Name: Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Poznaj metodę wyciągania nanorurek z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych do badania interakcji białek z zakrzywionymi błonami. Technika ta pozwala ilościowo określić wiązanie białek i właściwości mechaniczne błon lipidowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Benoit Sorre, Damienowi Cuvelierowi, Pierre'owi Nassoyowi, François Quemeneurowi i Gilowi Toombesowi za ich istotny wkład w wprowadzenie metody nanorurkowej w grupie. Grupa P.B. należy do konsorcjum CNRS CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) oraz Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai została sfinansowana ze stypendium EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1527-2014) i działań Marie Curie (H2020-MSCA-IF-2014, projekt membrane-ezrin-actin). M.S. jest młodszym członkiem Simons Society of Fellows.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda wyciągania rurek z GUV dostarcza bogatych informacji na temat układu błona-białko, ponieważ jest nie tylko środkiem do pomiaru podstawowych właściwości mechanicznych błony, ale także pomaga rzucić światło na sprzężenie między białkami a krzywizną błony. Jak omówiono we wprowadzeniu, istnieją inne techniki pomiaru wpływu białek zakrzywiających błonę, albo poprzez inkubację białek z submikronowymi liposomami przywiązanymi do pasywowanej powierzchni 18,19, al...

Wiele procesów komórkowych, takich jak endocytoza, transport wewnątrzkomórkowy, tworzenie filopodiów, infekcja itp., wiąże się z gwałtowną zmianą kształtu błon komórkowych1,2. W komórce szereg białek uczestniczy w tych procesach, wiążąc się z błoną i zmieniając jej kształt. Najbardziej znanymi przykładami są białka z rodziny Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR), zawierające charakterystyczną, wewnętrznie zakrzywioną domenę BAR3,4,5,6,7. Zazwyczaj oddziałują one z błoną poprzez przyleganie domeny BAR do jej powierzchni, a w wielu przypadkach również przez płytkie wprowadzanie helis amfipatycznych do dwuwarstwy. Kształt, rozmiar i ładunek domeny BAR wraz z liczbą helis amfipatycznych determinują: (1) kierunek zakrzywienia błony (t.j. czy wywołają one invaginacje, czy wypukłości) oraz (2) stopień zakrzywienia błony5,8. Należy zaznaczyć, że zakrzywienie dodatnie definiuje się tutaj jako wypukłą stronę zakrzywionej błony, t.j. wybrzuszenie w stronę oddziałującej cząsteczki, a w przeciwnym razie jako zakrzywienie ujemne. Ponadto badania ilościowe białek BAR wykazały, że ich wpływ na błonę zależy od zestawu parametrów fizycznych: gęstości powierzchniowej białek, napięcia błony oraz kształtu błony (płaski versus rurkowy versus sferyczny)7. W zależności od tych parametrów białka BAR mogą: (1) działać jako sensory zakrzywienia błony, (2) wyginać błony lub (3) indukować pękanie błony7.
Ze względu na ogromną liczbę komponentów zaangażowanych w przekształcanie błon w komórce, badanie ilościowych aspektów tych zjawisk, takich jak endocytoza, in vivo jest niezwykle trudne. Rekonstytucja in vitro minimalnych komponentów naśladujących zakrzywione błony komórkowe umożliwia mechanistyczne zrozumienie sposobu działania białek zakrzywiających błony. Niniejszy artykuł opisuje protokół rekonstytucji nanorurki błonowej in vitro z wykorzystaniem mikromanipulacji, mikroskopii konfokalnej i pęset optycznych. Podejście to może być stosowane do ilościowego badania interakcji białek, lipidów lub małych cząsteczek z zakrzywionymi błonami. Lipidowe GUV są wykorzystywane jako modele błony komórkowej, których krzywizna jest pomijalna w porównaniu z rozmiarem oddziałujących cząsteczek zakrzywiających błony. Są one przygotowywane metodą elektroformowania9, w której pęcherzyki powstają poprzez hydratację filmu lipidowego i jego pęcznienie do postaci GUV pod wpływem prądu przemiennego (AC)10. Najczęstszymi podłożami, na których hoduje się GUV, są półprzewodnikowe płytki powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO) lub druciki platynowe (Pt-wires)11. W niniejszej pracy GUV są hodowane na drucikach Pt, ponieważ wykazano, że metoda ta działa znacznie lepiej niż alternatywa przy tworzeniu GUV w obecności soli w buforze12. Chociaż protokół elektroformowania został tutaj opisany w stopniu wystarczającym do jego powtórzenia, odsyłamy czytelnika do wcześniejszych artykułów, w których szczegółowo opisano podobne i inne metody otrzymywania GUV13,14. W naszych badaniach elektroformowanie na drucikach Pt pozwoliło na pomyślne otrzymanie GUV z mieszaniny lipidów syntetycznych lub z naturalnych ekstraktów lipidowych w buforze zawierającym ~100 mM NaCl. Ponadto możliwe było enkapsulowanie białek wewnątrz GUV podczas ich wzrostu. Przykładowa komora do elektroformowania przedstawiona jest na Ryc. 1A; składa się ona z dwóch drucików Pt o długości ~10 cm, włożonych w uchwyt wykonany z politetrafluoroetylenu (PTFE), który można uszczelnić po obu stronach szkiełkami nakrywkowymi oddalonymi od siebie o ~1 - 2 cm (Ryc. 1A).
<img alt="Układ elektroforetyczny z mikropipetą i systemem spektroskopowym do analizy i rozdziału białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Układ eksperymentalny. (A) Komora do elektroformowania GUV z złączami elektrycznymi przymocowanymi do drucików platynowych (Pt). (B) Lewo: system eksperymentalny przedstawiający mikroskop, komorę eksperymentalną nad obiektywem oraz dwie mikropipety (lewą i prawą) przymocowane do mikromanipulatorów i wprowadzone do komory eksperymentalnej w celu wyciągania rurek i wstrzykiwania białka. Prawo: zbliżenie komory eksperymentalnej zamontowanej nad obiektywem, pokazujące wprowadzone końcówki mikropipety do aspiracji i wstrzykiwania. (C) Strzykawka wyposażona w cienki dozownik włożony do tylnego końca mikropipety. Na dole znajduje się zbliżenie dozownika wewnątrz mikropipety, gdzie niebieska przerywana linia obrysowuje mikropipetę. System ten służy do napełniania mikropipety kazeiną w celu pasywacji powierzchni szkła, a także do wypełniania od tyłu olejem mineralnym w razie potrzeby. (D) System służący do aspiracji ilości roztworu białka rzędu µL. Igła jest połączona ze strzykawką oraz z przewodami podłączonymi do mikropipety wtryskowej. Końcówka mikropipety zostaje ostrożnie zanurzona w roztworze białka i zasana w taki sposób, aby wypełnić końcówkę mikropipety. Następnie mikropipeta jest wypełniana od tyłu olejem mineralnym przy użyciu systemu pokazanego na panelu C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Nanorurka błonowa, o promieniu od 7 nm do kilkuset nm, może zostać wyciągnięta z GUV przez siłę zewnętrzną. Metoda ta została pierwotnie opracowana w celu pomiaru właściwości elastycznych błon komórkowych i pęcherzyków, takich jak sztywność zginania15,16. W najnowszych pracach metodę tę rozszerzono na badanie oddziaływań białek z zakrzywionymi błonami poprzez mikroiniekcję białek w pobliżu wyciągniętej nanorurki7,17. Opracowano inne metody badania białek zakrzywiających błony. W jednej z nich białka inkubuje się z liposomami o różnych rozmiarach, przytwierdzonymi do pasywowanej powierzchni. Mikroskopia konfokalna jest wykorzystywana do pomiaru wiązania białek w funkcji średnicy liposomów, co może wskazywać na sortowanie indukowane zakrzywieniem18,19. W innej metodzie białka wstrzykuje się w pobliżu mikroaspiracji GUV, aby zmierzyć ich zdolność do spontanicznego indukowania tworzenia cewek20,21. Metoda opisana w niniejszym protokole jest wyjątkowo odpowiednia do badania białek zakrzywiających błony uczestniczących w endocytozie, gdzie większość białek zazwyczaj napotyka wcześniej powstałe nanorurki błonowe łączące zawierającą ładunek wgłębienie błony z leżącą poniżej płaską błoną plazmatyczną. Ponadto w tej metodzie, w przeciwieństwie do testu z przytwierdzonymi małymi liposomami, nanorurka błonowa jest stale połączona z błoną; w związku z tym znajduje się ona w równowadze mechanicznej z GUV, co jest sytuacją spodziewaną in vivo. Zatem zastosowanie ma fundamentalna fizyka błon, co pozwala nam wywnioskować szereg właściwości mechanicznych z naszych pomiarów22,23,24.
Do pełnej implementacji tej metody niezbędny sprzęt obejmuje mikroskop konfokalny, pęsetę optyczną oraz jedną lub dwie mikropipety połączone ze zbiornikiem wody (Rycina 1B). Dzięki połączeniu tych trzech elementów możliwe jest jednoczesne pomiar napięcia błony, krzywizny błony, gęstości powierzchniowej białek oraz siły rurki25. Aspiracja mikropipetą jest kluczowa i można ją łatwo zrealizować poprzez włożenie szklanej mikropipety do uchwytu połączonego ze zbiornikiem wody, który za pomocą ciśnienia hydrostatycznego kontroluje ciśnienie aspiracji26. Mikropipeta i uchwyt są sterowane przez mikromanipulator, a idealnie w jednym kierunku przez siłownik piezoelektryczny w celu zapewnienia precyzyjnego ruchu. Aby wyciągnąć nanorurkę, poddana aspiracji GUV jest krótko przytwierdzona do koralika o wielkości mikrona, a następnie odciągana, co prowadzi do powstania nanorurki. W tej implementacji koralik jest utrzymywany przez pęsetę optyczną, którą można zbudować zgodnie z opublikowanym protokołem27. Możliwe jest zrezygnowanie z pęsety optycznej i wyciąganie nanorurek w inny sposób, choć odbywa się to kosztem dokładności pomiarów siły. Jeśli zbudowanie pułapki optycznej jest zbyt trudne lub jeśli pomiary siły nie są niezbędne, na przykład gdy chcemy jedynie sprawdzić preferencje białek względem zakrzywionych błon, rurkę można wyciągnąć za pomocą koralika aspirowanego na końcówce drugiej mikropipety28. Możliwe jest również wyciąganie rurek przy użyciu siły grawitacji29 lub przepływu30,31. Ponadto mikroskopia konfokalna również nie jest niezbędna; jest jednak preferowana w celu pomiaru gęstości powierzchniowej białek. Pozwala ona również na pomiar promienia nanorurki na podstawie intensywności fluorescencji lipidów w rurce, zatem niezależnie od siły i napięcia błony. Wyznaczanie promienia rurki z fluorescencji jest szczególnie istotne, jeśli zależność między tymi wielkościami odbiega od uznanych równań ze względu na obecność białek przylegających do błony25. Co ważne, nie można zrezygnować jednocześnie z pułapki optycznej i mikroskopii konfokalnej, ponieważ uniemożliwi to pomiar krzywizny rurki.
Metoda opisana w niniejszym protokole była wykorzystywana do badania segregacji indukowanej krzywizną różnych peryferyjnych białek błonowych na nanorurkach, głównie tych z rodziny BAR25,32,33,34. Wykazano również, że stożkowaty transbłonowy kanał potasowy KvAP ulega wzbogaceniu na zakrzywionych nanorurkach w ten sam sposób, co białka BAR35. Dzięki optymalizacji metody w celu enkapsulacji białek wewnątrz GUVs, niedawno zbadano również oddziaływania białek z ujemną krzywizną36. Co więcej, metoda ta była stosowana do wyjaśnienia procesu tworzenia rusztowań białkowych25,37 oraz do badania mechanizmu przecinania błony poprzez napięcie liniowe38, białko dynaminę39 lub białka BAR40,41. Oprócz białek, krzywiznę mogą indukować również małe cząsteczki lub jony. Przy użyciu tej metody wykazano, że jony wapnia indukują dodatnią krzywiznę w warunkach bezsolnych42. Co ciekawe, wykazano również, że lipidy mogą ulegać segregacji zależnej od krzywizny, choć tylko dla składów bliskich punktowi rozdzielania faz43,44. Podsumowując, metoda ta może być wykorzystywana przez badaczy zainteresowanych analizą tego, jak integralne komponenty błony (np. lipidy lub białka transbłonowe) lub cząsteczki wiążące się peryferyjnie (zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz GUVs) oddziałują z błonami o zakrzywieniu cylindrycznym, z punktu widzenia mechanicznego i ilościowego. Jest ona również przeznaczona dla osób zainteresowanych pomiarem właściwości mechanicznych samej błony22,23,45.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Przykład lipidu użytego w danych do rysunku 3</td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina-N-[biotynyl(glikol polietylenowy)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotyna]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>biotynylowany lipid</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-ceramid</td><td>Sondy molekularne (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>fluorescencyjny lipid</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-heksadekanoylocholina fosfatydylocholina (HPC*)</td><td>Sondy molekularne (ThermoFisher)</td><td></td><td>fluorescencyjny lipid do kalibracji gęstości białka</td></tr><tr><td>jajko L-&alfa;-fosfatydylocholina (eggPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>służy do kalibracji stałej promienia probówki</td></tr><tr><td>&beta;-kazeiny z mleka krowiego (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>służy do pasywacji mikropipety i komora doświadczalna</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+) glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>osmometr</td><td>Loser</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pt-wires, średnica 0,5 mm, czystość 99,99%</td><td>Goodfellow, USA</td><td>PT005139</td><td>używany do</td>generatora</tr><tr><td></td><td></td> funkcji elektroformacji GUV <td>nie dotyczy</td><td>służy do wytwarzania prądu dla</td></tr><tr><td>szpachlówki</td> galwanicznej GUV <td>Vitrex (z CML Francja)</td><td>CRIT 140013</td><td>używany do uszczelniania kąpieli w komorze elektroformacji</td></tr><tr><td>sonikator</td><td></td><td>nie jest przydatny</td><td>do czyszczenia komory elektroformacji, ale nie jest kluczowy</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony TE2000 firmy Nikon, system konfokalny eC1 (Nikon), z dwiema liniami laserowymi (&lambda; = 488 nm i 543 nm); pęseta optyczna indukowana laserem o długości fali ciągłej z włókna iterbowego o mocy 5 W (&lambda; > 1070 nm; IPG GmBH Niemcy)</td><td></td><td></td><td>przykład systemu mikroskopii konfokalnej wyposażonego w pęsetę optyczną</td></tr>, <tr><td>mikromanipulatory</td><td></td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>kapilary borokrzemianowe (o promieniach wewnętrznych i zewnętrznych odpowiednio 0,78 mm i 1 mm)</td><td>Ściągacz</td> do mikropipet Harvard <td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td> Siłownik piezoelektryczny <td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Physik Instrumente</td><td>brak</td><td></td></tr><tr><td>koralików pokrytych streptawidyną z polistyrenu (średnica 3,2 i mikro; m)</td> <td>Spherotech</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Przekształcanie błony komórkowej jest integralną częścią wielu zjawisk komórkowych, takich jak endocytoza, transport, powstawanie filopodiów, itp. Wiele różnych białek kojarzy się z zakrzywionymi błonami ze względu na ich zdolność do wyczuwania lub wywoływania krzywizny błony. Zazwyczaj procesy te obejmują wiele białek, co czyni je zbyt złożonymi, aby można je było badać ilościowo w komórce. Opisujemy protokół rekonstytucji zakrzywionej błony in vitro, naśladując zakrzywioną strukturę komórkową, taką jak szyjka endocytarna. Gigantyczny pęcherzyk jednopłytkowy (GUV) jest używany jako model błony komórkowej, której ciśnienie wewnętrzne i napięcie powierzchniowe są kontrolowane za pomocą aspiracji mikropipet. Przyłożenie punktowej siły ciągnącej do GUV za pomocą pęsety optycznej tworzy nanorurkę o dużej krzywiźnie połączoną z płaską membraną. Metoda ta jest tradycyjnie stosowana do pomiaru podstawowych właściwości mechanicznych błon lipidowych, takich jak sztywność zginania. W ostatnich latach został rozszerzony o badanie, w jaki sposób białka oddziałują z krzywizną błony oraz w jaki sposób wpływają na kształt i mechanikę błon. System łączący mikromanipulację, mikroiniekcję, pęsetę optyczną i mikroskopię konfokalną umożliwia jednoczesny pomiar krzywizny błony, napięcia błony i gęstości powierzchni białek. Na podstawie tych pomiarów można wywnioskować wiele ważnych właściwości mechanicznych i morfologicznych układu białkowo-błonowego. Ponadto opracowujemy protokół tworzenia GUV w obecności fizjologicznego stężenia soli oraz metodę ilościowego określania gęstości powierzchniowej białek na błonie na podstawie intensywności fluorescencji znakowanych białek i lipidów.

Eksperyment wyciągania rurek może dostarczyć kluczowych informacji mechanicznych na temat błony. W przypadku braku białek lub innych cząsteczek sprzęgających się z krzywizną błony, siłę błony oraz promień rurki można powiązać z napięciem błony, stosując równanie hamiltoniana Canhama-Helfricha do rurki wyciągniętej z GUV50,51
<img alt="Równanie równowagi sił, wzór \( \mat...

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Ogólnym celem tej metodologii wyciągania nanorurek jest ilościowe zbadanie interakcji między określonymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania a wysoce zakrzywionymi błonami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii błon komórkowych, takie jak endocytoza i transport wewnątrzkomórkowy. Ta technika pozwala nam bezpośrednio określić ilościowo, w jaki sposób białka wiążą się z zakrzywionymi błonami i wzajemnie je deformują.Początkowo metoda ta była stosowana do pomiaru podstawowych właściwości mechanicznych błon lipidowych. Ostatnio zaczęto go stosować do wyjaśniania ważnych mechanizmów w interakcjach błon białkowych, w szczególności błon kształtujących białka. Zacznij od zebrania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych bezpośrednio z platynowych drutów komory elektroformacyjnej.Aby zbudować komorę doświadczalną, umieść dwie prostokątne szklane pokrywy oddalone od siebie o jeden milimetr na metalowej podstawie, pozostawiając otwory wzdłuż dłuższych krawędzi wystarczająco duże, aby szklana końcówka mikropipety sięgała co najmniej do środka komory. Napełnij zarówno komorę doświadczalną, jak i szklaną mikropipetę pięcioma miligramami na mililitr wysoce czystego roztworu beta-kazeiny, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Podczas pasywacji komory zamontuj ją na mikroskopie świetlnym wyśrodkowanym nad obiektywem i włóż końcówkę mikropipety aspiracyjnej przez otwór wzdłuż dłuższej krawędzi, aż końcówka znajdzie się nad obiektywem.Wyregulować poziom wody w zbiorniku tak, aby ciśnienie zasysania było bliskie zeru, a następnie napełnić mikropipetę iniekcyjną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania rozpuszczoną w buforze doświadczalnym o odpowiednim stężeniu doświadczalnym. Zamontuj mikropipetę iniekcyjną wewnątrz mikromanipulatora i włóż mikropipetę przez drugą stronę komory doświadczalnej. Pod koniec inkubacji wyjąć roztwór beta-kazeiny z komory i kilkakrotnie przepłukać komorę buforem doświadczalnym.Następnie dodaj kilka mikrolitrów roztworu pęcherzyków do komory, a następnie kilka mikrolitrów kulek pokrytych streptawidyną, do końcowego stężenia 0,1 razy 10 do ujemnej 3% szybkości kulek na objętość lub mniej. Po tym, jak pęcherzyki i kulki osiądą na dnie komory, pozwól eksperymentalnemu buforowi odparować przez około 15 minut, w którym to momencie pęcherzyki powinny widocznie falować pod mikroskopem świetlnym. Gdy pęcherzyki są odpowiednio wiotkie, należy zassać poszczególne pęcherzyki do mikropipety do momentu, aż długość błon w pipecie będzie równa lub większa niż promień pipety.Po zidentyfikowaniu odpowiedniej wielkości języka zasysającego należy uszczelnić otwarte krawędzie komory olejem mineralnym. Aby ustawić pozycję zerową ciśnienia zasysania, umieść koniec pipety zasysającej w pobliżu koralika i wyreguluj wysokość zbiornika na wodę tak, aby kulka nie była ani zasysana, ani zdmuchiwana przez pipetę. Regulacja wysokości wody ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania napięcia błony pęcherzyka, który jest zasysany przez mikropipetę.Zassać pęcherzyk i przesunąć mikropipetę w górę i rozsunąć ją w kąt, nie przerywając jej działania. Za pomocą pęsety optycznej uwięzić koralik w odległości około 20 mikrometrów od dna komory. Ustaw pęcherzyk z powrotem w ostrości z dala od koralika i wyrównaj z pułapką optyczną, a następnie rejestruj ruch kulki przez jedną do dwóch minut, aby zmierzyć położenie równowagi.Zmniejsz ciśnienie wewnątrz mikropipety tak bardzo, jak to możliwe, nie tracąc pęcherzyka, aby zmniejszyć napięcie membrany, i ostrożnie doprowadź pęcherzyk do kontaktu ze kulką na około sekundę, aby ustanowić wiązania streptawidyna-biotyna. Następnie za pomocą siłownika piezoelektrycznego delikatnie odciągnij pęcherzyk do tyłu, aby utworzyć nanorurkę. Zwiększ ciśnienie aspiracji, aby odtworzyć język zasysający i wyrównaj rurkę w osi pipety zasysającej.Ustaw rurkę i pęcherzyk w pełnej ostrości i rejestruj ruch koralika z prędkością akwizycji 30 Hz oraz wysokość zbiornika na wodę w stosunku do pozycji zerowej przez kilka minut pod mikroskopią w jasnym polu. Po uzyskaniu wszystkich obrazów ponownie zarejestruj ruch stopki przy różnych ciśnieniach aspiracji i naprężeniach membrany. Aby wstrzyknąć interesujące nas białka lub cząsteczki, przyłóż mikropipetę do iniekcji w pobliżu nanorurki, uważając, aby koralik w pułapce optycznej nie został zakłócony, i delikatnie wstrzyknij białka pod ciśnieniem od jednego do dwóch paskalów.Po zrównoważeniu wiązania białek powtórzyć pomiary krokowe w obecności dodanych białek, jak pokazano dla gołej błony. Pomiary siły i promienia na nanorurkach wyciągniętych z pęcherzyków 100% DOPC są niezależne, ponieważ siła jest mierzona na podstawie przemieszczenia kulki w pułapce optycznej, a promień na podstawie intensywności fluorescencji, co zapewnia dwa sposoby obliczania sztywności zginania membrany. Względne wzbogacenie białek BAR lub kanałów potasowych na rurkach błonowych nad leżącymi poniżej pęcherzykami wskazuje, że białka są bardziej skłonne do wiązania się z zakrzywionymi błonami.Rzeczywiście, wiązanie białka N-BAR endofiliny A2 z błoną stopniowo zmniejsza siłę rurki do zera, co wskazuje na tworzenie trójwymiarowego rusztowania, które utrzymuje rurkę stabilnie. Zgodnie z tą procedurą, inne techniki mogą być łączone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład mikroskopia o wysokiej rozdzielczości w celu wykrycia organizacji białek na rurkach membranowych lub śledzenie pojedynczych cząstek w celu pomiaru ruchliwości białek.

pulling-membrane-nanotubes-from-giant-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Eksperymenty na oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) często zaniedbują fizjologiczne warunki roztworu. W pracy przedstawiono podejścia do badania wpływu buforu o wysokim zasoleniu na separację faz ciecz-ciecz w naładowanych wieloskładnikowych GUV w funkcji asymetrii i temperatury roztworu transmembranowego.

Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Ten protokół opisuje proces wytwarzania sieci nanorurek lipidowych za pomocą ślizgającej się ruchliwości kinezyny w połączeniu z gigantycznymi jednopłytkowymi pęcherzykami lipidowymi.

Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Ten przewodnik dla początkujących przedstawia ogólny protokół przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) metodą przenoszenia kropel, omawiając krytyczne etapy i dostarczając informacji, które pomogą w możliwych korektach wymaganych dla różnych zastosowań, w tym biologii syntetycznej i mikrorobotyki.

Wykorzystanie metody przenoszenia kropelek w celu niezawodnego przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Poznaj metodę wyciągania nanorurek z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych do badania interakcji białek z zakrzywionymi błonami. Technika ta pozwala ilościowo określić wiązanie białek i właściwości mechaniczne błon lipidowych.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Przeglądaj więcej filmów