In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie metodologii elektrofizjologicznych zapisów nerwów czuciowych jelita grubego in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie pióra in vitro, takie jak wpływ wrażliwości zewnętrznych obwodowych musów na korekcję hiperalgezji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na rozróżnienie jelita grubego w podobny sposób, w jaki dokonuje się rozróżnienia tętnicy szyjnej in vivo, u zwierząt lub u pacjentów.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ zlokalizowanie zwojów i wypreparowanie nerwów jest stosunkowo trudne. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odsłonić jamę brzuszną głęboko znieczulonego szczura, wykonując nacięcie w linii środkowej na ścianie brzucha za pomocą skalpela. Następnie odciągnij krezkę i inne tkanki na bok, aby odsłonić jelito grube.

Następnie umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym. Poprzez staranną sekcję zlokalizuj lewy ganglion miednicy i zidentyfikuj nerwy miednicy oraz łączące się z nim nerwy splanchniczne lędźwiowe. Następnie przetnij te nerwy kilka milimetrów od zwoju miednicy.

Zlokalizowanie zwoju miednicy i wypreparowanie nerwów jest najbardziej krytycznym i najtrudniejszym etapem tej procedury. Następnie przetnij kość spojenia, aby odsłonić odbytnicę. Usuń tkanki powyżej jelita grubego i uważaj, aby pozostawić zwój miednicy nienaruszony.

Po poświęceniu szczura przez dożylne wstrzyknięcie przedawkowania pentobarbitalu, należy przeciąć okrężnicę około trzech centymetrów powyżej zwoju miednicy i usunąć jelito grube ze zwierzęcia za pomocą kleszczy. Następnie przenieś jelito grube na szalkę Petriego wypełnioną wstępnie schłodzonym roztworem Krebsa. Usuń kał, delikatnie spłukując okrężnicę.

Następnie ostrożnie usuń resztki pęcherza moczowego i inne tkanki, nie naruszając zwoju miednicy. W tej procedurze umieść okrężnicę w komorze rejestracyjnej i stale oblewaj tkankę karbogenicznym roztworem Krebsa. Następnie kanuluj jelito grube zarówno na końcu jamy ustnej, jak i odbytu, a następnie rozpocznij infuzję śródświetlną okrężnicy solą fizjologiczną w kierunku ustno-odbytniczym, a następnie zlokalizuj główny ganglion miednicy pod mikroskopem preparacyjnym i użyj szpilek do owadów, aby odsłonić ganglion.

Po dokładnym rozbiorze znajdź cienką gałąź nerwu wychodzącą ze zwoju i biegnącą w kierunku okrężnicy, a następnie przetnij nerw blisko zwoju. Przed kolejnym krokiem włącz łaźnię grzewczą i utrzymuj roztwór Krebsa w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Teraz sprawdź wstępnie wyciągniętą szklaną pipetę pod mikroskopem preparacyjnym.

Złamać końcówkę elektrody za pomocą kleszczy tak, aby miała rozmiar zgodny ze średnicą nerwu, który ma być rejestrowany. Następnie ukosuj końcówkę, umieszczając ją w pobliżu jaśniejszego rozbłysku. Nowość w tej metodologii może również mieć trudności z ukosowaniem końcówki elektrody zgodnie z rozmiarem nerwu.

Następnie umieść skośną elektrodę w uchwycie elektrody, a następnie podłącz 10-mililitrową strzykawkę do bocznego portu uchwytu w celu przyłożenia podciśnienia lub nadciśnienia do elektrody. Następnie podłącz uchwyt do stopnia głównego biowzmacniacza i zamontuj stopień główny na manipulatorze. Następnie przenieś elektrodę do kąpieli tkankowej i napełnij elektrodę roztworem Krebsa, delikatnie odsysając, aż zetknie się ze srebrnym drutem uchwytu.

Następnie umieść końcówkę elektrody blisko przeciętego końca nerwu i zastosuj podciśnienie, aby zassać nerw do elektrody. Następnie zastosuj większe podciśnienie, tak aby około jednego milimetra nerwu zostało wciągnięte do elektrody i utworzyło szczelne uszczelnienie. Teraz włącz biowzmacniacz i ustaw filtr na 300 do trzech tysięcy herców.

Monitoruj sygnał na oscyloskopie i rejestruj sygnał nerwowy oraz sygnał ciśnienia śródświetlnego w oprogramowaniu do przetwarzania danych o skokach. Następnie zastosuj rampowe rozdęcie okrężnicy, zamykając trójkierunkowy kran na kaniuli wylotowej, jednocześnie stale wlewając się śródświetlne. Monitoruj ciśnienie śródświetlne, aż osiągnie 60 milimetrów słupa rtęci, a następnie otwórz trójkierunkowy kran na kaniuli drenującej.

Powtarzaj tę procedurę w regularnych odstępach piętnastu minut i stosuj leki dodatkowo lub doświetliście, aby przetestować wrażliwość chemiczną nerwów doprowadzających. Poniżej znajduje się schematyczna ilustracja układu doświadczalnego do preparatu jelita grubego ex vivo z reprezentatywnym zapisem od dystalnego nerwu do zwoju miednicy. W preparatach od normalnych szczurów nerwy doprowadzające okrężnicy zazwyczaj mają niski poziom regularnej spontanicznej aktywności.

Rozdęcie okrężnicy na rampie powoduje stopniowy wzrost szybkości wypalania. Właściwość mechanosensoryczna każdego nerwu jest reprezentowana przez wykreślenie krzywej odpowiedzi nerwu aferentnego pod ciśnieniem śródświetlnym. Alternatywnie zapis można wykonać z gałęzi nerwów miednicy proksymalnej do zwoju miednicy.

Profil aktywności mechanosensorycznej proksymalnych nerwów miednicy jest zwykle podobny do obserwowanego w nerwie dystalnym do zwoju miednicy. Analiza głównych składowych przebiegów potencjałów czynnościowych z zapisu wielojednostkowego może być przeprowadzona w celu rozróżnienia aktywności pojedynczej jednostki. Oto nałożone na siebie przebiegi dwóch pojedynczych aferenów miednicy.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć anatomię głównych zwojów miednicy i innych nerwów oraz być w stanie zlokalizować zwoje, aby wypreparować nerwy i zarejestrować aktywność aferentną. Zaletą tego protokołu jest to, że może on pozwolić na porównanie właściwości elektrofizjologicznych i profili farmakologicznych nerwów doprowadzających do miednicy i splanchnicznej.