrakt z błony podstawnej może utrudnić odzyskanie osadzonych komórek. Jednak leczenie lapazą, a następnie trypsyną, zapewnia wysoką wydajność żywotnych komórek.
Za pomocą sitka komórkowego o średnicy 70 mikronów przefiltruj zawiesinę komórek o wielkości jednego mililitra, aby usunąć zagregowane komórki i resztki BME z zawiesiny komórek. Następnie za pomocą licznika komórek policz komórki w jednym mililitrze zawiesiny komórek. Przeprowadzić cytometrię przepływową i qPCR zgodnie z protokołem tekstowym.
Jak pokazano tutaj, trzy do pięciu dni po osadzeniu pierścieni aorty w ECM istnieje region charakteryzujący się wysoką proliferacją komórek, ale niską organizacją strukturalną w pobliżu tkanki aorty. Rozwinięte sieci śródbłonka o wysokiej organizacji strukturalnej są w pełni rozwinięte i składają się głównie z zamkniętych pętli, nawet przed dodaniem MSC. Rozwijające się sieci znajdują się w dystalnych obszarach kultur śródbłonka i są miejscami migracji komórek śródbłonka i rozwoju nowej struktury.
Po 24 godzinach w kokulturach na obrzeżach rozwijających się sieci śródbłonka znaleziono znakowane HUCPVC FTM, które wykazywały wydłużone morfologie komórek i przyczyniły się do dalszego rozwoju sieci śródbłonka. Dla porównania, BMSC jest domem dla rozwijających się sieci, a jednocześnie wykazuje mniejszą interakcję z komórkami śródbłonka. Obrazy w dużym powiększeniu po 72 godzinach wykazały, że HUCPVC FTM utrzymywały wysoki zasięg i stabilizację sieci śródbłonka, podczas gdy BMSC i kokultury prezentowały morfologie sferyczne z ograniczoną integracją z sieciami śródbłonka.
Wreszcie, na tych obrazach pokazano wstępnie oznaczone HUCPVC FTM przylegające do niebarwionych komórek śródbłonka i zapewniające wsparcie strukturalne, służąc jako oś i powierzchnia mocowania między węzłami. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin czasu praktycznego, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby traktować wszystkie próbki w ten sam sposób i przestrzegać rygorystycznych terminów.
Dotyczy to zarówno ekstraktu z błony podstawnej, jak i tkanki aorty. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy limfocytów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy badane komórki zmieniły swoją mutagenność w środowisku mikronaczyniowym. Po opracowaniu, technika ta umożliwia naukowcom zajmującym się terapią mezenchymalnymi komórkami macierzystymi zbadanie potencjału angiogennego kandydatów na terapię komórkową w sposób wieloraki i ilościowy.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić test pierścienia aortalnego szczura, abyś mógł obserwować i oceniać zachowanie komórek terapeutycznych w rozwoju mikrokrążenia. Nie zapominaj, że praca z pierwotnymi tkankami zwierzęcymi i ludzkimi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak technika aseptyczna i środki ochrony osobistej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nową metodę badania pierścienia aorty, która umożliwia wizualizację komórek mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wchodzących w interakcję z sieciami śródbłonkowymi pochodzącymi z tętnicy aorty szczura. Metoda ta umożliwia ilościową ocenę właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów i ekspresji genów MSC.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Terapia komórkowa
- Angiogenesza
Tło
- Metoda ma na celu ocenę potencjału angiogennego MSC.
- Rozwiązuje kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej ukierunkowanej na układ krążenia.
- Technika naśladuje warunki in vivo, umożliwiając jednocześnie kontrolowane oceny in vitro.
- Niezbędne są niezawodne funkcjonalne testy w dziedzinie terapii komórkowej chorób niedokrwiennych.
Cel badania
- Obserwowanie i ilościowa ocena potencjału angiogennego MSC.
- Ocena sposobu działania i efektywności kandydatów na terapię komórkową.
- Dostarczenie niezawodnego i łatwego w użyciu funkcjonalnego testu do badań.
Zastosowane metody
- Izolacja aorty szczura.
- Przygotowanie medium zgodnie z protokołem.
- Współhodowla przedmarkowanych MSC z sieciami śródbłonkowymi.
- Wizualizacja i ilościowa ocena właściwości sieci.
Główne wyniki
- Udane wizualizowanie dochodzenia i integracji MSC z sieciami śródbłonkowymi.
- Wykonano ilościową ocenę właściwości sieci.
- Osiągnięto ocenę immunofenotypów i ekspresji genów MSC.
- Metoda zapewnia wgląd w efektywność MSC w terapii regeneracyjnej.
Wnioski
- Nowa metoda badania pierścienia aorty jest cennym narzędziem do badania MSC w medycynie regeneracyjnej.
- Ta metoda poprawia zrozumienie zachowania MSC w angiogenezie.
- Ma potencjalne zastosowania w rozwijaniu terapii chorób niedokrwiennych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay provides a quantitative, translatable in vitro model to evaluate the angiogenic potential of mesenchymal stromal cells (MSCs) for regenerative therapy, addressing a critical gap in preclinical functional assays for ischemic disease applications. By enabling visualization of MSC homing, integration with endothelial networks, and assessment of phenotypic and gene expression changes, the method supports mechanistic de-risking and target validation in cell therapy development. The assay’s compatibility with co-culture designs and quantitative readouts enhances predictive confidence in MSC efficacy prior to in vivo studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of MSC mechanisms of action in angiogenesis through direct observation of cell homing, elongation, and network integration.
- Operational Value: Provides a reproducible ex vivo model that excludes inflammatory components while preserving extracellular matrix and supportive stromal cells from host tissue.
- Predictive Value: Quantifies tubular endothelial network formation to assess MSC potency and prioritize candidates based on angiogenic functionality.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized endothelial networks from rat aortic rings that serve as a consistent background for evaluating MSC contributions to tube formation.
- Quantitative Output: Enables measurement of net effects on endothelial network development via bright-field microscopy imaging at defined time points (days 3, 5, 7).
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats, allowing parallel testing of multiple MSC doses or conditions with appropriate controls.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports evaluation of MSC phenotype stability and gene expression following co-culture, linking in vitro findings to potential in vivo behavior.
- Mechanistic De-risking: Differentiates MSC subtypes (e.g., FTM HUCPVCs vs. BMSCs) based on interaction patterns with endothelial networks, informing cell source selection.
- ECM Processing Assessment: Enables evaluation of MSC-mediated extracellular matrix remodeling through post-co-culture cell recovery and analysis workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing functional validation of MSC angiogenic activity after initial target identification and before lead optimization in regenerative medicine programs.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses regarding MSC modes of action in vascular targeting by observing intercellular interactions and network stabilization.
- Screening: Delivers quantitative, microscopy-based readouts on endothelial network development to compare MSC efficacy across conditions.
- Analytics: Generates immunophenotypic and gene expression data via flow cytometry and qPCR following cell recovery, enabling multi-parametric assessment of MSC responses.
- Translational Research: Connects MSC behavior in co-culture to potential angiogenic function in ischemic tissues through pericyte-like interactions and migration patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost platform for repeated use in evaluating diverse MSC sources or genetic modifications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in MSC-mediated angiogenesis by visualizing spatial and temporal dynamics of cell integration.
- Operational Value: Offers a fast, inexpensive setup with hands-on time of approximately four hours, suitable for routine laboratory use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in cell therapy development by providing early functional validation of angiogenic potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of MSC candidates based on quantitative angiogenic output and network integration quality.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary tissue isolation, sterile cell culture, and fluorescence/bright-field microscopy.
- Dependent on consistent preparation of basal membrane extract (BME) and endothelial growth medium (EGM) to ensure reproducible ring embedding and network formation.
- Necessitates standardized timing for medium changes, imaging intervals, and enzymatic dissociation steps to minimize variability.
- Involves optimization considerations when adapting to different MSC sources or genetic labels due to variations in proliferation and integration behavior.
- Limited by the ex vivo nature of the model, which may not fully recapitulate systemic hemodynamic or immune factors present in vivo.
