Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych
7 grudnia 2017
Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.
Ogólnym celem tej metodologii wyciągania nanorurek jest ilościowe zbadanie interakcji między określonymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania a wysoce zakrzywionymi błonami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii błon komórkowych, takie jak endocytoza i transport wewnątrzkomórkowy. Ta technika pozwala nam bezpośrednio określić ilościowo, w jaki sposób białka wiążą się z zakrzywionymi błonami i wzajemnie je deformują.
Początkowo metoda ta była stosowana do pomiaru podstawowych właściwości mechanicznych błon lipidowych. Ostatnio zaczęto go stosować do wyjaśniania ważnych mechanizmów w interakcjach błon białkowych, w szczególności błon kształtujących białka. Zacznij od zebrania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych bezpośrednio z platynowych drutów komory elektroformacyjnej.
Aby zbudować komorę doświadczalną, umieść dwie prostokątne szklane pokrywy oddalone od siebie o jeden milimetr na metalowej podstawie, pozostawiając otwory wzdłuż dłuższych krawędzi wystarczająco duże, aby szklana końcówka mikropipety sięgała co najmniej do środka komory. Napełnij zarówno komorę doświadczalną, jak i szklaną mikropipetę pięcioma miligramami na mililitr wysoce czystego roztworu beta-kazeiny, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Podczas pasywacji komory zamontuj ją na mikroskopie świetlnym wyśrodkowanym nad obiektywem i włóż końcówkę mikropipety aspiracyjnej przez otwór wzdłuż dłuższej krawędzi, aż końcówka znajdzie się nad obiektywem.
Wyregulować poziom wody w zbiorniku tak, aby ciśnienie zasysania było bliskie zeru, a następnie napełnić mikropipetę iniekcyjną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania rozpuszczoną w buforze doświadczalnym o odpowiednim stężeniu doświadczalnym. Zamontuj mikropipetę iniekcyjną wewnątrz mikromanipulatora i włóż mikropipetę przez drugą stronę komory doświadczalnej. Pod koniec inkubacji wyjąć roztwór beta-kazeiny z komory i kilkakrotnie przepłukać komorę buforem doświadczalnym.
Następnie dodaj kilka mikrolitrów roztworu pęcherzyków do komory, a następnie kilka mikrolitrów kulek pokrytych streptawidyną, do końcowego stężenia 0,1 razy 10 do ujemnej 3% szybkości kulek na objętość lub mniej. Po tym, jak pęcherzyki i kulki osiądą na dnie komory, pozwól eksperymentalnemu buforowi odparować przez około 15 minut, w którym to momencie pęcherzyki powinny widocznie falować pod mikroskopem świetlnym. Gdy pęcherzyki są odpowiednio wiotkie, należy zassać poszczególne pęcherzyki do mikropipety do momentu, aż długość błon w pipecie będzie równa lub większa niż promień pipety.
Po zidentyfikowaniu odpowiedniej wielkości języka zasysającego należy uszczelnić otwarte krawędzie komory olejem mineralnym. Aby ustawić pozycję zerową ciśnienia zasysania, umieść koniec pipety zasysającej w pobliżu koralika i wyreguluj wysokość zbiornika na wodę tak, aby kulka nie była ani zasysana, ani zdmuchiwana przez pipetę. Regulacja wysokości wody ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania napięcia błony pęcherzyka, który jest zasysany przez mikropipetę.
Zassać pęcherzyk i przesunąć mikropipetę w górę i rozsunąć ją w kąt, nie przerywając jej działania. Za pomocą pęsety optycznej uwięzić koralik w odległości około 20 mikrometrów od dna komory. Ustaw pęcherzyk z powrotem w ostrości z dala od koralika i wyrównaj z pułapką optyczną, a następnie rejestruj ruch kulki przez jedną do dwóch minut, aby zmierzyć położenie równowagi.
Zmniejsz ciśnienie wewnątrz mikropipety tak bardzo, jak to możliwe, nie tracąc pęcherzyka, aby zmniejszyć napięcie membrany, i ostrożnie doprowadź pęcherzyk do kontaktu ze kulką na około sekundę, aby ustanowić wiązania streptawidyna-biotyna. Następnie za pomocą siłownika piezoelektrycznego delikatnie odciągnij pęcherzyk do tyłu, aby utworzyć nanorurkę. Zwiększ ciśnienie aspiracji, aby odtworzyć język zasysający i wyrównaj rurkę w osi pipety zasysającej.
Ustaw rurkę i pęcherzyk w pełnej ostrości i rejestruj ruch koralika z prędkością akwizycji 30 Hz oraz wysokość zbiornika na wodę w stosunku do pozycji zerowej przez kilka minut pod mikroskopią w jasnym polu. Po uzyskaniu wszystkich obrazów ponownie zarejestruj ruch stopki przy różnych ciśnieniach aspiracji i naprężeniach membrany. Aby wstrzyknąć interesujące nas białka lub cząsteczki, przyłóż mikropipetę do iniekcji w pobliżu nanorurki, uważając, aby koralik w pułapce optycznej nie został zakłócony, i delikatnie wstrzyknij białka pod ciśnieniem od jednego do dwóch paskalów.
Po zrównoważeniu wiązania białek powtórzyć pomiary krokowe w obecności dodanych białek, jak pokazano dla gołej błony. Pomiary siły i promienia na nanorurkach wyciągniętych z pęcherzyków 100% DOPC są niezależne, ponieważ siła jest mierzona na podstawie przemieszczenia kulki w pułapce optycznej, a promień na podstawie intensywności fluorescencji, co zapewnia dwa sposoby obliczania sztywności zginania membrany. Względne wzbogacenie białek BAR lub kanałów potasowych na rurkach błonowych nad leżącymi poniżej pęcherzykami wskazuje, że białka są bardziej skłonne do wiązania się z zakrzywionymi błonami.
Rzeczywiście, wiązanie białka N-BAR endofiliny A2 z błoną stopniowo zmniejsza siłę rurki do zera, co wskazuje na tworzenie trójwymiarowego rusztowania, które utrzymuje rurkę stabilnie. Zgodnie z tą procedurą, inne techniki mogą być łączone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład mikroskopia o wysokiej rozdzielczości w celu wykrycia organizacji białek na rurkach membranowych lub śledzenie pojedynczych cząstek w celu pomiaru ruchliwości białek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę wyciągania nanorurek membranowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania in vitro oddziaływań między białkami a zakrzywionymi membranami. Podejście to umożliwia ilościowe określenie wiązania białek z tymi membranami oraz ocenę ich właściwości mechanicznych, co pozwala lepiej zrozumieć fundamentalne procesy, takie jak endocytoza i transport wewnątrzkomórkowy.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Dynamika błon
- Interakcje białko-błona
Wstęp
- Zrozumienie wpływu białek na krzywiznę błon jest kluczowe dla procesów komórkowych.
- Badanie zakrzywionych błon pomaga odkryć mechanizmy zaangażowane w endocytozę.
- Mechanika błon odgrywa istotną rolę w transporcie wewnątrzkomórkowym.
Zastosowane metody
- Metodyka wyciągania nanotubul do badania oddziaływań białek z zakrzywionymi błonami.
- Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe jako systemy modelowe.
- Pęsety optyczne i mikroskopia do pomiaru właściwości błon.
Główne wyniki
- Ilościowo określono, w jaki sposób białka, takie jak endofilina A2, oddziałują z nanotubulami błonowymi i stabilizują je.
- Wykazano właściwości mechaniczne błon lipidowych poprzez obserwację różnych zachowań.
- Przedstawiono spostrzeżenia na temat preferencyjnego wiązania białek z zakrzywionymi błonami.
Wnioski
- Niniejsze badanie podkreśla znaczenie krzywizny błony w oddziaływaniach białkowych.
- Przedstawiona metoda może wspomóc dalsze badania nad procesami komórkowymi i biologią błon.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia ilościową analizę oddziaływań białek z krzywizną błony, zapewniając wgląd w mechanizmy endocytozy oraz szlaki transportu wewnątrzkomórkowego. Poprzez pomiar wiązania białek z silnie zakrzywionymi błonami oraz ich efektów mechanicznych, metoda ta wspiera walidację celów i zmniejsza ryzyko we wczesnej fazie opracowywania terapeutyków związanych z błoną komórkową. Podejście to zapewnia wysoką pewność w przewidywaniu funkcji białek poprzez powiązanie oddziaływań molekularnych z fenotypami przebudowy błony.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie wiązania białek z zakrzywionymi błonami oraz ich wzajemnej deformacji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar stabilizacji błony indukowanej przez białka, takiej jak redukcja siły do zera przez endofilinę A2.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację białek, które preferencyjnie wiążą się z błonami o wysokiej krzywiźnie, co wskazuje na istotność mechanistyczną w procesie tworzenia pęcherzyków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy białko-membrana do dalszego przesiewu, umożliwiając jednoczesny pomiar krzywizny membrany, napięcia oraz powierzchniowej gęstości białek.
- Wyniki ilościowe: Generuje pomiary siły i promienia na podstawie przesunięcia w pułapce optycznej oraz intensywności fluorescencji, zapewniając podwójne odczyty do obliczeń sztywności zgięciowej.
- Powtarzalność: Standaryzuje kontrolę napięcia membrany poprzez aspirację mikropipetą i kalibrację pozycji zerowej, zapewniając spójne tworzenie się nanorurek w różnych eksperymentach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje zakrzywione struktury komórkowe, takie jak szyjki endocytyczne, łącząc oddziaływania białko-błona z szlakami transportu zaangażowanymi w zaburzenia neurodegeneracyjne i metaboliczne.
- Ciągłość translacyjna: Przenosi odkrycia in vitro do kontekstów komórkowych, umożliwiając dalsze badania z wykorzystaniem mikroskopii wysokiej rozdzielczości i śledzenia pojedynczych cząsteczek w celu oceny organizacji i mobilności białek na nanorurkach.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie wpływu białek na mechanikę błony, co zmniejsza niepewność w procesie ograniczania ryzyka mechanistycznego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta, stosowana na etapie biologii odkrywczej, umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych przed przejściem do identyfikacji związków wiodących oraz walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Badanie sposobu, w jaki konkretne białka wykrywają lub indukują krzywiznę błony, co pozwala wyjaśnić ich role w endocytozie i transporcie wewnątrzkomórkowym.
- Przesiewanie: Dostarcza systemów gotowych do analizy o zstandaryzowanej krzywiźnie i napięciu, umożliwiając wiarygodną ocenę związków lub białek.
- Analityka: Zapewnia odczyty siły, promienia i intensywności fluorescencji, które pozwalają na ilościowe określenie sztywności zginania błony oraz stopnia wzbogacenia białek w nanorurkach.
- Badania translacyjne: Łączą się z pracami przedklinicznymi poprzez umożliwienie korelacji wiązania białko-błona in vitro z lokalizacją i dynamiką komórkową.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania różnych białek w wielu projektach, co ogranicza redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w oddziaływaniach białko-błona.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu pęcherzyków, kontroli napięcia oraz pomiarowi właściwości nanorurek w trybie dualnym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o ilościowe dane dotyczące wiązania białek zależnego od krzywizny.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów związanych z błoną w ujęciu skorygowanym o ryzyko, łącząc charakterystykę wiązania z funkcjonalnym przebudowaniem błony.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikromanipulacji, pęset optycznych i mikroskopii fluorescencyjnej w celu wyciągania nanorurek i wstrzykiwania białek.
- Zależy od specjalistycznej aparatury, w tym aspiratorów do mikropipet, aktuatorów piezoelektrycznych i systemów konfokalnych do jednoczesnych pomiarów naprężenia, krzywizny i gęstości białek.
- Wymaga standaryzacji warunków buforu, protokołów przygotowania pęcherzyków oraz strategii znakowania białek pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy rozszerzaniu metody na różne składy lipidowe lub układy białkowe, szczególnie w odniesieniu do wydajności wiązania biotyny ze streptawidyną.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba użycia wysokiej czystości beta-kazeiny do pasywacji komory oraz staranne unikanie pęcherzyków powietrza podczas napełniania mikropipety w celu zachowania rzetelności pomiarów.
