Ustandaryzowana metoda pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc za pomocą pneumonektomii u myszy i implantacji protezy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dokładny pomiar wewnętrznej powierzchni płuca myszy po pneumonektomii i implantacji protezy. Metoda ta pomaga w analizie funkcji morfologicznych i fizjologicznych płuc w procesie regeneracji płuc dorosłych indukowanej siłami mechanicznymi. Główną zaletą tej techniki jest możliwość dokładnego określenia ilościowego wewnętrznej powierzchni płuc, co pozwala na zwiększenie wiarygodności i powtarzalności oceny stanu funkcji płuc.

Przygotuj mysz do zabiegu na platformie do intubacji w pozycji brzusznej. Następnie wysuń język i obejrzyj struny głosowe za pomocą laryngoskopu dla małych zwierząt, który umożliwia wprowadzanie cewników. Następnie ostrożnie wprowadź kaniulę do intubacji dożylnej o rozmiarze 20 G do tchawicy pod kątem.

Następnie ułożyć mysz w pozycji bocznej prawej i podłączyć kaniulę do respiratora mechanicznego. Obserwować klatkę piersiową, aby ocenić prawidłowość wprowadzenia kaniuli do tchawicy. Ustawić ciśnienie wdechowe na 12 cm H₂O oraz częstotliwość oddechów na 120 oddechów na minutę.

Następnie oczyść odsłoniętą skórę, wykonując co najmniej trzy naprzemienne przemycia Betadine oraz 70% etanolem. Po tym rozpocznij operację, wykonując dwu- lub trzycentymetrowe cięcie torakotomiczne posterolateralne w piątej przestrzeni międzyżebrowej. Przebij mięśnie, używając nożyczek sprężynowych Noyesa.

Następnie wykonaj nacięcie o długości 1,5 cm, aby odsłonić lewe płuco. W razie potrzeby w trakcie operacji używaj kauteryzatora wysokotemperaturowego w celu zahamowania krwawienia. Następnie za pomocą pęsety z tępym końcem unieś 1/3 płata lewego płuca z klatki piersiowej i za pomocą patyczka z watą wyciągnij całe lewe płuco.

Następnie zidentyfikuj tętnicę płucną oraz oskrzela lewego płata płuca i ściśle podwiąż oskrzela i naczynia w obrębie wnęki, używając nasączonej nici chirurgicznej. Następnie wycięty lewy płat płuca, odcinając go w odległości trzech do czterech milimetrów od miejsca podwiązania, uważając, aby nie przeciąć nici, co mogłoby doprowadzić do odmy opłucnowej. Na koniec zamknij ścianę klatki piersiowej za pomocą jednego szwu.

Następnie zszyj sekwencyjnie warstwę mięśniową i warstwę skóry, stosując od pięciu do sześciu szwów przerywanych w odstępach od trzech do czterech milimetrów. Należy upewnić się, że igła chirurgiczna nie zbliża się do serca. Przebicie serca jest śmiertelne.

Na koniec zdezynfekuj pole operacyjne za pomocą powidonu jodu. Następnie umieść mysz na podgrzewaczu utrzymującym temperaturę 38 degrees Celsius. Kontynuuj wentylację do momentu powrotu spontanicznego oddychania.

Wykonaj wcześniej opisaną operację, jednak bezpośrednio po usunięciu płuca przygotuj się do wprowadzenia protezy. Za pomocą tępych pęsety chwyć środek elipsoidalnej protezy silikonowej. Następnie, odsuwając pęsetą żebro w celu odsłonięcia jamy klatki piersiowej, bardzo delikatnie wprowadź protezę.

Wprowadź pod kątem 45 stopni pomiędzy płaszczyznę czołową protezy a powierzchnię klatki piersiowej. Używając pęsety tępej, upewnij się, że proteza znajduje się całkowicie wewnątrz lewej, pustej jamy klatki piersiowej. Następnie zamknij klatkę piersiową i monitoruj mysz zgodnie z wcześniejszym opisem.

Do tej procedury należy przygotować niestandardową rurkę do nadmuchiwania, składającą się z tłoka wyjętego z pipety serologicznej o pojemności 10 ml, elastycznej rurki o długości 40 cm z adapterem do igły, zaworu regulującego przepływ oraz igły o rozmiarze 18 G.

Po uśmierceniu myszy poprzez iniekcję środka anestetycznego, unieruchom ją na wysterylizowanej desce i ostrożnie otwórz klatkę piersiową, aby wyciąć mostek i odsłonić płaty płuc. Następnie odsłoń tchawicę. W kolejnym kroku napełnij rurkę do inflacji świeżo przygotowanym 4% PFA i usuń z rurki wszystkie pęcherzyki powietrza.

Następnie wprowadź igłę do tchawicy. Aby uniknąć wycieku, zacisnąć tchawicę za pomocą klipsów naczyniowych. Teraz napompuj płuco utrwalaczem przy stałym ciśnieniu transpłucnym wynoszącym 25 cm H₂O.

Inkubować płuca w temperaturze pokojowej przez dwie godziny do pełnego rozprężenia. Po nadmuchaniu odnotować objętość wypartego utrwalacza. Następnie podwiązać tchawicę i ostrożnie wypreparować nienaruszone płuca z otaczających je tkanek łącznych.

Użyj nożyczek i postępuj bardzo delikatnie. Następnie inkubuj płuca w 50 ml probówce stożkowej wypełnionej 4% PFA przez 12 godzin w temperaturze 4 °C przy łagodnym wstrząsaniu na wytrząsarce. Następnie przystąp do przetwarzania i barwienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby ilościowo określić MLI, należy wykorzystać obrazy użytego środka w przekrojach pobranych w świetle przechodzącym przy 20-krotnym powiększeniu. Z trzech różnych przekrojów płuc należy losowo wybrać łącznie 15 niezakładających się pól widzenia, z których każde ma powierzchnię około jednego milimetra kwadratowego, a następnie je wyodrębnić. Należy wykorzystywać wyłącznie obszary pozbawione tętnic i żył, głównych dróg oddechowych oraz przewodów pęcherzykowych.

Do analizy, za pomocą narzędzia linijki, narysuj siatkę 10 na 10 nad każdym wybranym obszarem. Linie siatki znajdują się w ten sposób w odstępach około 100 mikronów. Następnie, aby wyznaczyć punkt przecięcia wzdłuż linii, określ odległość między dwoma sąsiednimi nabłonkami pęcherzyków płucnych.

Na przykład strzałki dwustronne ilustrują długości. Należy zliczyć wszystkie te długości wzdłuż każdej linii siatki, a MLI stanowi średnią wartość długości przecięć. Z zastosowaniem opisanych protokołów porównano myszy poddane zabiegowi PNX z myszami z implantowaną protezą.

Wykorzystano ośmiotygodniowe samce myszy szczepu CD-1, u których wycięto lewe płaty płuc. Proteza, naśladująca rozmiar i kształt lewego płata płuca, została umieszczona w klatce piersiowej po usunięciu tego płata. 14 dni po operacji użyto specjalnie wykonanej rurki do inflacji, aby określić objętość wewnętrzną pozostałego prawego płuca.

Średnia objętość prawego płuca u pięciu myszy z indukowanym odmą (PNX) wynosiła około 1,4 mililitrów, co było wartością istotnie większą w porównaniu do 1,05 mililitrów u pięciu myszy z wszczepioną protezą. Wartości MLI w pozostałych prawych płucach również były istotnie wyższe. Na podstawie tych parametrów obliczono wewnętrzną powierzchnię płuc, która okazała się istotnie mniejsza u myszy z wszczepioną protezą.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat sposobu obliczania wewnętrznej powierzchni płuc w mysim modelu regeneracji pęcherzyków płucnych indukowanej siłą mechaniczną.