Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Ogólnym celem tej kombinacji standardowych metod jest wykazanie, w jaki sposób jelito C.elegans może być wykorzystane do analizy in vivo biogenezy spolaryzowanej błony i morfogenezy światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie polaryzacji i biogenezy, takie jak to, w jaki sposób wierzchołkowe i podstawno-boczne domeny błonowe oraz inne asymetrie subkomórkowe są ustanawiane i utrzymywane podczas i po morfogenezie. Główną zaletą tego systemu modelowego jest to, że ta przezroczysta pojedyncza warstwa składająca się z zaledwie 20 komórek może przetrwać w komorze tkankowej in vivo w celu wypreparowania biogenezy spolaryzowanej błony pojedynczej komórki i światła.

Techniki te można rozszerzyć na analizę innych fenotypów morfogenezy C.Elegans, koncentrując się tutaj na analizie biogenezy błony, w szczególności na biogenezie błony wierzchołkowej i światła. Procedury obejmują udoskonalone techniki obrazowania u zwierząt stałych i żywych w celu rozróżnienia domen błonowych i składników subkomórkowych oraz identyfikacji fenotypów morfogenezy światła w jelicie C. elegans. Temu filmowi na temat tubogenezy jelitowej towarzyszy film na temat wzajemnie informacyjnych modeli kanaliki wydalniczej, w których przeprowadza się analizę in vivo biogenezy błony spolaryzowanej.

W odniesieniu do znakowania, wytwarzanie zwierząt transgenicznych za pomocą znakowanych fluorescencyjnie białek fuzyjnych do obrazowania na żywo opisano w załączonym filmie na temat analizy kanaliki wydalniczej. Takie zwierzęta mogą być bezpośrednio wykorzystane w eksperymentach RNAi. Trzecia generacja jest zazwyczaj pierwszym krokiem w tej kombinacji procedur.

Ten film zaczyna się od alternatywnej metody etykietowania, barwienia przeciwciałami, dla których zwierzęta muszą być naprawione. Różne procedury znakowania można łączyć z immunohistochemią zwykle stosowaną do końcowej analizy obrazowania. Protokół ten zawiera również przykłady markerów błonowych specyficznych dla jelita, promotorów i innych zasobów przydatnych w obu procedurach znakowania.

Po zademonstrowaniu immunohistochemii, w tym filmie wykorzystano transgeniczny szczep, który znakuje błonę wierzchołkową jelita za pomocą ERM-1 GFP, w celu poszukiwania fenotypów polarności i morfogenezy światła za pomocą RNAi. Najpierw przygotuj szkiełko, aby naprawić robaki. Odpipetować 30 mikrolitrów poli-L-lizyny na szkiełko, a następnie umieścić drugie szkiełko na drugim i wrzucić je razem, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na obu.

Teraz rozerwij oba szkiełka i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Następnie umieść płaski metalowy blok w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem. Umyć płytki roztworem M9 i przenieść około 10 mikrolitrów M9 zawierającego robaki.

Alternatywnie wybierz robaki i dodaj M9 do zjeżdżalni. Po przeniesieniu robaków delikatnie upuść na nie szkiełko nakrywkowe, tak aby szkiełko nakrywkowe zwisało z jednej krawędzi. Następnie delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, nie wykonując żadnych ruchów bocznych.

Teraz natychmiast przenieś szkiełko do metalowego bloku w ciekłym azocie i pozwól mu zamarznąć. Po pięciu minutach strzepnij szkiełko nakrywkowe, używając wystającej krawędzi. Zrób to szybko, aby uzyskać prawidłowe pęknięcie naskórka.

Następnie zanurz szkiełko w wypełnionym metanolem szklanym słoiku Coplin w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach przenieś szkiełko do wypełnionego acetonem szklanego słoika z koplinu na kolejne pięć minut w tej samej temperaturze. Szkiełka mogą być barwione bezpośrednio lub przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Wyjmij szkiełko z acetonu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Następnie zaznacz miejsce na okrągłą ścianę wazeliny na spodniej stronie zjeżdżalni, a następnie zbuduj ścianę galaretki. Nie należy ścierać galaretki podczas tej procedury.

Następnie przygotuj mokrą komorę w koszu z mokrymi ręcznikami papierowymi i umieść szkiełko na stojaku w środku. Nie powinno być kontaktu między ręcznikami a zjeżdżalnią lub między sąsiednimi zjeżdżalniami. Teraz odpipetuj wystarczającą ilość PBS do koła galaretki, aby pokryć obszar.

Delikatnie umieść końcówkę pipety na krawędzi koła i pozwól, aby płyn płynnie rozproszył się po robakach. Następnie zamknij pokrywę i odczekaj pięć minut. Po pięciu minutach przechyl szkiełko i powoli zasysaj PBS, uważając, aby nie zgubić robaków ze zjeżdżalni.

Następnie ostrożnie wypełnij krąg galaretki świeżo przygotowanym roztworem blokującym. I pozwól szkiełku inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach zastąp roztwór blokujący roztworem blokującym zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe.

I inkubować szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy usunąć przeciwciało pierwotne i umyć szkiełko, trzykrotnie nakładając i usuwając roztwór blokujący. Pozwól każdej aplikacji blokowej inkubować przez 10 minut.

Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować szkiełko przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć szkiełko dwa razy roztworem blokującym, a następnie raz PBS. Następnie usuń jak najwięcej PBS, nie dopuszczając do wyschnięcia próbki i ostrożnie usuń galaretkę wokół próbki.

Nałóż kroplę podłoża montażowego na próbkę, a następnie nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelkę z lakieru do paznokci. Następnie przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś płytkę biblioteczną RNAi z minus 80 stopni Celsjusza na suchy lód.

Usuń taśmę uszczelniającą. I przenieś interesujący nas klon na selektywny ślimak. Następnie usuń klon i hoduj bakterie przez noc.

Przed włożeniem płytki bibliotecznej do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza nałóż nową taśmę uszczelniającą. Następnego dnia zaszczepić kolonie z płytki w jednomililitrowych porcjach płynnej pożywki zawierającej ampicylinę. Następnie potrząsaj nimi przez około 14 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia wysiewaj 200 mikrolitrów na klon na oddzielne płytki RNAi. Pozostawić płytki do wyschnięcia i indukować produkcję RNAi przez noc w temperaturze pokojowej. Dzień później przenieś pięć robaków w stadium L4 na każdą płytkę RNAi znakowaną specyficznym genem, który jest celowany.

Następnie przenieś płytki do inkubatora, zwykle w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Najpierw zbadaj kontrolę w porównaniu ze zwierzętami RNAi w jasnym świetle przy małym i dużym powiększeniu. Następnie zbadaj kontrolę w porównaniu ze zwierzętami RNAi w świetle fluorescencyjnym pod odpowiednimi filtrami.

Systematycznie skanuj płytkę ze zwierzętami RNAi od lewego górnego rogu do prawego dolnego rogu całej płytki w poszukiwaniu fenotypów. Szukaj interesujących Cię zwierząt. Aby dokładniej przyjrzeć się wybranym fenotypom RNAi, skoncentruj się na jelicie i użyj powiększenia do oceny fenotypów kanalikowozy i morfogenezy światła.

Aby zbadać interesujące nas robaki pod mikroskopią konfokalną, najpierw zamontuj i unieruchom je ręcznie, wykonaj cienki krąg z tłuszczu próżniowego lub wazeliny na szkiełku podstawowym. Warstwa smaru powinna być cienka, nie grubsza niż 0,1 milimetra. Następnie dodaj około 3,5 mikrolitra 10-milimolowego azydku sodu do środka koła.

Następnie szybko zbierz interesujące Cię robaki do roztworu pod mikroskopem preparacyjnym, zanim roztwór wyschnie. Następnie delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe i zobrazuj zwierzęta w ciągu 30 minut. Użyj łagodnego nacisku i pod mikroskopem sprawdź, czy robaki nie unoszą się w roztworze.

Pod mikroskopem konfokalnym znajdź robaki pod niską mocą i skup się. Następnie użyj obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 60 lub 100X, aby wyświetlić i zobrazować jelito. Następnie zbadaj zwierzę w świetle fluorescencyjnym za pomocą odpowiedniego kanału, aby wybrać obszary, które wyświetlają interesujący nas defekt komórkowy.

Poruszaj się szybko, aby uniknąć wybielania zdjęć. Następnie przełącz się na skanowanie laserowe i ogranicz obraz do jelita, ustawiając granice skanowania po jego stronie grzbietowej i brzusznej. Przechwyć serię obrazów, a następnie scal obrazy w jeden obraz projekcji.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób molekularnie analizować i wizualnie analizować biogenezę spolaryzowanej błony w rozwijającym się jelicie C. elegans, gdzie błona wierzchołkowa i morfogeneza światła zbiegają się. Wierzchołkowe i podstawno-boczne domeny błonowe, połączenia związane z błoną i światło jelita można rozwiązać, a ich wzajemne relacje można było badać przez cały okres rozwoju. Te subkomórkowe składniki mogą być znakowane fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami lub fluorescencyjnymi białkami fuzyjnymi w celu podwójnego lub potrójnego znakowania, jak opisano w dołączonym artykule.

Duże ubytki światła można szybko zeskanować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego do preparacji. Łącznik cytoszkieletu błon wierzchołkowych ERM-1 sprzężony z GFP jest silnie wyrażonym markerem przydatnym do badania przesiewowego RNAi. Podczas stosowania tego markera odkryto szereg nowych fenotypów morfogenezy i polaryzacji światła jelit wraz z leżącymi u ich podstaw defektami genów.

Następnie wykorzystano obrazy o większym powiększeniu uzyskane za pomocą konfokalnego skanowania laserowego, aby dokładniej zbadać fenotypy, aby lepiej zrozumieć ukryte defekty. Niektóre fenotypy można określić ilościowo. Do porównania takich wad i śledzenia ich postępu w trakcie rozwoju wykorzystano kwantyfikację.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać przedziały błony jelitowej i błony endo za pomocą barwienia immunologicznego oraz jak analizować fenotypy funkcji RNAi biogenezy spolaryzowanej błony i światła.