Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie in vivo monokultur astrocytów przy użyciu prostej, szybkiej i ekonomicznej metody. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie astroglibiologii, takie jak ekonomia fizycznego uwalniania lub wychwytu astrocytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że uzyskane komórki bardzo przypominają astrocyty in vivo pod względem morfologii, ekspresji mRNA i białek oraz międzykomórkowych wahań wapnia.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować obszar preparacji, umieszczając dwie 10-centymetrowe szalki Petriego wypełnione pożywką preparacyjną na lodzie w okapie preparacyjnym z przepływem laminarnym. Dla każdego obszaru mózgu, który ma zostać wyizolowany, przygotuj probówkę o pojemności 15 ml wypełnioną 14 ml pożywki preparacyjnej i trzymaj na lodzie. Następnie spryskaj narzędzia do preparacji 70% etanolem i umieść je obok mikroskopu preparacyjnego w kapturze.

Jeśli pracujesz z tkanką embrionalną, najpierw usuń zarodki z macicy i otwórz woreczki embrionalne. Natychmiast odetnij głowy nożyczkami. Po odcięciu wszystkich głów przenieś je do wstępnie schłodzonego podłoża preparacyjnego.

Gdy głowy zostaną zanurzone w podłożu, otwórz skórę i czaszkę kleszczami i uszczypnij móżdżek. Następnie ostrożnie podnieś resztę mózgu i wyjmij ją z czaszki. Następnie oddziel korę od leżącej pod nią struktury śródmózgowia.

Umieść kleszcze w podłużnej szczelinie między półkulami i przenieś je między korą mózgową a strukturami śródmózgowia jednej półkuli, aby uwolnić każdą półkulę. Następnie usuń wszystkie opony mózgowe z każdej półkuli i oddziel hipokampy. Jeśli wymagane są astrocyty hipokampa, przenieś każdy hipokamp do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 14 ml pożywki preparacyjnej na lodzie.

Następnie pokrój dowolną tkankę korową, która ma być użyta do generowania astrocytów, na kawałki nie większe niż jeden mililitr sześcienny. Następnie zbierz wszystkie kawałki tkanki korowej w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej podłożem preparacyjnym na lodzie. Po zebraniu wszystkich kawałków tkanki poczekaj, aż osiądą na dnie probówki.

Następnie odessać jak najwięcej pożywki. Następnie dodaj 2-3 ml 0,05% tripsen EDTA i inkubuj próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwadzieścia minut. Następnie ostrożnie odessać tripsen EDTA, pozostawiając kawałki tkanek w minimalnej ilości płynu na dnie probówki.

Następnie dodaj 5 ml wstępnie schłodzonej pożywki preparyjnej, aby zmyć pozostały tripsen EDTA i odpipetuj z boku górnej probówki, aby uzyskać wymieszanie kawałków tkanki. Następnie odessać podłoże preparacyjne i pozostawić kawałki tkanki w jak najmniejszej ilości płynu. Powtórz ten etap mycia z wstępnie schłodzonym podłożem preparacyjnym dwukrotnie.

Po ostatnim etapie mycia dodaj 1 ml preparatu D-Mem Plus o temperaturze pokojowej i rozprowadź tarcie tkanki, pipetując w górę i w dół bez wprowadzania pęcherzyków. Astrocyty są dość wrażliwe na pH, dlatego ważne jest, aby unikać wytwarzania pęcherzyków, ponieważ może to zmienić pH roztworu. Następnie umieść sitko o wielkości 100 mikronów w otworze probówki o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż filtr 4,5 ml wstępnie schłodzonym D-Mem Plus.

Odpipetować 1 ml zdysocjowanej zawiesiny tkankowej na sitko do komórek i dodać kolejne 4,5 ml wstępnie schłodzonego D-Mem Plus, aby przemyć przez nie komórki. Siódmego dnia po rozbiorze in vitro umieścić 10-centymetrowe szalki z komórkami w D-Mem Plus na wytrząsarce w inkubatorze i wstrząsać szalkami z prędkością 110 obr./min przez 6 godzin. 20 do 30 minut przed końcem sześciogodzinnego wstrząsania wstępnie podgrzej 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H i 0,25% tripsen EDTA do 37 stopni w łaźni wodnej.

Po 6 godzinach wstrząsania zdejmij naczynia hodowlane z wytrząsarki i natychmiast zastąp pożywkę 10 ml wstępnie podgrzanego 1 XPBS na naczynie. Następnie usuń PBS i dodaj 3 ml wstępnie podgrzanego tripsenu EDTA na danie. Następnie inkubować próbki przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W przypadku przygotowywania próbek do sekwencjonowania Western Blot lub RNA nie należy dodawać Tripsen EDTA. Zamiast tego zastąp PBS 12 ml wstępnie podgrzanego NB+H, po czym kultury można umieścić z powrotem w inkubatorze. Następnie dodaj 5 ml wstępnie podgrzanego D-Mem Plus do 3 ml tripsen EDTA w każdym naczyniu.

Odpipetować komórki z naczynia i zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml. Następnie odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 3220 razy G w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 4 minuty. Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś podniebienie komórkowe w 1 ml wstępnie podgrzanego NB+H.

Obrazy te pokazują, że astrocyty ausam transdukowane w obozie G wykazują spontaniczne zdarzenia jonów wapnia w sieciach astrocytów, w tym w cienkich procesach. W tym przypadku fala jonów wapnia przechodzi przez kilka astrocytów od lewej do prawej na obrazach różnych punktów czasowych, gdzie jasny kolor przedstawia obszary o wysokim stężeniu jonów wapnia, a czarne obszary reprezentują obszary pozakomórkowe. Na tym wykresie stężenie jonów wapnia zmienia się w oznaczonych kolorami obszarach w czasie, które są pokazane jako ślady intensywności fluorescencji w obozie G, ilustrujące, w jaki sposób fala sygnalizacyjna jonów wapnia rozprzestrzenia się po kilku astrocytach.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w godzinę i piętnaście minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek w połączeniu z transfekcją lub eksperymentami z transdukcją wirusa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zdarzenia zachodzące w błonach astrocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować in vivo, takie jak hodowle motoryczne astrocytów, w prosty, szybki i ekonomiczny sposób.