Name: Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj protokół AWESAM do hodowli mysich astrocytów zachowujących cechy in vivo. Ta szybka i ekonomiczna metoda umożliwia badanie sygnalizacji wapniowej oraz ekspresji genów w komórkach glejowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (FP7/260916), Fundacji Alexandra von Humboldta (Sofja Kovalevskaja) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 i SFB889).

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi niemieckiego dobrostanu zwierząt.
UWAGA: Oś czasu i główne kroki protokołu są zilustrowane w Rysunek 1.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotuj następujące rozwiązania.
	<ol>
		<li>Przygotuj DMEM+ do hodowli wielokątnych astrocytów MD: DMEM z 10% FCS, 100 U penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
		<li>Przygotuj NB+H do hodowli astrocytów gwiaździstych: pożywka neuropodstawowa z 5 ng/ml HBEGF, 1x suplement B-27, 1x suplement glutaminy, 100 U penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. 
		UWAGA: Podwielokrotności o wyższych stężeniach HBEGF mogą być przygotowywane i przechowywane w temperaturze -20 °C w celu dodania do pożywki w razie potrzeby.</li>
		<li>Przygotować pożywkę separacyjną (10 mM HEPES w HBSS).</li>
		<li>Przygotować porcje 6-7 ml 0,05% trypsyny-EDTA i 6-7 ml 0,25% trypsyny-EDTA w probówkach o pojemności 15 ml. Można je przechowywać w temperaturze -20 °C i rozmrażać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień przed rozpoczęciem protokołu pokryj 10 cm naczynia poddane kulturze tkankowej po 5 ml 0,04% polietyleninizny (PEI) każda.</li>
	<li>Następnego dnia usuń PEI i dwukrotnie umyj naczynia dejonizowaną, destylowaną wodą. Dodać 12 ml DMEM+ do każdej płytki i wstępnie zrównoważyć w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 30 minut przed posiewem komórek.</li>
	<li>Przygotuj obszar sekcji: W okapie preparacyjnym z przepływem laminarnym umieść na lodzie dwie 10-centymetrowe szalki Petriego wypełnione pożywką preparacyjną. Dla każdego obszaru mózgu, który ma zostać wyizolowany (np. kora, hipokamp), przygotuj 15-probówkę wypełnioną 14 ml pożywki preparacyjnej i trzymaj na lodzie. Spryskaj narzędzia do preparowania (cienkie nożyczki, kleszcze Dumont #3 i #5) 70% etanolem i umieść obok mikroskopu preparacyjnego w kapturze.</li>
</ol>
2. Sekcja mózgu szczura lub myszy
UWAGA: Można używać zarówno myszy, jak i szczurów. Zwierzęta starsze niż P8 mogą być również wykorzystywane (testowaliśmy do P12), ale usunięcie opon mózgowych będzie coraz trudniejsze. Co więcej, wydajność i zdrowie komórek będą się zmniejszać, ponieważ komórki mózgowe starszych zwierząt utworzą skomplikowane procesy i połączenia, które mogą zostać przerwane podczas dysocjacji tkanek, prowadząc do zwiększonej śmierci komórek. Opisano tutaj preparaty korowe, ale można również wykorzystać inne obszary mózgu.
<ol>
	<li>Umieścić 0,05% trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Eutanazja zwierząt (ciężarnych szczurów w przypadku szczeniąt E19 lub zwierząt P0-P8) poprzez powolne zwiększanie stężenia CO2 i izolowanie mózgów. Poniższe kroki wymagają sterylnej techniki.</li>
	<li>Jeśli pracujesz z tkanką embrionalną, najpierw usuń zarodki z macicy i otwórz woreczki embrionalne, a następnie natychmiast odetnij głowy nożyczkami. Po odcięciu wszystkich głów przenieś je do wstępnie schłodzonego podłoża preparacyjnego.
	<ol>
		<li>Gdy głowy zostaną zanurzone w podłożu, otwórz skórę i czaszkę (obie są bardzo miękkie u młodych zwierząt) za pomocą kleszczy i uszczypnij móżdżek. Ostrożnie podnieś resztę mózgu do góry i wyjmij z czaszki. 
		UWAGA: Dwa do czterech zarodków E19 wytwarza wystarczającą ilość tkanki na co najmniej osiem 10-centymetrowych szalek astrocytów korowych posianych po 500 000 komórek na szalkę w dniu sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku nowonarodzonych lub starszych szczeniąt odetnij głowy nożyczkami i odizoluj mózg, przyśrodkowo przecinając skórę w linii prostej od tyłu głowy do czubka nosa. Odciągnij skórę na bok i ostrożnie przetnij czaszkę w lewo i w prawo, a następnie podnieś kość czaszki do góry. Odetnij móżdżek i wyciągnij resztę mózgu do góry i na zewnątrz czaszki. 
	UWAGA: Dwa do trzech szczeniąt P0-P8 wytwarza wystarczającą ilość tkanki na co najmniej osiem 10-centymetrowych szalek astrocytów korowych posianych po 500 000 komórek na szalkę w dniu sekcji.</li>
	<li>Oddziel korę od leżącej poniżej struktury śródmózgowia. Umieść kleszcze w podłużnej szczelinie między półkulami, a następnie przesuń kleszcze między korą a strukturami śródmózgowia jednej półkuli (prostopadle do szczeliny podłużnej), aby uwolnić każdą półkulę.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń wszystkie opony mózgowe z każdej półkuli (i jej hipokampa), a następnie oddziel hipokampy. Jeśli wymagane są astrocyty hipokampa, przenieś każdy hipokamp do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 14 ml pożywki preparacyjnej na lodzie.</li>
	<li>Usuń kolejne obszary z kory każdej półkuli, jeśli wymagane są określone regiony (np. kora czołowa). Pokrój dowolną tkankę korową, która ma być użyta do wytworzenia astrocytów, na kawałki nie większe niż 1 mm3. Zbierz wszystkie kawałki tkanki korowej w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej podłożem preparacyjnym na lodzie.</li>
</ol>
3. Trawienie i dysocjacja tkanek
<ol>
	<li>Po zebraniu wszystkich kawałków tkanki poczekaj, aż osiądą na dnie probówki, a następnie odessaj jak najwięcej pożywki.</li>
	<li>Dodać 2-3 ml 0,05% trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej i inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 min. 
	UWAGA: Szybko uwolnij całą trypsynę-EDTA z pipety, aby wymieszać kawałki tkanki i pozostawić do ponownego ustabilizowania się.</li>
	<li>Ostrożnie odessać trypsynę-EDTA, pozostawiając kawałki tkanek w jak najmniejszej ilości płynu na dnie probówki.</li>
	<li>Dodaj 5 ml wstępnie schłodzonej pożywki preparyjnej, aby zmyć pozostałą trypsynę-EDTA. Odpipetować z boku górnej części probówki, aby uzyskać wymieszanie kawałków tkanki.</li>
	<li>Odessać podłoże preparacyjne i pozostawić kawałki tkanki w jak najmniejszej ilości płynu. Powtórz ten etap mycia z użyciem wstępnie schłodzonego podłoża preparacyjnego jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Po ostatnim etapie mycia dodaj 1 ml DMEM+ (podgrzanego do temperatury pokojowej) za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i rozcieraj tkankę, pipetując w górę iw dół bez wprowadzania pęcherzyków. 
	UWAGA: Ważne jest, aby unikać wytwarzania pęcherzyków, ponieważ może to zmienić pH roztworu, na które astrocyty są dość wrażliwe.</li>
	<li>Umieść sitko o pojemności 100 μm w otworze probówki o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż filtr 4.5 ml wstępnie schłodzonego DMEM+.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml zdysocjowanej zawiesiny tkankowej na sitko komórkowe i dodać kolejne 4,5 ml wstępnie schłodzonego DMEM+, aby przemyć komórki przez sitko komórkowe.</li>
</ol>
4. Posiewanie komórek w celu wzbogacenia astrocytów przez pasażowanie
<ol>
	<li>Policzyć komórki, np. rozcieńczając 10 μl zawiesiny komórek w 10 μl błękitu trypanowego i pipetując mieszaninę do hemocytometru.</li>
	<li>Umieść 500 000 komórek w 12 ml DMEM+ na 10-centymetrowe naczynie. 
	UWAGA: DMEM+ jest pomocny we wzroście astrocytów, bardziej niż w przypadku neuronów czy mikrogleju. Podczas wytrząsania siły fizyczne działające na szklane szkiełka nakrywkowe w studzienkach są znacznie silniejsze niż te działające na 10-centymetrowe szalki (bez szkiełek nakrywkowych). Jeśli komórki zostaną wstrząśnięte na płytkach 24-dołkowych, stają się niezdrowe lub umierają. Astrocyty umieszczać na płytkach 24-dołkowych tylko po wstrząśnięciu.</li>
	<li>Hodowle komórkowe należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez siedem dni.</li>
	<li>W dniu 6, dzień przed wytrząsaniem i pasażowaniem komórek, przygotuj płytki hodowlane pokryte PEI zgodnie z opisem w kroku 5.</li>
</ol>
5. Komórki pasujące
<ol>
	<li>Dzień przed pasażowaniem pokryj płytki hodowli komórkowych 0,04% PEI.
	<ol>
		<li>Do immunocytochemii, transdukcji wirusa lub transfekcji plazmidowej należy użyć płytek 24-dołkowych lub 6-dołkowych (każda zawierająca odpowiednio wysterylizowane szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm lub 25 mm).</li>
		<li>Wysterylizuj szklane szkiełka nakrywkowe przez inkubację w 70% etanolu przez co najmniej 1 godzinę, a następnie umyj trzykrotnie w dejonizowanej wodzie destylowanej przed umieszczeniem szkiełek nakrywkowych w studzienkach.</li>
		<li>Dodać co najmniej 70 μl 0,04% PEI na 12 mm szkiełka nakrywkowego w płytkach 24-dołkowych i 600 μl 0,04% PEI na 25 mm szkiełka nakrywkowego w płytkach 6-dołkowych.</li>
		<li>Do analizy Western blot lub RNA-Seq można nadal używać 10-centymetrowych szalek zawierających komórki po sekcji. Naczynia wystarczy wstrząsnąć, a następnie komórki przemywa się 1x PBS i traktuje NB+H (nie przenosić do nowych naczyń).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu in vitro (DIV) 7 po rozbiorze umieścić 10-centymetrowe szalki z komórkami w DMEM+ na wytrząsarce laboratoryjnej w inkubatorze i wstrząsać szalkami z prędkością 110 obr./min przez 6 godzin.</li>
	<li>Zmyć PEI z powlekanych szkiełek nakrywkowych dwukrotnie dejonizowaną, destylowaną wodą. Dodać pożywkę NB+H do płytek (500 μl na dołek dla płytek 24-dołkowych i 2 ml na dołek dla płytek 6-dołkowych). Wstępnie wyrównać płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 podczas wstrząsania 10-centymetrowych szalek lub przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>20-30 minut przed końcem 6-godzinnego wstrząsania podgrzej 1x PBS, DMEM+, NB+H i 0,25% trypsyny-EDTA do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Po 6 godzinach wstrząsania zdejmij szalki hodowlane z wytrząsarki i natychmiast zastąp pożywkę (zawierającą strząśnięte neurony, oligodendrocyty i mikroglej) 10 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS na talerz. 
	UWAGA: Ważne jest, aby natychmiast zassać starą pożywkę zawierającą oderwane komórki, aby uniknąć ponownego przyłączenia się komórek nieastrocytowych.</li>
	<li>Usuń PBS i dodaj 3 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA na danie. Inkubować każde naczynie przez 4 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: W przypadku przygotowywania próbek do Western blot lub RNA-Seq nie należy dodawać trypsyny-EDTA. Zamiast tego zastąp PBS 12 ml wstępnie podgrzanym NB+H, po czym kultury można umieścić z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Dodaj 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM+ do 3 ml trypsyny-EDTA w każdym naczyniu, odpipetuj komórki z naczynia za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i zbierz zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Pipetę należy odpipetować bezpośrednio od dna naczynia - dno naczynia powinno stać się czystsze w miarę odłączania się komórek. Używaj wyłącznie pożywki zawierającej surowicę (zamiast DMEM+), ponieważ surowica dezaktywuje trypsynę.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 3,220 x g w temperaturze 20 °C przez 4 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanego NB+H.</li>
</ol>
6. Posiewanie komórek do końcowych hodowli astrocytów
<ol>
	<li>Policz komórki.</li>
	<li>Płytka 20 000 komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych (w 2 ml pożywki NB+H na studzienkę) lub 5 000 komórek na studzienkę w 24-dołkowej pożywce (w 500 μl pożywki NB+H na studzienkę).</li>
	<li>Hodowle komórkowe należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu dalszego traktowania lub analizy.</li>
	<li>Wymieniaj połowę podłoża raz w tygodniu. 
	UWAGA: W środowiskach ubogich w składniki odżywcze astrocyty przestają się namnażać, ale pozostały mikroglej będzie się rozmnażał (chociaż z naszego doświadczenia wynika, że mikroglej nie pojawił się w kulturach AWESAM). Wymiana połowy pożywki raz w tygodniu zapobiega wzbogaceniu ewentualnie pozostałych mikrogleju 8, a monokultury pozostają zdrowe przez co najmniej trzy tygodnie.</li>
</ol>

<ol><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+affects+astrocyte+morphology%2C+proliferation%2C+differentiation%2C+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2%2B+signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Krencik, R., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26(2007).</li>
<li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li>
<li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li>
<li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes%3A+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe znaczenie mają cztery kroki w protokole: 1) przygotowanie stężenia HBEGF do dokładnie 5 ng/ml, ponieważ niewielki wzrost stężenia może prowadzić do niedojrzałych kultur, np. 10 ng/ml HBEGF spowoduje deróżnicowanie astrocytów4; 2) unikanie pęcherzyków w roztworach zawierających tkanki lub komórki, które mogą zmieniać pH i utrudniać zdrowie astrocytów; 3) pożywki wstępnie równoważące w celu osiągnięcia optymalnego pH i temperatury do wzrostu zdrowych astrocytów; 4) wymiana tylko po...

Astrocyty wpływają na funkcjonowanie mózgu poprzez wsparcie troficzne, przepływ krwi, sygnalizację synaptyczną i plastyczność, oraz komunikację międzykomórkową - wszystkie te mechanizmy koncentrują się wokół cienkich procesów astrocytowych. Opisany tutaj protokół AWESAM pozwala na badanie tych procesów bez zakłóceń ze strony neuronów i innych komórek glejowych, co jest przydatne np. dlatego, że ekspresja wielu białek, a nawet sygnalizacji Ca2+ nakłada się na siebie w różnych typach komórek mózgowych. Co więcej, metoda ta pokonuje ograniczenia wcześniej dostępnych technik. W szczególności nasz protokół zapewnia morfologię podobną do in vivo (astrocyty gwiaździste z cienkimi wyrostkami) i ekspresję genów w szybki, łatwy i tani sposób.
Na morfologię komórek, ekspresję genów i wiele innych procesów regulacyjnych bezpośredni wpływ ma środowisko. W naczyniu hodowlanym odnosi się to do czynników uwalnianych przez otaczające komórki, ale także pożywki, w której komórki są hodowane. W przypadku astrocytów wcześniej donoszono, że HBEGF indukuje morfologię gwiaździstą1, ale stwierdzono również, że deróżnicuje astrocyty2. Jednak niższe stężenia HBEGF zostały później wykorzystane do wygenerowania większej liczby astrocytów podobnych do in vivo, zidentyfikowanych za pomocą sekwencjonowania RNA w dwóch różnych protokołach3,4. Co więcej, morfologia astrocytów zmienia się wraz ze składem pożywki, niezależnie od protokołu4: Pożywka neurobazalna o niskim stężeniu HBEGF jest optymalna do wzrostu astrocytów gwiaździstych, podczas gdy inne kompozycje pożywki (np. DMEM zawierające surowicę) wytwarzają komórki wielokątne (nawet w astrocytach świeżo wyizolowanych przez immunopanning).
Protokół AWESAM przezwycięża wady poprzednich technik hodowli monocytów astrocytów4. Poprzednie techniki hodowli monocytów astrocytów miały następujące wady: morfologia wielokątna, która jest nietypowa dla astrocytów gwiaździstych in vivo (metoda MD)5; długość i koszt protokołu (przygotowanie astrocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych trwa trzy miesiące i wymaga wielu odczynników, w tym drogich czynników wzrostu)6; mała ilość materiału (metoda immunopanningu)<klasa SUP="xref">3; oraz dedyferencjacja astrocytów i wymóg matrycy 3D (Puschmann i wsp.)1,2. Natomiast protokół AWESAM zapewnia: morfologię podobną do in vivo (astrocyty gwiaździste z cienkimi wyrostkami); szybka, łatwa i tania metoda; duże ilości materiału; i największą ekspresję genów podobną do in vivo w porównaniu z astrocytami immunopanowanymi i MD. Dodatkowo hodowla 2D pozwala na badanie sygnalizacji Ca2+ i recyklingu pęcherzyków w cienkich procesach oraz w zdarzeniach w pobliżu błony (np. mikroskopia TIRF nie jest możliwa w hodowlach 3D).
Metoda MD jest szeroko stosowana od czasu jej publikacji w 1980 roku5, oferując prostą i szybką technikę dla monokultur astrocytów wielokątnych. Krótko mówiąc, metoda MD polega na hodowaniu mieszanych komórek mózgowych w DMEM zawierającym płodową surowicę cielęcą (FCS), a następnie etapach wstrząsania, które wzbogacają astrocyty (gdy wszystkie inne typy komórek mózgowych odłączają się od naczynia) i dalszej hodowli w tym samym podłożu. DMEM uzupełniony FCS jest stosowany do wielu innych typów komórek, począwszy od fibroblastów i adipocytów po różne linie komórek rakowych, z których wszystkie mają wspólną morfologię wielokątną wykazywaną przez astrocyty MD w hodowli. Do początku 2000 roku7, niewiele uwagi poświęcono pożywkom dostosowanym do astrocytów, szczególnie w celu faworyzowania ich typowej morfologii gwiaździstej znalezionej in vivo. Jeden z protokołów opublikowany w 2011 roku osiąga taką morfologię gwiaździstą: Nazywany metodą immunopanningu, wykorzystuje pożywkę bez surowicy zoptymalizowaną pod kątem hodowli astrocytów3. Korzystając z tej metody, świeżo wyizolowane komórki mózgowe są wystawiane na działanie szeregu szalek pokrytych przeciwciałami, które celują w białka powierzchniowe komórek specyficzne dla typu komórki, aby wzbogacić je w astrocyty. Pomimo bardziej zbliżonej do in vivo morfologii i profilu ekspresji astrocytów z immunobadaniem, większość badań in vitro nadal opiera się na metodzie astrocytów MD. Metoda MD jest prosta i szybka, podczas gdy metoda immunopanningu obejmuje bardziej złożone i czasochłonne etapy w pierwszym dniu hodowli (takie jak dłuższe okresy trawienia enzymów, staranne nakładanie warstw roztworów o różnej gęstości, samo immunopanning i kilka etapów wirowania - wszystko przed posiewem). Jednak dzięki zastosowaniu bardziej specjalistycznej pożywki, metoda AWESAM oferuje zarówno szybkość metody MD, jak i morfologię protokołu immunopanningu podobną do in vivo.
Ogólnie, protokół AWESAM jest przydatny do badania więcej astrocytów in vivo w monokulturach 2D izolowanych z neuronów i innych komórek glejowych (jak wcześniej scharakteryzowano4 za pomocą barwienia immunologicznego, immunoblotów i sekwencjonowania RNA). Pozwala na badanie cienkich procesów astrocytarnych i zapewnia doskonałą dostępność do wizualizacji spontanicznej sygnalizacji Ca2 + i zdarzeń w pobliżu błony (np. zobrazowanych za pomocą mikroskopii TIRF).

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>ciepła w 37 &ordm; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>ciepła w 37 &ordm; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Suplement B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X zapas</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100X zapas</td></tr><tr><td>Penicylina / streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50 zapas; penicylina: 5000 U/ml; streptomycyna: 5000 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Neurobasew</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>bez L-glutaminy</td></tr><tr><td></td><td>DMEM Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>Sigma</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>1X</td></tr><tr><td>100 &mu; m nylonowe sitko komórkowe</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Inkubator do hodowli komórkowych Hera Cell 240i</td> Wytrząsarka laboratoryjna Heidolph Rotamax 120&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Użyj wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu awesam

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Protokół AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) pociąga za sobą szybki, prosty i tani sposób generowania dużych ilości monokultur astrocytów myszy i szczurów podobnych do in vivo: Komórki mózgowe mogą być izolowane z różnych regionów mózgu, a po tygodniu hodowli komórek, komórki nieastrocytowe są otrząsane poprzez umieszczenie szalek hodowlanych na shakerze na 6 godzin w inkubatorze. Pozostałe astrocyty są następnie przenoszone do nowych płytek z pożywką specyficzną dla astrocytów (określaną jako NB+H). NB+H zawiera niskie stężenia wiążącego heparynę czynnika wzrostu podobnego do EGF (HBEGF), który jest stosowany zamiast surowicy w pożywce. Po wzroście w NB+H, astrocyty AWESAM mają gwiaździstą morfologię i charakteryzują się drobnymi wyrostkami. Co więcej, astrocyty te mają większą ekspresję genów podobną do in vivo niż astrocyty generowane wcześniej opublikowanymi metodami. ObrazowanieCa2+, dynamikę pęcherzyków i inne zdarzenia w pobliżu błony można zatem badać w drobnych procesach astrocytarnych in vitro, np. przy użyciu mikroskopii konfokalnej żywych komórek lub mikroskopii TIRF. Warto zauważyć, że astrocyty AWESAM wykazują również spontaniczną sygnalizację Ca2 + podobną do astrocytów in vivo.

Astrocyty współhodowane z neuronami i hodowane w medium NB+ wykazują gwieździsty kształt po 2 tygodniach hodowli (Rycina 2). Oprócz medium NB+, współhodowane astrocyty są również narażone na nieznane czynniki pochodzenia neuronalnego, które prawdopodobnie przyczyniają się do ich przeżywalności i morfologii. W przeciwieństwie do nich, astrocyty MD hodowane w DMEM+ jako monokultury (po odstrząśnięciu innych typów komórek przed pasażowaniem) wykazują kształt wie...

Opisany tutaj protokół AWESAM jest optymalny do hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych w szybki, prosty i tani sposób. Astrocyty AWESAM wykazują spontaniczną sygnalizację Ca2 +, morfologię i profile ekspresji genów podobne do astrocytów in vivo.

Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie monokultur astrocytów przypominających warunki in vivo przy użyciu prostej, szybkiej i ekonomicznej metody. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny astrogliobiologii, takie jak ekonomia fizycznego uwalniania lub pobierania substancji przez astrocyty. Główną zaletą tej techniki jest to, że uzyskane komórki ściśle przypominają astrocyty in vivo pod względem morfologii, ekspresji mRNA i białek oraz międzykomórkowych fluktuacji poziomu wapnia.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować obszar sekcji, umieszczając w laminarnym dygestorium do sekcji dwie szalki Petriego o średnicy 10 cm wypełnione medium do sekcji, ustawione na lodzie. Dla każdego obszaru mózgu przeznaczonego do izolacji należy przygotować probówkę 15 mL wypełnioną 14 mL medium do sekcji i przechowywać ją na lodzie. Następnie należy spryskać narzędzia do sekcji 70% etanolem i umieścić je obok mikroskopu sekcyjnego w dygestorium.W przypadku pracy z tkanką embrionalną, najpierw należy wyjąć embriony z macicy i otworzyć pęcherzyki żółtkowe. Następnie niezwłocznie odciąć głowy za pomocą nożyczek. Po odcięciu wszystkich głów, należy przenieść je do schłodzonego wcześniej medium do sekcji.Gdy głowy zostaną zanurzone w medium, rozchyl pęsetą skórę i czaszkę, a następnie odciśnij móżdżek. Następnie ostrożnie podważ resztę mózgu i wyjmij ją z czaszki. Po tym oddziel korę od znajdującej się pod nią struktury śródmózgowia.Umieść pęsetę w szczelinie podłużnej między półkulami, a następnie przesuń ją pomiędzy korę a struktury śródmózgia jednej z półkul, aby oddzielić każdą półkulę. Następnie usuń wszystkie opony mózgowe z każdej półkuli i wyizoluj hipokampy. Jeśli wymagane są astrocyty hipokampa, przenieś każdy hipokamp do probówki 15 mL wypełnionej 14 mL medium do sekcji, przechowywanej w lodzie.Następnie należy pociąć tkankę korową przeznaczoną do generowania astrocytów na kawałki nie większe niż jeden milimetr sześcienny. Potem wszystkie fragmenty tkanki korowej należy zebrać do oddzielnej probówki o pojemności 15 mL wypełnionej medium do sekcji, umieszczonej w lodzie. Po zebraniu wszystkich fragmentów tkanki należy odczekać, aż opadną one na dno probówki.Następnie odessać jak największą ilość pożywki. Po tym dodać 2-3 mL 0,05% tripsyny z EDTA i inkubować próbki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez dwadzieścia minut. Następnie ostrożnie odessać tripsynę z EDTA, pozostawiając fragmenty tkanek w minimalnej ilości cieczy na dnie probówki.Następnie dodaj 5 mL schłodzonego medium do sekcji, aby wypłukać pozostałe tripsen EDTA, i pipetuj do boku górnej rurki, aby wymieszać fragmenty tkanki. Następnie odessaj medium do sekcji i pozostaw fragmenty tkanki w jak najmniejszej ilości płynu. Powtórz ten etap płukania schłodzonym medium do sekcji dwukrotnie.Po ostatnim etapie płukania dodać 1 mL D-Mem Plus w temperaturze pokojowej i rozetrzeć tkankę poprzez pipetowanie w górę i w dół, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Astrocytami są dość wrażliwe na pH, dlatego ważne jest unikanie powstawania pęcherzyków, ponieważ może to zmienić pH roztworu. Następnie umieścić sitko komórkowe o oczkach 100 micron w otworze probówki o pojemności 50 mL i zwilżyć filtr 4,5 mL schłodzonego wcześniej D-Mem Plus.Pipetujemy 1 mL zawiesiny dysocjowanej tkanki na sitko do komórek i dodajemy kolejne 4,5 mL schłodzonego wcześniej D-Mem Plus, aby wypłukać komórki przez sitko. W siódmym dniu in vitro po sekcji naczynia 10 cm z komórkami w D-Mem Plus umieszczamy na wytrząsarce w inkubatorze i wytrząsamy z prędkością 110 RPM przez 6 godzin. Na 20 do 30 minut przed zakończeniem sześciogodzinnego wytrząsania podgrzewamy 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H oraz 0,25%trypsen EDTA do 37°C w łaźni wodnej.Po 6 godzinach inkubacji na wytrząsarce, należy wyjąć naczynia z hodowlą i natychmiast zastąpić medium 10 mL podgrzanego roztworu 1 XPBS na każde naczynie. Następnie należy usunąć PBS i dodać 3 mL podgrzanego roztworu tripsyna EDTA na każde naczynie. Próbki należy inkubować przez cztery minuty w temperaturze 37°C.W przypadku przygotowywania próbek do Western Blot lub sekwencjonowania RNA, nie należy dodawać Tripsen EDTA. Zamiast tego należy zastąpić PBS 12 mL podgrzanego NB+H, po czym kultury można ponownie umieścić w inkubatorze. Następnie do każdej szalki należy dodać 5 mL podgrzanego D-Mem Plus do 3 mL tripsen EDTA.Odessać komórki z naczynia i zebrać zawiesinę komórkową do probówki 50 mL. Następnie odwirować zawiesinę komórkową przy 3220 ×g w temperaturze 20 °C przez 4 minuty. Po tym czasie usunąć supernatant i ponownie zawiesić pellet komórkowy w 1 mL uprzednio ogrzanego NB+H.Obrazy te pokazują, że astrocyty ausam z transdukowanym G-camp wykazują spontaniczne zdarzenia jonów wapnia w całych sieciach astrocytarnych, w tym w cienkich wypustkach. Tutaj fala jonów wapnia przemieszcza się przez kilka astrocytów z lewej na prawą stronę na obrazach z różnych punktów czasowych, gdzie jasny kolor przedstawia obszary wysokich stężeń jonów wapnia, a obszary czarne reprezentują regiony pozakomórkowe. Na tym wykresie przedstawiono zmiany stężenia jonów wapnia w czasie w regionach oznaczonych kolorami w formie śladów intensywności fluorescencji G-camp, co ilustruje, w jaki sposób fala sygnalizacji jonów wapnia rozprzestrzenia się przez kilka astrocytów.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, proces ten zajmuje jedną godzinę i piętnaście minut. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek w połączeniu z transfekcją lub eksperymentami z transdukcją wirusową, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące zdarzeń zachodzących w błonach astrocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w prosty, szybki i ekonomiczny sposób przygotować hodowle astrocytów przypominające warunki in vivo.

culturing-vivo-like-murine-astrocytes-using-fast-simple-inexpensive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje technikę hodowli pierwotnych astrocytów z kory szczura. Kora jest mechanicznie dysocjowana w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek glejowych, która jest następnie powlekana na płytkach pokrytych polipeptydami w celu promowania selektywnej proliferacji astrocytów. Następnie astrocyty są enzymatycznie dysocjowane od płytek i przenoszone na świeże podłoża, co pozwala na hodowlę czystych astrocytów.

Generowanie pierwotnej kultury astrocytów z mózgu szczeniaka szczura

Film pokazuje prostą metodę hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych. Podczas hodowli, przy użyciu pożywek specyficznych dla astrocytów i hamowaniu przylegania komórek nieastrocytowych, metoda selektywnie hoduje astrocyty. Te hodowane astrocyty wykazują gwiaździstą morfologię z drobnymi wyrostkami.

Prosta technika izolacji i hodowli mysich astrocytów

Ten film pokazuje bezpośrednie przeprogramowanie astrocytów wyrażających czynniki transformujące w neurony. Czynniki transformacyjne uruchamiają kaskadę zdarzeń molekularnych ułatwiających konwersję astrocytów w neurony. Proces ten jest dodatkowo wspierany przez dostarczanie określonych środków i suplementów za pośrednictwem pożywki różnicowania neuronów.

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy w neurony

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Udar niedokrwienny jest złożonym zdarzeniem, w którym trudno jest zbadać specyficzny wpływ astrocytów na dotknięty obszar mózgu narażony na tlen, deprywację glukozy (OGD). W artykule przedstawiono metodologię otrzymywania izolowanych astrocytów oraz badania ich reaktywności i proliferacji w warunkach OGD.

Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych

Prezentujemy tutaj protokół, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów do obrazowania poklatkowego wewnątrzkomórkowego Ca2+ do badań nad patofizjologią stwardnienia zanikowego bocznego w modelu szczurzym hSOD1G93A.

Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania wysoce wzbogaconych kultur astrocytów pochodzących z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy po urodzeniu i ich bezpośredniej konwersji w funkcjonalne neurony przez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Poznaj protokół AWESAM do hodowli mysich astrocytów zachowujących cechy in vivo. Ta szybka i ekonomiczna metoda umożliwia badanie sygnalizacji wapniowej oraz ekspresji genów w komórkach glejowych.

Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

Przeglądaj więcej filmów