Name: Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj metody analizy biogenezy błony spolaryzowanej i morfogenezy światła w jelicie C. elegans na poziomie pojedynczej komórki. Techniki obejmują barwienie przeciwciałami, RNAi oraz obrazowanie konfokalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mario de Bono (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Wielka Brytania), Kennethowi J. Kemphuesowi (Cornell University, Ithaca, USA), Michelowi Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paryż, Francja), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Francja) oraz CGC, finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), dla szczepów i przeciwciał. Prace te były wspierane przez granty NIH GM078653, MGH IS 224570 i SAA 223809 dla V.G.

<ol><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+organs%3A+building+polarized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From cells to organs: building polarized tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).</li>
<li>Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/56101/the-c-elegans-excretory-canal-as-model-for-intracellular-lumen">The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+execution+of+the+epithelial+polarity+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization and execution of the epithelial polarity programme.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).</li>
<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+protein+sorting%2C+targeting+and+distribution+in+polarized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).</li>
<li>Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+core+mechanisms+to+generate+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity.</a> Nature. 422, 766-774 (2003).</li>
<li>Goldstein, B., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PAR+Proteins%3A+Fundamental+Players+in+Animal+Cell+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization.</a> Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+vesicular+trafficking+in+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of vesicular trafficking in epithelia.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).</li>
<li>Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).</li>
<li>Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apical+polarity+protein+network+in+Drosophila+epithelial+cells%3A+regulation+of+polarity%2C+junctions%2C+morphogenesis%2C+cell+growth%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).</li>
<li>Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+and+endocytosis%3A+reciprocal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarity and endocytosis: reciprocal regulation.</a> Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).</li>
<li>Bryant, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+network+for+de+novo+generation+of+the+apical+surface+and+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen.</a> Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).</li>
<li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicobasal+domain+identities+of+expanding+tubular+membranes+depend+on+glycosphingolipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).</li>
<li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+and+AP-1+regulate+apical+polarity+and+lumen+formation+during+C.+elegans+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis.</a> Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).</li>
<li>Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+C.+elegans+Intestine+Involves+Axon+Guidance+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes.</a> PLoS Genet. 12 (4), e1005950(2016).</li>
<li>Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10588867">Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine.</a> Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/intestine/Intframeset.html">Alimentary system, intestine.</a> WormAtlas. , (2009).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+and+morphogenesis+of+single-cell+tubes+in+the+C.+elegans+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract.</a> Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).</li>
<li>Maduro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Gut development in C. elegans.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2017).</li>
<li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans intestine.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).</li>
<li>Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2014).</li>
<li>Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2014).</li>
<li>Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumen+morphogenesis+in+C.+elegans+requires+the+membrane-cytoskeleton+linker+erm-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1.</a> Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).</li>
<li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+the+cell+cortex%3A+the+role+of+ERM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li>
<li>Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22226520">Immunofluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).</li>
<li>JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Putative+RNA-Directed+RNA+Polymerase+RRF-3+Makes+C.+elegans+Hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Netherlands, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F978-1-4020-6754-9_11479">Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy</a>. , Springer. Netherlands. (2008).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).</li>
<li>Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDC-25.2%2C+a+C.+elegans+ortholog+of+cdc25%2C+is+essential+for+the+progression+of+intestinal+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions.</a> Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).</li>
<li>Shi, A., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+recycling+endosomes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).</li>
<li>Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , 
 <a target="_blank" href="http://cbs.umn.edu/cgc/home">http://cbs.umn.edu/cgc/home</a> (2017).</li>
<li>Wormbase. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.wormbase.org/"> http://www.wormbase.org/</a> (2017).</li>
<li>McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2007).</li>
<li>Transgeneome website. , 
 <a target="_blank" href="https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html">https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html</a> (2017).</li>
<li>C. elegans expression pattern. , 
 <a target="_blank" href="http://gfpworm.org/">http://gfpworm.org/</a> (2017).</li>
<li>National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , 
 <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/">https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/</a> (2017).</li>
<li>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). , 
 <a target="_blank" href="http://dshb.biology.uiowa.edu">http://dshb.biology.uiowa.edu</a> (2017).</li>
<li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe podejścia genetyczne / RNAi do utraty funkcji i obrazowania (znakowanie i mikroskopowe) w celu wykorzystania nabłonka jelitowego C. elegans jako modelu do wizualnej i molekularnej sekcji biogenezy spolaryzowanej błony i światła in vivo .
Etykietowania
Protokół ten koncentruje się na barwieniu przeciwciał. Znakowanie in situ za pomocą przeciwciał jest wysoce specyficz...

Generowanie asymetrii komórkowych i subkomórkowych, takich jak tworzenie spolaryzowanych domen błonowych, jest kluczowe dla morfogenezy i funkcji komórek, tkanek i organów1. Badania nad biogenezą błon spolaryzowanych w nabłonku pozostają wyzwaniem technicznym, ponieważ zmiany kierunkowe w alokacji składników subkomórkowych zależą od wielu następujących po sobie i pokrywających się sygnałów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych, które są trudne do rozdzielenia w większości modeli i silnie zależą od systemu modelowego. Prezentowany tutaj model - jednowarstwowe jelito Caenorhabditis elegans - to tkanka o wyjątkowej prostocie. Wraz z jednokomórkowym kanałem wydalniczym C. elegans (patrz towarzyszący artykuł na temat biogenezy spolaryzowanej błony w kanale wydalniczym C. elegans)2, zapewnia kilka unikalnych korzyści w identyfikacji i charakterystyce cząsteczek wymaganych do biogenezy spolaryzowanej błony. Zachowanie wskazówek polarności molekularnej od drożdży do człowieka sprawia, że ten prosty narząd bezkręgowców jest doskonałą "komorą tkankową in vivo" do odpowiedzi na pytania dotyczące polaryzacji nabłonka, które mają bezpośrednie znaczenie dla systemu ludzkiego, który jest nadal zbyt złożony, aby umożliwić wizualną analizę tych zdarzeń na poziomie pojedynczej komórki in vivo.
Chociaż zidentyfikowano wiele zachowanych wskazówek polaryzacji z (1) macierzy zewnątrzkomórkowej, (2) błony plazmatycznej i jej połączeń oraz (3) wewnątrzkomórkowego transportu pęcherzykowego3, podstawowe zasady ich integracji w procesie biogenezy spolaryzowanej błony nabłonkowej i tkanki są słabo poznane4. Klasyczne modele pojedynczej komórki in vivo (np. S. cerevisiae i zygota C. elegans) odegrały zasadniczą rolę w zdefiniowaniu zasad spolaryzowanego podziału komórek i polaryzacji przednio-tylnej oraz zidentyfikowały krytyczne determinanty polaryzacji związane z błoną (małe GTPazy/CDC-42, PAR z wadliwym podziałem)5,6, ale zależą one od unikalnych sygnałów łamania symetrii (blizna pączka, wnikanie plemnika) i nie mają zabezpieczonych połączeniami domen błony wierzchołkowej i, przypuszczalnie, odpowiadającej im wewnątrzkomórkowej maszynerii sortowania apikopodstawnego. Nasza obecna wiedza na temat organizacji spolaryzowanego transportu w nabłonku opiera się jednak przede wszystkim na monokulturach 2D ssaków7, które nie mają fizjologicznych zewnątrzkomórkowych i rozwojowych wskazówek, które mogłyby zmieniać pozycje domen błonowych i kierunki trajektorii transportu (samo przejście z systemów hodowli in vitro 2D na 3D wystarcza do odwrócenia polaryzacji błony w komórkach MDCK (Madin-Darby canine nerney)8. Badania rozwojowe in vivo nad polaryzacją nabłonka w modelowych organizmach bezkręgowców początkowo przeprowadzono w płaskim nabłonku, na przykład w naskórku Drosophila melanogaster, gdzie zidentyfikowano krytyczny wpływ dynamiki połączeń na spolaryzowaną migrację komórek i ruch arkusza komórkowego9 oraz transportu endocytarnego dla utrzymania polarności10. Analiza 3D in vitro i in vivo morfogenezy światła w nabłonku kanalików w komórkach MDCK i w jelicie C. elegans zidentyfikowała ostatnio wymóg transportu wewnątrzkomórkowego dla biogenezy i pozycjonowania domeny de novo (wierzchołkowej) i światła11,12,13. Grubość rurkowatych (w porównaniu z płaskimi) komórkami nabłonkowymi jest zaletą w analizie 3D asymetrii subkomórkowych, ponieważ pozwala na lepsze wizualne rozróżnienie błony wierzchołkowo-świetlnej, połączeń wierzchołkowo-bocznych, błony bocznej i pozycji organelli wewnątrzkomórkowych. Do tych zalet wizualnych model C. elegans dodaje ustawienie in vivo, oś rozwojową, przezroczystość, prostotę planu ciała, niezmienniczą i zdefiniowaną linię komórkową, zalety analityczne (genetyczne) i dodatkowe opisane poniżej.
C. elegans sam w sobie jest glistą o rurkowatej budowie, której przezroczystość i prosta architektura sprawiają, że podobnie rurkowate organy wewnętrzne są bezpośrednio dostępne do wizualnej analizy morfogenezy rurki i światła. Dwadzieścia komórek jego jelita (czasami 21 lub 22 komórek)14 pochodzą z pojedynczej komórki progenitorowej (E) i rozwijają się z dwuwarstwowego nabłonka przez jeden etap interkalacji do obustronnie symetrycznej rurki z dziewięcioma pierścieniami INT (cztery komórki w pierwszym pierścieniu; Rysunek 1 schemat)14,15,16. Analiza pochodzenia i tkanek jelita, początkowo określona przez optykę Nomarskiego za pomocą tożsamości jądrowych17, a następnie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą znakowanych błon, dostarczyła krytycznych informacji na temat jego morfogenezy, w szczególności wymagań autonomicznej i nieautonomicznej komórki dla jej kierunkowych podziałów i ruchów komórek (np. interkalacja, asymetrie prawo-lewo, obrót rurki przedniej i tylnej)14,18. Wczesna specyfikacja komórek endodermalnych i sieć regulacyjna genów kontrolujących rozwój tego klonalnego narządu modelowego są dobrze scharakteryzowane19,20. Nacisk kładziony jest jednak na analizę biogenezy spolaryzowanej błony i światła w pojedynczych komórkach kanalików oraz asymetrii wewnątrzkomórkowych endomembran, struktur cytoszkieletu i organelli, które towarzyszą temu procesowi. Analizę ułatwia prostota tej rurki, w której wszystkie błony wierzchołkowe (na poziomie ultrastrukturalnym wyróżnione mikrokosmkami) są skierowane w stronę światła, a wszystkie błony podstawne są skierowane w stronę zewnętrznej powierzchni rurki, przy czym błony boczne stykają się ze sobą, oddzielone od błony wierzchołkowej połączeniami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 schemat; patrz referencje (16,21) dla C. elegans-specyficzna organizacja elementów złącza szczelnego i przylegającego). Biogeneza błony wierzchołkowej zbiega się zatem z morfogenezą światła. Co więcej, wielkość dorosłych komórek jelitowych - największych komórek tego małego zwierzęcia (z wyjątkiem komórki wydalniczej) - jest zbliżona do wielkości komórki ssaka, co pozwala na wizualne śledzenie in vivo elementów subkomórkowych, np. trajektorii pęcherzyków, co zwykle próbuje się uzyskać in vitro w szalce hodowlanej.
Dla celów tej analizy komórkowej i subkomórkowej, odpowiednie etykietowanie jest krytyczne. Domeny błony endo- lub plazmatycznej jelit, połączenia, struktury cytoszkieletu, jądra i inne organelle subkomórkowe można uwidocznić poprzez znakowanie ich specyficznych składników molekularnych. Wiele takich komponentów zostało scharakteryzowanych i nadal jest odkrywanych (Tabela 1 zawiera kilka przykładów i odnosi się do zasobów). Na przykład zidentyfikowano różne cząsteczki odróżniające kanalikowe i/lub pęcherzykowe przedziały układu endomembranowego jelita, od ER do Golgiego przez pęcherzyki post-Golgiego do błony plazmatycznej22. Określone białka (a także lipidy i cukry) mogą być znakowane bezpośrednio lub pośrednio poprzez białka wiążące. Protokół ten koncentruje się na barwieniu przeciwciał in situ utrwalonych próbek, jednej z dwóch standardowych technik znakowania (patrz towarzyszący artykuł na temat tubuogenezy kanału wydalniczego w celu zapoznania się z opisem drugiej techniki2 - znakowanie in vivo za pomocą fluorescencyjnych fuzji białek - która ma bezpośrednie zastosowanie w jelicie; Tabela 2 zawiera przykłady promotorów specyficznych dla jelit, które można wykorzystać do kierowania ekspresją takich białek fuzyjnych do jelita). Podwójne lub wielokrotne znakowanie z dowolnym podejściem lub z kombinacją obu plus dodatkowe barwienie chemiczne, pozwala na większą dogłębną rozdzielczość wizualną oraz badanie przestrzennych i czasowych zmian w kolokalizacji i rekrutacji określonych cząsteczek lub składników subkomórkowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Procedury utrwalania i barwienia opisane w tym protokole wspierają zachowanie znakowania białka zielonej fluorescencji (GFP) podczas procedur barwienia immunologicznego. Do obrazowania opisano kluczowe punkty wykrywania i charakterystyki fenotypów tuburogenezy za pomocą standardowych procedur mikroskopowych (preparacja fluorescencyjna i mikroskopia konfokalna) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, 4). Można je rozszerzyć na metody obrazowania o wyższej rozdzielczości, na przykład mikroskopię superrozdzielczą i transmisyjną mikroskopię elektronową (nieopisane tutaj).
Kluczową zaletą tego systemu jest możliwość analizy polaryzacji w poszczególnych komórkach na różnych etapach rozwoju, od embriogenezy do dorosłości. Na przykład wierzchołkową domenę błonową i biogenezę światła można śledzić przez cały okres rozwoju na poziomie pojedynczej komórki poprzez znakowanie ERM-1, wysoce konserwatywnym łącznikiem błonowo-aktynowym z rodziny Ezrin-Radixin-Moesin23,24. ERM-1 wizualizuje biogenezę błony wierzchołkowej (1) podczas morfogenezy rurki embrionalnej, gdy zachodzi ona jednocześnie ze spolaryzowanym podziałem i migracją komórek (komórki poruszają się wierzchołkowo wokół światła podczas interkalacji)<klasa sup="xref">15; (2) podczas późnego wydłużania się rurki zarodkowej i larwalnej, które przebiega przy braku podziału lub migracji komórek; oraz (3) w jelicie dorosłego, gdzie utrzymywane są spolaryzowane domeny błonowe (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). W rozszerzającym się postmitotycznym nabłonku larw biogeneza błony spolaryzowanej de novo może być zatem oddzielona od morfogenezy spolaryzowanej tkanki, co nie jest możliwe w większości modeli polaryzacji nabłonka in vivo i in vitro, w tym tych z rozdzielczością pojedynczej komórki (np. model torbieli 3D MDCK<klasa sup="xref">8). Dzięki znakowaniu innych składników, to ustawienie daje możliwość (szczególnie w stadium larwalnym L1, kiedy komórki mają wyższy stosunek cytoplazmy do jądra) odróżnienia tych zmian wewnątrzkomórkowych, które są specyficzne dla biogenezy spolaryzowanej błony (np. Reorientacja trajektorii transportu) od tych, które są jednocześnie wymagane do spolaryzowanego podziału i migracji komórek.
Wszechstronność genetyczna C. elegans jest dobrze znana25i czyni z niej potężny system modelowy do analizy molekularnej każdego zagadnienia biologicznego. Na przykład badania nad morfogenezą można rozpocząć od szczepu typu dzikiego, szczepu transgenicznego, w którym struktura będąca przedmiotem zainteresowania (np. błona) jest znakowana markerem fluorescencyjnym, lub od mutanta powodującego utratę lub zysk funkcji z defektem tej struktury. Typowe odwrotne badanie genetyczne może wygenerować mutanta, w którym gen będący przedmiotem zainteresowania jest usunięty w linii zarodkowej (np. przez celowaną delecję), zmodyfikowany przez mutagenezę (zwykle powodując mutacje punktowe z wynikającą z tego utratą, zmniejszeniem lub wzrostem funkcji genu) lub gdzie jego transkrypt jest zredukowany przez RNAi. Łatwość tworzenia RNAi poprzez żerowanie w C. elegans26 nadaje się również do projektowania ukierunkowanych badań przesiewowych, które badają większą grupę genów będących przedmiotem zainteresowania. Prawdopodobnie największą siłą organizmu modelu genetycznego jest zdolność do przeprowadzania badań przesiewowych in vivo (np. mutagenezy, systematycznych lub obejmujących cały genom badań przesiewowych RNAi), które pozwalają na bezstronne badanie molekularnej przyczyny fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, bezstronne wizualne badanie przesiewowe tubuogenezy RNAi C. elegans, zaczynając od transgenicznego zwierzęcia z błonami wierzchołkowymi znakowanymi ERM-1, odkryło intrygującą odwracalną konwersję polaryzacji jelit i fenotyp światła ektopowego, wykorzystany tutaj jako przykład dla tego typu analizy. To badanie przesiewowe zidentyfikowało wyczerpanie glikosfingolipidów (GSL; obligatoryjne lipidy błonowe, identyfikowane przez ich enzymy biosyntetyczne GLS) oraz składników klatryny płaszcza pęcherzykowego i jej adaptora AP-1 jako specyficzne defekty molekularne powodujące ten fenotyp konwersji polarności, charakteryzując w ten sposób te cząsteczki transportujące jako wskazówki in vivo dla polaryzacji błony wierzchołkowej i pozycjonowania światła12,13. Rozpoczynając od określonego fenotypu mutacji genetycznej/morfogenezy, takie badania przesiewowe (lub pojedyncze eksperymenty interakcji genetycznej/RNAi) mogą również badać funkcjonalne interakcje między dwoma lub wieloma genami będącymi przedmiotem zainteresowania (zobacz towarzyszący artykuł na temat kanału wydalniczego dla przykładu takiej analizy)2. Protokół ten koncentruje się na RNAi, który oprócz zdolności do bezpośredniej identyfikacji genu, którego utrata powoduje fenotyp w badaniach przesiewowych, zapewnia określone korzyści w analizie morfogenezy. Ponieważ produkty genów kierujące morfogenezą często działają w sposób zależny od dawki, RNAi zwykle z powodzeniem generuje spektrum fenotypów. Zdolność do generowania informacyjnych fenotypów częściowej utraty funkcji pomaga również rozwiązać problem polegający na tym, że większość ważnych genów tubuogenezy jest niezbędna, a ich utrata powoduje bezpłodność i wczesną śmiertelność zarodka. Protokół ten obejmuje warunkowe strategie RNAi w celu przezwyciężenia tej trudności i sugeruje sposoby optymalizacji generowania szerszego spektrum fenotypów, takich jak seria alleliczna wytwarzana przez mutagenezę.

<table><tbody><tr><td><silne>Barwienie przeciwciałami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-213-612</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Sigma</td><td>MT409-1BTL</td><td></td></tr><tr><td><silne>Przeciwciała pierwotne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MH27 (mysz)</td><td></td><td></td><td>Stężenie: 1:20 Zasoby: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td></tr><tr><td>MH33 (mysz)</td><td></td><td></td><td>Stężenie: 1:10 Zasoby: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td></tr><tr><td>anty-ICB4 (królik)</td><td></td><td></td><td>Stężenie: 1:5 Zasoby: Prezent od Mario de Bono (Medical Research Council, Anglia)</td></tr><tr><td>anty-PAR-3 (królik)</td><td></td><td></td><td>Stężenie: 1:50 Zasoby: Dar od Kennetha J. Kemphuesa (Cornell University)</td></tr><tr><td><silne>Przeciwciała drugorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Floor 568 (anty-królik)</td><td>ABCam</td><td>AB175471</td><td>Stężenie: 1:200</td></tr><tr><td>Cy5 (anty-mysz)</td><td>Technologie życia</td><td>A10524</td><td>Stężenie: 1:200</td></tr><tr><td>TRITC (anty-królik)</td><td>Invitrogen</td><td>T2769</td><td>Stężenie: 1:200</td></tr><tr><td>FITC (anty-mysz)</td><td>Sigma</td><td>F9006</td><td>Stężenie: 1:100</td></tr><tr><td>Oznaczone chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-Phalloidin</td><td></td><td></td><td>Stężenie: 1:100 Zasoby: Sondy molekularne-T7471</td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy Silikon</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>4448</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe mikroskopu (22x22-1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans powiązane</td><td></td><td></td><td>patrz odniesienie29 dla standardowych procedur hodowli i konserwacji C. elegans.</td></tr><tr><td>LB Medium i płyty</td><td></td><td></td><td>patrz referencja29 dla protokołów.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma</td><td>A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Średni</silny></td><td></td><td></td><td>patrz referencja29 dla protokołów.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM plates</td><td></td><td></td><td>patrz referencja29 dla protokołów.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td><>płytki RNAi</td><td></td><td></td><td>patrz referencja30 dla protokołów.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biological</td><td>I8500</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bacteria</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)</td><td>Źródło: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Biblioteka karmienia ORF-RNAi (ref51)</td><td>Źródło: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9221-500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop preparacyjny</td><td>Mikroskop</td> preparacyjny <td>Nikon SMZ-U</td><td></td></tr><tr><td>wyposażony w przystawkę do fluorescencji stereo o dużej mocy (Kramer Scientific), kamerę CCD z oprogramowaniem do przechwytywania Q i lampą fluorescencyjną X-Cite (Photonic Solutions)</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystem</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>zamontowany na odwróconym ECLIPSE Ti-E mikroskop</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td></td></tr></tbody></table>

jelito c. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji rnai i obrazowanie

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Rurki wielokomórkowe, podstawowe jednostki wszystkich organów wewnętrznych, składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonkowych lub śródbłonka, z błonami wierzchołkowymi wyściełającymi światło i błony podstawno-boczne stykające się ze sobą i/lub macierzą zewnątrzkomórkową. W jaki sposób ta charakterystyczna asymetria błon jest ustalana i utrzymywana podczas morfogenezy narządów, jest nadal nierozwiązaną kwestią biologii komórki. Protokół ten opisuje jelito C. elegans jako model do analizy biogenezy błony spolaryzowanej podczas morfogenezy rurki, z naciskiem na biogenezę błony wierzchołkowej i światła. Dwudziestokomórkowy jednowarstwowy nabłonek jelitowy C. elegans jest ułożony w prostą obustronnie symetryczną rurkę, umożliwiającą analizę na poziomie pojedynczej komórki. Polaryzacja błony zachodzi jednocześnie ze spolaryzowanym podziałem i migracją komórek podczas wczesnej embriogenezy, ale de novo spolaryzowana biogeneza błony trwa przez cały okres wzrostu larw, kiedy komórki już się nie namnażają i nie poruszają. To ostatnie ustawienie pozwala na oddzielenie zmian subkomórkowych, które jednocześnie pośredniczą w tych różnych procesach polaryzacji, trudnych do rozróżnienia w większości modeli polaryzacji. Składniki błony wierzchołkowej, podstawno-bocznej, połączeniowej, cytoszkieletu i endobłony mogą być znakowane i śledzone przez cały okres rozwoju za pomocą białek fuzyjnych GFP lub oceniane przez barwienie przeciwciał in situ. Wraz z genetyczną wszechstronnością organizmu, jelito C. elegans stanowi unikalny model in vivo do wizualnej, rozwojowej i molekularnej analizy genetycznej biogenezy spolaryzowanej błony i rurki. Opisane tutaj konkretne metody (wszystkie standardowe) obejmują: znakowanie subkomórkowych składników jelitowych przez barwienie przeciwciałami; analizować geny zaangażowane w biogenezę błon spolaryzowanych poprzez badania utraty funkcji dostosowane do zazwyczaj niezbędnych genów tubulogenezy; oceniać wady polaryzacji na różnych etapach rozwoju; interpretować fenotypy za pomocą epifluorescencji, różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i mikroskopii konfokalnej; określić ilościowo wady wzroku. Protokół ten można dostosować do analizy dowolnej z często wysoce konserwatywnych cząsteczek zaangażowanych w polaryzację nabłonka, biogenezę błony, morfogenezę rurki i światła.

Niniejszy protokół opisuje sposób analizy molekularnej i wizualizacji polaryzowanej biogenezy błon oraz morfogenezy światła w jelicie C. elegans na poziomie pojedynczych komórek i struktur subkomórkowych. Jednowarstwowe jelito C. elegans, składające się z dwudziestu komórek, powstaje w wyniku ukierunkowanego podziału i migracji komórek podczas środkowej fazy embriogenezy. W tym czasie ustalają się spolaryzowane domeny błonowe, jednak biogeneza polaryzowanych błon de ...

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Ogólnym celem tego zestawienia standardowych metod jest zademonstrowanie, w jaki sposób jelito C.elegans może być wykorzystywane do analizy in vivo biogenezy spolaryzowanej błony oraz morfogenezy światła narządu na poziomie pojedynczej komórki i struktur podkomórkowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie polarności i biogenezy, takie jak sposób ustanawiania i utrzymywania domen błonowych apikalnych i bazolateralnych oraz innych asymetrii podkomórkowych podczas i po morfogenezie. Główną zaletą tego modelu systemowego jest fakt, że ta przezroczysta jednowarstwowa struktura składająca się z zaledwie 20 komórek może przetrwać w komorze tkankowej in vivo, co pozwala na analizę biogenezy spolaryzowanej błony i światła w pojedynczych komórkach.Techniki te można rozszerzyć na analizę innych fenotypów morfogenezy C. elegans; w niniejszym przypadku skupiono się na analizie biogenezy błon, a konkretnie na biogenezie błony apikalnej i światła narządu. Procedury obejmują udoskonalone techniki obrazowania w zwierzętach utrwalonych i żywych, aby rozróżnić domeny błonowe oraz komponenty wewnątrzkomórkowe, a także zidentyfikować fenotypy morfogenezy światła w jelicie C. elegans. Niniejszemu filmowi dotyczącemu tubulogenezy jelita towarzyszy film o tubulogenezie kanału wydalniczego; są to wzajemnie uzupełniające się modele analizy in vivo biogenezy błon spolaryzowanych.W odniesieniu do znakowania, opisano generowanie zwierząt transgenicznych z białkami fuzyjnymi znakowanymi fluorescencyjnie do obrazowania na żywo w towarzyszącym filmie dotyczącym analizy tubulogenezy kanału wydalniczego. Takie zwierzęta mogą być bezpośrednio wykorzystane w eksperymentach RNAi. Trzecie pokolenie jest zazwyczaj pierwszym krokiem w tej kombinacji procedur.Niniejszy film rozpoczyna się od alternatywnej metody znakowania, jaką jest barwienie przeciwciałami, która wymaga utrwalenia zwierząt. Różne procedury znakowania można łączyć, przy czym immunohistochemia jest zazwyczaj wykorzystywana do końcowej analizy obrazowania. Protokół ten zawiera również przykłady specyficznych dla jelit promotorów markerów błonowych oraz inne zasoby przydatne w obu procedurach znakowania.Po zaprezentowaniu immunohistochemii, w niniejszym filmie wykorzystano szczep transgeniczny, który znakuje apikalną błonę jelita białkiem ERM-1 GFP, w celu poszukiwania fenotypów polarności i morfogenezy światła jelita przy użyciu RNAi. Najpierw należy przygotować szkiełko do unieruchomienia nicieni. Nanieś pipetą 30 µL poli-L-lizyny na szkiełko, a następnie nałóż na nie drugie szkiełko i opuść je razem, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na obu powierzchniach.Teraz rozdziel dwa szkiełka i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Następnie umieść płaski metalowy blok w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem. Przemyj płytki roztworem M9 i przenieś około 10 µL roztworu M9 zawierającego nicienie.Alternatywnie można przenieść nicienie i dodać M9 na szkiełko. Po przeniesieniu nicieni należy ostrożnie położyć szkiełko nakrywkę poprzecznie na nich, tak aby wystawała ona poza jedną krawędź. Następnie należy delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkę, nie wykonując żadnych ruchów bocznych.Teraz natychmiast przenieś preparat do metalowego bloku w ciekłym azocie i pozwól mu zamarznąć. Po pięciu minutach odrzuć szkiełko nakrywki, wykorzystując wystającą krawędź. Wykonaj tę czynność szybko, aby uzyskać odpowiednie pęknięcie kutykuli.Następnie zanurz preparat w szklanym naczyniu Coplina wypełnionym metanolem w temperaturze -20 °C. Po pięciu minutach przenieś preparat do szklanego naczynia Coplina wypełnionego acetonem na kolejne pięć minut w tej samej temperaturze. Preparaty można barwić bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -20 °C.Wyjmij preparat z acetonu i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie zaznacz miejsce na okrągłą ściankę z wazeliny na spodniej stronie szkiełka, a następnie uformuj ściankę z wazeliny. Nie ścieraj wazeliny podczas tej procedury.Następnie przygotuj wilgotną komorę w pojemniku z mokrymi ręcznikami papierowymi i umieść na nim przedmiot szkiełka na stojaku. Ręczniki nie powinny stykać się z przedmiotem szkiełka, podobnie jak sąsiednie przedmioty szkiełka nie powinny stykać się ze sobą. Teraz pipetą nanieś odpowiednią ilość PBS do kręgu żelowego, aby pokryć ten obszar.Delikatnie umieść końcówkę pipety na krawędzi okręgu i pozwól, aby płyn gładko rozprowadził się nad nicieczkami. Następnie zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut. Po pięciu minutach przechyl szkiełko i powoli odessać PBS, uważając, aby nie zgubić nicieczników ze szkiełka.Następnie ostrożnie wypełnij krążek żelowy świeżo przygotowanym roztworem blokującym. Pozostaw preparat do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach zastąp roztwór blokujący roztworem blokującym zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe.Następnie inkubować preparat w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć preparat, trzykrotnie nakładając i usuwając roztwór blokujący. Każda aplikacja roztworu blokującego powinna być inkubowana przez 10 minut.Następnie dodaj przeciwciało wtórne rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubuj preparat przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po tym czasie przemyj preparat dwukrotnie roztworem blokującym, a następnie raz PBS. Następnie usuń jak największą ilość PBS, nie dopuszczając do wyschnięcia próbki, i ostrożnie usuń galaretkę znajdującą się wokół preparatu.Nanieś kroplę medium montażowego na preparat, a następnie przykryj go szkiełkiem nakrywkowym i zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci. Następnie przechowuj preparaty w ciemności w temperaturze 4 °C. Przenieś płytkę z biblioteką RNAi z temperatury -80 °C na suchy lód.Usuń taśmę uszczelniającą. Następnie przenieś wybrany klon na agar selekcyjny. Po tym wysiej klon i inkubuj bakterie przez noc.Przed ponownym umieszczeniem płytki z biblioteką w zamrażarce o temperaturze -80°C należy nakleić nową taśmę uszczelniającą. Następnego dnia zaszczepić kolonie z płytki do 1 ml aliquotów medium płynnego zawierającego ampicylinę. Następnie inkubować je z wytrząsaniem przez około 14 godzin w temperaturze 37°C.Następnego dnia nanieś 200 µL na klon na oddzielne płytki RNAi. Pozostaw płytki do wyschnięcia i indukuj produkcję RNAi poprzez inkubację przez noc w temperaturze pokojowej. Dzień później przenieś pięć nicieni w stadium L4 na każdą płytkę RNAi oznakowaną konkretnym genem docelowym.Następnie przenieś płytki do inkubatora, zazwyczaj w temperaturze 20 °C. Najpierw zbadaj zwierzęta kontrolne oraz zwierzęta poddane RNAi w świetle przechodzącym przy małym i dużym powiększeniu. Następnie zbadaj zwierzęta kontrolne oraz zwierzęta poddane RNAi w świetle fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich filtrów.Systematycznie przeskanuj płytkę z zwierzętami RNAi, przesuwając się od górnego lewego do dolnego prawego rogu całej płytki w poszukiwaniu fenotypów. Wyszukaj zwierzęta wykazujące cechy zainteresowania. Aby dokładniej zbadać wybrane fenotypy RNAi, skup się na jelicie i użyj powiększenia, aby ocenić fenotypy tubulogenezy oraz morfogenezy światła jelita.Aby zbadać interesujące nas nicienie pod mikroskopem konfokalnym, należy najpierw je zamontować i unieruchomić ręcznie, tworząc na szkiełku przedmiotowym cienki okrąg z smaru próżniowego lub wazeliny. Warstwa smaru powinna być cienka, nie grubsza niż 0,1 millimeter. Następnie do wnętrza okręgu należy dodać około 3,5 microliters 10 millimolar azotku sodu.Następnie szybko przenieś wybrane nicienie do roztworu pod mikroskopem stereo, zanim roztwór wyschnie. Po czym delikatnie nałóż szkiełko nakrywką i wykonaj obrazowanie zwierząt w ciągu 30 minut. Zastosuj lekki nacisk i upewnij się pod mikroskopem, że nicienie nie pływają w roztworze.Pod mikroskopem konfokalnym zlokalizuj nicienie przy niskim powiększeniu i ustaw ostrość. Następnie użyj obiektywu imersyjnego olejowego 60- lub 100X, aby przejrzeć i zobrazować jelito. Następnie zbadaj zwierzę w świetle fluorescencyjnym z odpowiednim kanałem, aby wybrać obszary wykazujące interesującą wadę komórkową.Postępuj sprawnie, aby uniknąć fotobielenia. Następnie przełącz się na skanowanie laserowe i ogranicz obraz do jelita, wyznaczając granice skanowania po jego stronie grzbietowej i brzusznej. Przechwyć serię obrazów, a następnie połącz je w jeden obraz projekcyjny.Niniejszy protokół opisuje sposób analizy molekularnej i wizualnej sekcji biogenezy spolaryzowanej błony w rozwijającym się jelicie C.elegans, gdzie morfogeneza błony apikalnej i światła jelita zachodzą równocześnie. Możliwe jest rozróżnienie domen błony apikalnej i bazolateralnej, złącz związanych z błoną oraz światła jelita, a także zbadanie ich wzajemnych relacji w trakcie rozwoju. Komponenty podkomórkowe te można znakować przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją lub fluorescencyjnymi białkami fuzyjnymi w celu podwójnego lub potrójnego znakowania, zgodnie z opisem w towarzyszącej publikacji.Rażące wady światła jelita można szybko przeskanować, korzystając z fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Łącznik cytoszkieletu błon apikalnych ERM-1 sprzężony z GFP jest silnie ekspresjonowanym markerem, użytecznym w badaniach przesiewowych RNAi. Dzięki zastosowaniu tego markera odkryto szereg nowych fenotypów morfogenezy i polarności światła jelita wraz z leżącymi im u podstaw defektami genetycznymi.Następnie wykorzystano obrazy o większym powiększeniu, uzyskane za pomocą konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego, aby dokładniej zbadać fenotypy i lepiej zrozumieć występujące wady. Niektóre fenotypy można było poddać kwantyfikacji. Kwantyfikację zastosowano w celu porównania tych wad oraz śledzenia ich progresji w trakcie rozwoju.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak znakować błonę jelitową oraz przedziały endomembranowe za pomocą immunobarwienia oraz jak analizować fenotypy funkcjonalne RNAi w procesach biogenezy błony spolaryzowanej i światła jelita.

the-c-elegans-intestine-as-model-for-intercellular-lumen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten film opisuje freeze-cracking, metodę umożliwiającą barwienie tkanek C. elegans do barwienia przeciwciałami poprzez naruszanie naskórka.

Kraking zamrażalny nicieni: metoda wystawiania wewnętrznych tkanek robaków do barwienia

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Kanał wydalniczy C. elegans jest unikalnym modelem jednokomórkowym do wizualnej analizy in vivo biogenezy błony spolaryzowanej de novo. Protokół ten opisuje połączenie standardowych podejść genetycznych/RNAi i obrazowania, które można dostosować do identyfikacji i charakterystyki cząsteczek kierujących jednokomórkową tubulingenezą oraz biogenezą błony wierzchołkowej i światła.

Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania

Prezentujemy protokoły izolacji struktur 3D jelit z organoidów in vivo i in vitro w macierzy podstawnej, a także szczegółowo opisujemy różne protokoły utrwalania i barwienia zoptymalizowane pod kątem znakowania immunologicznego białek mikrotubulowych, centrosomalnych i łączących, a także markerów komórkowych, w tym białka komórek macierzystych Lgr5.

Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj metody analizy biogenezy błony spolaryzowanej i morfogenezy światła w jelicie C. elegans na poziomie pojedynczej komórki. Techniki obejmują barwienie przeciwciałami, RNAi oraz obrazowanie konfokalne.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie (Wideo) | JoVE Journal

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Przeglądaj więcej filmów