In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Ogólnym celem tej procedury jest określenie lokalizacji, liczebności i fenotypu specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8-dodatnich w tkankach będących przedmiotem zainteresowania. Ta metoda pomaga odpowiedzieć na szybkie pytania dotyczące limfocytów T CD8, zapewniając środki do lokalizacji, kwantyfikacji i fenotypowania praktycznie każdej specyficznej dla antygenu komórki T CD8 i dowolnej tkanki. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona określenie przestrzennego rozmieszczenia limfocytów T CD8-dodatnich specyficznych dla antygenu w stosunku do innych komórek i struktur w tkankach będących przedmiotem zainteresowania.

Demonstracją procedury z Shengbin Li będzie Gwantwa Mwakalundwa. W pierwszym dniu zabiegu za pomocą skalpela pokrój świeżą tkankę na kawałki o wymiarach około 0,5 x 0,5 centymetra. Tutaj pokazana jest tkanka śledziony makaka rezusa.

Oddzielnie przyklej każdy fragment tkanki do środka górnej części tłoka i zanurz próbki w trzech do pięciu mililitrach ciepłej 4% niskotopliwej agarozy w PBS. Oznaczyć tłoki odpowiednimi informacjami dotyczącymi tkanek. Następnie umieść próbki w schłodzonym uchwycie w wiaderku na lód.

Gdy agar zastygnie, włącz mikrotom i ustaw grubość na 200 mikrometrów. Po zainstalowaniu nowej żyletki włóż tłoki do kąpieli mikrotomowej. Napełnij kąpiel mikrotomową 100 do 200 mililitrami świeżo przygotowanego PBS-H i dodaj kostki lodu PBS-H, aby utrzymać temperaturę od zera do dwóch stopni Celsjusza.

Po uzyskaniu skrawków o długości 200 mikrometrów należy za pomocą pędzla usunąć agar otaczający każdą sekcję i przenieść próbki do indywidualnych komór tkankowych w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej jeden mililitr schłodzonego PBS-H. Po pobraniu wszystkich próbek inkubować skrawki tkanek przez noc w jednym mililitrze dopasowanych tetramerów MHC klasy pierwszej naładowanych sprzężonymi peptydami, rozcieńczonych w PBS-H uzupełnionych 2% normalną surowicą kozią w temperaturze czterech stopni Celsjusza z kołysaniem. Następnego ranka przenieść każdą komorę tkankową do indywidualnych dołków nowej 24-dołkowej płytki zawierającej jeden mililitr świeżo schłodzonego PBS-H przez 20 minut.

Po drugim praniu utrwal sekcje w jednym mililitrze świeżego 4% paraformaldehydu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie dwa pięciominutowe mycia w zimnym PBS-H. Przenieś skrawki do nowej 24-dołkowej płytki zawierającej 0,01 molowego mocznika i mikrofaluj skrawki trzy razy przez około 10 sekund za każdym razem, aż mocznik się zagotuje.

Aby przeniknąć i zablokować próbki, należy inkubować skrawki w roztworze blokującym zawierającym PBS-H uzupełnionym 0,3% detergentem triton x100 i 2% normalną surowicą kozią na bujaczku przez jedną godzinę, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przenieść komory tkankowe do indywidualnych studzienek nowej 24-dołkowej płytki zawierającej jeden mililitr roztworu zawierającego królicze przeciwciało anty-fitc, mysie przeciwciało anty-ludzkie CD3 i szczurze przeciwciało anty-ludzkie. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z kołysaniem.

W trzecim dniu przemyć skrawki trzy razy w świeżym PBS-H w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut na pranie i przeprowadzić końcową inkubację z odpowiednimi fluorescencyjnymi sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi przez okres do trzech dni, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji przeciwciał trzeciorzędowych przepłukać próbki trzema 20-minutowymi płukaniami w świeżym PBS-H i za pomocą pędzla przenieść próbki z każdej komory tkankowej na szklane szkiełko mikroskopowe. Pokryć każdą sekcję podłożem montażowym uzupełnionym fluoroforowym środkiem konserwującym i przykryć próbki szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie przechowuj szkiełka w pojemniku na szkiełka zabezpieczone przed światłem, w temperaturze 20 stopni Celsjusza. W dniu obrazowania należy umieścić pierwsze szkiełko podstawowe na stoliku mikroskopu konfokalnego i dobrać odpowiednie lasery i filtry do każdego fluoroforu użytego do znakowania próbki tkanki. Korzystając z obiektywu 20x, sekwencyjnie uzyskaj serię z w odstępach trzech mikronów w każdym z kanałów fluoroforowych, w wielu polach pikseli 800 x 800.

Następnie skonstruuj montaż zebranych pól i zapisz każdy obraz montażu z nazwą opartą na odpowiedniej próbce tkanki. Na tych reprezentatywnych obrazach wycinek wybarwiony tetramerami MHC klasy pierwszej załadowanymi peptydem SIV jest porównywany z odcinkiem tej samej tkanki, wybarwionym tetramerami MHC klasy pierwszej załadowanymi nieistotnym peptydem, co pokazuje specyficzność barwienia tetrameru. Na tych obrazach specyficzne dla wirusa limfocyty T wybarwione tetramerem MHC klasy pierwszej załadowanym peptydem SIV, współbarwią CD8, marker podzbioru limfocytów T, ale nie CD20, białko powierzchniowe komórki ulegające ekspresji na komórkach B.

Ten montaż został stworzony dla wielu konfokalnych pól serii z, które wykorzystano do ilościowego oznaczania komórek barwionych tetramerem o określonych fenotypach i różnych przedziałach anatomicznych w węźle chłonnym. Ten powiększony obraz podkreśla obszar węzła chłonnego montażowego, który zawiera pęcherzyk komórkowy B wyznaczony przez barwienie IGM. Komórki barwione tetramerem MHC klasy pierwszej, z których niektóre wykazywały współekspresję markera aktywacji i proliferacji limfocytów T, KI67 można wykryć wewnątrz i na zewnątrz pęcherzyka limfocytów B.

Ta kombinacja barwienia umożliwia określenie statusów aktywacji i proliferacji limfocytów T CD8-dodatnich specyficznych dla SIV, a także ich lokalizacji w wtórnych tkankach limfatycznych. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu około pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że świeża tkanka ma kluczowe znaczenie dla udanego barwienia.

Próbki należy przetworzyć w ciągu 24 godzin lub krócej po zbiorach, przechowując je w chłodzie do czasu utrwalenia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić barwienie tetramerem i immunohistochemię w celu określenia lokalizacji, obfitości i fenotypu limfocytów T CD8-dodatnich specyficznych dla antygenu w tkankach będących przedmiotem zainteresowania. Nie zapominaj, że praca z czynnikami zakaźnymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności zapobiegające narażeniu, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej i ograniczanie używania ostrych narzędzi.