Name: In vivo (in vivo) Wykrywanie i analiza sumoylacji białka Rb w komórkach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę wykrywania sumoylacji białka Rb w komórkach ludzkich HEK293 w warunkach endogennych i egzogennych. Ta technika pozwala badać modyfikacje białkowe SUMO w cyklu komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty Komisji Nauki i Technologii w Szanghaju (Grant nr 14411961800) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 81300805).

1. Wykrywanie endogennej sumoylacji Rb we wczesnej fazie G1
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i synchronizacja cyklu komórkowego.
	<ol>
		<li>Utrzymuj komórki HEK293 w pożywce wzrostowej zawierającej zmodyfikowane podłoże orła (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 1% Pen-Strep i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.</li>
		<li>Zsynchronizuj komórki HEK293 w fazie G0.
		<ol>
			<li>Policz komórki HEK293 za pomocą hemocytometru i zasiej ~1,5 x 107 komórek w 15 cm naczyniu z 25 ml pożywki wzrostowej przez 24 godziny przed zabiegiem. Po osiągnięciu konfluencji 70% - 80% należy odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki 5 ml wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
			<li>Dodać 25 ml DMEM zawierającego 1% penicyliny-streptomycyny i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 72 godziny. Zmyć komórki z płytki za pomocą 3 ml lodowatego PBS. Przenieś komórki do nowej probówki o pojemności 5 ml.</li>
			<li>Poddać niewielką część komórek analizie cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej (krok 1.2); zebrać pozostałą większość komórek przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać je w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze do czasu analizy sumoylacji Rb.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby uzyskać komórki fazy G1, pod koniec procesu synchronizacji G0 usuń DMEM i dodaj z powrotem świeżą pożywkę wzrostową, umożliwiając w ten sposób komórkom HEK293 ponowne wejście w cykl komórkowy. Następnie zbierz komórki w różnych fazach G1 (wczesny G1: 30 min; G1: 2h) do analizy cyklu komórkowego i dalszego testu SUMO.</li>
		<li>Zsynchronizuj komórki HEK293 w fazie S za pomocą metody podwójnego bloku tymidyny.
		<ol>
			<li>Wyhoduj komórki HEK293 do konfluencji 50% i umyj komórki wstępnie podgrzanym PBS. Następnie dodaj pożywkę wzrostową uzupełnioną 2,5 mM tymidyny przez 18 godzin (pierwszy blok).</li>
			<li>Usuń pożywkę zawierającą tymidynę, a następnie dwukrotnie umyj komórki wstępnie podgrzanym PBS. Dodaj świeżą pożywkę wzrostową przez 14 godzin, aby uwolnić komórki.</li>
			<li>Wyrzuć pożywkę pipetą i dodaj pożywkę wzrostową uzupełnioną 2,5 mM tymidyny przez kolejne 18 godzin (drugi blok) przed przeprowadzeniem analizy cyklu komórkowego i Rb SUMOylacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku synchronizacji G2/M płytkę ~1,5 × 107 komórek HEK293 na 15 cm szalkę z 25 ml pożywki wzrostowej przez 24 godziny. Następnie dodać nokodazol do pożywki, aż do uzyskania końcowego stężenia 400 ng/ml. Na koniec inkubuj komórki przez 16 godzin przed przeprowadzeniem analizy cyklu komórkowego i Rb SUMOylacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza cyklu komórkowego metodą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić zsynchronizowany HEK293 w PBS, a następnie utrwalić zawiesinę komórek za pomocą lodowatego 70% etanolu przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Należy pamiętać, że aby zminimalizować grupowanie komórek, dodaj zawiesinę komórek kroplami do lodowatego 100% etanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 70% etanolu podczas delikatnego wirowania.</li>
		<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g, następnie ostrożnie odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Powtórz krok wirowania.</li>
		<li>Dodaj 500 μl PBS zawierającego 50 μg/ml barwnika kwasem nukleinowym, jodku propidyny, 0,1% Triton X-100 i 1 μg/ml RNazy A do komórek i dobrze wymieszaj. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoprecypitacja endogennego białka Rb.
	<ol>
		<li>Przygotuj lizaty komórkowe HEK293.
		<ol>
			<li>Lizuj zsynchronizowane komórki HEK293, delikatnie zawieszając je ponownie w 1 ml lodowatego buforu do lizy testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (Tabela 1) zawierającego świeżo dodane 20 mM N-etylomaleimidu, inhibitora izopeptydazy, który może blokować proteazy SUMO i stabilizować koniugaty SUMO.</li>
			<li>Dalej homogenizuj komórki na lodzie poprzez homogenizację Dounce, sonikację lub po prostu 10-krotne przejście przez igłę 21 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 2 ml. Następnie inkubować komórki na lodzie przez 5 min. 
			UWAGA: Anionowy detergent dodecylosiarczan sodu (SDS) w buforze RIPA ma kluczowe znaczenie dla późniejszego oznaczania Rb-SUMO, ponieważ może wyeliminować niespecyficzny sygnał SUMO, który pochodzi z niekowalencyjnego oddziaływania między białkiem Rb a innymi gatunkami SUMO innymi niż Rb.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odwirować lizaty komórkowe przy 18 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Białka mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
		<li>Aby przygotować kontrolę wejściową każdej próbki do późniejszego Western blot, należy zachować niewielką część wyżej opisanego supernatantu do nowej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Do powyższych supernatantów dodać 1 μg nieswoistej mysiej immunoglobuliny G (IgG) tego samego gatunku i izotypu co przeciwciało monoklonalne Rb oraz 20 μl 50% zawiesiny białka A/G-sefarozy. Następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać supernatanty, nie naruszając kulek, i przenieść je do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Do każdej z próbek dodać 5 μl Rb przeciwciała pierwszorzędowego i 40 μl 50% zawiesiny białka A/G-sefarozy. Następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami.</li>
		<li>Zebrać kulki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie. Należy pamiętać, że aby uniknąć utraty koralików, nie należy ich zasysać do sucha.</li>
		<li>Umyj kulki czterokrotnie 1 ml buforu RIPA. Za każdym razem dobrze wymieszać probówki, obracając je w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Zebrać kulki przez odwirowanie na niskiej prędkości przy 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatanty.</li>
		<li>Po usunięciu supernatantów z końcowego płukania, ponownie zawiesić kulki w 30 μl 1x buforze ładującym do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym (SDS-PAGE) (Tabela 1) i dobrze wymieszać.
		<ol>
			<li>Inkubować probówki w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 10 minut. Odwirować próbki o stężeniu 12 000 x g przez 1 minutę w celu osadzenia kulek. Ostrożnie zebrać supernatanty, nie naruszając kulek, i przenieść je do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Próbki należy przeanalizować za pomocą 4% - 20% gradientu żelu SDS-PAGE i Western blot lub przechowywać je w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza egzogennej sumoylacji Rb oznaczonej tagiem 6XHis w komórkach ludzkich
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i transfekcja.
	<ol>
		<li>Wysiew ~ 6 × 106 komórek HEK293 w naczyniu o średnicy 10 cm i inkubuj przez 24 godziny w pożywce wzrostowej w normalnych warunkach hodowli komórek, aby uzyskać 75% -85% zlewających się komórek. Przed transfekcją należy usunąć pożywkę wzrostową i dodać 6 ml wstępnie podgrzanej pożywki z zredukowanej surowicy (patrz tabela materiałów), a następnie umieścić szalki z powrotem w inkubatorze.</li>
		<li>W przypadku testu SUMOylacji konstytutywnej Rb dodać po 15 μg każdego z oznaczonych 6XHis plazmidów Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT i Ubc9-C93S w 500 μl zredukowanej pożywki surowicy w 1,5 ml mikroprobówek wirówkowych, odpowiednio.
		<ol>
			<li>Aby przeanalizować koniugację SUMO dzikiego typu Rb i jego mutanta z defektem SUMOylacji, zmieszaj 10 μg plazmidu Rb-WT lub Rb-K720R znakowanego 6XHis razem z GFP-SUMO1 (10 μg) w 500 μl zredukowanej pożywki surowicy w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek13.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W międzyczasie w osobnej probówce wymieszać 50 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) w 500 μl zredukowanej pożywki surowicy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>W pełni połączyć dwie oddzielne probówki opisane powyżej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać kompleksy odczynnika/plazmidu do transfekcji do komórek i kontynuować hodowlę przez 8 godzin w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zastąp zredukowaną pożywkę surowicy pożywką wzrostową i inkubuj komórki w normalnych warunkach hodowli przez 48 godzin po transfekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ściąganie powinowactwa do niklu białka Rb znakowanego 6XHis.
	<ol>
		<li>Poddać lizie transfekowane komórki HEK293 i wyekstrahować białka ogółem, jak opisano w sekcji 1.3.1.</li>
		<li>Odwirować lizaty komórkowe przy sile 18 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać supernatanty i przenieść je do czystych probówek. 
		UWAGA: W tym momencie białko można zamrozić na dłużej niż 6 miesięcy w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Aby przygotować kontrolę wejściową każdej próbki do późniejszego Western blot, należy zachować niewielką część supernatantów opisanych powyżej w nowej probówce i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przepłukać 25 μl kulek agarozowych o stężeniu 50% niklu i kwasu nitrylotrioctowego (Ni-NTA) buforem RIPA dwukrotnie w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki. Zebrać kulki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 1 M imidazol do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM. Następnie dodaj każdą próbkę do probówki zawierającej przygotowane kulki agarozy Ni-NTA.</li>
		<li>Inkubować kulki i lizaty przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, delikatnie obracając. Wirować kulki w temperaturze 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatanty za pomocą pipetowania. Aby uniknąć utraty koralików, nie zasysaj koralików do sucha.</li>
		<li>Przemyć kulki 1 ml buforu do przemywania zawierającego 20 mM imidazolu (Tabela 1). Za każdym razem dobrze mieszać probówki, obracając je w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Zebrać kulki wirując w temperaturze 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatanty.</li>
		<li>Po ostatnim przepłukaniu dodać 30 μl buforu elucyjnego zawierającego 250 mM imidazolu (tabela 1) do każdej próbki i przetrzeć do wymieszania. Następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu wymycia białek.</li>
		<li>Wymieszać każdą próbkę z 6× buforem ładującym SDS-PAGE (tabela 1). Następnie inkubować probówki w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 10 minut.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 1 minutę, aby granulować kulki. Ostrożnie zebrać supernatanty, nie naruszając kulek, i przenieść próbki do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Próbki mogą być analizowane metodą Western blot lub przechowywane w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Western Blot
<ol>
	<li>Załaduj immunoprecypitację lub ściągnij próbki uzyskane w poprzednich krokach na żele SDS-PAGE o gradiacji 4-20%. Przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 120 V przez 90 minut w celu oddzielenia białek.</li>
	<li>Przenieść białka z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) przez elektroblottację w temperaturze 300 mA przez 90 minut w temperaturze 4 °C przy użyciu metody transferu w zbiorniku. Umieścić membranę PVDF w buforze blokowym zawierającym 5% mleka beztłuszczowego (tabela 1) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem w buforze do rozcieńczania przeciwciał zawierającym 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (Tabela 1) przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych należy użyć stężenia roboczego 0,5 μg/ml (przeciwciało anty-SUMO1) lub rozcieńczenia 1:2000 (przeciwciała anty-Rb i anty-tubuliny) lub 1:5 000 (przeciwciało anty-GFP i anty-He).</li>
	<li>Przemyć membranę 3x przez 10 minut za każdym razem za pomocą 1x soli fizjologicznej buforowanej tris z buforem Tween (TBST) (Tabela 1). Inkubować błonę z gatunkowo specyficznymi dla gatunku przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczonymi w stosunku 1:5 000 w buforze blokowym zawierającym 5% mleka beztłuszczowego (Tabela 1). Przemyć membranę 3x przez 10 min za każdym razem za pomocą 1x buforu TBST.</li>
	<li>Inkubować błonę z roztworem roboczym o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Przykryj membranę folią i wystaw ją na kliszę rentgenowską w zależności od siły sygnału.</li>
</ol>

<ol><li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G1+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li>
<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li>
<li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RB+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li>
<li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li>
<li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rb%2Fchromatin+connection+and+epigenetic+control%3A+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li>
<li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+within+the+pRb+pathway%3A+is+there+a+code+of+conduct%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li>
<li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li>
<li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+%28pRb%29+by+cyclin+D%3ACdk4%2F6+complexes+results+in+active+pRb%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li>
<li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+SUMO-2%2F3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li>
<li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li>
<li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+in+sumoylation%3A+a+decade+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li>
<li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation%3A+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li>
<li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li>
<li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li>
<li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+%28RB%29+and+Lamin+A%2FC+interaction+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li>
<li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+%28UFDS%29%3A+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li>
<li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO+pathway%3A+emerging+mechanisms+that+shape+specificity%2C+conjugation+and+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li>
<li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li>
<li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li>
<li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano protokół wykrywania i analizy endogennej SUMOylacji Rb w komórkach ludzkich. Ponieważ metoda ta koncentruje się w szczególności na endogennym białku Rb bez jakiejkolwiek zmiany globalnego sygnału związanego z SUMO, jest to ważne narzędzie do badania modyfikacji Rb-SUMO w całkowicie naturalnych warunkach fizjologicznych.
Aby osiągnąć ten cel, należy pamiętać, że: 1) chociaż SUMO składa się z czterech izoform (SUMO1-4, z których każda kodowana jest przez inne geny) w porównani...

Dokładna kontrola przebiegu cyklu komórkowego w komórkach eukariotycznych opiera się na ścisłej sieci regulacyjnej, która zapewnia, że poszczególne zdarzenia odbywają się w uporządkowany sposób1,2. Jednym z kluczowych graczy w tej sieci jest białko siatkówczaka (Rb), pierwszy sklonowany supresor nowotworu1,3. Uważa się, że białko Rb jest negatywnym regulatorem progresji cyklu komórkowego, szczególnie w przypadku przejścia fazowego G0/G1 do S i wzrostu guza4,5. Niewydolność funkcji Rb albo bezpośrednio prowadzi do najczęstszego nowotworu wewnątrzgałkowego u dzieci, siatkówczaka, albo przyczynia się do rozwoju wielu innych typów raka5. Co więcej, Rb bierze udział w wielu szlakach komórkowych, w tym w różnicowaniu komórek, przebudowie chromatyny i apoptozie za pośrednictwem mitochondriów3,6,7.
Modyfikacje potranslacyjne odgrywają kluczową rolę w regulacji funkcji RB8,9. Jedną z takich modyfikacji jest fosforylacja, która zwykle prowadzi do inaktywacji Rb. W spoczynkowych komórkach G0 Rb jest aktywny przy niskim poziomie fosforylacji. W miarę jak komórki przechodzą przez fazę G0 / G1, Rb jest sekwencyjnie hiperfosforylowany przez szereg kinaz białkowych zależnych od cyklin (CDK) i cyklin, takich jak cyklina E / CDK2 i cyklina D / CDK4 / 6, które dezaktywują Rb i eliminują jego zdolność do tłumienia ekspresji genów związanych z cyklem komórkowym4,10. Rb może być również modyfikowany przez mały modyfikator związany z ubikwityną (SUMO)11,12,13.
SUMO to białko podobne do ubikwityny, które jest kowalencyjnie przyłączone do różnych białek docelowych. Ma kluczowe znaczenie dla różnych procesów komórkowych, w tym regulacji cyklu komórkowego, transkrypcji, lokalizacji i degradacji komórek białek, transportu i naprawy DNA14,15,16,17,18. Szlak koniugacji SUMO składa się z dimerycznego enzymu aktywującego SUMO E1 SAE1 / UBA2, pojedynczego enzymu sprzężającego E2 Ubc9, wielu ligaz E3 i proteaz specyficznych dla SUMO. Ogólnie rzecz biorąc, powstające białka SUMO muszą być przetwarzane proteolitycznie, aby wytworzyć dojrzałą formę. Dojrzały SUMO jest aktywowany przez heterodimer E1, a następnie przenoszony do enzymu E2 Ubc9. Wreszcie, C-końcowa glicyna SUMO jest kowalencyjnie sprzężona z docelową lizyną substratu, a proces ten jest zwykle ułatwiony przez ligazy E3. Białko SUMO może zostać usunięte ze zmodyfikowanego substratu przez specyficzne proteazy. Poprzednie badanie przeprowadzone przez autorów tego artykułu wykazało, że SUMOylacja Rb zwiększa jego wiązanie z CDK2, prowadząc do hiperfosforylacji we wczesnej fazie G1, procesu, który jest niezbędny do progresji cyklu komórkowego13. Wykazaliśmy również, że utrata sumoylacji Rb powoduje zmniejszoną proliferację komórek. Co więcej, niedawno wykazano, że SUMOylacja Rb chroni białko Rb przed obrotem proteasomalnym, zwiększając w ten sposób poziom białka Rb w komórkach19. Dlatego SUMOylacja odgrywa ważną rolę w funkcji Rb w różnych procesach komórkowych. Aby dalej badać funkcjonalne konsekwencje i fizjologiczne znaczenie SUMOylacji Rb, ważne jest opracowanie skutecznej metody analizy statusu SUMO Rb w komórkach ludzkich lub tkankach pacjenta.
SUMOylacja jest odwracalnym, wysoce dynamicznym procesem. W związku z tym zwykle trudno jest wykryć białka modyfikowane SUMO w całkowicie endogennych warunkach. W pracy przedstawiono metodę wykrywania endogennej sumoylacji Rb. Ponadto pokazuje, jak wykryć egzogenną SUMOylację Rb zarówno Rb typu dzikiego, jak i jego mutacji z niedoborem SUMO11. W szczególności Jacobs i in. opisali metodę zwiększania modyfikacji SUMO danego substratu, w szczególności za pomocą SUMOylacji ukierunkowanej na fuzję Ubc9 (UFDS)20. Opierając się na tej metodzie, protokół ten opisuje, jak analizować wymuszoną SUMOylację Rb i jej funkcjonalne konsekwencje. Biorąc pod uwagę, że setki substratów SUMO zostały opisane wcześniej, a bardziej przypuszczalne substraty SUMO zostały zidentyfikowane na podstawie wielu testów opartych na proteomii, protokół ten można zastosować do analizy modyfikacji SUMO tych białek w komórkach ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) firmy DulbeccoThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>jodek propidyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-etylomaleimid</td><td>Sigma</td><td>E3876&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Substytut Nonidetu P-40 (NP-40)</td>Inhibitor proteazy <td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr> Roche <tr><td></td><td></td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Mysia immunoglobulina G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> <td>przeciwciała Rb</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Białko A/G-Sepharose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina-2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Kwas niklowo-nitrylotriooctowy (Ni-NTA) Koraliki agarozowe</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% gradientowy żel SDS-PAGE</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Polifluorek winylidenu (PVDF) Membrana</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało tubulinowe</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SUMO1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td>GFP Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe peroksydazy chrzanowej (HRP)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>wzmocniona chemiluminescencja (ECL)</td><td>Zestaw Thermo Fisher Naukowy</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) wykrywanie i analiza sumoylacji białka rb w komórkach ludzkich

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Modyfikacje potranslacyjne białek są kluczowe dla prawidłowej regulacji wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Wśród tych modyfikacji, mały modyfikator związany z ubikwityną (SUMO) jest białkiem podobnym do ubikwityny, które jest kowalencyjnie przyłączone do reszt lizyny różnych białek docelowych w celu regulacji procesów komórkowych, takich jak transkrypcja genów, naprawa DNA, interakcja i degradacja białek, transport subkomórkowy i transdukcja sygnału. Najpowszechniejsze podejście do wykrywania SUMOylacji białek opiera się na ekspresji i oczyszczaniu rekombinowanych znakowanych białek w bakteriach, co pozwala na reakcję biochemiczną in vitro, która jest prosta i odpowiednia do rozwiązywania problemów mechanistycznych. Jednak ze względu na złożoność procesu SUMOylacji in vivo, trudniej jest wykryć i przeanalizować SUMOylację białek w komórkach, zwłaszcza w warunkach endogennych. Niedawne badanie przeprowadzone przez autorów tego artykułu wykazało, że endogenne białko siatkówczaka (Rb), supresor nowotworu, który jest niezbędny do negatywnej regulacji progresji cyklu komórkowego, jest specyficznie SUMOylowane we wczesnej fazie G1. W artykule opisano protokół wykrywania i analizy SUMOylacji Rb zarówno w warunkach endogennych, jak i egzogennych w komórkach ludzkich. Protokół ten jest odpowiedni do badania fenotypowego i funkcjonalnego modyfikacji Rb, a także wielu innych białek ukierunkowanych na SUMO, w komórkach ludzkich.

Aby wykryć endogenną sumoilację białka Rb podczas progresji cyklu komórkowego, w niniejszym badaniu najpierw zsynchronizowano komórki HEK293 w pięciu różnych fazach cyklu komórkowego (G0, wczesna G1, G1, S oraz G2/M), zgodnie z opisem w sekcji protokołu niniejszej pracy. Jakość synchronizacji potwierdzono za pomocą barwienia kwasów nukleinowych jodeczkiem propidyny, a następnie analizy cytometrycznej (Rysunek 1). Następnie komórki zebrano i lizowano przy użyc...

Małe modyfikatory związane z ubikwityną (SUMO) białka są sprzężone z resztami lizyny docelowych białek w celu regulacji różnych procesów komórkowych. W pracy opisano protokół wykrywania SUMOylacji białka siatkówczaka (Rb) w warunkach endogennych i egzogennych w komórkach ludzkich.

In vivo (in vivo) Wykrywanie i analiza sumoylacji białka Rb w komórkach ludzkich

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie sumoilacji białek retinoblastomy w warunkach endogennych i egzogennych w komórkach ludzkich. Białka z rodziny małych modyfikatorów powiązanych z ubikwitiną, czyli SUMO, są konjugowane z resztami lizyny białek docelowych w celu regulacji różnych procesów komórkowych. Zazwyczaj zainicjowanie sumoilacji białek w komórkach jest bardziej wymagające ze względu na złożoność procesu sumoilacji in vivo.Niniejszy eksperyment pozwala na wykrycie sumoilacji zarówno endogennych, jak i egzogennych białek Rb. Chociaż metoda ta umożliwia uzyskanie informacji na temat sumoilacji białek Rb, jest ona również odpowiednia do wykrywania wielu innych białek docelowych sumoilacji w komórkach. Aby rozpocząć, należy dodać 25 ml DMEM zawierającego 1% penicyliny i streptomycyny, a następnie inkubować komórki HEK293 w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.Zmyć komórki z płytki, używając trzech mililitrów lodowatego PBS. Następnie przenieść komórki do nowej probówki o pojemności pięciu mililitrów. Aby uzyskać komórki w fazie G1 po zakończeniu procesu synchronizacji w fazie G0, usunąć DMEM i dodać świeżą pożywkę wzrostową, umożliwiając w ten sposób komórkom HEK293 pono

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje metodę in vitro do SUMOylacji białek substratowych przy użyciu sekwencyjnej kaskady enzymatycznej. Ponadto status SUMOylacji białka jest identyfikowany za pomocą techniki elektroforezy i immunoblottingu.

Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

W przeciwieństwie do ligaz ubikwityny, zidentyfikowano kilka ligaz E3 SUMO. Ten zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro jest w stanie zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 za pomocą testu rekonstytucji in vitro.

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju dominująco-ujemnego systemu indukcyjnego, w którym każde białko może być warunkowo dezaktywowane przez odwracalną nadekspresję jego dominująco-ujemnej wersji zmutowanej.

Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN)

SUMO to niezbędne i wysoce konserwatywne, małe białko modyfikujące podobne do ubikwityny. W tym protokole opisujemy zastosowanie odpornego na stres rekombinowanego białka pułapkującego SUMO (kmUTAG) do wizualizacji natywnych, nieoznakowanych koniugatów SUMO i ich lokalizacji w różnych typach komórek.

Lokalizacja białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania, izolowania, identyfikowania i charakteryzowania białek modyfikowanych przez SUMO in vivo, zarówno z ludzkich komórek wątroby, jak i guzów wątroby uzyskanych z mysich modeli raka wątrobowokomórkowego przy użyciu jednostek wiążących SUMO (SUBEs).

Jednostki wiążące SUMO (SUBE) jako narzędzia do wzbogacania, izolacji, identyfikacji i charakterystyki proteomu SUMO w raku wątroby

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Poznaj metodę wykrywania sumoylacji białka Rb w komórkach ludzkich HEK293 w warunkach endogennych i egzogennych. Ta technika pozwala badać modyfikacje białkowe SUMO w cyklu komórkowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie i analiza sumoylacji białka Rb w komórkach ludzkich

Przeglądaj więcej filmów