Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych

Ogólnym celem tego testu jest wizualizacja egzocytozy ziarnulek insuliny w czasie rzeczywistym w nienaruszonych wysepkach trzustkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda ta pozwoli odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cukrzycy. Na przykład: co reguluje egzocytozę insuliny?

Jest to kluczowe, ponieważ fuzja granulek jest najważniejszym zdarzeniem w cyklu życia komórki beta. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania nienaruszonych wysepek, co pozwala na obserwację zdarzeń fuzji w komórkach w ich naturalnym środowisku. Technikę tę zaprezentuje Madina Mahkmutova, doktorantka z naszego laboratorium.

Po otrzymaniu wysp trzustkowych należy przenieść je do probówek typu Falcon o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę z wyspami przy 1 000 obr./min przez pięć minut. Wyspy osadzą się na dnie probówki; należy przenieść je w 2 ml pożywki CMRL do 35 mm szalek Petriego, które nie były traktowane do hodowli tkanek, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny przed infekcją wirusową. Po ich izolacji należy zawiesić odpowiednią liczbę ekwiwalentów wysp trzustkowych myszy w 2 ml pożywki CMRL i przenieść je do 35 mm szalek Petriego nieprzystosowanych do hodowli tkanek.

Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny przed infekcją wirusową. Aby przeprowadzić infekcję wirusową, dodać od 5 do 10 µL roztworu wirusa do każdej szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej ludzkie lub mysie wysepki w 2 mL pożywki hodowlanej CMRL. Po 24 godzinach hodowli wysepek odessać pożywkę i zastąpić ją 2 mL pożywki hodowlanej CMRL bez wirusa.

Kulturować wysepki przez cztery do sześciu dni, wymieniając pożywkę co trzy dni. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy, łącząc wymienione tutaj odczynniki, a następnie wysterylizować bufor poprzez filtrację. Przygotować podstawową pożywkę glukozową o końcowym stężeniu glukozy 3 mM, dodając 75 µL roztworu zapasowego glukozy 2 M do 50 mL roztworu zewnątrzkomórkowego.

Następnie, aby przygotować pożywkę hiperglikemiczną o końcowym stężeniu glukozy 16 mM, należy dodać 400 µL roztworu zapasu glukozy o stężeniu 2 M do 50 mL roztworu zewnątrzkomórkowego. Rozcieńczyć wszelkie dodatkowe bodźce oraz roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający 3 mM glukozy. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy poddać szkiełka podstawowe wstępnej obróbce, nakładając 30 µL roztworu poli-d-lizyny o stężeniu 1 mg/mL i inkubując przez jedną godzinę.

Następnie dokładnie opłucz szkiełka podstawowe wodą. Przynajmniej na godzinę przed eksperymentem przenieś grupę wysepek do szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej roztwór zewnątrzkomórkowy z 3 mM glukozy. Pozostałe wysepki przechowuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

Na 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu przymocuj szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania, używając smaru silikonowego do uszczelnienia. Następnie zamocuj komorę obrazowania na platformie obrazującej. W kolejnym kroku, za pomocą pipety, przenieś od 20 do 30 wysepek do obszaru szkiełka nakrywkowego potraktowanego poli-d-lizyną i pozostaw wysepki na 20 minut, aby przylgnęły do powierzchni.

Ten krok jest kluczowy dla powodzenia eksperymentu; zbieramy około 20 do 30 wysp w mniej niż 10 µL buforu i odczekujemy 20 minut. Ważne jest, aby nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć uszkodzenia wysp. Podczas gdy wyspy przylegają do szkiełka nakrywkowego, należy przygotować system perfuzyjny, dokładnie płucząc go wodą.

Następnie należy dodać każdy roztwór do innego kanału, zgodnie z poniższą tabelą. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z układu, otwierając każdy kanał osobno i pozwalając roztworowi przepływać przez kilka minut. Upewnij się, że przepływ jest stabilny, a rurki nie przeciekają.

Następnie podłącz pojedynczy przepływowy podgrzewacz roztworów do rurki wylotowej perfuzji i ustaw temperaturę wypływającego buforu na 37 °C. Następnie przygotuj pompę ssącą. Podłącz przewody, włącz pompę i upewnij się, że ciecz jest odsysana.

Umieść platformę obrazującą z wyspami na stoliku mikroskopu i podłącz ją do systemu perfuzyjnego oraz pompy ssącej. Następnie ostrożnie napełnij komorę obrazującą roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy. Aby przeprowadzić obrazowanie konfokalne, zlokalizuj wyspy w polu widzenia mikroskopu przy użyciu małego powiększenia.

Po ustawieniu ostrości na wysepkach należy przełączyć się na obiektywy o większym powiększeniu. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i aktywuj wbudowany tryb skanowania. Wybierz obrazowanie xyzt, a następnie, aby skonfigurować ustawienia akwizycji, włącz laser argonowy i ustaw go na 30%, a następnie linię lasera 488 nanometr, dostosowując moc lasera do około 50% w celu wzbudzenia pHluoriny.

Zbierz emisję w zakresie od 505 do 555 nanometrów, opierając się na widmie emisji EGFP. Wybierz rozdzielczość 512 na 512 pikseli. Rozpocznij obrazowanie, naciskając przycisk live, a następnie dostosuj poziomy wzmocnienia.

Ustaw początek i koniec stosu z (z-stack), ustawiając ostrość na górnej części wysepki i wybierając opcję „begin”, a następnie przechodząc do ostatniej płaszczyzny, na której można ustawić ostrość, i wybierając opcję „end”. Wybierz rozmiar stosu z wynoszący 5 µm. Ustaw odstęp czasu dla akwizycji każdego stosu z na około 1,5 do 2 s i wybierz opcję „acquire until stopped” w celu prowadzenia ciągłego obrazowania.

Następnie naciśnij przycisk start, aby zainicjować obrazowanie. W celu zastosowania protokołów stymulacji indukujących egzocytozę ziarnistości należy odnieść się do protokołu tekstowego. Przy użyciu wbudowanego skanera obrazy konfokalne wysepki są pozyskiwane jako nagrania timelapse w czasie krótszym niż dwie sekundy.

Ponadto technikę tę można połączyć z barwnikami do obrazowania funkcjonalnego, takimi jak barwniki potencjału błonowego lub wolnego wapnia cytozolowego. Aby określić, czy NP Y-pHluorin jest rzeczywiście odpowiednim narzędziem do monitorowania dynamiki ziarnistości insuliny, zainfekowane wysepki poddano immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko GFP dla NP Y-pHluorin oraz przeciwko hormonom wysepek: insulinie, somatostatynie lub glukagonowi. Większość komórek wykazujących ekspresję NP Y-pHluorin stanowiły komórki beta, ponieważ wykazywały one również ekspresję insuliny.

Jedynie kilka komórek alfa dodatnich pod kątem glukagonu lub komórek delta dodatnich pod kątem somatostatyny zostało oznakowanych białkiem GFP. Co istotne, w zakażonych komórkach fuzja NP Y współlokalizowała z insuliną. Rysunek ten dowodzi, że pHluorin jest skutecznym sensorem pH.

Ponieważ zwiększenie wewnątrzkomórkowego pH za pomocą 50 mM chlorku amonu spowodowało wzrost fluorescencji wewnątrzkomórkowej o ponad 500%, wraz ze wzrostem pH wewnątrz ziarnistości podczas fuzji z błoną plazmatyczną w momencie otwarcia poru fuzyjnego, ziarnistości zawierające NP Y-pHluorin stają się widoczne w warunkach stymulujących egzocytozę insuliny, takich jak depolaryzacja błony chlorkiem potasu. Wykorzystując konfokalne obrazowanie timelapse zainfekowanych wysp NP Y-pHluorin, można wizualizować pojedyncze zdarzenia sekrecyjne w komórkach beta w obrębie nienaruszonych wysp.

Zjawiska te występują w odpowiedzi na bezpośrednią depolaryzację błony chlorkiem potasu lub kilka innych bodźców fizjologicznych. Przy podstawowym stężeniu glukozy zewnątrzkomórkowej obserwuje się niewielką aktywność wydzielniczą. Jednakże fuzja ziarnistości z błoną plazmatyczną jest wywoływana w odpowiedzi na stymulację wysokim stężeniem glukozy.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dlaczego fuzja ziarnistek zachodzi w określonych obszarach komórki. Po opracowaniu ta technika była wykorzystywana do badania wzorca czasowego sekrecji ziarnistek insuliny w populacjach komórek beta w ludzkich wysepkach.