Name: Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę analizy biogenezy spolaryzowanej błony i tubulogenezy w pojedynczej komórce u C. elegans. Technika łączy znakowanie GFP, badania przesiewowe RNAi oraz obrazowanie konfokalne, umożliwiając wizualizację 2000-krotnej ekspansji błony apikalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy M. Buechnerowi (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, Nowy Jork, USA) oraz Caenorhabditis Genetics Center, finansowanemu przez National Institutes of Health, Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Prace te były wspierane przez granty NIH GM078653, MGH IS 224570 i SAA 223809 dla V.G.

<ol><li>Lubarsky, B., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+morphogenesis%3A+making+and+shaping+biological+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes.</a> Cell. 112 (1), (2003).</li>
<li>Sundaram, M. V., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+make+the+doughnuts%3A+Building+and+shaping+seamless+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes.</a> Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).</li>
<li>Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+intestine+as+a+model+for+intercellular+lumen+morphogenesis+and+in+vivo+polarized+membrane+biogenesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Andrew, D. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+epithelial+tubes%3A+Insights+into+tube+formation%2C+elongation%2C+and+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation.</a> Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).</li>
<li>Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ultrastruct.+Res%22%5BJournal%5D)">Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system.</a> J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).</li>
<li>Sundaram, M. V., Buechner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Excretory+System%3A+A+Model+for+Tubulogenesis%2C+Cell+Fate+Specification%2C+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity.</a> Genetics. 203 (1), 35(2016).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretory+system%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">Excretory system.</a> WormAtlas. , (2009).</li>
<li>Buechner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubes+and+the+single+C.+elegans+excretory+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubes and the single C. elegans excretory cell.</a> Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).</li>
<li>Khan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+lumen+extension+requires+ERM-1-dependent+apical+membrane+expansion+and+AQP-8-mediated+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux.</a> Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).</li>
<li>Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+unicellular+tube+extension+depending+on+the+lymphatic+vessel+determinant+Prox1+and+on+osmoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation.</a> Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).</li>
<li>Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+canal+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+are+defective+in+the+apical+membrane+domain+of+the+renal+%28excretory%29+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell.</a> Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).</li>
<li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+the+cell+cortex%3A+the+role+of+ERM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).</li>
<li>Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumen+morphogenesis+in+C.+elegans+requires+the+membrane-cytoskeleton+linker+erm-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1.</a> Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).</li>
<li>Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006
 <a target="_blank" href="http://www. wormbook.org ">http://www. wormbook.org </a> (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).</li>
<li>Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+set+of+lacZ+fusion+vectors+for+studying+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 93 (2), 189-198 (1990).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006
 <a target="_blank" href="http://www. wormbook.org">http://www. wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHibbs%2C+AR+%22Confocal+Microscopy+for+Biologists%22">Confocal Microscopy for Biologists</a>. , Springer. US. (2004).</li>
<li>Bankhead, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBankhead%2C+P+%22Analyzing+fluorescence+microscopy+images+with+ImageJ%22">Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ</a>. , (2014).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).</li>
<li>Frøkjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+Targeting+and+the+CRISPR+Revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution.</a> Science. 344 (6185), 707-708 (2014).</li>
<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li>
<li>Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+cloning+for+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gateway cloning for protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+fusion-based+approach+to+create+reporter+gene+constructs+for+expression+analysis+in+transgenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans.</a> Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).</li>
<li>Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+CLIC-like+protein+required+for+intracellular+tube+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance.</a> Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).</li>
<li>Mattingly, B. C., Buechner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGD+homologue+EXC-5+regulates+apical+trafficking+in+C.+elegans+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules.</a> Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).</li>
<li>Shaye, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+disease-associated+formin+INF2%2FEXC-6+organizes+lumen+and+cell+outgrowth+during+tubulogenesis+by+regulating+F-actin+and+microtubule+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons.</a> Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).</li>
<li>Lant, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCM-3%2FSTRIPAK+promotes+seamless+tube+extension+through+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling.</a> Nat. Commun. 6 (6), 6449(2015).</li>
<li>Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-EM+localization+of+GFP-tagged+yolk+proteins+in+C.+elegans+using+microwave+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation.</a> J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).</li>
<li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+with+photo-switchable+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Sherman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abts+and+sulp+families+of+anion+transporters+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).</li>
<li>Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , 
 <a target="_blank" href="http://cbs.umn.edu/cgc/home">http://cbs.umn.edu/cgc/home</a> (2017).</li>
<li>Wormbase. , 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbase.org/">http://www.wormbase.org/</a> (2017).</li>
<li>Transgeneome website. , 
 <a target="_blank" href="https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html">https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html</a> (2017).</li>
<li>C. elegans expression pattern. , 
 <a target="_blank" href="http://gfpworm.org/">http://gfpworm.org/</a> (2017).</li>
<li>National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , 
 <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ ">https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ </a> (2017).</li>
<li>Heppert, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+fluorescent+proteins+for+in+vivo+imaging+in+an+animal+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system.</a> Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>GeneMANIA. , 
 <a target="_blank" href="http://genemania.org/ ">http://genemania.org/ </a> (2017).</li>
<li>AceView. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ ">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ </a> (2017).</li>
<li>iHOP. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / ">http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / </a> (2017).</li>
<li>Saccharomyces Genome Database. , 
 <a target="_blank" href="http://www.yeastgenome.org ">http://www.yeastgenome.org </a> (2017).</li>
<li>Flybase. , 
 <a target="_blank" href="http://www.flybase.org ">http://www.flybase.org </a> (2017).</li>
<li>Mouse Genome Database. , 
 <a target="_blank" href="http://www.informatics.jax.org">http://www.informatics.jax.org</a> (2017).</li>
<li>Human Genome Database. , 
 <a target="_blank" href="http://www.gdb.org ">http://www.gdb.org </a> (2017).</li>
<li>BLAST. , 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi </a> (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wszechstronność genetyczna C. elegans, przejrzystość, prosty plan ciała i niezmienna linia komórkowa sprawiają, że jest to doskonały model do analizy morfogenezy. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe manipulacje genetyczne i badania obrazowe, aby wykorzystać kanały wydalnicze C. elegans o grubości 2 mikronów do badania biogenezy światła spolaryzowanej błony i wewnątrzkomórkowego w pojedynczej rurce komórkowej.
Etykietowania Kanały wyd...

Wszystkie organy wewnętrzne składają się z rurek, kluczowych dla ich wielu różnych funkcji, takich jak transport i wymiana gazów, płynów i składników odżywczych oraz wydalanie produktów przemiany materii. Ich spolaryzowany charakter, z wyraźnymi błonami wierzchołkowymi i świetlnymi, jest przystosowany do tych specyficznych funkcji, a defekty w biogenezie ich systemów błon endo- i plazmatycznych są częstą przyczyną chorób u ludzi1,2. Większość rurek naczyniowych i narządów wewnętrznych jest wielokomórkowa i tworzy światło międzykomórkowe; Jednak rurki jednokomórkowe, które tworzą światło wewnątrzkomórkowo, mogą na przykład stanowić nawet 30–50% ludzkich łożysk naczyń włosowatych<klasa SUP="xref">2. Spolaryzowane błony rurek wielo- i jednokomórkowych mają podobny skład, chociaż ich mikrodomeny mogą się różnić w zależności od specyficznej funkcji rurki (np. kanaliki kanału wydalniczego kontra mikrokosmki jelitowe u Caenorhabditis elegans; patrz artykuł towarzyszący na temat tubuogenezy jelitowej C. elegans)3. Zasady biogenezy błony spolaryzowanej i tubuogenezy są zachowane wśród metazoan, a podobna maszyneria molekularna nimi kieruje1,2,4.
System wydalniczy C. elegans składa się z pięciu komórek: komórki wydalniczej (EC), komórki przewodu (DC), komórki porowej (PC) i dwóch komórek gruczołowych. Ablacja EC, DC lub PC powoduje gromadzenie się płynu w jamie ciała i zwierzęta umierają we wczesnym stadium larwalnym5. Co ciekawe, te trzy jednokomórkowe rurki wytwarzają swoje światło na trzy różne sposoby: poprzez drążenie komórek (EC); owijanie komórek w połączeniu z tworzeniem połączeń autokomórkowych (PC); oraz przez owijanie komórek sprzężone z autofuzją (DC); Różne mechanizmy morfogenezy światła, które są filogenetycznie zachowane<klasa SUP="xref">6,<klasa SUP="XREF">7. EC, znajdujący się po lewej bocznej stronie tylnej opuszki gardłowej, wysyła dwa boczne przedłużenia, z których cztery kanały rozgałęziają się, aby rozciągać się do przodu i do tyłu (zarówno po prawej, jak i lewej stronie) odpowiednio do czubka nosa i ogona robaka (Rysunek 1)5,6,8. EC rozciąga się od około 1 μm do 2 x 1 000 μm, co czyni go największą komórką u zwierzęcia. Na poziomie subkomórkowym kanał wydalniczy jest prostą rurką, utworzoną z błony podstawnej skierowanej w stronę pseudocoelom i tunelowaną przez błonę świetlną (endotube). Błona świetlna kanału łączy się z błoną świetlną przewodu w jego jedynym połączeniu międzykomórkowym; kanały są poza tym bezłączeniowe na całej swojej długości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Błona świetlna kanału wydalniczego i jej podbłonowy cytoszkielet są wierzchołkowe, określone przez ich skład molekularny, który przypomina skład błony wierzchołkowej i cytoszkieletu subbłonowego rurek wielokomórkowych, takich jak jelito, oraz innych (np. płaskich) nabłonków. Organelle cytoplazmatyczne, w tym endosomalne pęcherzykowe i inne (np. Golgiego) endobłony, są rozmieszczone wzdłuż długości kanału. Ponadto przez kanał cytoplazmy przewleczonych jest wiele pęcherzyków kanałowych - połączonych z błoną świetlną i/lub połączonych ze sobą lub izolowanych - przewleczonych przez kanał cytoplazma7,8,9,10. To dynamiczne połączenie plazmato-błona/kanał dodatkowo rozszerza system błonowy kanału i przyczynia się zarówno do morfogenezy światła, jak i osmoregulacji10. Kanał wydalniczy składa się zatem prawie wyłącznie z błon endo- i plazmatycznych, co stanowi doskonały model do analizy biogenezy błony spolaryzowanej i regulacji granicy faz błony endo- i plazmatycznej. Gwałtowne rozszerzanie się błony wierzchołkowej podczas morfogenezy kanału - w tym układzie jednokomórkowym zbiegające się z wydłużeniem światła - pozwala również na analizę problemów architektonicznych wynikających z konieczności stabilizacji i wyśrodkowania wewnątrzkomórkowej błony świetlnej. Protokół ten koncentruje się na analizie strukturalnej morfogenezy rurki kanałowej i światła oraz dynamiki błony wewnątrzkomórkowej wymaganej w tym procesie, a nie na sygnałach kierujących ruchami komórki, które generują pozycję EC w układzie wydalniczym i konstruują jej skomplikowane połączenia z innymi elementami komórkowymi (recenzja w6).
Kolejną zaletą systemu kanałów jednokomórkowych C. elegans do analizy biogenezy spolaryzowanej błony i światła wewnątrzkomórkowego jest jego zdolność do oddzielania, poprzez okres rozwoju, generowania różnych składników swoich błon i połączeń. EC rodzi się w momencie zamknięcia brzusznego i osiada brzuszno-bocznie gardła podczas środkowej embriogenezy5,6,8, w którym to czasie dochodzi do bocznego wydłużenia kanału i rozgałęzienia. Po tym następuje rozszerzenie kanału przednio-tylnego podczas późnej embriogenezy, proces, który trwa do stadium larwalnego L1 (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). U nowo wyklutej larwy tylny wierzchołek kanału sięga mniej więcej do środka robaka, w pełni rozciągając się do ogona pod koniec stadium L1, po którym to czasie kanał wydłuża się wraz z robakiem8. Aktywny wzrost kanałowy z prędkością większą niż tempo wzrostu zwierzęcia kończy się zatem na pierwszym stadium larwalnym, jednak dalszy wzrost następuje równolegle ze wzrostem całego zwierzęcia w dodatkowych stadiach larwalnych (L2–4). To ustawienie daje możliwość analizy różnych etapów biogenezy błony spolaryzowanej de novo, niezależnie od spolaryzowanego podziału lub migracji komórek. Co więcej, pozwala na oddzielenie tego procesu od składania się połączeń (które zachodzą w zarodku przed inicjacją światła); Ich dokładne wymagania dotyczące polaryzacji membrany są nadal otwarte w dziedzinie polaryzacji. Wreszcie, w unikalny sposób oddziela ekspansję błony wierzchołkowej od podstawnej, przy czym ten drugi proces poprzedza ten pierwszy w kanałach wydalniczych10. Model kanału wydalniczego C. elegans jest zatem szczególnie pouczającym uzupełnieniem modelu jelitowego, który dzieli wiele z tych zalet dla analizy biogenezy spolaryzowanej błony, ale realizuje ją w warunkach wielokomórkowych (patrz towarzyszący artykuł na temat kanaliki jelitowej3).
Chociaż kanały typu dzikiego są ultracienkimi kanalikami w tym maleńkim robaku, ich światło może być bezpośrednio widoczne przez optykę Nomarskiego u tego przezroczystego zwierzęcia. W rzeczywistości zmutowane morfologie kanałów torbielowatych można scharakteryzować u nieoznakowanych zwierząt za pomocą mikroskopii preparacyjnej o małym powiększeniu, która została wykorzystana z dużym skutkiem w zaawansowanych badaniach genetycznych do identyfikacji genów zaangażowanych w tubulingenezę11. Lepsza wizualizacja morfologii kanałów i rozróżnienie ich spolaryzowanych błon, składników cytoszkieletu, różnych organelli wewnątrzkomórkowych i innych struktur subkomórkowych wymaga jednak znakowania oraz fluorescencyjnego preparowania o większej mocy i mikroskopii konfokalnej. Chociaż delikatna struktura kanałów stwarza szereg trudności w znakowaniu i mikroskopii, błony i składniki subkomórkowe można odróżnić za pomocą specyficznych cząsteczek unikalnych dla każdego przedziału, a zwierzęta można bezpiecznie przystosować do mikroskopii, jeśli zostaną podjęte pewne środki ostrożności w celu uniknięcia wprowadzenia artefaktów (patrz Protokół i dyskusja). Znakowanie można przeprowadzić za pomocą immunohistochemii w utrwalonych próbkach lub poprzez generowanie transgenicznych robaków eksprymujących fluorescencyjne białka fuzyjne pod kontrolą własnych lub specyficznych dla kanału wydalniczego promotorów do obrazowania in vivo. Protokół ten opisuje tę ostatnią technikę znakowania (patrz towarzyszący artykuł na temat tubuogenezy jelitowej dla barwienia przeciwciałami3).
Możliwość łączenia badań in vivo nad utratą lub zyskiem funkcji z analizą obrazowania in vivo na poziomie pojedynczej komórki w trakcie rozwoju sprawia, że kanał wydalniczy C. elegans jest szczególnie silnym modelem do molekularnej i komórkowej analizy jednokomórkowej tubulingenezy. Genetyczne badania przesiewowe do przodu lub do tyłu można przeprowadzić, zaczynając od zwierzęcia transgenicznego typu dzikiego lub znakowanego, w celu zidentyfikowania fenotypów morfogenezy kanałów (na przykład torbieli) i leżących u ich podstaw wad genowych. Alternatywnie, takie badania przesiewowe mogą rozpocząć się od zmutowanego fenotypu (np. kanału torbielowatego) i zidentyfikować supresory lub wzmacniacze tego fenotypu w celu zidentyfikowania genów, które funkcjonalnie oddziałują z genem powodującym zmutowany fenotyp. Defekt genetyczny powodujący zmutowany fenotyp może indukować utratę (np. poprzez delecję genu) lub zysk (np. poprzez mutację aktywującą lub wprowadzenie nadmiaru kopii genów) badanej funkcji. Mutageneza do przodu lub systematyczne badania przesiewowe RNAi nie przyjmują uprzedzeń dotyczących funkcji genów i pozwalają na bezstronną identyfikację genów zaangażowanych w funkcję będącą przedmiotem zainteresowania. Biorąc pod uwagę dostępność bibliotek odżywiania RNAi w całym genomie, prawie każdy gen może być łatwo powalony przez RNAi u C. elegans, tak że każdy pojedynczy gen lub dowolna grupa genów (np. w ukierunkowanych badaniach przesiewowych) może być również szybko zbadana pod kątem ich wpływu w podejściu genetyki odwrotnej. Aby zademonstrować możliwą kombinację podejść, opisujemy tutaj ukierunkowane badanie przesiewowe interakcji RNAi, zaczynając od mutanta torbielowatego kanału wydalniczego o wzmocnieniu funkcji, znakowanego zielonym białkiem fluorescencyjnym kanału cytoplazmatycznego (GFP). Zmutowany fenotyp został wygenerowany przez nadekspresję erm-1, wysoce konserwatywnego ortologa C. elegans z rodziny łączników błonowo-aktynowych Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), który jest zaangażowany w morfogenezę światła i organizację błony u wielu gatunków12. C. elegans (C. elegans) ERM-1 lokalizuje się w błonach świetlnych narządów wewnętrznych, takich jak kanał wydalniczy i jelito, i jest wymagany do tworzenia światła w obu13. Nadekspresja ERM-1 rekrutuje nadmiar aktyny i pęcherzyków do błony świetlnej kanału, zwiększając strumień do światła i generując krótki kanał torbielowaty i zaciśniętą błonę świetlną z zagęszczonym podszerstkiem aktyny9. Protokół opisuje, w jaki sposób generować transgeniczne szczepy z białkami fuzyjnymi znakowanymi w kanale wydalniczym (lub innymi białkami); jak wykonywać celowane badania przesiewowe RNAi, zaczynając od takich szczepów, w celu identyfikacji modyfikatorów fenotypu kanałowego; oraz jak wizualnie analizować wyniki takich badań przesiewowych za pomocą analizy fluorescencyjnej i mikroskopii konfokalnej, w tym prostych sposobów ilościowego określania informacyjnych fenotypów tubuogenezy. Alternatywne techniki znakowania i szczegóły dotyczące RNAi, dostosowane do często śmiertelnych genów tubuogenezy, można znaleźć w dołączonym artykule na temat tubuogenezy jelitowej3. Wszystkie metody mogą być stosowane w różnych kombinacjach do badania innych zagadnień dotyczących kanaliki kanałowej.

<table><tbody><tr><td>Klonowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid pPD95.75</td><td>Addgene</td><td>Cat. Nr 37464</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do PCR</td><td>Qiagen</td><td>Kat. Nr 27106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do podwiązywania</td><td>New England Biolabs</td><td>Kat. Nie. E2611L</td><td></td></tr><tr><td>Marker DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat. Nie. SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Klasa DNA agarozy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. Nie. BP164-100</td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne komórki</td><td>New England Biolabs</td><td>Kat. Nie. C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. Nie. BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. Nie. ED-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. Nie. A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. Nie. BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine&nbsp;</td><td>MJ Research</td><td>Kat. Nie. PTG-200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>kot. No. 5415C</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Precyzyjna Naukowa&nbsp;</td><td>kot. Nr 666A3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Żelowy przyrząd do biegania</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. Nr 09-528-165</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz do pracy</td><td>żelowej Fisher Scientific</td><td>Cat. Nr 45-000-465</td><td></td></tr><tr><td>Obrazownik molekularny&nbsp; Żel Doc XR System</td><td>Bio-Rad</td><td>Kat. Nr 1708195EDU</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Kat. Nie. ND1000</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans powiązany1</td><td></td><td></td><td>1patrz odniesienie19 dla standardowych procedur hodowli i konserwacji C. elegans.</td></tr><tr><td>LB Medium i płyty2</td><td></td><td></td><td>2patrz referat19 dla protokołów.</td></tr><tr><td>Trypton&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>Nr kat. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt</td><td>drożdżowy BD Biosciences</td><td>Nr kat. 212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Nr kat. 214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat. BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Medium2</td><td></td><td></td><td>2patrz referat19 dla protokołów.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM 2</td><td></td><td></td><td>2patrz Reference19 dla protokołów.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Pepton&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Nr kat. 211677</td><td></td></tr><tr><td>Trypton&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>Nr kat. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Nr kat. 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. C3881</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. P0662</td><td></td></tr><tr><td>RNAi plates3</td><td></td><td></td><td>3patrz sygnatura 21 dla protokołów.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Pepton&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Nr kat. 211677</td><td></td></tr><tr><td>Trypton&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>Nr kat. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Nr kat. 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. C3881</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Nr kat. P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4Sigma</td><td></td> <td>Nr kat. P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>US Biologiczny</td><td>Nr kat. I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat. BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific Nr</td><td>kat. SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat. 50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bacteria</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteki RNAi obejmujące cały genom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka karmienia RNAi w całym genomie Ahringer (ref21,58,59)</td><td>Źródło: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAi biblioteka żywieniowa (ref60)</td><td>Źródło: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>MP Biomedicals,LLG</td><td>Cat. no. 193917</td><td></td></tr><tr><td> Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy Silikon</td><td>Beckman</td><td>Nr kat. 335148</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nr kat. 4448</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej, 6 dołków&nbsp;</td><td>Corning Inc.</td><td>Nr kat. 08-772-33</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ-U mikroskop preparacyjny SZX12</td> (Olympus), <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wyposażony w przystawkę do fluorescencji stereo o dużej mocy (Kramer Scientific), kamerę CCD z oprogramowaniem do przechwytywania Q i świetlówką X-Cite (Photonic Solutions).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny TCS SL (Leica Microsystem)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny C2 zamontowany na odwróconym mikroskopie ECLIPSE Ti-E (Nikon)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kanał wydalniczy c. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji gfp, badania przesiewowego interakcji rnai i obrazowania

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

Cztery kanały wydalnicze C. elegans to wąskie rurki przedłużone przez całą długość zwierzęcia z pojedynczej komórki, z prawie równie daleko rozciągniętymi wewnątrzkomórkowymi endorurkami, które budują i stabilizują światło za pomocą błony i subbłonowego cytoszkieletu o charakterze wierzchołkowym. Komórka wydalnicza rozszerza swoją długość około 2000 razy, aby wytworzyć te kanały, co czyni ten model unikalnym do oceny in vivo biogenezy błony spolaryzowanej de novo, morfogenezy światła wewnątrzkomórkowego i tubulingenezy jednokomórkowej. Przedstawiony tutaj protokół pokazuje, jak połączyć standardowe znakowanie, genetyczne zakłócenia przyrostu i utraty funkcji lub interferencję RNA (RNAi) oraz mikroskopijne podejście do wykorzystania tego modelu do wizualnej analizy i funkcjonalnej analizy tych procesów na poziomie molekularnym. Jako przykład podejścia opartego na znakowaniu, protokół przedstawia tworzenie transgenicznych zwierząt z fluorescencyjnymi białkami fuzyjnymi do analizy tubulogenezy na żywo. Jako przykład podejścia genetycznego podkreśla kluczowe punkty wizualnego ekranu interakcji opartego na RNAi, zaprojektowanego w celu modyfikacji fenotypu kanału torbielowatego o wzmocnieniu funkcji. Konkretne opisane metody to: znakowanie i wizualizacja kanałów poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych; skonstruowanie ukierunkowanej biblioteki RNAi i opracowanie strategii badań przesiewowych RNAi w celu analizy molekularnej morfogenezy kanałów; wizualnie oceniać modyfikacje fenotypów kanałów; oceniaj je, analizując mikroskopię fluorescencyjną; scharakteryzować składniki kanałów subkomórkowych w wyższej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej; i określić ilościowo parametry wizualne. Podejście to jest przydatne dla badacza, który jest zainteresowany wykorzystaniem kanału wydalniczego C. elegans do identyfikacji i charakteryzowania genów zaangażowanych w filogenetycznie zachowane procesy wewnątrzkomórkowego światła i morfogenezy rurki jednokomórkowej.

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania kanałów wydalniczych C. elegans do wizualnej i molekularnej analizy jednokomórkowej tubulogenezy oraz wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła w pojedynczej komórce. Podczas swojego wydłużania się od etapu środkowej embriogenezy aż do dorosłości, cztery kanały wydalnicze stale rozszerzają swoje błony bazolateralne i apikalne/światłowe wraz z kanalikowym i endosomalnym systemem endomembranowym, stanowiąc unikalny model dla analizy ...

Kanał wydalniczy C. elegans jest unikalnym modelem jednokomórkowym do wizualnej analizy in vivo biogenezy błony spolaryzowanej de novo. Protokół ten opisuje połączenie standardowych podejść genetycznych/RNAi i obrazowania, które można dostosować do identyfikacji i charakterystyki cząsteczek kierujących jednokomórkową tubulingenezą oraz biogenezą błony wierzchołkowej i światła.

Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Ogólnym celem tej kombinacji standardowych procedur jest zademonstrowanie, w jaki sposób kanał wydalniczy C.elegans może być wykorzystany do analizy in vivo jednokomórkowych rurek, wewnątrzkomórkowego światła oraz biogenezy błon polaryzowanych de novo. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu tubulogenezy i polarności, takie jak sposób tworzenia się rozszerzonego wewnątrzkomórkowego światła lub to, jakie cząsteczki są niezbędne do rozbudowy błony apikalnej. Główną zaletą tego modelu systemowego jest możliwość wizualnej weryfikacji in vivo w pojedynczej komórce ogromnej, 2000-krotnej ekspansji błony apikalnej w stosunku do błony bazolateralnej.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tym modelem napotykają trudności, ponieważ kanał wydalniczy C.elegans jest bardzo cienki i wrażliwy na stres osmotyczny oraz na wszelkie manipulacje niezbędne do obrazowania. Niniejszy film dotyczący tubulogenezy kanału wydalniczego uzupełnia film o tubulogenezie jelita; są to wzajemnie uzupełniające się modele do analizy in vivo biogenezy błon spolaryzowanych. W kwestii znakowania, towarzyszący film o tubulogenezie jelita opisuje alternatywną procedurę znakowania, polegającą na barwieniu komponentów komórkowych przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie.Technika ta ma zastosowanie również do kanału wydalniczego. W niniejszym filmie opisano analizę obrazowania na żywo z wykorzystaniem zwierząt z fluorescencyjnie znakowanymi białkami fuzyjnymi. Sposób konstruowania plazmidu zawierającego gen zainteresowania połączony z GFP oraz metoda generowania zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję białka fuzyjnego zostały opisane w tekście.Protokół zawiera również przykłady markerów błonowych specyficznych dla kanałów wydalniczych, markerów organelli oraz promotorów. Podano także inne źródła dotyczące obu procedur znakowania. W tym filmie szczep transgeniczny, który znakuje cytoplazmę kanału białkiem GFP i wykazuje fenotyp kanału torbielowatego, jest przesiewany w celu znalezienia modyfikatorów przy użyciu RNAi.Fenotyp jest spowodowany nadekspresją ERM-1, genu morfogenezy światła. Z kolonii bakterii wykazujących ekspresję RNAi, wyhodowanych przez noc na płytkach z ampicyliną i tetracykliną, należy wybrać pojedyncze kolonie i zaszczepić je do 600 µL płynnego podłoża LB z ampicyliną. Probówki należy inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce przez sześć godzin.Z kultur ciekłych przenieś alikwoty o objętości 70 µL do dołków płytek RNAi z sześcioma dołkami, tworząc zestawy w dwóch lub trzech powtórzeniach. Następnie inkubuj płytki RNAi przez noc w temperaturze od 20 do 22 °C. Następnego ranka wybierz trzy nicienie w stadium L4 i umieść je w każdym dołku płytek RNAi.Każdy osobnik powinien wyglądać na zdrowego i dobrze odżywionego oraz wykazywać ekspresję odpowiedniego markera w kanale wydalniczym. Następnie inkubować płytki w temperaturze od 20 do 22 °C przez trzy dni. Po trzech dniach spożywania bakterii RNAi zbadać fenotypy kanałów potomstwa F1 pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.Aby ocenić wydłużenie kanału, należy zbadać nicienie w stadium larwalnym L3 L4. Do tej procedury należy przygotować arkusz oceny dla przesiewu, który zawiera wszystkie możliwe fenotypy. Kilka fenotypów kanału opisano w protokole tekstowym.Skanuj studzienki systematycznie, zaczynając od kontroli, takiej jak nicienie karmione bakteriami RNAi z pustym wektorem. Najpierw użyj światła widzialnego przy mniejszym powiększeniu, a następnie przy większym, aby zidentyfikować ogólne fenotypy, takie jak letalność embrionalna, sterilność, przejrzysty wygląd oraz wygląd typu dumpy. Odnotuj te obserwacje w arkuszu ocen.Po drugie, w świetle fluorescencyjnym należy zbadać fenotypy kanałów wydalniczych, najpierw przy mniejszym powiększeniu, a następnie przy większym. Należy przybliżyć obraz i ocenić mierzalne cechy fenotypowe, takie jak długość kanału, szerokość światła lub wielkość cyst. Plazmidy markerowe, takie jak role, mogą być przydatne podczas obrazowania, ponieważ zapobiegają przemieszczaniu się zwierząt do przodu i utrzymują je w jednym miejscu.Może to również zapewnić lepszy wgląd w fenotyp w przypadku zwierząt zwijających się w kłębek. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej uwzględniającej fenotypy o niższej penetracji należy ocenić co najmniej 100 zwierząt na płytkę. Eksperymenty te należy wykonać w trzech powtórzeniach.W trakcie tego procesu należy wykonać zdjęcia dominujących fenotypów z co najmniej trzech różnych zwierząt, używając kamery CCD i oprogramowania do przechwytywania obrazu. Następnie należy wykonać zdjęcia przy mniejszym i większym powiększeniu. Aby poddać analizie wybrane nicienie za pomocą mikroskopii konfokalnej, należy je najpierw zamontować i unieruchomić.Ręcznie nanieś na szkiełko przedmiotowe cienki okrąg z smaru próżniowego lub wazeliny. Warstwa smaru nie powinna być grubsza niż 0.1 mm. Następnie dodaj około 6 µL pięcioprocentowego roztworu lidokainy do środka okręgu.Następnie, przed wyschnięciem roztworu, szybko przenieś wybrane nicienie do roztworu za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Następnie ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe na kręgu z wazeliny i pozwól mu opaść pod własnym ciężarem. Sprawdź unieruchomienie preparatu pod mikroskopem stereoskopowym.Nicienie powinny być nieuszkodzone i przylegać do szkiełka, a nie pływać w roztworze. Teraz należy nanieść kroplę oleju na szkiełko nakrywkowe i ustawić ostrość na nicienie w świetle jasnym, używając obiektywu 10x w mikroskopie konfokalnym. Następnie należy ostrożnie przełączyć na obiektyw imersyjny oraz zmienić oświetlenie na fluorescencyjne, aby uwidocznić znakowane kanały wydalnicze.Następnie należy zbadać fenotypy komórkowe i subkomórkowe kanałów wydalniczych, aby znaleźć okaz odpowiedni do obrazowania. Należy pracować sprawnie, aby uniknąć fotoblaknięcia. Należy zwrócić uwagę na kształt i średnicę światła kanału oraz rozmiar i kształt cyst.Należy również zbadać komponenty subkomórkowe oznakowane do analizy, takie jak błona apikalna, błona bazalna, cytoplazma, pęcherzyki lub organelle. Za pomocą sterowania oprogramowaniem należy dostosować intensywność lasera i pozyskać obrazy. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, należy zastosować niską wartość wzmocnienia (gain), nie otwierać zbyt szeroko otworu pinhole oraz wykonać około czterech uśrednień na obraz.Ponadto należy unikać nadmiernego nasycenia intensywności koloru. Najpierw należy zarejestrować obraz pojedynczego przekroju, a następnie obraz wielu przekrojów wzdłuż osi z. Zazwyczaj wystarcza od 15 do 20 przekrojów.Poprzez zaznaczenie nawiasem konkretnego regionu kanału wydalniczego w obszarze skanowania w panelu sterowania, można powiększyć dany odcinek kanału. W przypadku kanałów znakowanych podwójnie lub wielokrotnie krytyczne jest zastosowanie skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć przenikania sygnału (bleed-through) pomiędzy kanałami. W przeciwnym razie badania kolokalizacji sygnałów nie będą dokładne.Jednocześnie należy wykonać odpowiadające im obrazy DIC Nomarski, aby określić długość kanałów lub średnice światła w stosunku do długości i średnicy ciała nicienia. Następnie należy nałożyć obrazy fluorescencyjne na obrazy Nomarskiego w celu wskazania punktów orientacyjnych. Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania kanałów wydalniczych C. elegans do wizualnej i molekularnej analizy jednokomórkowej tubulogenezy oraz wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła w obrębie jednej komórki.Komponenty subkomórkowe, takie jak błony apikalne, cytoplazma oraz pęcherzyki endosomalne i kanalikowe, mogą być wizualizowane i rozróżniane w tej samej komórce przy użyciu specyficznych dla danych komponentów fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Nicienie wykazujące nadekspresji cząsteczki związanej z błoną apikalną, zwanej ERM-1, były karmione bakteriami RNAi w celu przesiewania modyfikacji ich unikalnego fenotypu kanału wydalniczego. Supresory i enhancery zidentyfikowano przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu sekcyjnego.Wiele subkomórkowych aspektów zmodyfikowanych fenotypów można było szczegółowo zbadać przy większym powiększeniu za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obejmowały one nieprawidłowe błony, cysty świetlne zamiast wakuol cytoplazmatycznych, lokalizację kanalików wewnątrzkomórkowych, nieciągłość światła z nieprawidłową morfologią końcówek kanalików, defekty rozszerzenia światła w stosunku do kanalików oraz rekrutację komponentów subkomórkowych do światła. Wiele efektów wynikających z działania supresorów i enhancerów fenotypu indukowanego przez ERM-1 można było również poddać kwantyfikacji, takich jak wielkość cyst, długość kanalików oraz fluorescencyjnie znakowane komponenty subkomórkowe.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak łączyć standardowe procedury RNAi i ERM w celu charakterystyki fenotypów kanału wydalniczego C.elegans przy użyciu fluorescencyjnych mikroskopów stereoskopowych i konfokalnych. Wykorzystując te techniki, będą Państwo mogli badać biogenezę polaryzowanej błony de novo oraz tubulogenezę w pojedynczej komórce u żywych zwierząt.

the-c-elegans-excretory-canal-as-model-for-intracellular-lumen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj metodę analizy biogenezy spolaryzowanej błony i tubulogenezy w pojedynczej komórce u C. elegans. Technika łączy znakowanie GFP, badania przesiewowe RNAi oraz obrazowanie konfokalne, umożliwiając wizualizację 2000-krotnej ekspansji błony apikalnej.

Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania (Wideo) | JoVE Journal

Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania

Przeglądaj więcej filmów