Name: In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę elektrofizjologicznych rejestracji nerwów czuciowych okrężnicy in vitro u szczura. Technika ta pozwala analizować właściwości mechanosensoryczne nerwów aferentnych i ich rolę w bólu trzewnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten protokół był wspierany przez granty badawcze z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (#31171066, #81270464) oraz Chińsko-Niemieckiego Centrum Nauki (GZ919).

Opisany tutaj protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Etyki Zwierząt Szkoły Medycznej Uniwersytetu Jiaotong w Szanghaju (# SYXK2013-0050). Sekcja jelita grubego z nienaruszonym ganglionem i pniem nerwowym zajmuje minimum 15 minut dla osoby dość doświadczonej w tej technice. W związku z tym konieczne jest utrzymanie zwierzęcia przy życiu, ale w głębokim znieczuleniu podczas wykonywania sekcji, aby zapewnić żywotność tkanki do późniejszego zapisu elektrofizjologicznego.
1. Przygotowanie roztworu perfuzyjnego i związków testowych
<ol>
	<li>Przygotuj 5 l roztworu Krebsa: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2 i 11,5 mM glukozy. Nasycić roztwór mieszaniną gazów o stężeniu 95%O2 + 5%CO2. Wstępnie schłodzić ~500 ml natlenionego Krebsa w lodówce.</li>
	<li>W razie potrzeby przygotować podwielokrotności podstawowych związków badanych (1 mM kapsaicyny w etanolu i 10 mM 5-hydroksytryptaminy (5-HT) w soli fizjologicznej). Rozcieńczyć wywar w roztworze Krebs (do kąpieli) i w soli fizjologicznej (do podawania doświetlnego) do końcowego stężenia tuż przed użyciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrody rejestrującej
<ol>
	<li>Wyciągnij elektrodę rejestrującą ze standardowych szklanych rurek bez wewnętrznych żarników (średnica zewnętrzna 1,5 mm) za pomocą konwencjonalnego ściągacza elektrod. Dostosuj ustawienia ściągacza do ciepła i pociągnij tak, aby trzpień ciągniętych elektrod znajdował się między 20 a 25 mm.</li>
</ol>
3. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Dokładnie znieczulić szczura za pomocą pentobarbitalu sodu (80 mg/kg, i.p.).  </li>
	<li>Zapewniając sterylność, należy odsłonić jamę brzuszną, wykonując nacięcie w linii środkowej ściany brzucha za pomocą skalpela. Odciągnij krezkę i inne tkanki na bok, aby odsłonić jelito grube.</li>
	<li>Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym. Poprzez staranną sekcję zlokalizuj lewy PG i zidentyfikuj PN i łączący go LSN. Przetnij te nerwy kilka milimetrów od PG. 
	UWAGA: PG leży blisko połączenia jelita grubego. Zazwyczaj 3 - 4 PN od rdzenia kręgowego lędźwiowo-krzyżowego i projekt LSN do PG (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Przetnij kość spojenia, aby odsłonić odbytnicę. Usuń tkanki (tj. pęcherz moczowy itp.) powyżej jelita grubego; uważaj, aby pozostawić PG nienaruszony.</li>
	<li>Złóż szczura w ofierze przez dożylne wstrzyknięcie przedawkowania pentobarbitalu. Przeciąć okrężnicę około 3 cm powyżej PG i usunąć jelito grube ze zwierzęcia za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przenieść jelito grube na szalkę Petriego wypełnioną wstępnie schłodzonym roztworem Krebsa. Usuń kał, delikatnie spłukując okrężnicę. Ostrożnie usuń resztki pęcherza moczowego i inne tkanki, nie naruszając PG.</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie nerwów doprowadzających okrężnicy
<ol>
	<li>Umieścić okrężnicę w komorze rejestracyjnej (20 ml) i w sposób ciągły perfundować tkankę karbonogennym roztworem Krebsa. Ustaw szybkość perfuzji na 15 ml/min.</li>
	<li>Kanniulacja jelita grubego zarówno na końcu ustnym, jak i odbytowym. Rozpocząć infuzję doświetlną okrężnicy solą fizjologiczną z szybkością 10 ml/h w kierunku doustnym do odbytu.</li>
	<li>Zlokalizuj główny PG pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj szpilek przeciw owadom, aby odsłonić ganglion. Po dokładnym przeprowadzeniu sekcji znajdź delikatną gałąź nerwu wychodzącą ze zwoju i biegnącą w kierunku okrężnicy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Przetnij nerw w pobliżu ganglionu. 
	UWAGA: Rysunek 1 ilustruje nagranie z gałęzi nerwowej dystalnej do PG. Nerw prawdopodobnie zawiera mieszaninę włókien doprowadzających miednicy i odcinka lędźwiowego splanchnicznego. Alternatywnie można dokonać zapisu z PN i/lub LSN proksymalnie do PG.</li>
	<li>Włączyć łaźnię grzewczą i podgrzać roztwór Krebsa, aby utrzymać temperaturę komory na poziomie 34 ± 0,5 °C.</li>
</ol>
5. Przygotowanie elektrody ssącej
<ol>
	<li>Weź wstępnie wyciągniętą szklaną pipetę (krok 2) i sprawdź ją pod mikroskopem preparacyjnym. Złamać końcówkę elektrody za pomocą kleszczy tak, aby miała rozmiar zgodny ze średnicą nerwu, który ma być rejestrowany.</li>
	<li>Skoś końcówkę, umieszczając ją w pobliżu jaśniejszego rozbłysku.</li>
</ol>
6. Zapis elektrofizjologiczny
<ol>
	<li>Podłącz skośną elektrodę do uchwytu elektrody. Podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do bocznego portu na uchwycie, aby wywrzeć podciśnienie lub nadciśnienie na elektrodzie.</li>
	<li>Podłącz uchwyt do stopnia głównego bioamplifier i zamontuj stopień główny na manipulatorze.</li>
	<li>Przenieś elektrodę do kąpieli tkankowej i napełnij elektrodę roztworem Krebsa, delikatnie odsysając, aż zetknie się ze srebrnym drutem uchwytu. Umieść końcówkę elektrody blisko przeciętego końca nerwu i zastosuj podciśnienie, aby zassać nerw do elektrody. Zastosuj większe podciśnienie, aby ~1 mm nerwu został wciągnięty do elektrody i utworzył szczelne uszczelnienie.</li>
	<li>Włącz biowzmacniacz i ustaw filtr na 300 - 3,000 Hz. Monitoruj sygnał na oscyloskopie i rejestruj sygnał nerwowy (częstotliwość próbkowania 20 kHz) oraz sygnał ciśnienia śródświetlnego (częstotliwość próbkowania 100 Hz) za pomocą komputera z oprogramowaniem do przetwarzania danych skokowych.</li>
</ol>
7. Testowanie wrażliwości jelita grubego na aferentne
<ol>
	<li>Zastosuj rampowe rozdęcie okrężnicy, zamykając trójkierunkowy kran na kaniuli wylotowej, jednocześnie stale wlewając się śródświetlnie. Monitoruj ciśnienie śródświetlne, aż osiągnie 60 mmHg, po czym otwórz trójdrożny kran na kaniuli drenującej.</li>
	<li>Powtarzaj tę procedurę w regularnych odstępach czasu 15 minut. Stosuj leki docelowo lub śródświetlnie, aby sprawdzić wrażliwość chemiczną nerwów doprowadzających.</li>
</ol>

<ol><li>Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basis+of+visceral+pain%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Biological basis of visceral pain: recent developments.</a> Pain. 96 (3), 221-225 (2002).</li>
<li>Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spinal+distribution+and+neurochemical+phenotype+of+colonic+afferents+in+mouse+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat.</a> J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).</li>
<li>Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+mechanisms+contribute+to+mechanosensory+transduction+in+the+rat+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum.</a> Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+the+Primary+Afferent+Nerves+in+a+Rat+Model+of+Diabetic+Visceral+Hyposensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity.</a> Mol Pain. 11, (2016).</li>
<li>Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recordings+of+afferent+fibres+with+receptive+fields+in+the+serosa%2C+muscle+and+mucosa+of+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon.</a> J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).</li>
<li>Page, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+contributions+of+ASIC+channels+1a%2C+2%2C+and+3+in+gastrointestinal+mechanosensory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function.</a> Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).</li>
<li>Hockley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y+Receptors+Sensitize+Mouse+and+Human+Colonic+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors.</a> J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).</li>
<li>Peiris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+afferent+recordings%3A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human visceral afferent recordings: preliminary report.</a> Gut. 60 (2), 204-208 (2011).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Functional+Characterization+of+Mouse+Colorectal+Afferent+Endings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings.</a> J Vis Exp. (95), e52310(2015).</li>
<li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Recording+of+Mesenteric+Afferent+Nerve+Activity+in+Mouse+Jejunal+and+Colonic+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jejunalafferent+nerve+sensitivity+in+wild-type+and+TRPV1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice.</a> J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).</li>
<li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+chemosensory+function+and+receptor+expression+of+splanchnic+and+pelvic+colonic+afferents+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice).</a> J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li>
<li>La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+expression+of+transient+receptor+potential+channel+V1%2C+transient+receptor+potential+channel+A1+and+mechanosensitive+two+pore-domain+K%2B+channels+between+the+lumbar+splanchnic+and+pelvic+nerve+innervations+of+mouse+urinary+bladder+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon.</a> Neuroscience. 186, 179-187 (2001).</li>
<li>Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+noxious+colonic+input+by+thoracolumbar+and+lumbosacral+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat.</a> J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół jest stosunkowo prostą metodą eksperymentalną służącą do oceny właściwości elektrofizjologicznych okrężnicy aferentnej szczurów. Wykonanie protokołu (od wypreparowania tkanek do ustawienia zapisu nerwu) trwa zwykle około 2 godzin. Pobranie tkanki (krok 3) i przygotowanie elektrody ssącej (krok 5) są krytycznymi etapami. Bardzo ważne jest, aby móc zlokalizować PG, LSN i PN oraz uważać, aby nie uszkodzić zwoju i nerwów podczas rozwarstwiania tkanek. Końcówka szklanej pipety musi być złamana i ś...

Przewód pokarmowy (GIT) jest bogato unerwiony zewnętrznymi nerwami doprowadzającymi, które przekazują sygnały czuciowe z jelit do ośrodkowego układu nerwowego i które przyczyniają się do interakcji jelito-mózg. Zmieniona pobudliwość tych zewnętrznych aferentów, jak również zmienione centralne przetwarzanie wejść aferentnych, leży u podstaw bólu trzewnego i innych objawów chorób przewodu pokarmowego, w tym funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit1. Informacje sensoryczne z jelita grubego są przekazywane głównie przez nerwy piersiowo-lędźwiowe/podbrzuszne i lędźwiowo-krzyżowe/miedniczne (PN)2. Wzrosło zainteresowanie badaniem właściwości elektrofizjologicznych tych pierwotnych włókien doprowadzających w modelach chorób gryzoni. Jednak zapisy elektrofizjologiczne in vivo aferentów okrężnicy u gryzoni stanowią wyzwanie techniczne i wymagają znacznych umiejętności chirurgicznych. Ponadto zmiany hemodynamiczne, ruch tkanek i środki znieczulające mogą również wpływać na aktywność nerwów i wrażliwość na bodźce testowe in vivo. Dlatego w ostatnich latach w coraz większej liczbie badań stosuje się preparaty in vitro (ex vivo) różnych gatunków, w tym myszy, szczurów, świnek morskich i ludzi, w celu zbadania mechanizmów transdukcji czuciowej w okrężnicy aferentnej i zmienionej pobudliwości w stanach chorobowych. 3,4,5,6,7,8
Przede wszystkim zgłoszono dwa rodzaje przygotowania okrężnicy ex vivo: przygotowanie "płaskiego arkusza"5,9,10 oraz przygotowanie "tuby"3,4. Wcześniej opublikowano protokół wideo dotyczący preparatu mysiego jelita grubego z "płaskim arkuszem"11. W tym protokole jelito grube myszy z przyczepionymi PN) lub nerwami lędźwiowymi (LSN) jest zbierane i superfuzjowane w komorze tkankowej. Jelito grube jest rozcinane wzdłużnie, a pęczek nerwowy jest przedłużany do komory zapisu wypełnionej olejem parafinowym. Aktywność nerwów rejestrowana jest za pomocą monopolarnej elektrody platynowo-irydowej. Protokół pozwala na identyfikację pól recepcyjnych poszczególnych włókien doprowadzających za pomocą bezstronnej stymulacji elektrycznej. Lokalizuje zastosowanie bodźców chemicznych, a także zastosowanie różnych paradygmatów stymulacji mechanicznej (np. ogniskowe sondowanie błony śluzowej i rozciąganie obwodowe) do zakończeń nerwowych doprowadzających. Ponieważ nerw musi być przedłużony do oddzielnej komory od komory tkankowej, bardzo ważne jest, aby przyczepiony nerw był stosunkowo długi; Udana sekcja nerwów stanowi wyzwanie dla tych, którzy dopiero zaczynają przygodę z tą metodologią. Niedawno Nullens i wsp. opublikowali protokół wideo do rejestracji in vitro krezkowych aferentów w mysich segmentach jelita czczego i okrężnicy12. W tym preparacie "rurkowym" segment jelita z przyczepioną krezką pozostaje nienaruszony, co pozwala na stopniowe rozdęcie oraz do- i pozaświetlne podawanie różnych substancji chemicznych. Ponieważ nerw krezkowy jest rejestrowany za pomocą elektrody ssącej, którą można umieścić blisko tkanki, aktywność aferentną można rejestrować, nawet jeśli nerw krezki jest stosunkowo krótki. Jednak nerw krezkowy składa się z mieszanych populacji włókien doprowadzających nerwu błędnego i rdzeniowego, które unerwiają jelito czcze lub podbrzusze piersiowo-lędźwiowe. Aferenty miedniczki lędźwiowo-krzyżowej unerwiają jelito grube, którego nie można dyskryminować w tym protokole. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół elektrofizjologicznego zapisu aferentów jelita grubego szczura za pomocą preparatu jelita grubego "rurkowego" z nienaruszonym PG. Metoda ta może pozwolić na scharakteryzowanie właściwości funkcjonalnych odcinka lędźwiowego splanchnicznego (hipożołądkowego) i lędźwiowo-krzyżowego doprowadzającego do miednicy.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Shanghai Westang Bio-Tech</td><td>B558</td><td></td></tr><tr><td>Kapsaicyna</td><td>Sigma</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod</td><td>MicroData Instrument Inc</td><td>PMP107</td><td></td></tr><tr><td>System neurologiczny (biowzmacniacz)</td><td>Digitimer, Ltd</td> Konwerter analogowo-cyfrowy <td>Neurolog System</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Micro1401</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 wersja 6</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>World Precision Instruments</td><td>EP12</td><td></td></tr><tr><td>Szklane rurki</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3SBW</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia grzewcza</td><td>Grant</td><td>GR150</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td></td><td>Leica Zoom2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>World Precision Instruments</td><td>PZMIII-BS</td><td></td></tr><tr><td>Zapalniczka</td><td>dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>World Precision Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>domowej roboty z drutu ze stali nierdzewnej 0,1 mm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td> <td>trójdrożnyWorld Precision Instruments</td><td>KITF-R</td><td></td></tr><tr><td>Rats</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Można użyć dowolnego szczepu/płci.</td></tr></tbody></table>

in vitro charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunkcja nerwów czuciowych okrężnicy jest wpisana w patofizjologię kilku powszechnych schorzeń, w tym funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit oraz cukrzycy. W tym miejscu opisujemy protokół charakterystyki in vitro właściwości elektrofizjologicznych aferentów okrężnicy u szczurów. Jelito grube, z przyczepionym nienaruszonym ganglionem miednicy (PG), jest usuwane ze szczura; przekrwiony karbogenicznym roztworem Krebsa w komorze zapisu; i kaniulowane na końcach ustnych i odbytowych, aby umożliwić rozdęcie. Identyfikowana jest cienka wiązka nerwowa wychodząca z PG, a wielojednostkowa aktywność nerwu doprowadzającego jest rejestrowana za pomocą elektrody ssącej. Rozdęcie odcinka okrężnicy powoduje stopniowy wzrost wydzieliny wielojednostkowej. Analizę głównych składowych przeprowadza się w celu rozróżnienia włókien aferentnych o niskim progu, wysokim progu i szerokim zakresie dynamiki. Wrażliwość chemiczną aferentów okrężnicy można badać poprzez kąpiel lub doświetlne podawanie badanych związków. Protokół ten można zmodyfikować w celu zastosowania do innych gatunków, takich jak myszy i świnki morskie, oraz do badania różnic we właściwościach elektrofizjologicznych piersiowo-lędźwiowych/podbrzusznych i lędźwiowo-krzyżowych/miednicznych doprowadzaczy okrężnicy zstępującej w warunkach normalnych i patologicznych.

Rysunek 1 jest schematyczną ilustracją układu doświadczalnego dla ex vivo przygotowanie okrężnicy w „tubie”, z reprezentatywnym zapisem z nerwu położonego dystalnie względem zwoju podbrzusznego (PG). Nerw ten prawdopodobnie zawierał mieszankę aferentnych włókien miednicznych i lędźwiowych splotów trzewnych. W preparatach od prawidłowych szczurów nerwy aferentne okrężnicy wykazują zazwyczaj niski poziom nieregularnej aktywności spontanicznej. Stopniow...

Nieprawidłowa funkcja czuciowa leży u podstaw bólu trzewnego i innych objawów funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit. Przedstawiono protokół elektrofizjologicznego zapisu nerwów doprowadzających okrężnicy w preparacie ex vivo jelita grubego szczura.

In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie metodologii rejestracji elektrofizjologicznej nerwów czuciowych okrężnicy i odbytnicy in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w obszarze badań in vitro, takie jak wpływ wrażliwości obwodowych włókien aferentnych na hiperalgezję okrężnicy i odbytnicy. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na izolację okrężnicy i odbytnicy w sposób analogiczny do izolacji tętnicy szyjnej przeprowadzanej in vivo u zwierząt lub pacjentów.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ lokalizacja zwojów i wypreparowanie nerwów są stosunkowo trudne. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odsłonić jamę brzuszną głęboko znieczulonego szczura, wykonując skalpelem nacięcie w linii środkowej ściany brzucha. Następnie odsunąć krezkę i inne tkanki, aby odsłonić okrężnicę i odbytnicę.Następnie umieść zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym. Poprzez ostrożną dyssekcję zlokalizuj lewy zwoj Pelviczny i zidentyfikuj nerwy miedniczne oraz nerwy trzewne lędźwiowe do niego dołączone. Następnie przetnij te nerwy w odległości kilku milimetrów od zwoju miednicznego.Zlokalizowanie zwoju miednicznego i wypreparowanie nerwów jest najkrytyczniejszym i najtrudniejszym etapem tej procedury. Następnie przetnij kość spojnia, aby odsłonić odbytnicę. Usuń tkanki powyżej okrężnicy i odbytnicy, uważając, aby nie uszkodzić zwoju miednicznego.Po uśmierconiu szczura poprzez dożylne wstrzyknięcie przedawkowanej dawki pentobarbitalu, przetnij jelito grube około trzech centymetrów powyżej zwoju miednicznego i usuń końcową część jelita grubego z organizmu zwierzęcia za pomocą pęsety. Następnie przenieś odcinek jelita do szalki Petriego wypełnionej schłodzonym roztworem Krebsa. Usuń treść jelitową, delikatnie przepłukując jelito grube.Następnie ostrożnie usuń pozostałości pęcherza moczowego oraz inne tkanki, tak aby nie uszkodzić zwoju miednicznego. W tej procedurze umieść jelito grube w komorze rejestracyjnej i stale perfunduj tkankę roztworem Krebsa nasyconym karbogenem. Następnie kaniuluj okrężnicę i odbytnicę zarówno od strony ustnej, jak i odbytniczej, a potem rozpocznij wlewanie soli fizjologicznej do światła jelita grubego w kierunku od strony ustnej do odbytnicy; po tym czasie zlokalizuj główny zwój miedniczny pod mikroskopem sekcyjnym i użyj szpilek entomologicznych, aby odsłonić zwój.Za pomocą ostrożnej dyssekcji odnajdź cienką gałązkę nerwu odchodzącą z zwoju i biegnącą w stronę okrężnicy, a następnie przetnij nerw blisko zwoju. Przed kolejnym krokiem włącz kąpiel wodną i utrzymuj roztwór Krebsa w temperaturze 34 °C. Teraz sprawdź przygotowaną wcześniej szklaną pipetę pod mikroskopem stereoskopowym.Odłam końcówkę elektrody za pomocą pęsety, aby jej rozmiar był dostosowany do średnicy rejestrowanego nerwu. Następnie ścinij końcówkę pod kątem, przykładając ją do płomienia zapalniczki. Osoby nieznające tej metodologii mogą mieć trudności z odpowiednim ścięciem końcówki elektrody w celu dopasowania jej do rozmiaru nerwu.Następnie umieść ściętą elektrodę w uchwycie elektrody, a następnie podłącz strzykawkę o pojemności 10 mililitrów do bocznego portu uchwytu, aby umożliwić przyłożenie podciśnienia lub nadciśnienia do elektrody. Po tym podłącz uchwyt do modułu przedwzmacniacza (head stage) bioamplifikatora i zamocuj moduł przedwzmacniacza na manipulatorze. Następnie przesuń elektrodę do kąpieli tkankowej i napełnij ją roztworem Krebsa, stosując delikatne ssanie, aż elektroda zetknie się z srebrnym drutem uchwytu.Następnie należy umieścić końcówkę elektrody blisko przeciętego końca nerwu i zastosować podciśnienie, aby wciągnąć nerw do elektrody. Następnie należy zwiększyć podciśnienie tak, aby około jeden milimetr nerwu został wciągnięty do elektrody, tworząc szczelne połączenie. Teraz należy włączyć bioamplifikator i ustawić filtr w zakresie od 300 do trzech tysięcy hertz.Monitoruj sygnał na oscyloskopie i rejestruj sygnał nerwowy oraz sygnał ciśnienia wewnątrzświatowego w oprogramowaniu do przetwarzania danych z impulsów. Następnie zastosuj rampowe rozciąganie jelita grubego, zamykając kurek trójdrożny na kaniuli wylotowej podczas ciągłej infuzji do światła jelita. Monitoruj ciśnienie wewnątrzświatowe, aż osiągnie ono 60 mmHg, a następnie otwórz kurek trójdrożny na kaniuli odpływowej.Powtarzaj tę procedurę w regularnych odstępach piętnastu minut i podawaj leki zewnątrz- lub wewnątrzświatłowo, aby zbadać wrażliwość chemiczną nerwów doprowadzających. Poniżej znajduje się schematyczne przedstawienie układu eksperymentalnego dla preparatu ex vivo jelita grubego i odbytnicy wraz z reprezentatywnym zapisem z nerwu dystalnego w stosunku do zwoju miednicznego. W preparatach od prawidłowych szczurów nerwy doprowadzające okrężnicy zazwyczaj wykazują niski poziom regularnej aktywności spontanicznej.Stopniowe rozciąganie okrężnicy indukuje stopniowy wzrost częstotliwości wyładowań. Właściwości mechanosensoryczne każdego nerwu są przedstawione poprzez wykreślenie krzywej odpowiedzi nerwu doprowadzającego na ciśnienie wewnątrzświatłowe. Alternatywnie, rejestrację można przeprowadzić z gałęzi nerwów miednicznych proksymalnie w stosunku do zwoju miednicznego.Profil aktywności mechanosensorycznej proksymalnych nerwów miednicznych jest zazwyczaj podobny do profilu obserwowanego w nerwie dystalnie względem zwoju miednicznego. Analiza głównych składowych kształtów potencjałów czynnościowych z rejestracji wielojednostkowej może zostać wykorzystana do rozróżnienia aktywności pojedynczych jednostek. Poniżej przedstawiono nałożone na siebie przebiegi potencjałów dwóch poszczególnych włókien doprowadzających nerwu miednicznego.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć dwie godziny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat anatomii głównych zwojów miedniczych oraz pozostałych nerwów, a także potrafić zlokalizować zwoje w celu wypreparowania nerwów i rejestracji aktywności aferentnej. Zaletą tego protokołu jest możliwość porównania właściwości elektrofizjologicznych i profili farmakologicznych nerwów aferentnych miedniczych oraz trzewnych.

in-vitro-characterization-electrophysiological-properties-colonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę rejestrowania aktywności nerwów doprowadzających okrężnicy w okrężnicy szczura ex-vivo, kaniulowanej na obu końcach i podawanej solą fizjologiczną w celu zwiększenia ciśnienia śródświetlnego. Wraz ze wzrostem ciśnienia sygnał nerwowy wzrasta, wskazując na jego stymulację.

Zapis elektrofizjologiczny nerwów doprowadzających okrężnicy w okrężnicy szczurzej okrężnicy

Ten film pokazuje proces rejestrowania sygnałów elektrycznych z krezkowych nerwów doprowadzających w wypreparowanym segmencie jelita czczego myszy w celu zbadania wpływu ciśnienia w tkance i zmian ruchu na aktywność nerwu doprowadzającego.

Zapis aktywności nerwu doprowadzającego krezki w segmencie jejunum myszy ex vivo

Ten film pokazuje jednowłóknowe nagranie przewodnictwa nerwowego włókna C u szczurów. Znieczulony szczur jest nacinany w celu odsłonięcia nerwu kulszowego, który zapewnia czuciowe i motoryczne zasilanie kończyn dolnych. Poszczególne włókna C są następnie naświetlane. Stymulacja elektryczna jest dostarczana za pomocą elektrod bodźcowych wszczepionych w stopę, a odpowiedź jest rejestrowana z pojedynczego włókna nerwowego.

Zapis in vivo pojedynczych włókien włókien C nerwu kulszowego u szczurów

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

Ten film demonstruje protokół przeprowadzania jednowłóknistych zapisów elektrofizjologicznych na preparacie in vitro mysiego nerwu jelita grubego.

Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

Nerwy doprowadzające krezkowe przekazują informacje z przewodu pokarmowego w kierunku mózgu dotyczące normalnej homeostazy, jak również patofizjologii. Aktywność nerwów doprowadzających przewodu pokarmowego można ocenić, montując izolowane segmenty jelita z przyczepionymi nerwami doprowadzającymi do kąpieli narządowej, izolując nerw i oceniając aktywność podstawową i stymulowaną.

In vitro Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy

Techniki pobudliwości aksonalnej dostarczają potężnego narzędzia do badania patofizjologii i zmian biofizycznych, które poprzedzają nieodwracalne zdarzenia zwyrodnieniowe. Manuskrypt ten demonstruje zastosowanie tych technik na nerwie łokciowym znieczulonych szczurów.

In vivo (in vivo)Pomiar elektrofizjologiczny nerwu łokciowego szczura z badaniem pobudliwości aksonalnej

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

Poznaj metodę elektrofizjologicznych rejestracji nerwów czuciowych okrężnicy in vitro u szczura. Technika ta pozwala analizować właściwości mechanosensoryczne nerwów aferentnych i ich rolę w bólu trzewnym.

In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

Przeglądaj więcej filmów