Name: Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj metodę analizy funkcji genów w larwach komarów Aedes aegypti przy użyciu rekombinowanego densowirusa jako wektora dostarczania genów. System umożliwia wysoką efektywność transdukcji i trwałą ekspresję genów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (2016YFC1200500 dla Xiao-Guang Chen), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81672054 i 81371846), Programu Zespołu Badawczego Fundacji Nauk Przyrodniczych w Guangdong (2014A030312016) oraz Programu Naukowo-Technologicznego Guangzhou (201508020263). Serdecznie dziękujemy profesorowi Jonathanowi Carlsonowi (Colorado State University) za uprzejme dostarczenie plazmidów pUCA i p7NS1-GFP oraz za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Południowego Uniwersytetu Medycznego.
1. Projektowanie sztucznego intronu
UWAGA: Sztuczny intron użyty w tej pracy ma długość 65 pz, a sekwencja to 5'-GTAAGAGTCGATCGCGTTACTAACTGGCTCTTCTTTTTTTTTTTTTATTATCCTGCAG-3'.
<ol>
	<li>Umieść miejsce restrykcji HpaI na obu końcach sztucznego intronu, tak aby trawienie HpaI mogło uwolnić intron z plazmidów (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść dwa miejsca restrykcyjne XbaI w intronie, aby można było użyć trawienia XbaI do wstawienia sekwencji ekspresyjnych małych RNA.</li>
	<li>Zamów syntezę chemiczną pełnowymiarowych sekwencji DNA sztucznego intronu u producenta DNA. Powstało syntetyczne DNA, które powstało w wyniku klonowania do standardowego plazmidu pUC19. 
	UWAGA: Podstawowe składniki sztucznego intronu obejmują kilka uzgodnionych elementów nukleotydowych, w tym miejsce splicingu donora 5' (DS) z sekwencją GUAAGAGU, konserwatywną sekwencję punktu rozgałęzienia (BPS) z sekwencją UACUAAC, trakt polipirymidynowy (PPT) z sekwencją UCUUC(U)10 oraz miejsce splicingu 3'-akceptora (AS) z sekwencją GAUAUCCUGCAG (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Między DS i BPS wprowadzono dwa miejsca restrykcyjne XbaI, które można wykorzystać do wstawienia sekwencji ekspresyjnych małych RNA. Zdolność do skutecznego łączenia tego sztucznego intronu z komórek ssaków i komarów została już wcześniej potwierdzona14.</li>
</ol>
2. Projektowanie sztucznej kasety z ekspresją małego RNA
UWAGA: W przypadku nadekspresji lub knockdownu endogennego miRNA, sekwencje kodujące prekursorowe miRNA lub gąbkę miRNA zostały wstawione między DS i BPS. Jako przykład wybrano endogenny prekursor miRNA z Ae. albopictus aal-let-7 w celu skonstruowania rekombinowanych wektorów wirusowych dla nadekspresji miRNA i knockdownu. Gąbka anti-let-7 została zaprojektowana zgodnie z wcześniej opisanymi metodami15. Aby zniszczyć docelowe geny u larw, zaprojektowaliśmy specyficzne sekwencje sztucznego miRNA (amiRNA) lub krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA) za pomocą oprogramowania online16,17; jako przykład, podjednostka V-ATPazy A mRNA (nr akcesyjny. AY864912) został wybrany jako gen docelowy w tym badaniu. AmiRNA będzie dalej określane jako amiVTP. Wszystkie szczegóły sekwencji pre-miRNA, gąbki, amiRNA i shRNA są opisane w tabeli uzupełniającej 1.
<ol>
	<li>Zamów syntezę chemiczną pełnowymiarowych sekwencji cDNA prekursorowych miRNA, gąbek miRNA i shRNA z miejscami restrykcyjnymi XbaI na obu końcach od producenta DNA.</li>
	<li>Po otrzymaniu zamówionego DNA należy obracać probówki zawierające bloki DNA o masie 10 000-14 000 x g przez 1 minutę, aby upewnić się, że całe wysuszone DNA znajduje się na dnie probówki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wysuszone DNA w wodzie wolnej od DNaz, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng/μl.</li>
	<li>Trawić szkielet plazmidowy i sekwencje DNA za pomocą XbaI w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie defosforylować końce 5' zlinearyzowanego szkieletu plazmidowego za pomocą fosfatazy alkalicznej jelita cielęcego () zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Dezaktywować przez ogrzewanie przez 60 minut w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Uruchom 1,0% żel agarozowy i przetnij zlinearyzowany kręgosłup. Następnie wyekstrahuj DNA z wycinka żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Związać fragment DNA do szkieletu za pomocą ligazy DNA T4 (5 U/μL) w temperaturze 22 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przekształć produkty reakcji ligacji z etapu 2.7 w właściwe komórki Escherichia coli (E. coli) i umieścić je na płytce agarowej z bulionu lizogenicznego (LB) zawierającej ampicylinę (w stężeniu 100 μg/ml).
	<ol>
		<li>Wykonaj transformację metodą szoku cieplnego18 i użyj odpowiedniego szczepu E. coli. Na przykład użyj szczepu E. coli DH5α do transformacji szoku cieplnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybrać pojedynczą kolonię z kroku 2.8 i inkubować w kulturze zawierającej 3 ml wzbogaconej pożywki zawierającej ampicylinę (w stężeniu 100 μg/ml).</li>
	<li>Wyodrębnij plazmidowe DNA z kultury bakteryjnej za pomocą mini-zestawu przygotowawczego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Wyślij próbkę do firmy zajmującej się sekwencjonowaniem DNA. 
	UWAGA: W celu nadekspresji lub knockdownu endogennego miRNA, sekwencje kodujące prekursor miRNA lub gąbkę miRNA wstawiono między dwa miejsca XbaI. Wszystkie ekspresje miRNA lub konstrukty gąbek muszą być krótsze niż 400 pz (10% długości genomu wirusa) ze względu na limit pakowania wirusa19.</li>
</ol>
3. Generowanie konstruktu rAeaDV poprzez klonowanie kasety ekspresji miRNA lub shRNA do szkieletu plazmidu
UWAGA: pUCA, zakaźny klon składający się z plazmidu pUCA zawierającego genom AaeDV (3,981 nt)19, został uprzejmie dostarczony przez prof. Jonathana Carlsona i został wcześniej szczegółowo opisany11. p7NS1-DsRed wykazuje ekspresję białka fuzyjnego niestrukturalnego białka fluorescencyjnego 1 (NS1)-czerwonego białka fluorescencyjnego (DsRed) z promotora p7 i zostało szczegółowo opisane gdzie indziej14. Specyficzny dla człowieka prekursor miR-941-120 i jego gąbka, zaszyfrowany shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), zostały również sklonowane do AaeDV jako kontrola negatywna.
<ol>
	<li>Zliguj pre-miRNA, gąbkę, shRNA lub kasetę ekspresyjną amiVTP do miejsca HpaI regionu kodującego AaeDV NS1 w szkielecie plazmidu pUCA, jak opisano w kroku protokołu od 2.4 do 2.7.</li>
	<li>Przekształć DNA w kompetentne komórki E. coli Stbl3 i wybierz dodatni klon, jak opisano w krokach od 2.8 do 2.10.</li>
	<li>Następnie wyekstrahuj plazmid rAaeDV z komórek bakteryjnych za pomocą zestawu do przygotowania maxi, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Komórki E. coli Stbl3 lub Stbl4 powinny być wykorzystywane do transformacji DNA rAaeDV, aby zminimalizować niepożądaną rekombinację ITR. Do ekstrakcji plazmidu rAaeDV w celu uzyskania dużej ilości DNA (>100 μg) należy zastosować maksymalny preparat. Przed wygenerowaniem wirusa, integralność sekwencji plazmidu rAaeDV powinna być zawsze analizowana za pomocą sekwencjonowania DNA21.</li>
</ol>
4. Transfekcja komórek C6/36 za pomocą plazmidów rAaeDV
<ol>
	<li>Hodowla komórek C6/36 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w inkubatorze o temperaturze 28 °C.</li>
	<li>W dniu 0 umieść komórki w dziesięciu kolbach hodowlanych 25 cm2 18-20 godzin przed transfekcją, dzieląc 90-95% zlewających się komórek w rozcieńczeniu 1:2. 
	UWAGA: Do 1 dnia komórki powinny osiągnąć 90-95% konfluencji.</li>
	<li>W dniu 1 transfekuj komórki serią plazmidów rAaeDV class<= sup class="xref">22.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 10 μg DNA w 600 μl pożywki RPMI-1640 w probówce mikrowirówkowej i delikatnie wymieszać. W międzyczasie przygotuj 600 μl pożywki RPMI-1640 i 25 μl odczynnika do transfekcji na transfekcję.</li>
		<li>Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie dodaj 625 μl mieszaniny odczynników do transfekcji 1640 do mieszaniny 1640-plazmidowego DNA.</li>
		<li>Inkubować tę mieszaninę przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej. Przed transfekcją umyj komórki dwukrotnie 2 ml pożywki RPMI-1640.</li>
		<li>Po inkubacji RT (etap 4.3.3) dodać mieszaninę plazmidu DNA odczynnika do transfekcji 1640 do kolby hodowlanej o średnicy 25cm2 i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 28 °C.</li>
		<li>Po około 6 godzinach od transfekcji usuń pożywkę do transfekcji, przemyj komórki dwukrotnie 5 ml pożywki RPMI-1640, a następnie dodaj pożywkę RPMI-1640 z 10% FBS. 
		UWAGA: rAaeDV wykazuje wysokie wskaźniki infekcji (95%) u larw Ae. albopictus; Jednak z naszego doświadczenia wynika, że u prawie 50% zakażonych larw infekcja ograniczała się do pierwotnych miejsc infekcji (np. brodawek odbytu i komórek szczeciniastych) bez rozpowszechniania23. W związku z tym, jeśli istnieje potrzeba zakażenia larw w wielu tkankach, wadliwy rekombinowany wirus wykazujący ekspresję białka fluorescencyjnego powinien zostać poddany jednoczesnemu zakażeniu, aby umożliwić wizualizację miejsc infekcji. Na przykład, aby wytworzyć wadliwy rekombinowany wirus wykazujący ekspresję DsRed, p7NS1-DsRed powinien być współtransfekowany plazmidem pomocniczym do komórek C6/36 zgodnie z procedurą opisaną powyżej (stosunek stężenia kotransfekcji powinien wynosić 2:1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zbieranie wirionów rAaeDV z transfekowanych komórek C6/36
<ol>
	<li>Zbierz komórki 5 dni po transfekcji. Usunąć i zawiesić komórki w szalkach za pomocą szklanego zakraplacza o pojemności 5 ml, pipetując w górę i w dół za pomocą pożywki hodowlanej. Przenieś wszystkie zawiesiny komórek do sterylnych probówek o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Zamrażać w temperaturze -80 °C lub w kąpieli suchego lodu i etanolu przez 30 minut, a następnie rozmrażać w temperaturze 37 °C. Wirować przez 1 minutę. Powtórzyć procedurę zamrażania i rozmrażania 3 razy.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 4 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i wyrzucić osad. Następnie przepuścić supernatant przez jednorazowy filtr strzykawkowy 0,22 μm. Porcjować i przechowywać końcowe oczyszczone zapasy wirionów w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja rAaeDV
<ol>
	<li>Przygotuj wzorce DNA. Zlinearyzuj wszystkie plazmidy rAaeDV za pomocą HpaI i oczyść strawione produkty za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu24.</li>
	<li>Skonstruuj bezwzględną ilościową krzywą wzorcową i zmierz miano wirusa zgodnie z wcześniej opisanymi metodami25.</li>
</ol>
7. Transdukcja komarów
<ol>
	<li>Umyj 100 larw 1st instar Ae. albopictus trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie przenieś larwy do zlewki zawierającej 95 ml wody dejonizowanej. Dodać 5 ml zapasów rAaeDV (końcowe stężenie 1,00 x10 10 kopii/ml).</li>
	<li>Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 28 °C, umyć larwy trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie przenieść larwy z powrotem na płytki i regularnie karmić.</li>
	<li>Monitorować poziom ekspresji genów docelowych u larw za pomocą qPCR lub Western blot (reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunkach 3 i 4). 
	UWAGA: Metoda wykrywania sygnału fluorescencji może być wykorzystana do dokładniejszego odizolowania zakażonych larw. Na przykład, aby wykryć sygnały fluorescencyjne od larw zakażonych rekombinowanym wirusem eksprymującym DsRed, larwy można umieścić na szkiełku wklęsłym i obserwować pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym co 8 godzin do 2 dni po zakażeniu. Po wykryciu larw fluorescencyjnych należy je rozdzielić do oddzielnych plastikowych kubków testowych, aby umożliwić późniejszą ciągłą obserwację. Larwy z zainfekowanymi wieloma tkankami można zidentyfikować za pomocą tej metody.</li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.cppah.com/article/S1538-5442(09)00014-5/fulltext">Mosquito-borne diseases.</a> Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).</li>
<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).</li>
<li>Roberts, D. R., Andre, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+issues+in+vector-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance issues in vector-borne disease control.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).</li>
<li>Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+risks+on+the+backs+of+the+poor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing risks on the backs of the poor.</a> Nature medicine. 6, 729-731 (2000).</li>
<li>Volohonsky, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+the+Anti-parasitic+Factor+TEP1+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS pathogens. 13, 1006113(2017).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature communications. 5, 3977(2014).</li>
<li>Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+one+rabbit+out+of+the+hat%3A+Radiation%2C+transgenic+and+symbiont-based+approaches+for+sustainable+management+of+mosquito+and+tsetse+fly+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+tropica%22%5BJournal%5D)">More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations.</a> Acta tropica. 157, 115-130 (2016).</li>
<li>Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvised+microinjection+technique+for+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Improvised microinjection technique for mosquito vectors.</a> The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).</li>
<li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+science%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> Journal of insect science. 13, (Online) 69(2013).</li>
<li>Ward, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+transducing+densovirus+pathogenesis+and+expression+in+Aedes+aegypti+and+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae.</a> Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).</li>
<li>Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densoviruses+for+control+and+genetic+manipulation+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+virus+research%22%5BJournal%5D)">Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes.</a> Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).</li>
<li>Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+the+Aedes+albopictus+parvovirus+%28AaPV%29%2C+a+denso-like+virus%2C+for+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes.</a> Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+non-defective+recombinant+densovirus+vectors+for+microRNA+delivery+in+the+invasive+vector+mosquito%2C+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus.</a> Scientific reports. 6, 20979(2016).</li>
<li>Ortega, M. M., Bouamar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+Designing+MicroRNA+Sponges%3A+From+Construction+to+Stable+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line.</a> Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).</li>
<li>BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/">http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/</a> (2017).</li>
<li>GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e253(2007).</li>
<li>Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densovirus+of+Aedes+aegypti+as+an+expression+vector+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells.</a> Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).</li>
<li>Hu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+human-specific+microRNA+miR-941%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Evolution of the human-specific microRNA miR-941.</a> Nature communications. 3, 1145(2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).</li>
<li>Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+AeDNA+containing+the+insect-specific+toxin%2C+BmK+IT1%2C+displayed+an+increasing+pathogenicity+on+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).</li>
<li>Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serious+overestimation+in+quantitative+PCR+by+circular+%28supercoiled%29+plasmid+standard%3A+microalgal+pcna+as+the+model+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene.</a> PloS one. 5, 9545(2010).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ważne jest, aby pokonać dwie kluczowe bariery, które ograniczają budowę rAaeDV. Pierwszym z nich jest produkcja wadliwego wirusa rekombinowanego. Doniesiono, że MDV może być używany jako wektor do ekspresji obcych genów o odpowiedniej wielkości, takich jak neurotoksyny specyficzne dla owadów skorpionów20 i białko GFP; jednakże, niezależnie od strategii konstrukcyjnej, po wstawieniu lub zastąpieniu ORF MDV genami egzogennymi, wiriony nie mogą tworzyć się niezależnie, chyba że plazmid pomocniczy zostanie kotransfekowany w ...

Choroby przenoszone przez komary, takie jak malaria, gorączka denga, gorączka zika i żółta febra, są głównymi międzynarodowymi problemami zdrowia publicznego, które nadal stanowią znaczną część globalnego obciążenia chorobami zakaźnymi1,2. Konwencjonalne środki owadobójcze, które są stosowane w odpowiedzi na wektory, są głównym elementem zrównoważonej zintegrowanej strategii zwalczania komarów w celu zapobiegania chorobom przenoszonym przez komary. Jednak takie strategie okazały się stosunkowo nieskuteczne lub niepożądane ze względu na związany z nimi negatywny wpływ na środowisko, a także ewolucję odporności w populacjach komarów3,4. Z tych powodów istnieje pilna potrzeba alternatywnych metod zwalczania komarów, a stosowanie metod transgenicznych do produkcji bezpłodnych samców komarów i uwalnianie komarów odpornych na patogeny pojawiły się jako obiecujące nowe strategie kontroli. Aby opracować nowe, skuteczne metody kontroli, takie jak bezpieczne i skuteczne podejścia do dostarczania genów in vivo, konieczna jest kompleksowa analiza funkcji genów komarów.
Bezpośrednia mikroiniekcja plazmidowego DNA, dwuniciowego RNA (dsRNA) lub małego interferującego RNA (siRNA) jest najczęściej stosowaną metodą dostarczania genów in vivo u komarów. W rzeczywistości produkcja transgenicznych szczepów komarów nadal opiera się na procesie mikroiniekcji zarodków5,6,7. Mikroiniekcja ma jednak kilka ograniczeń. Po pierwsze, technika ta jest wymagająca technicznie i obejmuje skomplikowane procedury. Po drugie, wstrzyknięcie powoduje fizyczną zniewagę zarodka, larw, poczwarek i osobnika dorosłego, co bezpośrednio wpływa na żywotność organizmu docelowego. Po trzecie, trudno jest unieruchomić larwy komarów do mikroiniekcji, ponieważ większość z nich żyje w środowisku wodnym i ma charakterystyczny ruch wijący się. Po czwarte, wielkość larw1-2 stopnia jest od 10 do 20 razy mniejsza niż larw 4-go stadium i starszych, a skórki tych pierwszych są delikatniejsze. Cechy te utrudniają manipulowanie larwami1-2 nd w stadium rozwojowym w porównaniu z larwami w starszych stadiach. Łącznie czynniki te przyczyniają się do zmniejszenia wskaźnika przeżywalności larw po wstrzyknięciu (około 5%) w porównaniu z dorosłymi8. Wirusowe systemy dostarczania zostały opracowane w celu pokonania powiązanych barier zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Systemy te mają zalety łatwej manipulacji, wysokiej wydajności transdukcji, długotrwałych i solidnych poziomów ekspresji oraz zdolności do wytwarzania trwałych efektów in vivo. Dlatego systemy dostarczania genów wykorzystujące retrowirusy, lentiwirusy i adenowirusy są szeroko stosowane w liniach komórkowych ssaków i gatunkach modelowych. System ekspresji wirusa Sindbis był wcześniej używany do analizy funkcji genów u dorosłego komara; Pomijając jednak obawy związane z bezpieczeństwem biologicznym, wstrzyknięcie jest nadal niezbędnym procesem w przypadku infekcji wirusowej9. Chociaż podawanie doustne przez moczenie larw w roztworze dsRNA było wcześniej zgłaszane jako wykonalna metoda dostarczania, nie nadaje się do analizy funkcji małego RNA10. Tak więc nadal należy opracować skuteczne metody dostarczania wirusa dla komarów.
Densowirusy komarów (MDV) należą do podrodziny Parvoviridae Densovirinae, a wszystkie oprócz jednego należą do rodzaju Brevidensovirus11. Wiriony MDV są bezotoczkowe i składają się z jednoniciowego genomu DNA (ssDNA) i dwudziestościennego kapsydu (o średnicy 20 nm). Genom wirusa ma rozmiar około 4 kb i jest replikowany w jądrach komórek gospodarza. MDV są stosunkowo stabilne w środowisku i wykazują wąski zakres żywicieli o wysokiej swoistości dla komarów. Wirusy te mają potencjał do rozprzestrzeniania się i utrzymywania się naturalnie w populacjach komarów i mogą atakować prawie wszystkie narządy i tkanki tych owadów, w tym jelito środkowe, kanaliki Malpighiego, ciało tłuszczowe, mięśnie, neurony i gruczoły ślinowe12.
Nienaruszone genomy MDV mogą być subklonowane do wektorów plazmidowych w celu wytworzenia zakaźnych klonów opartych na plazmidach; gdy te klony są dostarczane do komórek komara, genom wirusa jest ekstrahowany z wektora plazmidowego i produkowane są zakaźne cząsteczki wirusa. Ponieważ MDV ma mały genom ssDNA, zakaźne klony są łatwe do zbudowania, a genom wirusa można łatwo manipulować11,13. Te cechy sprawiają, że MDV jest cennym środkiem do badania biologii komarów. Jednakże, ponieważ prawie cała sekwencja genomu wirusa jest niezbędna do proliferacji wirusa, tworzenie rekombinowanego wirusa poprzez zastąpienie lub wstawienie obcych genów powoduje utratę zdolności pakowania i / lub replikacji wirusa, co tworzy barierę dla rozwoju MDV jako wektorów dostarczania genów. W niniejszym artykule informujemy o zastosowaniu sztucznej strategii ekspresji intronu małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania RNA rAaeDV in vivo, który ma zalety łatwej budowy plazmidu i utrzymania funkcjonalnego wirusa, który może wytwarzać stabilną i długotrwałą ekspresję w komórkach gospodarza bez potrzeby stosowania wirusa typu dzikiego. Dodatkowo metoda ta pozwala na łatwą transdukcję larw.
Protokoły dla następujących kroków są opisane w tym badaniu: 1) projektowanie rAaeDVs kodujących kasetę ekspresji intronu małego RNA, 2) produkcja rekombinowanych cząsteczek wirusa przy użyciu linii komórkowej pakującej C6/36, 3) analiza ilościowa liczby kopii genomu rAaeDV bez komórek, oraz 4) zakażenie Ae. albopictus larw poprzez bezpośrednie wprowadzenie wirusa do zbiornika wodnego siedliska larw. Ogólnie rzecz biorąc, prace te wykazały, że określone małe RNA lub geny docelowe mogą ulegać nadekspresji lub powalaniu w larwach komarów przy użyciu opracowanego systemu dostarczania MDV.

<table><tbody><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>System wirówek</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit</td><td>Omega Biotech</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>Agar oczyszczony</td><td>OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>FastAP Termoczuła fosfataza alkaliczna (1 U/&micro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HpaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 (5 U/&mikro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 Chemicznie kompetentna komórka</td><td>Beijing Transgen Biotech</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina&nbsp;</td><td>Pekin Tiangen Biotech</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Promega</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td><td>Pekin Tiangen Biotech</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

Mikroiniekcja in vivo jest najczęściej stosowaną techniką transferu genów do analizy funkcji genów u poszczególnych komarów. Metoda ta wymaga jednak bardziej wymagającej technicznie operacji i wiąże się ze skomplikowanymi procedurami, zwłaszcza w przypadku stosowania u larw ze względu na ich niewielkie rozmiary, stosunkowo cienki i delikatny naskórek oraz wysoką śmiertelność, co ogranicza jej stosowanie. W przeciwieństwie do tego, wektory wirusowe do dostarczania genów zostały opracowane w celu pokonania barier zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Systemy te mają zalety łatwej manipulacji, wysokiej wydajności transdukcji genów, długoterminowego utrzymania ekspresji genów oraz zdolności do wywoływania trwałych efektów in vivo. Zagęszczenia komarów (MDV) to specyficzne dla komarów, małe jednoniciowe wirusy DNA, które mogą skutecznie dostarczać obce kwasy nukleinowe do komórek komarów; Jednak zastąpienie lub wstawienie obcych genów w celu wytworzenia rekombinowanych wirusów zwykle powoduje utratę zdolności pakowania i/lub replikacji, co stanowi barierę dla rozwoju tych wirusów jako wektorów dostarczania.
Niniejszym informujemy o użyciu strategii sztucznej ekspresji intronicznego małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółowe procedury budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV oraz infekcji larwalnej.
To badanie po raz pierwszy pokazuje możliwość opracowania niewadliwego systemu ekspresji rekombinowanego mikro RNA (miRNA) MDV, dostarczając tym samym potężnego narzędzia do funkcjonalnej analizy genów u komarów i ustanawiając podstawy do zastosowania paratransgenezy wirusowej do kontrolowania chorób przenoszonych przez komary. Wykazaliśmy, że larwy Aedes albopictus 1st instar mogą być łatwo i skutecznie zakażone poprzez wprowadzenie wirusa do zbiornika wodnego miejsca rozrodu larw oraz że rozwinięte rAaeDV mogą być wykorzystywane do nadekspresji lub obniżenia ekspresji określonego genu docelowego u larw, zapewniając narzędzie do funkcjonalnej analizy genów komarów.

Strategie konstrukcji rAaeDV  
W celu ekspresji genu DsRed w larwach komarów wygenerowano defektywny wektor rAaeDV. Powstały plazmid zawierał kasetę białka fuzyjnego NS1-DsRed z usuniętym białkiem VP (Rysunek 1A). Zaprojektowano plazmidy rAaeDV zawierające konstrukty ekspresyjne dla miRNA, gąbki miRNA, shRNA oraz amiRNA (pokazane na Rysunku 1B). Przykładowo, w celu nadekspresj...

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza funkcji genów larw komarów z wykorzystaniem rekombinowanego densowirusa komarów jako nośnika genów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące systemów dostarczania opartych na wirusach, takich jak sposób pokonywania powiązanych z nimi barier pozakomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Głównymi zaletami tych technik są łatwość manipulacji, wysoka wydajność transdukcji, długotrwała i stabilna ekspresja oraz zdolność do wywoływania trwałych efektów in vivo.Niniejsza praca wykazała, że określone małe RNA lub geny docelowe mogą być nadeksprimowane lub wyciszone w larwach komarów przy użyciu opracowanego systemu dostarczania opartego na densowirusach. Zastosowanie tej techniki rozszerza możliwości opisanej strategii ekspresji w badaniu biologii komarów, ponieważ metoda ta umożliwia łatwą transdukcję larw. Procedurę zaprezentuje Pei-Wen Liu, doktorant z naszego laboratorium.Należy rozpocząć od zamówienia chemicznej syntezy pełnych sekwencji cDNA dla prekursorów miRNA, gąbek miRNA (miRNA sponges) oraz shRNA, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Po otrzymaniu zamówionego DNA należy odwirować probówk

use-recombinant-mosquito-densovirus-as-gene-delivery-vector-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zastosowanie rekombinowanego densovirusa komarów jako wektora dostarczającego geny do analizy funkcjonalnej genów u larw komarów

Podejścia genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za oporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Jamesa do wstrzykiwania dsRNA samicom komarów A. aegypti, będących nosicielami wirusa dengue. Przedstawiono technikę kalibracji igieł wstrzykujących, obsługi zestawu do iniekcji oraz wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej.

Iniekcja dsRNA do samic komarów A. aegypti

Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za odporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym nosicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.

Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

W tym wywiadzie George Dimopoulos skupia się na mechanizmach fizjologicznych wykorzystywanych przez komary do zwalczania infekcji wywoływanych przez Plasmodium falciparum oraz wirusa dengi. Wyjaśniono, w jaki sposób identyfikuje się u komarów kluczowe geny refrakcyjne, czyli geny nadające odporność na patogeny wektora, oraz jak tę wiedzę można wykorzystać do stworzenia transgenicznych komarów, które nie są w stanie przenosić pasożyta malarii ani wirusa dengi.

Tworzenie lepszego komara: Identyfikacja genów umożliwiających odporność na malarię i gorączkę dengi u komarów A. gambiae i A. aegypti

Oligonukleotydy można wykorzystać do specyficznej lokalnie podstawienia pojedynczego nukleotydu w transfekowanych genach docelowych zarówno w komórkach Anopheles gambiae, jak i Anopheles stephensi.

Transfekcja i mutagenza genów docelowych w komórkach komarów przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych kwasem nukleinowym typu Locked Nucleic Acid

W niniejszym protokole łączymy wyciszanie genów za pomocą RNAi z testem diurezy in vivo, aby zbadać wpływ wyciszenia wybranych genów na wydalanie płynów przez komary.

Wyciszenie genów za pomocą RNAi oraz test diurezy in vivo u dorosłych samic komarów Aedes aegypti

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do modyfikacji ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny, co pozwala na funkcjonalną analizę genetyczną w Anopheles gambiae. Opisane procedury korzystania z tego systemu to częściowo ustandaryzowana strategia klonowania, określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek pod kątem fluorescencyjnych markerów białkowych i utrwalanie zarodków.

Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae

Poznaj metodę analizy funkcji genów w larwach komarów Aedes aegypti przy użyciu rekombinowanego densowirusa jako wektora dostarczania genów. System umożliwia wysoką efektywność transdukcji i trwałą ekspresję genów in vivo.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Przeglądaj więcej filmów