Name: In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę barwienia tetramerów MHC in situ do analizy lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach. Technika ta umożliwia szczegółowe mapowanie przestrzenne komórek T w tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty Publicznej Służby Zdrowia z National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. Dzień 1: Sekcja świeżych tkanek i pierwotna inkubacja
<ol>
	<li>Za pomocą skalpela pokrój świeżą tkankę na małe (około 0,5 cm szerokości i 0,5 cm wysokości) kawałki. Oddzielnie przyklej każdą tkankę do tłoka i zanurz je w 3-5 ml 4% niskotopliwej agarozy w PBS. Oznaczyć tłok informacjami o tkance za pomocą naklejki. Umieść go w schłodzonym uchwycie w wiaderku z lodem, aby stwardniał.</li>
	<li>Włącz mikrotom i ustaw grubość skrawków na 200 μm. Zamontuj żyletkę na mikrotomie i włóż tłok z chusteczką do kąpieli mikrotomowej.</li>
	<li>Przygotować buforowaną fosforanem sól fizjologiczną z heparyną (PBS-H), dodając 100 μg/ml lub 18,7 U/ml heparyny do PBS w celu zachowania RNA i umożliwienia potencjalnych zastosowań ISH w dalszej kolejności. Napełnij kąpiel mikrotomową, przykrywającą osadzoną tkankę, 100 - 120 ml schłodzonego, sterylnego PBS-H. Dodać kostki lodu PBS-H do kąpieli, aby utrzymać temperaturę na poziomie 0 - 2 °C. Uruchom mikrotom i pokrój tkankę na odcinki o wielkości 200 μm. 
	Uwaga: Ważne jest, aby tkanki były schłodzone na lodzie, aby zminimalizować aktywność komórkową w tkankach oraz dlatego, że świeża tkanka jest łatwiejsza do cięcia, gdy jest schłodzona. Sam PBS może być używany, jeśli nie ma planów dotyczących dalszego ISH.</li>
	<li>Alternatywnie, w przypadku tkanek, które nie tną dobrze za pomocą mikrotomu (np. jelita i płuca), użyj skalpela lub żyletki, aby pociąć tkankę na cienkie paski jak najbardziej zbliżone do 200 μm.</li>
	<li>Oznaczyć pokrywę 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych informacjami o próbce doświadczalnej i umieścić komory tkankowe w odpowiednich studzienkach. Za pomocą pędzla przenieś skrawki do komory tkankowej umieszczonej w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 1 ml schłodzonego PBS-H. 
	UWAGA: Komory na tkanki wielokrotnego użytku powinny być wykonane przed rozpoczęciem barwienia. Komory na chusteczki można wykonać przy użyciu 14 ml polipropylenowej rurki zatrzaskowej z okrągłym dnem i siatki drucianej. Użyj ostrej żyletki, aby odciąć spód polipropylenowej rurki z okrągłym dnem o pojemności 14 ml. Wytnij siatkę drucianą w kółko, aby pasowała do otworu w dolnej części rury. Podgrzej okrąg z siatki drucianej za pomocą palnika Bunsena, aż będzie rozgrzany do czerwoności. Bardzo szybko ustaw okrąg siatki drucianej w dół i wepchnij rurkę na siatkę. Sprawdź, czy siatka druciana jest dobrze przymocowana do dna tuby, a następnie ostrożnie odetnij górną część probówki w miejscu oznaczenia 3 ml za pomocą ostrej żyletki. Umieść do 3 skrawków tkanki w każdej komorze tkankowej lub do 1cm2 tkanki na studzienkę. Utrzymuj co najmniej jedną pustą studzienkę między studzienkami z różnymi kombinacjami przeciwciał, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Przystąpić do pierwotnego barwienia tetramerem i przeciwciałami natychmiast po zakończeniu przenoszenia wszystkich wyciętych odcinków do komór tkankowych. Utrzymuj sekcje zanurzone i schłodzone w 1 ml PBS-H przez cały czas.</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanki przez noc z 0,5 μg / ml sprzężonych z FITC, naładowanych peptydami tetramerów MHC-I rozcieńczonych w PBS-H z 2% normalną surowicą kozią (NGS). Uwzględnij mysie lub inne przeciwciała inne niż królicze skierowane przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym będącym przedmiotem zainteresowania w tej inkubacji (np. szczurze przeciwciała anty-CD8 rozcieńczone w stosunku 1:500 w PBS-H z 2% NGS). Umieścić 1 ml rozcieńczonych przeciwciał w każdym dołku. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność przy wyborze przeciwciał CD8, ponieważ niektóre z nich mogą wzmacniać, a inne hamować wiązanie tetramerów MHC z receptorami komórek T4,21. Opisane tutaj szczurze przeciwciało anty-ludzkie CD8 jest niestabilne i czasami powoduje nieco słabe barwienie. Jest on tutaj używany do potrójnego znakowania, ponieważ jest to jedyne testowane przeciwciało CD8 nie-królików i myszy, które barwiło limfocyty T CD8 makaka rezusa.</li>
	<li>Użyć 1 ml roztworu na studzienkę dla przeciwciała pierwotnego i wszystkich kolejnych inkubacji, a następnie przeprowadzić tę i wszystkie kolejne inkubacje w temperaturze 4 °C, z płytkami na platformie kołyszącej. 
	UWAGA: Chusteczki powinny swobodnie unosić się w komorze.</li>
</ol>
2. Dzień 2: Fiksacja i wtórna inkubacja
<ol>
	<li>Po wstępnej inkubacji przemyć skrawki dwukrotnie 1 ml schłodzonego PBS-H przez 20 minut każde płukanie. W tym celu należy przenieść komory tkankowe na inną 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą 1 ml schłodzonego PBS-H w odpowiednich studzienkach. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie kapać zawartości z jednej próbki doświadczalnej do drugiej podczas przemieszczania się między komorami tkankowymi. We wszystkich kolejnych inkubacjach i przemyciach należy w podobny sposób przenieść komorę tkankową na czystą płytkę zawierającą odpowiedni roztwór. Należy pamiętać o monitorowaniu skrawków w komorach tkankowych podczas zabiegu, aby upewnić się, że skrawki nie przyklejają się do boków komór tkankowych. Jeśli tak, wepchnij je z powrotem do roztworu.</li>
	<li>Utrwal skrawki 1 ml świeżego 4% paraformaldehydu buforowanego PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (nie należy przesadzać). Myć zimnym PBS-H dwa razy przez 5 min. 
	Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny; Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 
	UWAGA: Jeśli do wykrycia epitopów wewnątrzkomórkowych potrzebne jest pobieranie i przenikanie antygenu, antygeny można odzyskać, gotując skrawki w moczniku o stężeniu 0,01 mola po utrwaleniu paraformaldehydu.</li>
	<li>Przenieść skrawki na 24-dołkowe płytki hodowlane zawierające 0,01 mola mocznika i umieścić te płytki w kuchence mikrofalowej. Gotuj sekcje trzy razy przez około 10 s każda, co daje w sumie 30 s. 
	UWAGA: Bądź bardzo ostrożny, ponieważ gotowanie roztworu może wypchnąć sekcje ze studzienek. Jeśli tak się stanie, za pomocą pędzla wepchnij skrawki z boków komory na chusteczki lub z pokrywy płytki z powrotem na dno odpowiedniej komory na tkanie.</li>
	<li>Przed drugorzędową inkubacją przeciwciał należy przepuścić i zablokować skrawki tkanki, inkubując je w roztworze blokującym zawierającym PBS-H, 0,3% detergent (PBS-H-T) i 2% NGS na kołysce przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Wykonać kolejne inkubacje przeciwciał z PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>Do inkubacji wtórnej przenieść skrawki z komór tkankowych do studzienek zawierających królicze przeciwciało anty-FITC rozcieńczone w stosunku 1:10 000 w PBS-H-T/2% NGS. Inkubować przez noc.</li>
	<li>Wykonaj barwienie przeciwstawne za pomocą mysiego przeciwciała anty-CD20 rozcieńczonego w stosunku 1:200 w PBS-H-T / 2% NGS. W przypadku tej opcji w razie potrzeby pobierz epitopy, przeniknij komórki i zablokuj przed tą inkubacją, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
3. Dzień 3: Inkubacja trzeciorzędowa
<ol>
	<li>Po drugiej inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie w PBS-H w temperaturze 4 °C przez co najmniej 20 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić końcową inkubację z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie (np. kozie przeciwciała przeciwko królikowi sprzężone zielonkawożółte, kozie przeciwciała anty-szczurze sprzężone daleko-czerwony barwnik i kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z zielonym barwnikiem rozcieńczone odpowiednio 1:5 000, 1:5 000 i 1:2 000 w PBS-H-T / 2% NGS). Inkubować przez noc. 
	UWAGA: W tym momencie inkubację można w razie potrzeby przedłużyć do trzech dni. Skrawki należy chronić przed światłem, owijając płytki folią aluminiową podczas tego etapu inkubacji, a następnie w miarę gaszenia fluoroforów światłem.</li>
</ol>
4. Dzień 4: Montaż sekcji
<ol>
	<li>Umyć sekcje trzy razy w PBS-H przez co najmniej 20 min. 
	UWAGA: Jeśli planujesz dalszy ISH19, umocuj skrawki w 4% paraformaldehydzie przez 1 godzinę, aby zabezpieczyć tetramery i przeciwciała na miejscu, a następnie przemyj skrawki dwukrotnie PBS-H przez 5 minut każda. 
	Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Użyj pędzla, aby przenieść skrawki na szkiełko mikroskopowe. Uważaj, aby nie szturchać tkanki zbyt mocno. Pokryć każdą sekcję glicerolem/żelatyną zawierającą 4 mg/ml galusanu n-propylu lub innym podłożem montażowym zawierającym środek konserwujący fluorofor. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Przechowywać szkiełka w zabezpieczonym przed światłem pojemniku na szkiełka w temperaturze -20 °C. Wypłukać płytki do hodowli tkankowych i usunąć etykiety z pokrywek za pomocą alkoholu. 
	UWAGA: Płyty mogą być ponownie użyte.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazów z mikroskopu konfokalnego
<ol>
	<li>Rejestruj obrazy o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając odpowiednich laserów i filtrów dla każdego fluoroforu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A i B). 
	UWAGA: W tym przykładzie użyto mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów). Obrazy zebrano za pomocą lasera 561 nm o mocy 20% dla zielonkawo-żółtych komórek T specyficznych dla antygenu, lasera 488 nm o mocy 10% dla komórek B z ekspresją CD20 znakowanych na zielono oraz lasera 640 nm o mocy 15% dla komórek T CD8 znakowanych na czerwono. Zastosowano obiektyw 20X i aperturę numeryczną 0,8.</li>
	<li>Sekwencyjnie zbieraj serie Z w odstępach 3 μm (lub innych) w trzech kanałach w wielu polach o rozdzielczości 800 x 800 pikseli. Skonstruuj montaż zebranych pól (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C-E). Nazwij każdy obraz montażowy na podstawie informacji z odpowiedniego slajdu i zapisz do analizy.</li>
	<li>Wykonaj ilościową analizę obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy i kwantyfikacji mikroskopu konfokalnego lub za pomocą ImageJ.</li>
</ol>
6. Ilościowa analiza obrazu
UWAGA: Ilościowa analiza obrazu może być przeprowadzona za pomocą oprogramowania do analizy i kwantyfikacji mikroskopu konfokalnego lub za pomocą oprogramowania ImageJ. Tutaj jako przykład użyto ImageJ.
<ol>
	<li>Otwórz montaż konfokalny, przeciągając go do okna ImageJ (Rysunek 2A). 
	UWAGA: ImageJ może bezpośrednio otwierać montaże zebrane przez wiele różnych mikroskopów konfokalnych. Jeśli montaż nie może zostać otwarty bezpośrednio przez ImageJ, wyeksportuj wybrany z-scan jako plik TIFF, aby go otworzyć.</li>
	<li>Zduplikuj wybrany z-scan do analizy ("Obraz"-> "Duplikat") (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Podziel różne kanały ("Obraz"-> "Kolor"-> "Podziel kanały") (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Narysuj ROI do analizy ilościowej w odpowiednim kanale, aby był obiektywny i dodaj go do menedżera ROI, naciskając "T" na klawiaturze. Zmierz powierzchnię. 
	UWAGA: Menedżer ROI ImageJ pokazuje obszar w μm2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast fluorescencji analizowanego kanału ("Obraz" -> "Dostosuj" -> "Jasność/Kontrast") (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Spłaszcz ROI na obrazie ("Menedżer ROI" -> "Spłaszcz") (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Określ ilościowo dodatnie komórki na obrazie za pomocą narzędzia "Wielopunktowy" (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2G).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

IST w połączeniu z IHC stanowi niezbędne narzędzie do wykrywania, charakteryzowania i ilościowego oznaczania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 w środowiskach natywnych w kontekście innych komórek i struktur tkankowych. Tutaj opisaliśmy szczegółowe procedury IST w połączeniu z IHC, a następnie ilościową analizę obrazu w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w węzłach chłonnych makaków rezusów. Podobne barwienie można zastosować do tkanek ludzkich, mysich ...

T limfocyty są kluczowe dla wielu procesów immunologicznych, w tym wykrywania i eliminowania komórek zakażonych wirusem, zapobiegania autoimmunizacji, wspomagania produkcji przeciwciał przez komórki B i plazmatyczne oraz wykrywania i eliminowania komórek rakowych. Opracowanie barwienia tetramerem peptyd/MHC klasy I limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu 1 oraz niedawny rozwój barwienia tetramerów MHC klasy II limfocytów T CD42 za pomocą cytometrii przepływowej zrewolucjonizowały naszą zdolność do badania i zrozumienia immunobiologii limfocytów T. Chociaż cytometria przepływowa jest niezwykle przydatna do określania ilości i fenotypu limfocytów T specyficznych dla antygenu, nie pozwala na wykrycie przestrzennej lokalizacji limfocytów T specyficznych dla antygenu do innych komórek i struktur w tkankach, a obecne techniki dezagregacji w celu ekstrakcji limfocytów T potrzebnych do cytometrii przepływowej mają ograniczoną skuteczność w tkankach nielimfatycznych3.
My i inni opracowaliśmy metody wykorzystujące peptydowe odczynniki tetramerowe lub multimerowe MHC klasy I i II do barwienia specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i CD4 w tkankach4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Te metody IST pozwalają na określenie lokalizacji, liczebności i fenotypu specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i CD4 w tkankach oraz zapewniają środki do wykrywania tych komórek w stosunku do innych komórek i struktur w tkankach. Nasza grupa szeroko wykorzystała barwienie tetramerem MHC-I do badania limfocytów T CD8 specyficznych dla ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) i małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV) w tkankach limfoidalnych, narządów płciowych i odbytnicy, aby zrozumieć immunopatogenezę HIV i SIV oraz zidentyfikować korelaty skutecznych strategii szczepień14,15,16,17. Ponadto opracowaliśmy również technikę, która łączy IST z hybrydyzacją in situ (ISH) w celu lokalizacji i ilościowego określenia specyficznych dla wirusa limfocytów T CD8 i komórek zakażonych wirusem w tkankach oraz określenia poziomów in vivo efektor-docelowy 18,19.
Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący tetramery MHC-I z peptydami do barwienia specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 w świeżych skrawkach tkanek, do przeciwdziałania barwieniu tkanek za pomocą IHC oraz do ilościowego oznaczania komórek o określonych fenotypach w określonych przedziałach tkankowych. Procedury te są takie same, jak te, które zostały zastosowane w naszej niedawnej publikacji Li i wsp., w której określiliśmy lokalizację, liczebność i fenotyp limfocytów T specyficznych dla SIV w tkance limfatycznej podczas przewlekłego zakażenia SIV u makaków20.
W tej procedurze, świeże tkanki są cięte i inkubowane przez noc z tetramerami MHC-I naładowanymi peptydami sprzężonymi z cząsteczkami tiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Następnie utrwala się je w paraformaldehydzie. Po utrwaleniu tkanki sygnał z tetramerów MHC jest amplifikowany za pomocą króliczych przeciwciał anty-FITC i inkubowany z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami anty-króliczymi IgG, które dodatkowo wzmacniają sygnał z związanych tetramerów. IHC jest stosowany w połączeniu z IST do charakteryzowania limfocytów T specyficznych dla antygenu i otaczających komórek. Przeciwciała, które rozpoznają epitopy na powierzchni komórek lub w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, są włączane do pierwotnej inkubacji z tetramerami. Przeciwciała, które rozpoznają epitopy wewnątrzkomórkowe, wymagają przenikania przez ścianę komórkową przed barwieniem. Wybarwione skrawki tkanek są obrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego i analizowane za pomocą oprogramowania konfokalnego. Znakowane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą oprogramowania do mikroskopii konfokalnej lub ImageJ. Opisany protokół może być stosowany do barwienia zasadniczo każdej specyficznej dla antygenu limfocytu T CD8 w dowolnej tkance, dla której dostępne są tetramery MHC-I.

<table><tbody><tr><td>Monomer MHC-I</td> Zakład <td></td><td>rdzeniowy tetrameru NIH</td><td>Materiały do przygotowania tetrameru MHC</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materiały do przygotowania tetrameru MHC</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SLBL6391V</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna glicerolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>galusan n-propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Przeciwciało niestabilne, stosować jednorazową zamrożoną podwielokrotność</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Wektor</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>koza-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Szybki zestaw kleju błyskawicznego</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z płaskim dnem</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Brzytwa&nbsp; ostrze</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel z piór</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel okrągły #2</td><td>PRINCETON ART & SZCZOTKA CO.</td><td>4350R</td><td>Może przycinać w razie potrzeby za pomocą maszynki do golenia</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ barwienie tetrameru mhc i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów t cd8 specyficznych dla antygenu w tkankach

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T limfocyty są kluczowe dla wielu procesów immunologicznych, w tym wykrywania i eliminowania komórek zakażonych wirusem, zapobiegania autoimmunizacji, wspomagania produkcji przeciwciał przez komórki B i plazmatyczne oraz wykrywania i eliminowania komórek rakowych. Rozwój barwienia tetramerem MHC limfocytów T specyficznych dla antygenu analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej zrewolucjonizował naszą zdolność do badania i zrozumienia immunobiologii limfocytów T. Chociaż cytometria przepływowa jest niezwykle przydatna do określania ilości i fenotypu limfocytów T specyficznych dla antygenu, nie może określić przestrzennej lokalizacji limfocytów T specyficznych dla antygenu do innych komórek i struktur w tkankach, a obecne techniki dezagregacji w celu ekstrakcji limfocytów T potrzebnych do cytometrii przepływowej mają ograniczoną skuteczność w tkankach nielimfatycznych. In situ Barwienie tetramerem MHC (IST) to technika wizualizacji limfocytów T, które są specyficzne dla antygenów będących przedmiotem zainteresowania w tkankach. W połączeniu z immunohistochemią (IHC), IST może określić liczebność, lokalizację i fenotyp specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i CD4 w tkankach. W tym miejscu opisujemy protokół barwienia i zliczania limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu, ze specyficznymi fenotypami zlokalizowanymi w określonych przedziałach tkankowych. Procedury te są takie same, jak te, które zastosowaliśmy w naszej niedawnej publikacji Li i wsp., zatytułowanej "Komórki wytwarzające małpiego wirusa niedoboru odporności w pęcherzykach są częściowo tłumione przez komórki CD8 + in vivo."Opisane metody mają szerokie zastosowanie, ponieważ można je stosować do lokalizacji, fenotypu i ilościowego oznaczania zasadniczo każdej specyficznej dla antygenu komórki T CD8, dla której dostępne są tetramery MHC, w dowolnej tkance.

Rycina 1 pokazuje, jak pozyskiwać obrazy konfokalne przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Rycina 2 prezentuje ilościową analizę obrazu z wykorzystaniem programu ImageJ. Ryciny 3 i 4 należy przedstawić reprezentatywne obrazy tkanek węzłów chłonnych pobranych od zakażanego SIV makaka rezusa, barwionych tetramerami MHC, przeciwciałami CD8 oraz przeciwciałami CD20, aby wykazać specyficzność barwienia ...

Tutaj opisujemy metodę, która łączy barwienie in situ MHC-tetrameru z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, fenotypu i ilości limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkankach. Protokół ten służy do określania charakterystyki przestrzennej i fenotypowej limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w stosunku do innych typów komórek i struktur w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie lokalizacji, liczebności oraz fenotypu antygenowo swoistych limfocytów T CD8+ w badanych tkankach. Metoda ta pozwala na szybkie uzyskanie odpowiedzi na pytania dotyczące limfocytów T CD8+, umożliwiając lokalizację, kwantyfikację i charakterystykę fenotypową praktycznie każdego antygenowo swoistego limfocytu T CD8+ w dowolnej tkance. Główną zaletą tej techniki jest możliwość określenia rozkładu przestrzennego antygenowo swoistych limfocytów T CD8+ w odniesieniu do innych komórek i struktur w badanych tkankach.Procedurę w wykonaniu Shengbin Li zademonstruje Gwantwa Mwakalundwa. Pierwszego dnia procedury należy użyć skalpela, aby pociąć świeżą tkankę na kawałki o wielkości około 0,5 x 0,5 centymetra. W tym przypadku pokazano tkankę śledziony makaka rezusa.Każdy fragment tkanki należy osobno przykleić do środka górnej części tłoka, a następnie zatopić próbki w trzech do pięciu mililitrów ciepłej 4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w PBS. Tłoki należy opisać, podając odpowiednie informacje o tkankach. Następnie próbki należy umieścić w chłodzonym uchwycie w pojemniku z lodem.Po zestaleniu agaru włącz mikrotom i ustaw grubość cię

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.<br...

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Protokół wykrywania samoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu poprzez bezpośrednie barwienie głównymi dekstramerami klasy II kompleksu zgodności tkankowej został opisany w tym raporcie. Do kompleksowej analizy opracowano również wiarygodną metodę wyliczania częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu in situ.

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do liczenia i charakteryzowania limfocytów T CD8+ makaków rezusów przeciwko wirusowi AIDS. Ten artykuł jest przydatny nie tylko w dziedzinie immunologii HIV, ale także w innych obszarach badań biomedycznych, w których wiadomo, że odpowiedzi limfocytów T CD8 + wpływają na wynik choroby.

Analiza limfocytów T CD8 + specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.

Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Poznaj metodę barwienia tetramerów MHC in situ do analizy lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach. Technika ta umożliwia szczegółowe mapowanie przestrzenne komórek T w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach (Wideo) | JoVE Journal

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Przeglądaj więcej filmów