Name: Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę obrazowania konfokalnego egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych wyspach trzustkowych myszy i człowieka przy użyciu neuropeptydu Y-pHluorin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Marci Boulinie z głównego ośrodka obrazowania DRI za pomoc przy mikroskopach. Prace te były wspierane przez granty NIH 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 i R56 DK084321 (AC).

Komisja etyki zwierząt Uniwersytetu w Miami zatwierdziła wszystkie eksperymenty.
1. Wirusowa infekcja nienaruszonych izolowanych ludzkich lub mysich wysp trzustkowych
<ol>
	<li>Hodowla wysp trzustkowych: przygotuj pożywkę do hodowli wysp trzustkowych: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS i 2 mM L-glutamina.
	<ol>
		<li>Ludzkie wyspy trzustkowe uzyskuje się ze Zintegrowanego Programu Dystrybucji Wysp Trzustkowych (NIDDK, NIH). Po przybyciu przenieść wysepki (~ 500 ekwiwalentów wysp) na 35-milimetrowe szalki Petriego poddane działaniu kultur nietkankowych z 2 ml pożywki hodowlanej CMRL w temperaturze 37 °C, 5%/95% CO2/O2 przez 24 godziny przed infekcją wirusową.</li>
		<li>Mysie wyspy trzustkowe można wyizolować zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami16. Po izolacji, hodowla ~ 200 ekwiwalentów wysepek w 35-milimetrowej kulturze nietkankowej traktowana szalki Petriego 2 ml pożywki hodowlanej CMRL w temperaturze 37 °C, 5%/95% CO2/O2 przez 24 godziny przed infekcją wirusową. 
		UWAGA: Unikaj używania myszy transgenicznych z reporterami GFP lub YFP ulegającymi ekspresji na wysepkach, aby uniknąć nakładania się fluorescencji z NPY-pHluorin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wirusa 
	UWAGA: Fuzja NPY-pHluorin została sklonowana do pcDNA3 vector10 i podklonowana do wektora adenowirusowego do produkcji adenowirusa [adenowirus serotyp 5 (DE1/E3)] przez firmę produkującą rekombinowane adenowirusy. Wirus podawano na porcję i przechowywano w temperaturze -80 °C. Zapas wirusa jest dostarczany przez firmę przy mianach 1012 do 1013 cząstek wirusa (~ 3 x 1010 - 3 x 1011 PFU).
	<ol>
		<li>W przypadku zakażenia wysp trzustkowych in vitro należy użyć 106 PFU/ml, co daje przybliżoną wielokrotność infekcji (MOI) około 2 (szczegóły w Dyskusji)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie wirusowe wysp trzustkowych 
	Uwaga: Praca z adenowirusami wymaga procedur i certyfikacji na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Skontaktuj się z Instytucjonalnym Inspektorem ds. Bezpieczeństwa Biologicznego, aby uzyskać wskazówki i szkolenie w zakresie procedur BSL2.
	<ol>
		<li>Przygotuj wysepki człowiek/mysz zgodnie z powyższym opisem.</li>
		<li>Dodać 5 - 10 μl podstawowego wirusa do każdej 35-milimetrowej szalki Petriego zawierającej wysepki ludzko-mysie w 2 ml pożywki hodowlanej CMRL (z 10% FBS i 2 mM L-glutaminą). 
		UWAGA: Dostosuj głośność używanego wirusa zgodnie z mianem wirusa zgodnie z arkuszem danych firmy.</li>
		<li>Hodować wysepki w pożywkach zawierających wirusa w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 godziny.</li>
		<li>Po 24 godzinach odessać pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją 2 ml pożywki hodowlanej CMRL (z 10% FBS i 2 mM L-Glutaminy).</li>
		<li>Hodować wysepki przez 4 - 6 dni w temperaturze 37 °C/5% CO2 , wymieniając pożywkę co 3 dni.</li>
		<li>Po 4-6 dniach hodowli spodziewaj się, że około 30% komórek wysp trzustkowych zostanie zainfekowanych. Wysepki mogą być następnie wykorzystywane do eksperymentów z obrazowaniem na żywo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie konfokalne zakażonych wysp trzustkowych
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby dowiedzieć się, jakie materiały i sprzęt są wymagane do obrazowania konfokalnego.
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynnika i konfiguracja eksperymentalna
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy: dodać 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, sterylne przefiltrowane. 
		UWAGA: Ten bufor jest zwykle przygotowywany bez glukozy i może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. Glukoza jest dodawana w dniu eksperymentu, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe.
		<ol>
			<li>Przygotować podłoże z glukozą podstawową (3 mM): dodać 75 μl 2 M bulionu glukozowego do 50 ml roztworu zewnątrzkomórkowego.</li>
			<li>Podłoże hiperglikemiczne (16 mM): dodać 400 μl 2 M bulionu glukozy do 50 ml roztworu zewnątrzkomórkowego</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozcieńczyć wszelkie dodatkowe bodźce (np. KCl lub adenozynotrifosforan (ATP)) w roztworze zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wstępnie potraktować szkiełka nakrywkowe poli-D-lizyną, dodając 30 μl roztworu poli-D-lizyny (1 mg/ml) do szkiełka nakrywkowego przez 1 godzinę i dokładnie spłukując je H2O. 
		UWAGA: Szkiełka nakrywkowe pokryte polilizyną można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.</li>
		<li>Co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem, za pomocą pipety o pojemności 1 ml, przenieś wysepki na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór zewnątrzkomórkowy z 3 mM glukozy. Utrzymuj wysepki w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
		UWAGA: W razie potrzeby błonę plazmatyczną można oznaczyć na tym etapie. Aby oznaczyć błonę plazmatyczną, dodaj 2 μM barwnika di-8-ANEPP do roztworu zewnątrzkomórkowego z 3 mM glukozy. Inkubować wysepki w roztworze barwnika przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Barwnik błony plazmatycznej może być wzbudzony przy 488 nm i wykryty przy 620 nm.</li>
		<li>Minimum przed rozpoczęciem eksperymentu przymocuj szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania, uszczelniając je próżniowym smarem silikonowym. Przymocuj komorę obrazowania do platformy obrazowania. Za pomocą pipety umieść 20 - 30 wysepek na obszarze szkiełka nakrywkowego poddanym działaniu poli-D-lizyny i pozwól wysepkom przylegać do powierzchni przez 20 min. 
		UWAGA: Ważne jest, aby nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć uszkodzenia wysepek.</li>
		<li>Gdy wysepki przylegają do szkiełka nakrywkowego, przygotuj system perfuzyjny, dokładnie spłukując go wodą. Dodaj każdy roztwór do innego kanału: 3 mM glukozy (kanał 1), 16 mM glukozy (kanał 2), 16 mM glukozy ze 100 μM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) i 10 μM forskoliny (kanał 3), 25 mM KCl w 3 mM glukozy (kanał 4), 10 μM ATP w 3 mM glukozy (kanał 5). Usuń wszystkie pęcherzyki z systemu, otwierając każdy kanał osobno i pozwalając roztworowi płynąć przez kilka minut, a następnie upewnij się, że przepływ jest stały (0,5 ml/min), a rurka nie przecieka.</li>
		<li>Podłączyć pojedynczą grzałkę roztworu liniowego do rurki wylotowej perfuzji i dostosować temperaturę wypływającego buforu do 37 °C.</li>
		<li>Przygotuj pompę ssącą. Usuń wszystkie pęcherzyki z systemu i upewnij się, że przepływ jest stały, a rurka nie przecieka.</li>
		<li>Gdy wysepki przylegają do powierzchni szkiełka nakrywkowego, delikatnie napełnij komorę obrazowania roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy. Unikać zmywania wysepek z powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Umieść platformę obrazowania z wyspami trzustkowymi na stoliku mikroskopu i podłącz ją do systemu perfuzyjnego i pompy ssącej.</li>
		<li>Włącz przepływ i stale wykonuj wysepki za pomocą roztworu zewnątrzkomórkowego 3G. System jest teraz gotowy do obrazowania konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie konfokalne
	<ol>
		<li>Zlokalizuj wysepki w polu mikroskopu przy mniejszym powiększeniu. Po ustawieniu ostrości na wysepkach przełącz się na obiektywy o większym powiększeniu (np. obiektyw 63X zanurzony w wodzie (63X/0,9 NA)).</li>
		<li>Otwórz akwizycję za pomocą oprogramowania (Tabela materiałów) i aktywuj tryb skanera rezonansowego.</li>
		<li>Wybierz tryb obrazowania XYZT i skonfiguruj ustawienia akwizycji w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Włącz laser argonowy i linię laserową 488 nm i dostosuj moc lasera do 50% w celu wzbudzenia pHluorin.</li>
			<li>Zbierać emisję przy 505 - 555 nm.</li>
			<li>Wybierz rozdzielczość 512 x 512 pikseli. Naciśnij przycisk "Live", aby rozpocząć obrazowanie i dostosować poziomy wzmocnienia (typowe wzmocnienie wynosi około 600 V).</li>
			<li>Ustaw początek i koniec stosu z: skup się na szczycie wysepki i wybierz "początek" i przejdź do ostatniej płaszczyzny, na której można ustawić ostrość i wybierz "koniec". Użyj kroku Z o rozmiarze 5 μm. Oprogramowanie automatycznie obliczy liczbę płaszczyzn konfokalnych.</li>
			<li>Ustaw przedział czasowy akwizycji każdego stosu z blisko 1,5 - 2 s i wybierz opcję "Pobieraj do zatrzymania" dla ciągłego obrazowania.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "start", aby zainicjować.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Stosuj różne protokoły stymulacji, aby wywołać egzocytozę ziarnistości poprzez perfuzję wysp trzustkowych z pożądanymi bodźcami. Protokoły stymulacji można dostosować do pożądanego celu naukowego (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokoły stymulacji 
	UWAGA: W każdym protokole stymulacji zacznij od zarejestrowania co najmniej 2 minut aktywności tła wysp trzustkowych podczas ciągłej perfuzji roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy. Perfuzja ze stymulantem przez żądany okres czasu. Kolejność stymulantów, czas trwania stymulacji, a także czas trwania nagrań można dostosować do pożądanych celów naukowych. Pamiętaj, aby dokładnie umyć wyspy trzustkowe roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy przed rozpoczęciem nowej stymulacji. Poniżej znajdują się przykładowe protokoły stymulacji, które zostały wykorzystane do zademonstrowania możliwości metody.
	<ol>
		<li>Stymulacja chlorkiem amonu (NH4Cl) jako pozytywna kontrola wrażliwości pH pHluorin i skuteczności infekcji wirusowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3): 3 mM glukozy (2 min) → 50 mM NH4Cl (2 min) w 3 mM glukozy → 3 mM glukozy (2 min) 
		UWAGA: W roztworze NH4Cl zastąpić NaCl na zasadzie równomolowej.</li>
		<li>Stymuluj egzocytozę granulek insuliny poprzez zwiększenie stężenia glukozy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 6): 3 mM glukozy (2 min) → 16 mM glukozy (15-30 min) → 3 mM glukozy (2 min 
		UWAGA: Aby zobaczyć kilka wybuchów aktywności, wysepki należy wysysać roztworem 16G w sposób ciągły przez co najmniej 15 minut. 
		UWAGA: W celu zwiększenia spójności odpowiedzi wydzielniczych17, użytkownicy mogą dodawać środki podnoszące cAMP (100 μM IBMX i 10 μM forskoliny) zarówno do roztworów 3G, jak i 16G. Nie zmienia to czasowych wzorców wydzielania granulek. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz15 i Dyskusja.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+insulin+granule+biogenesis+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis.</a> Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).</li>
<li>Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cell+identity%2C+glucose+sensing+and+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion.</a> Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).</li>
<li>Rorsman, P., Renstrom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+granule+dynamics+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).</li>
<li>Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vti1a+identifies+a+vesicle+pool+that+preferentially+recycles+at+rest+and+maintains+spontaneous+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).</li>
<li>Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+insulin+vesicle+dynamics+during+pulsatile+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion.</a> Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).</li>
<li>Ohara-Imaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+exocytosis+and+endocytosis+of+insulin+secretory+granules+in+the+pancreatic+beta-cell+line+MIN6+using+pH-sensitive+green+fluorescent+protein+%28pHluorin%29+and+confocal+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy.</a> Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).</li>
<li>Whim, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cells+synthesize+neuropeptide+Y+and+can+rapidly+release+peptide+co-transmitters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters.</a> PLoS One. 6 (4), e19478(2011).</li>
<li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+%26%2334%3Bkiss-and-run%26%2334%3B+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).</li>
<li>Zhu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+I+and+IX+function+redundantly+in+controlling+fusion+pore+of+large+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+fusion+pore+opening+and+the+amount+of+hormone+released+are+regulated+by+myosin+II+during+kiss-and-run+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis.</a> Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).</li>
<li>Felmy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cargo+release+from+dense+core+granules+by+size+and+actin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network.</a> Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Gandasi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+Red+Fluorescence+Proteins+as+Markers+for+Secretory+Granule+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis.</a> PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).</li>
<li>Almaca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+coordination+of+insulin+granule+exocytosis+in+intact+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets.</a> Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> J Vis Exp. (99), e52632(2015).</li>
<li>Hanna, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kiss-and-run+exocytosis+and+fusion+pores+of+secretory+vesicles+in+human+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+transfection+of+isolated+pancreatic+islets%3A+a+study+of+programmed+cell+death+%28apoptosis%29+and+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function.</a> J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).</li>
<li>Michael, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cargo+proteins+in+pancreatic+beta-cells%3A+design+determines+secretion+kinetics+at+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis.</a> Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).</li>
<li>Serre-Beinier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx36+makes+channels+coupling+human+pancreatic+beta-cells%2C+and+correlates+with+insulin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression.</a> Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).</li>
<li>Rutter, G. A., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+connectivity+in+pancreatic+islets%3A+a+type+2+diabetes+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?</a> Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).</li>
<li>Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHuji%2C+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+for+imaging+of+exo-+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis.</a> J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Manuskrypt ten opisuje technikę, którą można wykorzystać do wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w komórkach beta w nienaruszonych wyspach trzustkowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wykorzystuje NPY-pHluorin jako fluorescencyjny reporter sklonowany do adenowirusa, aby zapewnić wysoką wydajność transfekcji.
Chociaż metoda była bardzo skuteczna w naszych rękach, może wymagać pewnych modyfikacji, które zależą przede wszystkim od dwóch parametrów: 1) jakości przygotowania wysp trzustkowy...

Insulina jest wytwarzana przez komórki beta wyspy trzustkowej i jest kluczowym regulatorem metabolizmu glukozy1. Śmierć lub dysfunkcja komórek beta zaburza homeostazę glukozy i prowadzi do cukrzycy2. Insulina jest upakowana w gęste granulki, które są uwalniane w sposób zależny odCa2+3. Wyjaśnienie, w jaki sposób regulowana jest egzocytoza granulek insuliny, jest niezbędne, aby w pełni zrozumieć, co decyduje o wydzielaniu insuliny i otwiera nowe możliwości identyfikacji nowych celów terapeutycznych w leczeniu cukrzycy.
Egzocytoza insuliny była intensywnie badana przy użyciu metod elektrofizjologicznych, takich jak pomiary pojemności błony oraz podejścia mikroskopowe w połączeniu z cząsteczkami fluorescencyjnymi. Pomiary pojemności membrany mają dobrą rozdzielczość czasową i umożliwiają zapisy pojedynczych komórek. Jednak zmiany pojemności odzwierciedlają zmianę powierzchni netto komórki i nie wychwytują poszczególnych zdarzeń fuzji ani nie odróżniają fuzji granulek insuliny od innych pęcherzyków wydzielniczych insuliny3. Podejścia mikroskopowe, takie jak mikroskopia dwufotonowa lub mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) w połączeniu z sondami fluorescencyjnymi i białkami pęcherzykowymi, dostarczają dodatkowych szczegółów. Techniki te rejestrują pojedyncze zdarzenia egzocytotyczne, a także etapy przed- i po-egzocytotyczne i mogą być używane do badania wzorców egzocytotycznych w populacjach komórek3.
Reportery fluorescencyjne mogą być trzech typów: 1) pozakomórkowe, 2) cytoplazmatyczne lub 3) pęcherzykowe. 1) Reportery zewnątrzkomórkowe to znaczniki polarne (np. dektrans, sulforodamina B (SRB), żółcień lucyferowa, piranina), które mogą być wprowadzane przez środowisko zewnątrzkomórkowe4. Zastosowanie znaczników polarnych pozwala na badanie porów fuzyjnych w populacji komórek i wychwytuje różne struktury międzykomórkowe, takie jak naczynia krwionośne. Nie informują jednak o zachowaniu ładunku pęcherzykowego. 2) Reportery cytoplazmatyczne to sondy fluorescencyjne sprzężone z białkami związanymi z błoną, które są skierowane w stronę cytoplazmy i biorą udział w dokowaniu i egzocytozie. Przykłady obejmują członków rodziny rozpuszczalnych receptorów białka przyłączającego czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (SNARE), które zostały z powodzeniem wykorzystane w neurobiologii do badania uwalniania neuroprzekaźników5. Takie białka mają wielu partnerów wiążących i nie są specyficzne dla granulek insuliny. 3) Reportery pęcherzykowe to sondy fluorescencyjne połączone z pęcherzykowymi białkami ładunkowymi, które pozwalają na badanie zachowania pęcherzyków specyficznych dla ładunku. Białka ładunkowe specyficzne dla granulek insuliny obejmują między innymi insulinę, peptyd c, polipeptyd amyloidowy wysp trzustkowych i NPY6,7. NPY występuje tylko w granulkach zawierających insulinę i jest uwalniany jednocześnie z insuliną, co czyni go doskonałym partnerem dla fluorescencyjnego reportera8.
Fuzja różnych białek fluorescencyjnych z NPY została wcześniej wykorzystana do badania różnych aspektów egzocytozy w komórkach neuroendokrynnych, takich jak wymagania specyficznych izoform synaptotagminy9,10 i jak czas uwalniania zależy od cytoszkieletu aktynowego i od miozyny II11,12. W tym badaniu wybraliśmy pHluorin jako fluorescencyjny reporter, który jest zmodyfikowanym GFP, który jest niefluorescencyjny w kwaśnym pH wewnątrz gęstych granulek rdzeniowych, ale staje się jasno fluorescencyjny po wystawieniu na obojętne zewnątrzkomórkowe pH 13. Dojrzałe granulki insuliny mają kwaśne pH poniżej 5,5. Gdy granulka połączy się z błoną plazmatyczną i otworzy się, jej ładunek jest wystawiany na działanie neutralnego zewnątrzkomórkowego pH 7,4, co pozwala na użycie wrażliwych na pH białek pHluorin jako reportera7,14.
Ze względu na wrażliwy na pH charakter pHluorin i selektywną ekspresję NPY w granulkach insuliny, konstrukt fuzji NPY-pHluorin może być używany do badania różnych właściwości egzocytozy granulek insuliny. Wirusowe dostarczanie konstruktu fuzyjnego zapewnia wysoką wydajność transfekcji i działa na pierwotne komórki beta lub linie komórkowe, a także na izolowane wyspy trzustkowe. Metoda ta może być również stosowana jako wskazówka do badania egzocytozy w dowolnym innym typie komórek z pęcherzykami zawierającymi NPY. Można go również połączyć z dowolnym transgenicznym modelem myszy w celu zbadania wpływu niektórych stanów (knockdowns, nadekspresja itp.) na egzocytozę. Technika ta była wcześniej używana do charakteryzowania przestrzennych i czasowych wzorców wydzielania granulek insuliny w populacjach komórek beta w ludzkich wyspach trzustkowych15.

<table><tbody><tr><td>Pionowy laserowo-skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>TCS-SP5</td><td>zawiera LAS AF, oprogramowanie do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Komora obrazowania</td><td>Instrumenty Warner</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Platforma komory obrazowania</td><td>Instrumenty Warner Szkiełka</td> nakrywkowe <td>szklane PH-1</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40</td><td>Daiggerbrand</td><td>G15972H</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum smar silikonowy</td><td>Sigma</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowy system perfuzyjny</td><td>Warner instruments</td><td>VC-8</td><td></td></tr><tr><td>Pojedyncza grzałka roztworu</td><td>inline Warner instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Perystaltyczna pompa ssąca</td><td>Pharmacia</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego, </td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td></td></tr><tr><td>CMRL Medium, bez glutaminy</td><td>ThermoFisher</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>FBS, inaktywowany termicznie</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>5 M roztwór NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>3 M roztwór KCl</td><td>Sigma</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl2 roztwór</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 roztwór</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Filtr próżniowy</td><td>VWR</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANNEP</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie konfokalne neuropeptydu y-phluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Wydzielanie insuliny odgrywa kluczową rolę w homeostazie glukozy w normalnych warunkach fizjologicznych, jak również w chorobie. Obecne podejścia do badania egzocytozy granulek insuliny wykorzystują elektrofizjologię lub mikroskopię sprzężoną z ekspresją reporterów fluorescencyjnych. Jednak większość z tych technik została zoptymalizowana pod kątem klonalnych linii komórkowych lub wymaga dysocjacji wysp trzustkowych. Natomiast przedstawiona tutaj metoda pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych wyspach trzustkowych. W tym protokole najpierw opisujemy infekcję wirusową izolowanych wysp trzustkowych adenowirusem, który koduje wrażliwe na pH białko zielonej fluorescencji (GFP), pHluorynę, sprzężone z neuropeptydem Y (NPY). Po drugie, opisujemy obrazowanie konfokalne wysp trzustkowych pięć dni po infekcji wirusowej i sposób monitorowania wydzielania granulek insuliny. Krótko mówiąc, zainfekowane wyspy trzustkowe umieszcza się na szkiełku nakrywkowym w komorze obrazowania i obrazuje pod pionowym laserowym mikroskopem konfokalnym, podczas gdy są one stale perfundowane roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym różne bodźce. Obrazy konfokalne obejmujące wysepkę o wielkości 50 μm są rejestrowane jako nagrania poklatkowe za pomocą szybko rezonansowego skanera. Fuzję granulek insuliny z błoną plazmatyczną można obserwować w miarę upływu czasu. Procedura ta pozwala również na przetestowanie baterii bodźców w jednym eksperymencie, jest kompatybilna zarówno z mysimi, jak i ludzkimi wyspami trzustkowymi i może być łączona z różnymi barwnikami do obrazowania funkcjonalnego (np. potencjałem błonowym lub cytozolowymi barwnikami wapniowymi).

Cały schemat działania techniki przedstawiono na Rysunku 1. W skrócie, wyspki mysie lub ludzkie można zainfekować adenowirusem kodującym NPY-pHluorinę, a po kilku dniach hodowli obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. W momencie fuzji ziarnistości z błoną plazmatyczną i ich otwarcia obserwuje się wzrost fluorescencji, który można ilościowo określić (Rysunek 1). Aby ustalić, czy NPY-pHluorina jest rzeczywiście odpowiednim nar...

Opisujemy protokół wizualizacji egzocytozy insuliny w nienaruszonych wyspach trzustkowych za pomocą pHluoryny, wrażliwego na pH białka zielonej fluorescencji. Izolowane wysepki są zakażone adenowirusem kodującym pHluorynę sprzężoną z neuropeptydem Y ładunku pęcherzyka. Pozwala to na wykrycie zdarzeń fuzji granulek insuliny za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Ogólnym celem tego testu jest wizualizacja egzocytozy ziarnulek insuliny w czasie rzeczywistym w nienaruszonych wysepkach trzustkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda ta pozwoli odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cukrzycy. Na przykład: co reguluje egzocytozę insuliny?Jest to kluczowe, ponieważ fuzja granulek jest najważniejszym zdarzeniem w cyklu życia komórki beta. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania nienaruszonych wysepek, co pozwala na obserwację zdarzeń fuzji w komórkach w ich naturalnym środowisku. Technikę tę zaprezentuje Madina Mahkmutova, doktorantka z naszego laboratorium.Po otrzymaniu wysp trzustkowych należy przenieść je do probówek typu Falcon o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę z wyspami przy 1 000 obr./min przez pięć minut. Wyspy osadzą się na dnie probówki; należy przenieść je w 2 ml pożywki CMRL do 35 mm szalek Petriego, które nie były traktowane do hodowli tkanek, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny przed infekcją wirusową. Po ich izolacji należy zawiesić odpowiednią liczbę ekwiwalentów wysp trzustkowych myszy w 2 ml pożywki CMRL i przenieść je do 35 mm szalek Petriego nieprzystosowany

confocal-imaging-neuropeptide-y-phluorin-technique-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę obrazowania komórek wysp trzustkowych w czasie rzeczywistym, w celu zbadania zmian w stężeniu wapnia cytozolowego w mniejszych subpopulacjach komórek wysp trzustkowych. Mniejsze subpopulacje komórek można zidentyfikować za pomocą funkcjonalnych odpowiedzi na związki markerowe, takie jak adrenalina i grelina, które indukują zmiany w cytozolowym wapniu w określonych populacjach komórek wysp trzustkowych. Może to zapewnić wgląd w wzajemne oddziaływanie między poziomem...

Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach trzustki: technika badania zmian w czasie rzeczywistym stężenia wapnia cytozolowego w wyspach trzustkowych

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Ten protokół opisuje technikę obserwacji w czasie rzeczywistym transportu białka GLUT4 (Glucose Transporter 4) w czasie rzeczywistym po stymulacji insuliną oraz charakterystykę biologicznej roli CCR5 w szlaku sygnałowym insuliny-GLUT4 za pomocą mikroskopii dekonwolucyjnej.

Obrazy na żywo transportu białka GLUT4 w pierwotnych neuronach podwzgórza myszy przy użyciu mikroskopii dekonwolucyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania sekcji ludzkiej trzustki w trzech wymiarach (3D) przy użyciu zoptymalizowanych metod pasywnego oczyszczania. Niniejszy manuskrypt demonstruje te procedury pasywnego oczyszczania optycznego, a następnie wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego w celu zidentyfikowania kluczowych elementów autonomicznych i czuciowych sieci neuronowych unerwiających ludzkie wyspy trzustkowe.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości sieci neurowyspiowej ludzkiej trzustki

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę obrazowania żywych komórek regulowanej egzocytozy. Metoda ta wykorzystuje dekstran FITC, który gromadzi się w organellach związanych z lizosomami, jako reporter. Ta prosta metoda pozwala również na rozróżnienie różnych trybów regulowanej egzocytozy w komórkach, które są trudne do manipulowania genetycznie.

Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.

Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

Ten protokół opisuje, jak generować ludzkie wycinki trzustki od zmarłych dawców narządów w celu badania funkcji komórek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. To innowacyjne podejście umożliwia badanie normalnych i strukturalnie uszkodzonych wysp trzustkowych oraz skomplikowanych interakcji między przedziałami endokrynnymi i zewnątrzwydzielniczymi.

Generowanie wycinków ludzkiej tkanki trzustki w celu badania fizjologii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej trzustki

Opracowaliśmy test hybrydyzacji Duplex in situ do mapowania izoform receptora insuliny IR-A i IR-B w mysim splocie naczyniówkowym, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod. To podejście o wysokiej rozdzielczości ujawnia ekspresję specyficzną dla izoformy, oferując nowe informacje na temat sygnalizacji insuliny w mózgu i potencjalnych terapii ukierunkowanych na izoformy w zaburzeniach neurologicznych.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Poznaj metodę obrazowania konfokalnego egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych wyspach trzustkowych myszy i człowieka przy użyciu neuropeptydu Y-pHluorin.

Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych

Przeglądaj więcej filmów