Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza funkcji genów larw komarów z wykorzystaniem rekombinowanego densowirusa komarów jako nośnika genów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące systemów dostarczania opartych na wirusach, takich jak sposób pokonywania powiązanych z nimi barier pozakomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Głównymi zaletami tych technik są łatwość manipulacji, wysoka wydajność transdukcji, długotrwała i stabilna ekspresja oraz zdolność do wywoływania trwałych efektów in vivo.

Niniejsza praca wykazała, że określone małe RNA lub geny docelowe mogą być nadeksprimowane lub wyciszone w larwach komarów przy użyciu opracowanego systemu dostarczania opartego na densowirusach. Zastosowanie tej techniki rozszerza możliwości opisanej strategii ekspresji w badaniu biologii komarów, ponieważ metoda ta umożliwia łatwą transdukcję larw. Procedurę zaprezentuje Pei-Wen Liu, doktorant z naszego laboratorium.

Należy rozpocząć od zamówienia chemicznej syntezy pełnych sekwencji cDNA dla prekursorów miRNA, gąbek miRNA (miRNA sponges) oraz shRNA, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Po otrzymaniu zamówionego DNA należy odwirować probówki zawierające bloki DNA, aby upewnić się, że całe wysuszone DNA znajduje się na dnie probówki. Następnie DNA należy resuspender w wodzie wolnej od DNazy, aby uzyskać końcowe stężenie 10 nanograms per microliter.

Dodaj 6 µL XbaI w celu trawienia szkieletu plazmidu i sekwencji cDNA, a następnie inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie przeprowadź defosforylację końców 5' zlinearyzowanego szkieletu plazmidu za pomocą alkalicznej fosfatazy z jelit cielęcych, zgodnie z instrukcją producenta. Aby zapewnić wydajne pakowanie, rozmiar genomu nie może przekraczać 4 400 nukleotydów, co stanowi 110% długości genomu dzikiego typu densovirusa komarów, lub do genomu Aedes aegypti można wprowadzić ekspresję intronowego mikroRNA o długości nieprzekraczającej 400 nukleotydów.

Następnie przeprowadź inaktywację termiczną fosfatazy alkalicznej w temperaturze 65 °C. Potem poddaj DNA elektroforezie na 1% żelu agarozowym i wytnij fragment liniowego szkieletu. Wyekstrahuj DNA z wycinka żelu, używając zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z instrukcjami producenta.

Po wyekstrahowaniu fragment DNA należy poddać ligacji z wektorem, wykorzystując T4 DNA ligase. Następnie, za pomocą szoku termicznego, należy wprowadzić produkty reakcji ligacji do kompetentnych komórek E.coli DH5-alpha. Przetransformowane bakterie należy wysiać na płytkę z agarem LB zawierającym 100 µg/mL ampicyliny.

Następnego dnia należy wybrać pojedynczą kolonię z płytki i przygotować kulturę startową, wykorzystując 3 mL medium wzbogaconego zawierającego 100 µg/mL ampicyliny. Na koniec, zgodnie z instrukcją producenta, należy wyizolować plazmidowe DNA z kultury bakteryjnej przy użyciu zestawu do miniprepu. Próbkę DNA należy przesłać do firmy sekwenującego DNA w celu weryfikacji.

Liguj pre-miRNA lub shRNA w miejsce rozpoznawane przez HpaI w regionie kodującym NS1 AaeDV w szkielecie plazmidu pUCA, stosując metody przedstawione dla sztucznej intronowej kasety ekspresyjnej małych RNA. Zamiast komórek DH5-alpha, przeprowadź transformację DNA do kompetentnych komórek E.coli Stbl3. Następnie wysiej transformowane komórki na płytkę z agarem LB zawierającą 100 µg/mL ampicyliny i przygotuj kulturę startową z pozytywnego klonu. Następnie wyizoluj plazmid rAaeDV z komórek bakteryjnych, używając zestawu do maxiprepu, zgodnie z instrukcjami producenta.

W dniu zerowym przenieś komórki C6/36 z kolb o 90–95% konfluencji w stosunku od 1:1 do 1:2 do 10 kolb hodowlanych T-25. Inkubuj kolby przez 18–20 godzin w temperaturze 28 °C, aż ponownie osiągną 90–95% konfluencji.

Pierwszego dnia przeprowadź transfekcję komórek przy użyciu przygotowanych plazmidów rAaeDV. W tym celu rozcieńcz 10 µg DNA w 600 µl pożywki RPMI-1640 i delikatnie wymieszaj roztwór. W tym samym czasie przygotuj 600 µl pożywki RPMI-1640 oraz 25 µl odczynnika do transfekcji na każdą transfekcję.

Inkubować komórki z DNA przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 625 µl mieszaniny odczynnika do transfekcji w medium RPMI-1640 do mieszaniny plazmidowego DNA i inkubować tę mieszaninę przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie medium RPMI-1640, a następnie dodać mieszaninę do transfekcji do każdej z kolb hodowlanych T-25.

Inkubuj komórki w mieszaninie do transfekcji przez sześć godzin w temperaturze 28 °C. Po sześciu godzinach usuń medium do transfekcji, przemyj komórki dwukrotnie 5 ml medium RPMI-1640, a następnie dodaj świeże medium RPMI-1640 zawierające 10% FBS. Pięć dni po transfekcji, używając szklanej pipety o pojemności 5 ml, odklej i zawieś komórki w naczyniach, pipetując je w górę i w dół w medium hodowlanym.

Przenieś zawiesiny komórkowe z każdej kolby do osobnych sterylnych probówek o pojemności 50 ml. Aby zebrać wirusa zależnego od wysokiego progu, konieczne jest utrzymanie komórek przez pięć dni po transfekcji. Zamroź poszczególne probówki w temperaturze -80 °C lub w kąpieli z suchego lodu i etanolu przez 30 minut.

Następnie szybko rozmrozić je w temperaturze 37 °C i mieszać zawiesinę komórkową na wortexie przez jedną minutę. Następnie zebrać nadsącz z odwirowanej próbki, a osad odrzucić. Po tym przefiltrować nadsącz przez jednorazowy filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 µm.

Rozdziel końcowe oczyszczone zapasy wirionów na aliquoty i przechowuj w temperaturze -80 °C. Przemyj trzykrotnie 100 larw A. albopictus pierwszego stadium, używając wody dejonizowanej. Następnie przenieś larwy do zlewki zawierającej 95 ml wody dejonizowanej.

Dodaj pięć mililitrów roztworu rAaeDV i inkubuj larwy przez 24 godziny w temperaturze 28 °C. Aby infekcja larw przebiegła pomyślnie, niezbędne jest utrzymanie ich w kontakcie z cząsteczkami wirusa infekcyjnego przez okres od 24 do 36 godzin w celu zapewnienia wysokiego stopnia infekcji. Po inkubacji przemyj larwy trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie przenieś je z powrotem na płytki. Regularnie karm larwy. Monitoruj poziom ekspresji genu docelowego w larwach, stosując standardowe techniki qPCR lub western blot.

W tym przykładzie przeanalizowano ekspresję endogennego miRNA u 100 larw pierwszego stadium po zakażeniu rekombinowanym wirusem zawierającym kasetę ekspresyjną aal-let-7 wykazującą nadekspresję.

Wydajność konstruktu anti-let-7 przedstawiono po prawej stronie, co podkreśla jego zdolność do wyciszania ekspresji genów. Aby monitorować wydajność wyciszania mRNA V-ATPase przez wektory rAaeDV, łącznie 100 larw pierwszego stadium rozwojowego poddano działaniu równych ilości rAaeDV różnych typów, dodając wirusa do wody w środowisku bytowania larw. Poziomy mRNA V-ATPase zostały znacznie obniżone przez rAaeDV wykazujący ekspresję miRNA oraz rAaeDV wykazujący ekspresję intronowego shRNA.

Nasze wyniki potwierdzają strategię ekspresji intronowej, która oferuje nowy paradygmat pozwalający przełamać ograniczenia densowirusów komarów z defektywnym genomem, aby umożliwić efektywne dostarczanie obcych genów do organizmów komarów. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że do genomu densowirusa Aedes aegypti można wprowadzić intronową kasetę ekspresyjną mikroRNA o długości nieprzekraczającej 400 nt. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań nad produkcją niedefektywnych rekombinowanych densowirusów komarów, które mogą nadmiernie eksponować lub obniżać poziom ekspresji mikroRNA oraz genów docelowych w celu przeprowadzenia analizy funkcjonalnej genów komarów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać opracowany system dostarczania densowirusa komarów do analizy funkcji genów w larwach komarów.