Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych

Ogólnym celem tego testu jest wizualizacja egzocytozy granulek insuliny w czasie rzeczywistym w nienaruszonych wyspach trzustkowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta odpowie na kluczowe pytania w dziedzinie cukrzycy. Na przykład, co reguluje egzocytozę insuliny?

Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ fuzja granulek jest najważniejszym wydarzeniem w życiu lepszej komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wykorzystać nienaruszone wysepki, możemy zobaczyć zdarzenia fuzji w komórkach w ich naturalnym środowisku. Madina Mahkmutova, doktorantka z naszego laboratorium, zademonstruje tę technikę.

Na początku, po przybyciu wysp trzustkowych, przenieś je do 50-mililitrowych probówek sokoła i odwiruj zawiesinę wysp z prędkością 1000 obrotów na minutę przez pięć minut. Wysepki zbierają się na dnie probówki, przenoszą je w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej CMRL na 35-milimetrowe szalki Petriego poddane działaniu kultur nietkankowych i inkubują je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny przed infekcją wirusową. Po ich wyizolowaniu ponownie zawiesić w przybliżeniu odpowiedniki mysich wysp trzustkowych w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej CMRL i przenieść je na 35-milimetrowe szalki Petriego bez hodowli tkankowych.

Inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny przed infekcją wirusową. Aby przeprowadzić infekcję wirusową, dodaj od pięciu do 10 mikrolitrów podstawowego wirusa do każdej 35-milimetrowej szalki Petriego zawierającej ludzkie lub mysie wyspy w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej CMRL. Po hodowli wysp trzustkowych przez 24 godziny odessać pożywkę i zastąpić ją dwoma mililitrami pożywki hodowlanej CMRL bez wirusa.

Hoduj wysepki przez cztery do sześciu dni, wymieniając podłoże co trzy dni. Przygotuj roztwór zewnątrzkomórkowy, łącząc wymienione tutaj odczynniki, a następnie przefiltruj bufor. Przygotuj podstawową pożywkę glukozy do trzymilimolowego końcowego stężenia glukozy, dodając 75 mikrolitrów dwumolowej glukozy do 50 mililitrów roztworu zewnątrzkomórkowego.

Następnie, aby przygotować pożywkę hiperglikemiczną do 16 milimolowych końcowych stężeń glukozy, dodaj 400 mikrolitrów dwumolowego bulionu glukozy do 50 mililitrów roztworu zewnątrzkomórkowego. Rozcieńczyć wszelkie dodatkowe bodźce i roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający trzy milimolowe glukozy. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wstępnie potraktować szkiełka nakrywkowe 30 mikrolitrami jednego miligrama na mililitr roztworu poli-d-lizyny i inkubować przez godzinę.

Następnie użyj wody, aby dokładnie spłukać szkiełka nakrywkowe. Co najmniej godzinę przed eksperymentem przenieś grupę wysepek na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór zewnątrzkomórkowy z trzema milimolowymi glukozami. Pozostałe wysepki utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Na 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu przymocuj szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania, używając smaru silikonowego do jej uszczelnienia. Następnie przymocuj komorę obrazowania do platformy obrazowania. Następnie, za pomocą pipety, przenieś od 20 do 30 wysepek na obszar szkiełka nakrywkowego poddanego działaniu poli-d-lizyny i pozwól wysepkom przylegać do powierzchni przez 20 minut.

Ten krok ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu i zbieramy około 20 do 30 wysepek w mniej niż 10 mikrolitrach buforu i czekamy 20 minut. Ważne jest, aby nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia pokrywy, aby uniknąć uszkodzenia wysepek. Gdy wysepki przylegają do szkiełka nakrywkowego, przygotuj system perfuzyjny, używając wody do dokładnego spłukania.

Następnie dodaj każde rozwiązanie do innego kanału, zgodnie z tą tabelą. Usuń wszystkie pęcherzyki z systemu, otwierając każdy kanał osobno i pozwalając roztworowi płynąć przez kilka minut. Upewnij się, że przepływ jest stały, a rurka nie przecieka.

Następnie podłącz pojedynczą grzałkę roztworu liniowego do rurki wylotowej perfuzji i dostosuj temperaturę wypływającego bufora do 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj pompę ssącą. Podłącz rurkę, włącz pompę i upewnij się, że płyn jest zasysany.

Umieść platformę obrazowania z wyspami trzustkowymi na stoliku mikroskopu i podłącz ją do systemu perfuzyjnego i pompy ssącej. Następnie delikatnie napełnij komorę obrazowania roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym trzymilimolową glukozę. Aby przeprowadzić obrazowanie konfokalne, zlokalizuj wysepki w polu mikroskopu przy małym powiększeniu.

Po ustawieniu ostrości na wysepkach przełącz się na obiektywy o większym powiększeniu. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i aktywuj rezydentny tryb skanowania. Wybierz obrazowanie xyzt, a następnie, aby skonfigurować ustawienia akwizycji, włącz laser argonowy i ustaw go na 30%, a następnie linię laserową 488 nanometrów, dostosowując moc lasera do około 50% w celu wzbudzenia pHluorin.

Zbieraj emisje w zakresie od 505 do 555 nanometrów, używając widma emisji EGFP jako przewodnika. Wybierz rozdzielczość 512 na 512 pikseli. Rozpocznij obrazowanie, naciskając przycisk na żywo i dostosuj poziomy wzmocnienia.

Ustaw początkowy koniec stosu z, skupiając się na górnej części wysepki i wybierając początek, a następnie przechodząc do ostatniej płaszczyzny, na której można się skupić, i wybierając n. Wybierz rozmiar stosu z wynoszący pięć mikrometrów. Ustaw interwał czasowy akwizycji każdego stosu z na blisko 1,5 do 2 sekund i wybierz opcję akwizycji do momentu zatrzymania dla ciągłego obrazowania.

Następnie naciśnij przycisk start, aby zainicjować obrazowanie. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby zapoznać się z protokołami stymulacji w celu wywołania egzocytozy ziarnistości. Za pomocą skanera rezydentnego obrazy konfokalne wysepki są rejestrowane jako nagrania poklatkowe w czasie krótszym niż dwie sekundy.

Ponadto technikę tę można łączyć z barwnikami do obrazowania funkcjonalnego, takimi jak potencjał membry lub cytozolowe barwniki wapniowe wolne od cytozolu. Aby ustalić, czy NP Y-pHluorin jest rzeczywiście odpowiednim narzędziem do monitorowania dynamiki granulek insuliny, zakażone wyspy trzustkowe poddano barwieniu immunologicznemu przeciwciałami przeciwko GFP dla NP Y-pHluorin i hormonom wysp trzustkowych: insulinie, somatostatynie lub glukagonowi. Większość komórek wykazujących ekspresję NP Y-pHluorin to komórki beta, ponieważ one również wyrażają insulinę.

Tylko kilka glukagno-dodatnich komórek alfa lub komórek delta dodatnich do somatostatyny zostało znakowanych GFP. Co ważne w zakażonych komórkach, fuzja NP Y współlokalizowała się z insuliną. Liczba ta pokazuje, że pHluorin jest skutecznym czujnikiem pH.

Ponieważ zwiększenie pH międzykomórkowego za pomocą 50 milimolowego chlorku amonu spowodowało ponad 500% wzrost fluorescencji międzykomórkowej. Ponieważ pH wewnątrz granulki wzrasta po fuzji z błoną plazmatyczną w otworze poru fuzyjnego, granulki zawierające NP Y-pHluorin stają się widoczne w warunkach stymulujących egzocytozę insuliny, takich jak depolaryzacja błony chlorkiem potasu. Korzystając z konfokalnego obrazowania poklatkowego wysp trzustkowych zakażonych NP Y-pHluoryną, można wizualizować pojedyncze zdarzenia sekretarskie w komórkach beta w nienaruszonych wyspach trzustkowych.

Występują one w odpowiedzi na bezpośrednią depolaryzację błony za pomocą chlorku potasu lub kilku innych bodźców fizjologicznych. Przy podstawowym stężeniu glukozy zewnątrzkomórkowej obserwuje się niewielką aktywność sekretariatu. Jednak fuzja granulek z błoną plazmatyczną jest wyzwalana w odpowiedzi na stymulację wysokim poziomem glukozy.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, dlaczego fuzja granulek zachodzi w określonych regionach komórki. Po opracowaniu technika ta została wykorzystana do zbadania czasowego wzorca wydzielania granulek insuliny w populacjach komórek beta w ludzkich wyspach trzustkowych.