26 lipca 2017
Wewnętrzna powierzchnia płuc (ISA) jest krytycznym kryterium oceny morfologii i fizjologii płuc w chorobach płuc i regeneracji pęcherzyków płucnych wywołanej urazem. Opisujemy tutaj znormalizowaną metodę, która może zminimalizować błąd systematyczny pomiaru ISA zarówno w modelach myszy do pneumonektomii płuc, jak i implantacji protez.
Ogólnym celem tej procedury jest dokładny pomiar wewnętrznej powierzchni płuca myszy po pneumonektomii i wszczepieniu protezy. Metoda ta pomaga w analizie morfologicznych i fizjologicznych funkcji płuc w regeneracji płuc dorosłych wywołanej siłą mechaniczną. Główną zaletą tej techniki jest dokładne ilościowe określenie wewnętrznej powierzchni płuc, co daje nadzieję na zwiększenie wiarygodności i odtwarzalności stanu czynności płuc.
Przygotuj mysz do operacji na platformie intubacyjnej z dostępną stroną brzuszną. Następnie wyciągnij język i sprawdź struny głosowe za pomocą laryngoskopu dla małych zwierząt, który jest kompatybilny z cewnikami prowadzącymi. Następnie delikatnie włóż kaniulę do intubacji dożylnej w rozmiarze 20 G do tchawicy pod kątem wewnętrznym.
Następnie ustaw mysz w prawej bocznej pozycji leżącej i podłącz kaniulę do wentylatora mechanicznego. Obserwuj klatkę piersiową, aby ocenić wprowadzenie kaniuli do tchawicy. Ustaw ciśnienie wdechowe na 12 centymetrów wody i ustaw częstość oddechów na 120 oddechów na minutę.
Teraz oczyść odsłoniętą skórę za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych peelingów Betadine i 70% etanolu. Następnie rozpocznij operację od dwu- do trzycentymetrowego nacięcia torakotomii tylno-bocznej w piątej przestrzeni międzyżebrowej. Wbij się w mięśnie za pomocą nożyczek sprężynowych Noyes.
Następnie wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie, aby odsłonić lewe płuco. W razie potrzeby podczas operacji należy użyć kauteryzatora o wysokiej temperaturze, aby zatrzymać krwawienie. Następnie podnieś 1/3 lewego płata płuca z klatki piersiowej za pomocą kleszczy z końcówką i użyj bawełnianego wacika, aby wyciągnąć całe lewe płuco.
Teraz zidentyfikuj tętnicę płucną i oskrzela lewego płata płuca i mocno podwiąż oskrzela i naczynia we wnęce za pomocą nasączonego szwu chirurgicznego. Następnie wytnij lewy płat płuca w odległości trzech do czterech milimetrów od podwiązania, uważając, aby nie odciąć szwu, co może spowodować odmę opłucnową. Następnie zamknij ścianę klatki piersiowej jednym szwem.
Następnie zszyj kolejno warstwę mięśniową i warstwę skóry, używając pięciu do sześciu przerywanych szwów z trzy-czteromilimetrowymi odstępami. Pamiętaj, aby trzymać igłę do szwów chirurgicznych z dala od serca. Nakłucie serca jest śmiertelne.
Na koniec zdezynfekuj obszar operacyjny jodonem powidonu. Następnie umieść mysz na podkładce termicznej o temperaturze 38 stopni Celsjusza. Kontynuuj korzystanie z respiratora, aż powróci spontaniczne oddychanie.
Wykonaj opisaną wcześniej operację, ale zaraz po usunięciu płuca przygotuj się do założenia protezy. Za pomocą stępionych kleszczy chwyć środek elipsoidalnej protezy silikonowej. Następnie, trzymając żebro kleszczami, aby odsłonić klatkę piersiową, bardzo delikatnie włóż protezę.
Wprowadzić pod kątem 45 stopni między płaszczyzną czołową protezy a powierzchnią piersiową. Za pomocą kleszczy upewnij się, że proteza znajduje się całkowicie w lewej pustej jamie piersiowej. Teraz zamknij klatkę piersiową i monitoruj mysz zgodnie z wcześniejszym opisem.
Do tej procedury zmontuj niestandardową rurkę do napełniania, która składa się z tłoka wyjętego z 10-mililitrowej pipety serologicznej, elastycznej rurki o długości 40 centymetrów z adapterem igły, zaworu sterującego natężeniem przepływu i igły o rozmiarze 18. Po zmontowaniu przymocuj pipetę do kredensu za pomocą taśmy. Odległość między górną częścią pipety a stołem musi wynosić co najmniej 30 centymetrów.
Po eutanazji myszy przez wstrzyknięcie znieczulające przymocuj ją do wysterylizowanej deski i ostrożnie otwórz klatkę piersiową, aby wyciąć mostek i odsłonić płaty płuc. Następnie odsłoń tchawicę. Następnie napełnij rurkę do napełniania świeżo przygotowanym 4% PFA i usuń wszystkie pęcherzyki z tuby.
Następnie włóż igłę do tchawicy. Aby uniknąć wycieku, przypnij tchawicę klipsami do naczyń. Teraz napompuj płuco utrwalaczem przy stałym ciśnieniu przezpłucnym 25 centymetrów wody.
Inkubuj płuca w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby uzyskać pełną ekspansję. Po napompowaniu zwróć uwagę na przemieszczenie objętości utrwalacza. Teraz podwiąż tchawicę i delikatnie wypreparuj nienaruszone płuca z otaczających tkanek łącznych.
Używaj nożyczek i bądź bardzo delikatny. Następnie inkubuj płuca w 50-mililitrowej stożkowej probówce wypełnionej 4% PFA przez 12 godzin w czterech stopniach Celsjusza, delikatnie potrząsając na shakerze. Następnie przystąp do przetwarzania i barwienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby określić ilościowo MLI, należy użyć obrazów czynnika użytego w sekcjach zebranych w jasnym polu przy 20-krotnym powiększeniu. Z trzech różnych sekcji płuc wybierz losowo łącznie 15 nienakładających się widoków, każdy o długości około jednego milimetra kwadratowego, a następnie odwietrz je. Używaj tylko obszarów bez tętnic i żył, głównych dróg oddechowych lub przewodów pęcherzykowych.
Na potrzeby analizy narysuj siatkę 10 na 10 nad każdym zaznaczonym obszarem za pomocą narzędzia linijki. Linie siatki są zatem oddalone od siebie o około 100 mikronów. Następnie, aby znaleźć punkt przecięcia wzdłuż linii jako długość między dwoma sąsiednimi nabłonkami pęcherzyków płucnych.
Na przykład strzałki z dwoma grotami ilustrują długości. Policz wszystkie te długości wzdłuż każdej linii siatki, a MLI jest średnią wartością długości punktu przecięcia. Korzystając z opisanych protokołów, myszy leczone PNX porównano z myszami z implantami protetycznymi.
Wykorzystano myszy będące ośmiotygodniowymi samcami CD-1, a ich lewe płaty płuc zostały wycięte. Proteza naśladuje rozmiar i kształt lewego płata płuca i została wprowadzona do klatki piersiowej po usunięciu lewego płata płuca. 14 dni po operacji użyto specjalnie wykonanej rurki do napełniania, aby określić wewnętrzną objętość pozostałego prawego płuca.
Średnia objętość prawego płuca u pięciu myszy leczonych PNX wynosiła około 1,4 mililitra, co było znacznie większe, 1,05 mililitra dla pięciu myszy z implantami protezowymi. Wartości MLI w pozostałych płucach prawych były również znacznie wyższe. Korzystając z tych parametrów, obliczono wewnętrzną powierzchnię płuc i stwierdzono, że jest ona znacznie mniejsza u myszy z implantami protezowymi.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obliczyć wewnętrzną powierzchnię płuc dla mysiego modelu regeneracji pęcherzyków płucnych wywołanej siłą mechaniczną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Artykuł ten przedstawia ustandaryzowaną metodę pomiaru powierzchni wewnętrznej płuc (ISA) u modeli myszy po pneumonektomii i wszczepieniu protezy. Dokładna kwantyfikacja ISA jest niezbędna do zrozumienia morfologii i fizjologii płuc, zwłaszcza w kontekście chorób płuc i regeneracji.
Accurate quantification of internal lung surface area (ISA) is critical for assessing respiratory function in pulmonary disease models and regeneration studies. This standardized method reduces observer bias in morphometric measurements, improving reliability and reproducibility in preclinical lung research. Enhanced measurement confidence supports mechanistic de-risking and predictive value in target validation for respiratory therapeutics.
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative morphometric data that informs lead identification and preclinical advancement decisions in respiratory research.