Name: Ustandaryzowana metoda pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc za pomocą pneumonektomii u myszy i implantacji protezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj ustandaryzowaną metodę pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc u myszy po pneumonektomii i implantacji protezy. Technika zwiększa niezawodność ocen funkcji płuc w badaniach regeneracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować Narodowemu Instytutowi Nauk Biologicznych w Pekinie za pomoc. Prace te były wspierane przez Miejską Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (nr Z17110200040000).

Wszystkie procedury użyte w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Wytycznych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Narodowego Instytutu Nauk Biologicznych w Pekinie. 8-tygodniowe samce myszy CD-1 były trzymane w specyficznym ośrodku wolnym od patogenów (SPF) do czasu przeprowadzenia eksperymentów. Operacje przeprowadzano przy użyciu całkowicie znieczulonych myszy (tj. bez reakcji na uszczypnięcie palca). Po operacji myszy trzymano w ciepłym, wilgotnym pomieszczeniu z wystarczającą ilością pożywienia i świeżej wody. Myszy zostały uśmiercone przy użyciu przedawkowania środka znieczulającego podawanego w wstrzyknięciu dootrzewnowym.
1. Chirurgia PNX u myszy
<ol>
	<li>W pełni znieczulić myszy fenobarbitalem sodu (120 mg / kg masy ciała) i buprenorfiną (0,1 mg / kg masy ciała) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP). Wykonaj operację, gdy myszy nie reagują już na szczypanie palców.</li>
	<li>Usuń włosy z lewej klatki piersiowej myszy za pomocą chemicznej depilacji (obszar ~3 x 3cm2).</li>
	<li>Zabezpiecz każdą mysz na platformie intubacyjnej brzuszną stroną skierowaną w stronę operatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wyciągnij język myszy i oświetl struny głosowe za pomocą laryngoskopu dla małych zwierząt, zawierającego wycięcie do prowadzenia cewników18 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Rozróżnij struny głosowe, obserwując ruchy strun głosowych podczas oddychania. Delikatnie wprowadzić kaniulę do intubacji dożylnej 20 G do tchawicy pod kątem przednim19.</li>
	<li>Umieść myszy w prawej bocznej pozycji leżącej i podłącz kaniulę do respiratora mechanicznego (np. z kontrolowanym ciśnieniem; patrz tabela materiałów). Sprawdź wprowadzenie kaniuli do tchawicy, obserwując ruchy oddechowe klatki piersiowej myszy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Ustaw ciśnienie wdechowe wentylatora na 12 cm H2O i ustaw częstość oddechów na 120 oddechów na minutę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Odkaż skórę w obszarze operacyjnym za pomocą betadyny i 70% etanolu.</li>
	<li>Wykonaj 2-3 cm nacięcie torakotomii tylno-bocznej w przestrzeni na 5przestrzeni międzyżebrowej, przeciąć skórę i mięśnie nożyczkami Noyes Spring Scissors (krawędź tnąca: 14 mm; średnica końcówki: 0,275 mm) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B, C). Narzędzia chirurgiczne używane do zabiegu torakotomii są sterylizowane przed użyciem.</li>
	Wykonaj 1,5 cm nacięcie w 5. przestrzeni międzyżebrowej, aby odsłonić lewe płuco (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D, E).<li> Podczas operacji użyj kauteryzatora o wysokiej temperaturze, aby zatrzymać krwawienie.</li>
	<li>Podnieś jedną trzecią lewego płata płuca z klatki piersiowej za pomocą kleszczy z końcówką (<silna klasa="xfig">Ryc. 2F), a następnie użyj bawełnianego wacika, aby wyciągnąć całe lewe płuco (<silna klasa="xfig">Rycina 2G).</li>
	<li>Zidentyfikuj tętnicę płucną i oskrzela lewego płata płuca (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	<li>Mocno podwiń oskrzela i naczynia na wnęce jedwabnym szwem chirurgicznym i wytnij lewy płat płuca w odległości 3 - 4 mm od podwiązania (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2H, I). 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie odciąć węzłów szwów na lewej wnęce, co może spowodować powstanie odmy opłucnowej (tj. powietrza lub gazu w jamie klatki piersiowej).</li>
	<li>Zamknij ścianę klatki piersiowej 1 szwem, a następnie zszyj kolejno warstwę mięśniową i warstwę skóry, używając 5 - 6 przerwanych szwów. Pozostaw 3 - 4 mm odstęp między każdym szwem (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 2M, 2N). 
	UWAGA: Igłę do szwu chirurgicznego należy trzymać z dala od serca; Nieumyślne nakłucie serca spowoduje natychmiastową śmierć.</li>
	<li>Zdezynfekuj obszar operacyjny jodonem powidonu.</li>
	<li>Po operacji chirurgicznej umieść mysz na podkładce termicznej o temperaturze 38 °C i podłącz ją do respiratora, aż rozpoczną się spontaniczne ruchy oddechowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2O).</li>
</ol>
2. Implantacja protezy
<ol>
	<li>Wykonaj kroki 1.1 - 1.13 procedury PNX (czyli do momentu, w którym lewy płat płuca myszy zostanie usunięty).</li>
	<li>Zacisnąć środek protezy silikonowej (wykonanej przez klienta, 12 mm długości, 3 mm grubości, 7 mm szerokości, 0,2 g, kształt elipsoidalny) za pomocą kleszczy (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2J). Wysterylizuj protezę silikonową przed założeniem.</li>
	<li>Jedną ręką przytrzymaj żebro kleszczami, aby odsłonić klatkę piersiową, a następnie drugą ręką włóż protezę do lewej pustej klatki piersiowej. 
	UWAGA: Kąt wsunięcia wynosi około 45 stopni między płaszczyzną czołową protezy a powierzchnią klatki piersiowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2K, L). Zachowaj ostrożność podczas zakładania protezy. Nadmierna siła spowoduje pęknięcie opłucnej.</li>
	<li>Dostosuj orientację protezy za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że proteza zajmuje lewą pustą jamę piersiową.</li>
	<li>Wykonaj kroki 1.14 - 1.16 procedury PNX myszy.</li>
</ol>
3. Pomiar ILV
<ol>
	<li>Przygotuj niestandardowe urządzenie ("rurkę do napełniania"), które składa się z tłoka wyjętego z jednorazowej pipety serologicznej (10 ml), elastycznej rurki o długości 40 cm z adapterem igły, zaworu sterującego natężeniem przepływu i igły 18 G. Po złożeniu zabezpiecz pipetę na płytce taśmą (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Odległość między górną częścią pipety a stołem doświadczalnym musi wynosić co najmniej 30 cm.</li>
	<li>Przygotować świeży 4% roztwór utrwalający paraformaldehyd (PFA), rozpuszczając 20 g PFA w 500 ml wstępnie podgrzanego 1x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, wstrząsając ręcznie raz na 10 minut, aż roztwór będzie klarowny. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej przefiltrować roztwór filtrem 0,45 μm. 
	UWAGA: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
	<li>Ofiaruj myszy za pomocą przedawkowania środka znieczulającego (0,8% fenobarbitalu sodu, 1,000 U/ml heparyny).</li>
	<li>Zabezpiecz każdą mysz na styropianowej płytce preparacyjnej i spryskaj ją 70% alkoholem.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz klatkę piersiową myszy i wytnij mostek za pomocą nożyczek, aby dokładnie odsłonić płaty płuc.</li>
	<li>Usuń nadmiar tkanki za pomocą nożyczek, aby odsłonić tchawicę. Upewnij się, że tchawica jest oddzielona od przełyku.</li>
	<li>Przeciąć aortę brzuszną i wprowadzić igłę o rozmiarze 25G do prawej komory serca; przed tym wkłuciem podłączyć igłę do strzykawki o pojemności 20 ml. Powoli wepchnij 1x PBS do serca, aby usunąć komórki krwi, aż płuca staną się białe. Zazwyczaj do oczyszczenia naczyń krwionośnych płuc wymagane jest 5 - 10 ml PBS.</li>
	<li>Napełnij specjalnie skonstruowaną rurkę do napełniania 4% świeżym PFA i usuń wszystkie pęcherzyki z rurki do napełniania.</li>
	<li>Włóż igłę rurki do napełniania o rozmiarze 18 do tchawicy i przypnij tchawicę zaciskami do naczyń, aby uniknąć wycieku płynu.</li>
	Napompuj płuca 4% PFA przy stałym ciśnieniu przezpłucnym 25 cm/H2O2,20.<li> Inkubuj płuca w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby uzyskać w pełni rozwinięte płuca. Ten etap "prefiksu" ma kluczowe znaczenie dla zachowania morfologii płuc.
	<ol>
		<li>Monitorując rurkę do napełniania, zapisz wartość początkowej objętości PFA 4% i zapisz końcową objętość. Wewnętrzna objętość płuc jest równa początkowej objętości PFA wynoszącej 4% minus końcowej objętości PFA wynoszącej 4%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązaj tchawicę i za pomocą nożyczek delikatnie wypreparuj płuca (zachowując nienaruszone płuca) z otaczających tkanek łącznych. Bądź bardzo delikatny, aby nie uszkodzić płuc.</li>
	<li>Inkubować płuca w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 4% PFA przez 12 godzin w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając wytrząsarką (50 obr./min). Przystąpić do przetwarzania tkanek i barwienia (patrz punkt 4).</li>
</ol>
4. Osadzanie tkanek, cięcie oraz barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
<ol>
	<li>Po utrwaleniu użyj nożyczek sprężynowych Noyes, aby przyciąć serce i nadmiar tkanki łącznej z płuc. Delikatnie oddziel poszczególne płaty płuc, odcinając oskrzela łączące płaty płuc z tchawicą.</li>
	<li>Dokładnie przemyć płaty płuc 3 - 4 razy w 50 ml 1x PBS (30 min/pranie) na wytrząsarce orbitalnej (50 obr./min).</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu należy kriochronić płaty płuc, zanurzając je w 30% roztworze sacharozy (w 1x PBS) w temperaturze 4 °C, aż tkanka opadnie na dno stożkowych probówek o pojemności 50 ml (około 12 godzin).</li>
	<li>Przed zatopieniem i kriosekcją tkanek należy usunąć próbki płata płuc z probówek za pomocą kleszczy, zachować płaty dodatkowe do analizy histologicznej, wklepać pozostały roztwór sacharozy z powierzchni próbek płata dodatkowego, a następnie dokładnie zanurzyć próbkę na szalce Petriego zawierającej związek o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T) na około 30 minut.</li>
	<li>Zamroź próbki płata akcesoriów osadzonego w OCT w ciekłym azocie za pomocą krioform. Ustaw największą powierzchnię płata równolegle do dna formy.</li>
	<li>Podczas kriosekcji należy przygotować łącznie trzy skrawki o grubości 10 μm dla każdej próbki do analizy histologicznej. Odrzucić pierwszy 1 mm tkanki, pobrać jeden odcinek o grubości 10 μm, odrzucić 0,5 mm tkanki, pobrać kolejny odcinek, odrzucić 0,5 mm tkanki i pobrać trzeci (końcowy) odcinek.</li>
	<li>Suszyć sekcje na powietrzu przez 1 godzinę przed wykonaniem barwienia H&E.</li>
	<li>Wykonaj barwienie H&E
	<ol>
		<li>Umyj skrawki w 3 - 4 podmianach wody z kranu, a następnie zabarwij je świeżą hematoksyliną przez 2 minuty; opłucz sekcję pod bieżącą wodą z kranu; zanurz sekcję dwa razy w 1% roztworze HCl-70% etanolu, aby usunąć nadmiar hematoksyliny.</li>
		<li>Zabarwić skrawki w świeżej eozynie przez 3 minuty; odwodnić skrawki dwoma kolejnymi 30-sekundowymi praniami w 95% etanolu i dwoma 30-sekundowymi praniami w 100% etanolem; oczyść skrawki ksylenem przez 30 s, powtórzyć etap oczyszczania raz w świeżym ksylenie; zamontuj szkiełka z medium montażowym za pomocą szklanych szkiełek nakrywkowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja MLI
<ol>
	<li>Uzyskaj cyfrowe obrazy barwionych sekcji płatów akcesoriów H&E (powiększenie 20x) za pomocą mikroskopu jasnego pola.</li>
	<li>Aby określić ilościowo MLI, wybierz losowo łącznie 15 nienakładających się widoków (1 000 μm x 1 000 μm) z odpowiednich obszarów (bez tętnic i żył, głównych dróg oddechowych i wyrostków zębodołowych) z 3 sekcji.</li>
	<li>Umieść siatkę z 10 równomiernie rozmieszczonymi liniami pionowymi i 10 równomiernie rozłożonymi liniami poziomymi o określonej długości (1 000 μm) w wybranych obszarach widzenia za pomocą narzędzia linijki; każda linia jest w ten sposób oddalona od siebie o 100 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Wartość jednego punktu przecięcia należy zdefiniować jako długość liniową między dwoma sąsiednimi nabłonkami wyrostka zębodołowego. Zmierz wartości wszystkich punktów przecięcia wzdłuż każdej linii o długości 1 000 μm.</li>
	<li>Dla każdej siatki należy określić ilościowo wartości wszystkich punktów przecięcia między 10 poziomymi liniami o długości 1 000 μm i 10 pionowymi liniami o długości 1 000 μm. 
	UWAGA: MLI jest średnią wartością długości przecięcia z łącznie 15 siatek analizowanych spośród 3 przekrojów przygotowanych dla każdego z płatów akcesoriów.</li>
</ol>
6. Obliczanie ISA
<ol>
	<li>Oblicz ISA, korzystając z równania 1 (patrz Wprowadzenie). Patrz sekcja 3 w celu pomiaru ILV i patrz sekcja 5 w celu ilościowego określenia MLI.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-Mediated+YAP+Activation+Controls+Mechanical-Tension-Induced+Pulmonary+Alveolar+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration.</a> Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).</li>
<li>Thurlbeck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+surface+area+and+other+measurements+in+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Internal surface area and other measurements in emphysema.</a> Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).</li>
<li>Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+air+space+size+characteristics+by+intercept+%28chord%29+measurement%3A+an+accurate+and+efficient+stereological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach.</a> J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).</li>
<li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeibel%2C+ER+%22Morphometry+of+the+Human+Lung%22">Morphometry of the Human Lung</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).</li>
<li>Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+surface+area+of+the+lung+in+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The internal surface area of the lung in emphysema.</a> J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).</li>
<li>Branchfield, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+neuroendocrine+cells+function+as+airway+sensors+to+control+lung+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response.</a> Science. 351 (6274), 707-710 (2016).</li>
<li>Ding, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-derived+angiocrine+signals+induce+and+sustain+regenerative+lung+alveolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization.</a> Cell. 147 (3), 539-553 (2011).</li>
<li>Dunnill, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+pulmonary+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of pulmonary pathology.</a> Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).</li>
<li>Weibel, E. R., Gomez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+human+lung.+Use+of+quantitative+methods+establishes+fundamental+relations+between+size+and+number+of+lung+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures.</a> Science. 137 (3530), 577-585 (1962).</li>
<li>Thurlbeck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+surface+area+of+nonemphysematous+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">The internal surface area of nonemphysematous lungs.</a> Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).</li>
<li>Butler, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+adult+lung+growth+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for adult lung growth in humans.</a> N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).</li>
<li>Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+lung+growth+occurs+in+adult+dogs+after+right+pneumonectomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy.</a> J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).</li>
<li>Thurlbeck, S. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumonectomy+in+Rats+at+Various+Ages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Pneumonectomy in Rats at Various Ages.</a> Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).</li>
<li>Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Age+on+Postpneumonectomy+Growth+in+Rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits.</a> Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).</li>
<li>Langston, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+multiplication+in+the+contralateral+lung+after+unilateral+pneumonectomy+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit.</a> Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).</li>
<li>Cohn, R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ar.1090750206/abstract">Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung.</a> Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).</li>
<li>Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+mediastinal+shift+after+pneumonectomy+impairs+regenerative+alveolar+tissue+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).</li>
<li>Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> J Vis Exp. (73), e50318(2013).</li>
<li>Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pneumonectomy+model+of+compensatory+lung+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airspace+configuration+at+different+transpulmonary+pressures+in+normal+and+paraquat-induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats.</a> Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).</li>
<li>Yilmaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+quantification+of+heterogeneous+lung+growth+following+extensive+lung+resection+by+high-resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography.</a> J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).</li>
<li>Voswinckel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+post-pneumonectomy+lung+growth+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice.</a> Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).</li>
<li>Ravikumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://jap.physiology.org/content/jap/97/4/1567.full.pdf">Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography.</a> J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).</li>
<li>Gibney, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+murine+post-pneumonectomy+lung+regeneration+by+18FDG+PET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging.</a> EJNMMI Res. 2 (1), (2012).</li>
<li>Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+lung+damage+in+an+elastase-induced+mouse+model+of+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biomed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema.</a> Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole podajemy szczegółowe opisy dotyczące pomiaru parametrów płucnych po implantacji PUX lewego płuca myszy i protezie. ISA jest obecnie uważany za kluczowy wskaźnik oceny funkcji oddechowej w wielu chorobach płuc oraz w regeneracji pęcherzyków płucnych wywołanej urazem. Jednakże, chociaż społeczność badaczy pulmonologów jest zgodna co do użyteczności ISA jako użytecznego wskaźnika, do tej pory niewiele uwagi poświęcono standaryzacji pomiaru ILV i MLI, dwóch parametrów używanych do obliczania ISA. Oczywiście, ...

Podstawową funkcją płuc jest wymiana tlenu i dwutlenku węgla między naczyniami krwionośnymi a atmosferą. Choroby płuc, takie jak dysplazja oskrzelowo-pęcherzykowa (BPD), przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) oraz ostre infekcje dróg oddechowych, prowadzą do zmniejszenia ISA2. Badacze zajmujący się chorobami płuc opracowali kilka metod ilościowych do oceny zmian morfologicznych w płucach, w tym MLI, ILV, liczbę jednostek wymiany gazowej, ISA oraz podatność tkanki płucnej2,3. Pionierskie badania Weibel et al.4 oraz Duguid et al.5 wspólnie wykazały, że ISA może służyć jako bezpośrednia miara wydajności wymiany gazowej w płucach człowieka i może być stosowana jako kryterium oceny stopnia zaawansowania rozedmy. W licznych badaniach opublikowanych w ciągu ostatnich pięciu lat wykorzystano parametry morfologiczne płuc (np. ISA i MLI) do oceny zmian morfologicznych i funkcjonalnych w płucach myszy podczas rozwoju6 oraz podczas rekonwalescencji po urazie PNX1,7. ISA oblicza się za pomocą Równania 18,9:
<img alt="Równanie powierzchni wewnętrznej płuc, ISA=4x(ILV)/MLI, obliczanie parametru fizjologicznego." src="/files/ftp_upload/56114/56114eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">
, gdzie ILV oznacza wewnętrzną objętość płuc, a MLI jest parametrem pośrednim reprezentującym rozmiar obwodowych przestrzeni powietrznych płuc10.
PNX, czyli chirurgiczne usunięcie jednego lub więcej płatów płuca, według licznych doniesień indukuje regenerację pęcherzyków płucnych u wielu gatunków, w tym u ludzi1, myszy1, psów12, szczurów13 i królików14,15. Badanie płuc myszy czternaście dni po PNX wykazało, że zarówno rozszerzanie istniejących pęcherzyków, jak i tworzenie nowych pęcherzyków de novo przyczyniają się do przywrócenia ISA, ILV oraz liczby pęcherzyków w pozostałych tkankach płuc1. My oraz inni badacze wykazaliśmy, że wprowadzenie do pustej jamy klatki piersiowej po PNX materiałów takich jak gąbka, wosk lub proteza o niestandardowym kształcie (tj. implantacja protezy) upośledza regenerację pęcherzyków płucnych. Obecnie jest ugruntowane, że siła mechaniczna pełni rolę jednego z najważniejszych czynników inicjujących regenerację pęcherzyków1,16,17. Takie badania podkreśliły skuteczność wykorzystania wartości ISA z płuc po PNX oraz po implantacji protezy jako kryterium do ilościowej oceny regeneracji pęcherzyków płucnych.
Znane jest, że błąd obserwatora znacząco wpływa na pomiarowe wartości parametrów morfologicznych płuc (np. MIL i ILV). Aby wyeliminować ten błąd przy określaniu zarówno ILV, jak i MLI — dwóch parametrów wykorzystywanych do obliczenia ISA — można zastosować ustandaryzowane protokoły. Przedstawiamy tutaj bardzo szczegółowe, ustandaryzowane protokoły pomiaru tych parametrów płucnych. Co istotne, możliwość dokładnego określenia ISA obiecuje poprawę wiarygodności i powtarzalności badań funkcji płuc w modelach regeneracji pęcherzyków płucnych indukowanej urazem i powinna ułatwić odkrycia mechanistyczne w wielu chorobach płuc.

<table><tbody><tr><td>Niedrogi zestaw do kauteryzacji</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Noyes</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Igły</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do naczyń</td><td>Fine Science Tools</td><td>18374-44</td><td></td></tr><tr><td>I. V. Kaniula-20 miernik</td><td>Jinhuan Medical Product Co., LTD.</td><td>29P0601</td><td></td></tr><tr><td>Szew chirurgiczny</td><td>Jinhuan Medical Product Co., LTD.</td><td>F602</td><td></td></tr><tr><td>Platforma do intubacji myszy</td><td>Penn-Century, Inc</td><td>Model MIP</td><td></td></tr><tr><td>Laryngoskop dla małych zwierząt</td><td>Penn-Century, Inc</td><td>Model LS-2-M</td><td></td></tr><tr><td>TOPO Wentylator dla małych zwierząt</td><td>Kent Scientific</td><td>RSP1006-05L</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka termiczna</td><td>Sprzęt Stuart</td><td>SBH130D</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa pentobarbitalu</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny</td><td>Sigma</td><td>GHS132</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny Y, alkoholik</td><td>Sigma</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta</td><td>Thermo Scientific 170356</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>Compound Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>maszyna do kriosekcji</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe formy bazowe</td><td>Fisher HealthCare</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 18</td><td>Becton Dickinson</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>Jod powidonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy infuzyjne dla osób pojedynczych użyj</td><td>Weigao</td><td>SFDA 2012 3661704</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Taśmy</td><td>3M Scotch</td><td>8915</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka bawełniana</td><td>Vinda</td><td>Dr.P</td><td></td></tr><tr><td>Proteza silikonowa</td><td>Wykonany</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>mikroskop</td><td>Brightfield Olympus</td><td>VS120</td><td></td></tr><tr><td>Linijka narzędzie</td><td>Adobe Przeglądarka Photoshop</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ustandaryzowana metoda pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc za pomocą pneumonektomii u myszy i implantacji protezy

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

Morfologia, fizjologia i funkcje oddechowe płuc zmieniają się zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Wewnętrzna powierzchnia płuc (ISA), reprezentująca zdolność płuc do wymiany gazowej, jest krytycznym kryterium oceny czynności oddechowej. Jednak stronniczość obserwatora może znacząco wpływać na mierzone wartości parametrów morfologicznych płuc. Opisany przez nas protokół minimalizuje odchylenia podczas pomiarów dwóch parametrów morfologicznych wykorzystywanych do obliczania ISA: wewnętrznej objętości płuc (ILV) i średniego przecięcia liniowego (MLI). Wykorzystując ISA jako parametr morfometryczny i funkcjonalny do określenia wyniku regeneracji wyrostka zębodołowego zarówno w modelach myszy do pneumonektomii (PNX), jak i implantacji protez, stwierdziliśmy, że zwiększony ISA po leczeniu PNX był znacznie zablokowany przez implantację protezy do jamy klatki piersiowej1. Oczekuje się, że możliwość dokładnego ilościowego określenia ISA nie tylko poprawi wiarygodność i odtwarzalność badań nad czynnością płuc w modelach regeneracji pęcherzyków płucnych wywołanych kontuzjami, ale także przyczyni się do mechanistycznych odkryć wielu chorób płuc.

Przeprowadziliśmy tutaj eksperyment z grupą poddaną działaniu PNX oraz grupą z implantowaną protezą (Prosthesis-implanted). Podział ten jest zgodny z grupami wykorzystanymi w poprzednim badaniu opublikowanym przez nasz zespół badawczy14.
Procedury PNX u myszy oraz implantacji protezy przedstawiono na Rysunku 2. Do zabiegów chirurgicznych oraz do kwantyfikacji wykorzystano 8-t...

Wewnętrzna powierzchnia płuc (ISA) jest krytycznym kryterium oceny morfologii i fizjologii płuc w chorobach płuc i regeneracji pęcherzyków płucnych wywołanej urazem. Opisujemy tutaj znormalizowaną metodę, która może zminimalizować błąd systematyczny pomiaru ISA zarówno w modelach myszy do pneumonektomii płuc, jak i implantacji protez.

Ustandaryzowana metoda pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc za pomocą pneumonektomii u myszy i implantacji protezy

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dokładny pomiar wewnętrznej powierzchni płuca myszy po pneumonektomii i implantacji protezy. Metoda ta pomaga w analizie funkcji morfologicznych i fizjologicznych płuc w procesie regeneracji płuc dorosłych indukowanej siłami mechanicznymi. Główną zaletą tej techniki jest możliwość dokładnego określenia ilościowego wewnętrznej powierzchni płuc, co pozwala na zwiększenie wiarygodności i powtarzalności oceny stanu funkcji płuc.Przygotuj mysz do zabiegu na platformie do intubacji w pozycji brzusznej. Następnie wysuń język i obejrzyj struny głosowe za pomocą laryngoskopu dla małych zwierząt, który umożliwia wprowadzanie cewników. Następnie ostrożnie wprowadź kaniulę do intubacji dożylnej o rozmiarze 20 G do tchawicy pod kątem.Następnie ułożyć mysz w pozycji bocznej prawej i podłączyć kaniulę do respiratora mechanicznego. Obserwować klatkę piersiową, aby ocenić prawidłowość wprowadzenia kaniuli do tchawicy. Ustawić ciśnienie wdechowe na 12 cm H₂O oraz częstotliwość oddechów na 120 oddechów na minutę.Następnie oczyść odsłoniętą skórę, wykonując co najmniej trzy naprzemienne przemycia Betadine oraz 70% etanolem. Po tym rozpocznij operację, wykonując

a-standardized-method-for-measuring-internal-lung-surface-area-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Mysia pneumonektomia jest powszechnie stosowanym modelem kompensacyjnego wzrostu płuc. Procedura ta może być stosowana w połączeniu ze śledzeniem linii lub transgenicznymi modelami myszy w celu wyjaśnienia podstawowych mechanizmów.

Mysi model pneumonektomii kompensacyjnego wzrostu płuc

Tutaj prezentujemy protokół prostego i wiarygodnego pomiaru krzywej ciśnienia i objętości płuc u myszy, pokazując, że jest ona wystarczająco czuła, aby wykryć fenotypowe zmiany miąższowe w dwóch powszechnych patologiach płuc, zwłóknieniu płuc i rozedmie płuc. Ta metryka zapewnia sposób na ilościowe określenie zmian strukturalnych płuc wraz z rozwijającą się patologią.

Pomiar krzywej ciśnienie-objętość w płucach myszy

Celem tego artykułu jest opisanie prostych metod, które znacznie pomogą w konfiguracji i analizie płuc myszy z rakiem płuc lub innymi patologiami. Przedstawiamy 3 protokoły do prostego i niezawodnego przeprowadzania wkraplania płuc, stabilizacji i pomiarów objętości płuc.

Metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc myszy

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego wszczepienia na stałe stałego okna optycznego dla mysiej klatki piersiowej, który umożliwia wysokorozdzielcze, przyżyciowe obrazowanie płuc. Trwałość okienka sprawia, że dobrze nadaje się ono do badania dynamicznych procesów komórkowych w płucach, zwłaszcza tych, które powoli ewoluują, takich jak progresja przerzutowa rozsianych komórek nowotworowych.

Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Ten protokół pokazuje, jak optymalne ustawienie myszy i transoralne wprowadzenie otoskopu opartego na kamerze umożliwia wizualizację głośni, szybką intubację przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i stałe dostarczanie płynu do płuc.

Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) do ilościowego oznaczania wentylowanych regionów w jednostronnym modelu zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną poprzez wkroplenie dotchawicze po stronie zmiany.

Jednostronna analiza objętości płuc za pomocą mikrotomografii komputerowej w celu lepszej oceny zwłóknienia płuc w modelach przedklinicznych

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Poznaj ustandaryzowaną metodę pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc u myszy po pneumonektomii i implantacji protezy. Technika zwiększa niezawodność ocen funkcji płuc w badaniach regeneracji.

Ustandaryzowana metoda pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc za pomocą pneumonektomii u myszy i implantacji protezy

Przeglądaj więcej filmów