Name: Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metody genetyczne do analizy zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy. Technika ta poprawia badania ekologii troficznej i interakcji sieci pokarmowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Silke Classen z Instytutu Badawczego Analizy i Oceny Ekosystemów (gaiac), RWTH Aachen za pomoc w ustanowieniu specyficznych dla grupy zestawów starterów używanych w tym protokole. Dziękujemy również Peterowi Martinowi i Laurze Schynawa z Uniwersytetu w Kilonii za współpracę przy eksperymentach z roztoczami wodnymi. Dziękujemy również asystentom laboratoriów technicznych za dbanie o sprawne działanie laboratorium oraz przygotowanie rejestru firm i numerów katalogowych. Prace te były wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG; projekt GE 2219/3-1).

<ol><li>Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolution+in+food+web+analysis+and+trophic+ecology%3A+diet+analysis+by+DNA+and+stable+isotope+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis.</a> Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).</li>
<li>Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+accounting+for+fish+using+combined+DNA+and+stable+isotope+analyses+in+a+regulated+lowland+river+weir+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool.</a> Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).</li>
<li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2427.2004.01328.x/full">Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones.</a> Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).</li>
<li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1890/04-138/abstract">Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies.</a> Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).</li>
<li>Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/259188892_Chapter_Three_-_Empirically_characterising_trophic_networks_what_emerging_DNA-based_methods_stable_isotope_and_fatty_acid_analyses_can_offer">Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer.</a> Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).</li>
<li>Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/292536291_Feeding_habits_of_the_spiny_lobster_Panulirus_interruptus_Randall_1840_in_Bahia_Tortugas_Baja_California_Sur">Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur.</a> Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).</li>
<li>Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002209819602730X">Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).</li>
<li>Akin, S., Winemiller, K. O. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF02784282?LI=true">Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary.</a> Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).</li>
<li>Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+approach+to+identify+prey+of+the+southern+rock+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Entomol+Res%22%5BJournal%5D)">A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster.</a> Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).</li>
<li>Gergs, R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/30019761_Dreissena_polymorpha_in_Lake_Constance_An_example_of_a_keystone_engineer">Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer?</a> Universität Konstanz. , (2009).</li>
<li>Sheppard, S. K., Harwood, J. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Samuel_Sheppard2/publication/227994386_Advances_in_molecular_ecology_Tracking_trophic_links_through_predator-prey_food-webs/links/0deec519bc75aa375c000000.pdf">Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs.</a> Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).</li>
<li>Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide+primers+for+PCR+amplification+of+coelomate+introns%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns.</a> Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).</li>
<li>Verma, S. K., Singh, L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1471-8286.2003.00340.x/abstract">Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application.</a> Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).</li>
<li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+scatology+as+a+tool+to+study+diet%3A+analysis+of+prey+DNA+in+scats+from+captive+Steller+sea+lions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions.</a> Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).</li>
<li>Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group-specific+polymerase+chain+reaction+for+DNA-based+analysis+of+species+diversity+and+identity+in+dietary+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples.</a> Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).</li>
<li>Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1471-8286.2005.01172.x/full">Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica.</a> Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).</li>
<li>Hayashi, K., Yandell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8257985">How sensitive is PCR-SSCP?</a> Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).</li>
<li>Glavač, D., Dean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+single-strand+conformation+polymorphism+%28SSCP%29+technique+for+detection+of+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations.</a> Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).</li>
<li>Mülhardt, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%BClhardt%2C+C+%22Der+Experimentator+Molekularbiologie+%2F+Genomics%22">Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics</a>. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).</li>
<li>Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+SV+%22Gel+Electrophoresis+-+Principles+and+Basics%22">Gel Electrophoresis - Principles and Basics</a>. , InTech. (2012).</li>
<li>Wang, X. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/60628">A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles.</a> Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).</li>
<li>Gemmer, I., Gergs, R. <a target="_blank" href="https://pubag.nal.usda.gov/catalog/612063">Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda).</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).</li>
<li>Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+set+of+multiplex+assays+%28SalPrint15%29+for+efficient+analysis+of+15+microsatellite+loci+of+contemporary+samples+of+the+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar).</a> Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).</li>
<li>Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. <a target="_blank" href="https://www.kmae-journal.org/articles/kmae/abs/2006/01/kmae2006380-381p977/kmae2006380-381p977.html">First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes.</a> Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).</li>
<li>Koester, M., Gergs, R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/265367886_No_evidence_for_intraguild_predation_of_Dikerogammarus_villosus_Sowinsky_1894_at_an_invasion_front_in_the_Untere_Lorze_Switzerland">No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland.</a> Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).</li>
<li>Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+LSU+rDNA+D1-D2+sequences+for+their+use+in+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Zool%22%5BJournal%5D)">An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification.</a> Front Zool. 4 (6), 6(2007).</li>
<li>Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10750-015-2558-9">Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system?</a> Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).</li>
<li>Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12686-013-9998-1">Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates.</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).</li>
<li>Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+detection+of+prey+DNA+in+Hygrobates+fluviatilis+%28Hydrachnidia%2C+Acari%29%3A+a+new+approach+for+determining+predator-prey+relationships+in+water+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Appl+Acarol%22%5BJournal%5D)">First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites.</a> Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).</li>
<li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Seabird+Diet+through+Genetic+Analysis+of+Faeces%3A+A+Case+Study+on+Macaroni+Penguins+%28Eudyptes+chrysolophus%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus).</a> PLoS One. 2 (9), e831(2007).</li>
<li>Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group-Specific+Multiplex+PCR+Detection+Systems+for+the+Identification+of+Flying+Insect+Prey%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey.</a> PLoS One. 9 (12), e115501(2014).</li>
<li>Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+PCR+detection+of+prey+in+molecular+diet+studies%3A+importance+of+group-specific+primer+set+selection+and+extraction+protocol+performances%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).</li>
<li>Vestheim, H., Jarman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+primers+to+enhance+PCR+amplification+of+rare+sequences+in+mixed+samples+-+a+case+study+on+prey+DNA+in+Antarctic+krill+stomachs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Zool%22%5BJournal%5D)">Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs.</a> Front Zool. 5 (1), 12(2008).</li>
<li>Harper, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+invertebrate+predators+for+multiple+prey+DNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets.</a> Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy łatwą i opłacalną metodę określania interakcji drapieżnik-ofiara na podstawie PCR na podstawie próbek terenowych za pomocą starterów specyficznych dla grupy dla regionów rDNA, które można łączyć z innymi niemolekularnymi analizami tych samych próbek. W protokole istnieje jednak kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, niezbędne jest zapewnienie specyfiki stosowanych podkładów. Po drugie, kluczowe jest uniknięcie zanieczyszczenia i utraty materiału jelitowego podczas przygotowania przewodu pokarm...

Interakcje drapieżnik-ofiara, które stanowią większość interakcji troficznych i dynamiki sieci pokarmowej, są kluczowymi aspektami do scharakteryzowania przepływów materii i energii w sieciach pokarmowych wewnątrz i pomiędzy ekosystemami, co jest jednym z głównych celów ekologii1. Określenie źródła i przepływu węgla i składników odżywczych pogłębia wiedzę na temat ekologicznych połączeń między ekosystemami2. Jednak ekosystemy, takie jak rzeki i ich zlewnie, są połączone nie tylko przez przepływy materii organicznej i składników odżywczych, ale także przez ruchy organizmów3. Tak więc zmiany siedlisk przerywające przepływ zasobów łączących te systemy mogą silnie zmienić sieci pokarmowe obu ekosystemów, nie tylko bezpośrednio, ale także pośrednio, zmieniając odpowiedni skład społeczności drapieżników i ofiar. Na przykład wykazano, że zmiany w sieciach pokarmowych są związane z przemieszczaniem się pojedynczych gatunków drapieżników (np. pstrąga tęczowego)4. Takie zmiany mogą zagrażać różnorodności biologicznej i funkcjonowaniu ekosystemów wodnych. Dlatego analiza interakcji drapieżnik-ofiara w terenie jest niezbędna do określenia wpływu zmian środowiskowych wywołanych przez człowieka, takich jak praktyki gospodarki wodnej, na rodzimą różnorodność biologiczną ekosystemów wodnych.
Ponieważ śledzenie powiązań troficznych jest trudne w złożonych systemach, ustalono kilka podejść, które umożliwiają ocenę interakcji żywieniowych w terenie5. Tradycyjnie, badania interakcji żywieniowych w terenie opierają się na wizualnej identyfikacji szczątków ofiar w wypreparowanych jelitach i wymagają rozległej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej ofiar. Wizualne analizy zawartości jelit dostarczyły informacji na temat wykorzystania zasobów przez kilka grup konsumentów (np. sezonowe różnice w diecie homarów6 i fish7,8 lub preferencje żywieniowe widłonogów). Jednak fizyczny proces trawienia sprawia, że wizualna analiza treści jelitowej jest trudna i zwykle pomija miękkie ciała ofiary9. W przypadku gatunków żywiących się płynem lub niektórych bezkręgowców, które intensywnie rozdrabniają pokarm przed spożyciem, takich jak obunogi, wizualna identyfikacja gatunków ofiar w treści jelit jest niemożliwa10. Ze względu na te ograniczenia analiza molekularna stanowi obiecującą alternatywę.
Analizy molekularne stały się teraz powszechnym narzędziem umożliwiającym szybkie i precyzyjne wykrywanie zdobyczy w zawartości jelit. Zakres takich technik jest różnorodny: często stosuje się strategie oparte na przeciwciałach monoklonalnych lub reakcjach łańcuchowych polimerazy (PCR), ze względu na ich wysoką swoistość i czułość11. Opracowanie nowych przeciwciał monoklonalnych jest czasochłonne i kosztowne, dlatego zastosowanie innych technik molekularnych jest bardziej przydatne, gdy przeciwciała jeszcze nie istnieją11. Innym powszechnym podejściem jest amplifikacja regionów kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), takich jak geny rybosomalnego kwasu rybonukleinowego (RNA) obecne u większości gatunków, przy użyciu uniwersalnych zestawów starterów12,13. Podczas korzystania z tej techniki często nie jest możliwe zidentyfikowanie całego zakresu organizmów drapieżnych w mieszanych źródłach DNA14. Skutecznym podejściem do uniknięcia takiej wady jest stosowanie specyficznych dla grupy zestawów starterów do analiz genetycznych treści jelitowych. Zaprojektowane tak, aby amplifikować tylko regiony DNA określonych grup docelowych i wykluczać wszystkie inne gatunki15,16, startery specyficzne dla grupy umożliwiają identyfikację organizmów drapieżnych na poziomie taksonomicznym określonych grup bez czasochłonnych i kosztownych analiz wtórnych. Jednak, podobnie jak wszystkie analizy zawartości jelit, takie analizy dostarczają tylko migawki zachowań żywieniowych. Dlatego połączenie molekularnych analiz zawartości jelit z analizami naturalnych znaczników integrujących czas (np. stabilnych izotopów) jest uważane za korzystne1,2.
Tutaj opisujemy szczegółową metodę badań interakcji drapieżnik-ofiara opartej na PCR, przy użyciu specyficznych dla grupy zestawów starterów dla regionów jądrowego rybosomalnego DNA (rDNA), które mają być połączone z analizami stabilnych izotopów tego samego próbki. Opisujemy wykrywanie DNA pojedynczych grup ofiar za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Dodatkowo stwarzamy możliwość dalszych analiz produktów PCR takich starterów specyficznych dla grupy, mających zastosowanie wszędzie tam, gdzie wymagana jest wyższa rozdzielczość taksonomiczna niż swoistość starterów. Ponieważ jednoniciowe fragmenty DNA (ssDNA) tworzą trzeciorzędowe konformacje, które są determinowane przez ich pierwotną sekwencję17, niewielkie różnice we fragmentach amplifikowanych przez takie specyficzne dla grupy startery prowadzą do zmian konformacyjnych. Takie zmiany można wykryć za pomocą analiz polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (SSCP) z żelami poliakrylamidowymi17,18, co umożliwia bardziej precyzyjną identyfikację organizmów drapieżnych (aż do poziomu gatunku).
Podczas gdy elektroforeza w żelu agarozowym jest powszechnym i niedrogim narzędziem do wizualizacji fragmentów DNA i określenia ich przybliżonej długości19, rozdzielczość zależy od ilości DNA i użytego barwnika barwiącego20. Zazwyczaj wizualizacja jest prosta podczas pracy z czystymi próbkami DNA, ale potencjalnie niewielkie ilości DNA ofiary w treści jelitowej konsumentów mogą skomplikować ocenę wyników elektroforezy w żelu agarozowym. Mimo to ta metoda wykrywania jest wykonalna do badania przesiewowego niewielkiej liczby osobników konsumenckich z terenu pod kątem jednej lub kilku grup ofiar, ale komplikacje w punktacji sprawiają, że badanie przesiewowe dużej liczby próbek pod kątem wielu taksonów ofiar jest niezwykle czasochłonne, a zatem niewykonalne. Bardziej czułą metodą detekcji jest automatyczna analiza fragmentów za pomocą elektroforezy kapilarnej, która dodatkowo pozwala na określenie dokładnej długości fragmentów21. Kilka badań mikrosatelitarnych wykazało, że przy użyciu różnych barwników fluorescencyjnych jako etykiet, możliwe jest wykrycie i określenie różnych fragmentów o porównywalnej długości za pomocą automatycznej analizy fragmentów22,23,24. Dlatego przedstawiamy również szczegółowy protokół równoległego wykrywania DNA z wielu grup ofiar za pomocą PCR z znakowanymi zestawami starterów specyficznych dla grupy oraz wykrywania poprzez automatyczną analizę fragmentów za pomocą automatycznego sekwenatora. Dodatkowo przedstawiamy wyniki studium przypadku pokazujące, że wykrywanie DNA ofiary za pomocą automatycznej analizy fragmentów jest podejściem, które umożliwia również względną kwantyfikację spożytej ofiary.

<table><tbody><tr><td>ciekły azot</td><td>Dowolna</td><td>nie b.n.k</td><td>. Do transportu próbek terenowych makrobezkręgowców do laboratorium.</td></tr><tr><td>Probówki reakcyjne 1,5 ml - Safelock</td><td>Any</td><td>NA</td><td>W przypadku pobierania próbek konsumenckich w terenie i późniejszej konserwacji w ciekłym azocie probówki reakcyjne z ciekłym azotem niekoniecznie muszą być czyste metodą PCR. Aby uniknąć wybuchu rurek, wieczko probówek należy przekłuć igłą.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Dowolny</td><td>NA</td><td>Upewnij się, że powiększenie jest odpowiednie do przygotowania przewodu pokarmowego o wielkości interesującego konsumenta.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td>Do preparowania przewodu pokarmowego próbek konsumenckich pod stereomikroskopem.</td></tr><tr><td>Ogniska ze stali nierdzewnej: Kleszcze Dumont nr 7</td><td>Bioform</td><td>B40d</td><td>Te zakrzywione kleszczyki ze stali nierdzewnej mogą czasami być bardzo elastyczne, aby utrzymać próbkę zamocowaną między zakrzywioną częścią bez nakłuwania przewodu pokarmowego.</td></tr><tr><td>Ogniska ze stali nierdzewnej: Kleszcze Dumont Electronic No. 5</td><td>Bioform</td><td>B40b</td><td>Te drobne kleszczyki ze stali nierdzewnej idealnie nadają się do przygotowania przewodu pokarmowego próbek konsumenckich.</td></tr><tr><td>DNA-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7409,1000RF</td><td>Roztwór do dekontaminacji do usuwania zanieczyszczeń DNA i RNA</td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy bez kłaczków</td><td>Dowolna</td> waga <td>laboratoryjna NA</td><td></td></tr><tr><td>Dowolna</td><td>precyzja</td><td>NA</td><td>musi wynosić co najmniej 0,01 g.</td></tr><tr><td>Pipety mikrolitrowe (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td> <td>Dowolne</td> probówki <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 2,0 ml</td><td>VWR</td><td>211-2165</td><td>Bardzo ważne jest, aby te probówki trakcyjne były wolne od inhibitorów DNA, DNazy, RNazy i PCR (PCR clean)!</td></tr><tr><td>Probówki Safe-Lock 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>211-2164</td><td>Bardzo ważne jest, aby te probówki trakcyjne były wolne od inhibitorów DNA, DNazy, RNazy i PCR (PCR clean)!</td></tr><tr><td>Chlorek sodu &ge; 99,5%, p.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>3957.3</td><td>Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i 5M roztworu NaCl wymaganego do ekstrakcji DNA.</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)-aminometan Tris</td><td>carlroth</td><td>4855.2</td><td>Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i buforu TBE Pipety</td></tr><tr><td>mikrolitrowe (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td> <td>carlroth</td><td>8043.1</td><td>Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i buforu TBE Kwas</td></tr><tr><td>borowy &ge; 99,8 %, p.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>6943.2</td><td>Do bufora TBE. Nie jest wymagane, jeżeli uzyskuje się dostępny na rynku bufor TBE.</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>carlroth</td><td>4360.1</td><td>Do ekstrakcji</td></tr><tr><td>liofilu proteinazy K.</td><td>carlroth</td><td>7528.1</td><td>Przygotować roztwór roboczy zawierający 10 mg/ml.</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen</td><td>85300</td><td>Młyn perełkowy do homogenizacji próbek.</td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mm</td><td>Quiagen</td><td>69989</td><td>Do homogenizacji próbek.</td></tr><tr><td>Ogrzewanie Wytrząsarka</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem: himac CT 15 RE</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>Wirówka z chłodzeniem używana do wirowania podczas ekstrakcji DNA (Protokół 1).</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>carlroth</td><td>6752.5</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99,8 %, rocznie</td><td>Dowolna</td><td>woda NA</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna klasy (ddH2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7398,1000</td><td>wolna od nukleaz (sterylizowana strumieniowo i traktowana DEPC) woda używana do ponownego zawieszania DNA i zawsze, gdy jest mowa o ddH2O w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Niemodyfikowane Olegonukleotydy</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>NA</td><td>Startery nieoznakowane</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane olegonukleotydy</td><td>Metabion International AG</td><td>NA</td><td>Podkłady z oznaczeniem</td></tr><tr><td>peqGOLD Taq all inclusive</td><td>VWR Peqlab</td><td>01-1000</td><td>Taq all inclusive do mieszanin reakcyjnych PCR (bufor reakcyjny Y i S, dNTPs i MgCl2)</td></tr><tr><td>Zaawansowany termocykler gradientowy Primus 96 lub peqStar96x Uniwersalny gradient</td><td>Peqlab</td><td>NA</td><td>Zestawy podkładów zostały pierwotnie opracowane na zaawansowanym termocyklerze gradientowym Primus 96. Ponieważ ten cykler był dość stary, sprawdziliśmy, czy nasze zestawy starterów są wydajne i specyficzne w tych samych warunkach, używając peqSta96x (który również mógł symulować starszy model). Testy wykazały jednak, że nasze startery działają dobrze i nadal są specyficzne (patrz Koester i in. 2013) bez korzystania z symulacji starej maszyny.</td></tr><tr><td>Standardowe 96-dołkowe płytki do PCR</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-2879</td><td>Używane do reakcji PCR.</td></tr><tr><td>Niskoprofilowe paski do tub 0,15 ml z płaskimi paskami</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-3223</td><td>Paski do zamykania płytek PCR.</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td>Służy do elektroforezy żelowej.</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kolba stożkowa</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder miarowy</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pozioma jednostka elektroforezy i odpowiednie grzebienie z zębami</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td>Do elektroforezy w żelu agarozowym.</td></tr><tr><td>Zasilacz do elektroforezy PS3002</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny 1 %</td> <td>carlroth</td><td>2218.1</td><td>Służy do przygotowania kąpieli barwiącej do żeli agarozowych.</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>carlroth</td><td>6749.1</td><td>Wymagany do bufora denaturacyjnego do analiz SSCP.</td></tr><tr><td>Błękit bromfenolowy</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td>Potrzebny do ładowania barwnika do elektroforezy w żelu agarozowym.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>carlroth</td><td>4621.1</td><td>Potrzebna do ładowania barwnika do elektroforezy w żelu agarozowym.</td></tr><tr><td>100 bp-DNA-Ladder extended</td><td>carlroth</td><td>T835.1</td><td>Jako standard rozmiaru do elektroforezy w żelu agarozowym.</td></tr><tr><td>System dokumentacji UV</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td>Do wizualizacji wyników elektroforezy żelowej.</td></tr><tr><td>Rotiphorese NF-Akrylamid/Bis-roztwór 40 % (29:1)</td><td>carlroth</td><td>A121.1</td><td>Do sporządzania żeli poliakryloamidowych.</td></tr><tr><td>Peroksydisiarczan amonu</td><td>carlroth</td><td>9592.2</td><td>Do sporządzania żeli poliakryloamidowych.</td></tr><tr><td>Składane klipsy (32 mm)</td><td>Dowolna</td><td>NIE DOTYCZY</td><td>Do przygotowania żeli poliakrylomidowych.</td></tr><tr><td>plastikowe pudełko w kształcie kwadratu (21 &x; 6,5 &x; 5 cm)</td><td>Dowolna</td><td>NA Do</td><td>przygotowania żeli poliakrylomidowych.</td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>karłówka</td><td>23.67.1</td><td>Do sporządzania żeli poliakryloamidowych.</td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RC 10 Cyfrowy agregat chłodniczy</td><td>VWR</td><td>462-0138</td><td>Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.</td></tr><tr><td>Pionowe urządzenie do elektroforezy P10DS (OWL Separation Systems)</td><td>VWR</td><td>700-2361</td><td>Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.</td></tr><tr><td>Płyta szklana z karbem</td><td>VWR</td><td>730-0261</td><td>Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.</td></tr><tr><td>Czysta płyta szklana</td><td>VWR</td><td>730-0260</td><td>Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.</td></tr><tr><td>Podkładki dystansowe</td><td>VWR</td><td>730-0262</td><td>Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.</td></tr><tr><td>Grzebień z 25 zębami</td><td>VWR</td><td>730-0294</td><td>Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.</td></tr><tr><td>Platforma wytrząsająca</td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td>Do ciągłego potrząsania wanną barwiącą.</td></tr><tr><td>Barwienie kwasami nukleinowymi GelStar (Lonza Rockland, Inc.)</td><td>Biozym</td><td>850535 (50535)</td><td>Do barwienia żeli poliakrylamidowych.</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp</td><td>AB Sciex</td><td>608098</td><td>Do automatycznych analiz fragmentów. Norma rozmiaru dla partii B.</td></tr><tr><td>Zestaw GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp</td><td>AB Sciex</td><td>608095</td><td>Do automatycznych analiz fragmentów. Norma wielkości dla partii A.</td></tr><tr><td>Sample Loading Solution (SLS)</td><td>AB Sciex</td><td>608082</td><td>Do zautomatyzowanych analiz fragmentów.</td></tr><tr><td>Płytka sekwencyjna - 96-dołkowa mikropłytka polipropylenowa do PCR</td><td>Costar</td><td>6551</td><td>Do automatycznej analizy fragmentów.</td></tr><tr><td>Wirówka płytkowa, PerfectSpin P</td><td>VWR Peqlab</td><td>NA</td><td>mini wirówka płytkowa służąca do odkręcania produktów PCR.</td></tr><tr><td>Płyta buforowa - 96 Well EIA/RIA Przezroczysty polistyren płaski bez obróbki Mikropłytka</td><td>Corning</td><td>9017</td><td>Do automatycznych analiz fragmentów.</td></tr><tr><td>GenomeLab Seperation Buffer</td><td>AB Sciex</td><td>608012</td><td>Do automatycznych analiz fragmentów.</td></tr><tr><td>Żel separacyjny - LPAI</td><td>AB Sciex</td><td>608010</td><td>Do automatycznej analizy fragmentów.</td></tr><tr><td>Sequenzer - System Analizy Genetycznej CEQ8000</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Do zautomatyzowanych analiz fragmentów.</td></tr><tr><td>GeneMarker V1.95</td><td>Softgenetics</td><td>NA</td><td>Do analizy wyników automatycznych analiz fragmentów.</td></tr></tbody></table>

protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rdna specyficznych dla grupy

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analiza sieci pokarmowych jest niezbędna do lepszego zrozumienia ekosystemów. Na przykład interakcje w sieci troficznej mogą ulegać poważnym zmianom spowodowanym inwazją gatunków obcych. Jednak dokładna identyfikacja interakcji drapieżnik-ofiara w terenie jest w wielu przypadkach trudna. Analizy te często opierają się na wizualnej ocenie zawartości jelit lub analizie proporcji izotopów stabilnych (δ15N i δ13C). Takie metody wymagają wszechstronnej wiedzy na temat, odpowiednio, różnorodności morfologicznej lub sygnatury izotopowej poszczególnych organizmów drapieżnych, co prowadzi do przeszkód w dokładnej identyfikacji organizmów drapieżnych. Wizualne analizy zawartości jelit szczególnie zaniżają znaczenie miękkich organizmów drapieżnych, ponieważ maceracja, spożycie i trawienie organizmów drapieżnych utrudnia identyfikację konkretnych gatunków. W związku z tym strategie oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), na przykład stosowanie zestawów starterów specyficznych dla danej grupy, stanowią potężne narzędzie do badania interakcji w sieci pokarmowej. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły badania zawartości jelit konsumentów makrobezkręgowców w terenie przy użyciu specyficznych dla grupy zestawów starterów dla jądrowego kwasu rybosynukleinowego (rDNA). DNA można ekstrahować albo z całych próbek (w przypadku małych taksonów), albo z treści jelitowej próbek zebranych w terenie. Obecność i sprawność funkcjonalną matryc DNA należy potwierdzić bezpośrednio od badanej osoby za pomocą uniwersalnych zestawów starterów ukierunkowanych na odpowiednią podjednostkę DNA. Wykazaliśmy również, że spożytą zdobycz można określić dalej aż do poziomu gatunku za pomocą PCR z niezmodyfikowanymi starterami specyficznymi dla grupy w połączeniu z późniejszymi analizami polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (SSCP) przy użyciu żeli poliakrylamidowych. Ponadto wykazaliśmy, że zastosowanie różnych barwników fluorescencyjnych jako znaczników umożliwia równoległe badania przesiewowe fragmentów DNA różnych grup ofiar z wielu próbek zawartości jelit za pomocą automatycznej analizy fragmentów.

Z powodzeniem zastosowaliśmy kroki opisane w niniejszym protokole do analizy diety w ramach różnych badań. W tej sekcji przedstawiamy przykłady opisujące zastosowanie poszczególnych części protokołu.
Przykładowo, aby zademonstrować skuteczność zestawów starterów specyficznych dla grup, opracowanych przez autorów28 oraz potencjału do dalszych analiz produktów PCR metodą SSCP, przeprowadzono eksperyment żyw...

Najczęstsze analizy zawartości jelit makrobezkręgowców są wizualne. Wymagając intensywnej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej organizmów drapieżnych, pomijają zdobycz o miękkim ciele, a ze względu na silne rozdrobnienie zdobyczy są prawie niemożliwe dla niektórych organizmów, w tym obunogów. Zapewniamy szczegółowe, nowatorskie podejścia genetyczne do identyfikacji zdobyczy makrobezkręgowców w diecie obunogów.

Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest usprawnienie badań nad ekologią troficzną, w szczególności w odniesieniu do próbek terenowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii sieci troficznych, takie jak wpływ gatunków inwazyjnych na interakcje troficzne. Główną zaletą jest możliwość dodatkowego zastosowania analiz troficznych integrujących dłuższe okresy czasu dla tych samych okazów oraz fakt, że metoda ta może być stosowana praktycznie przez każdego ekologa.Chociaż opracowaliśmy tę metodę, aby uzyskać wgląd w konsumpcję ofiar przez konsumentów wodnych, można ją zastosować również w innych celach, na przykład do określenia składu gatunkowego w próbkach makrobezkręgowców bentosowych. Procedurę zaprezentuje Christian Sodemann, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć ten eksperyment, przenieś wcześniej wypreparowany przewód pokarmowy drapieżnika do probówki reakcyjnej typu safe-lock o pojemności 2 ml zawierającej 440 µl buforu do ekstrakcji soli.Próbki należy natychmiast zamrozić w temperaturze -20 °C do momentu ekstrakcji DNA. Po wyjęciu próbek z zamrażarki należy rozpocząć ekstrakcję DNA, dodając pęsetą jedną stalową kulkę o objętości 5 ml do każdej probówki z próbką, a następnie pozostawić próbki na blacie w temperaturze pokojowej do rozmrożenia. Próbki należy zhomogenizować w młynku kulkowym przez jedną minutę przy częstotliwości 15 Hz.Po krótkim odwirowaniu próbek, należy dodać do nich 90 µL 10% SDS oraz 5 µL proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL. Następnie próbki należy dokładnie wymieszać w wibratorze Vortex i inkubować w temperaturze 60 °C przez jedną godzinę na urządzeniu ThermoMixer przy stałym wytrząsaniu z prędkością 400 rpm. Aby dodatkowo wspomóc lizę, próbki należy mieszać w wibratorze Vortex co 10 minut podczas inkubacji.Po krótkim wirowaniu, pipetować 350 µL 5 M chlorku sodu do próbek. Mieszać na wortexie od 30 sekund do jednej minuty, aby całkowicie wymieszać próbki. Następnie wirować przy 16 200 ×g w temperaturze 5 °C przez 40 minut.Jednym z najważniejszych elementów podczas wyjmowania próbek z wirówki jest zapobieganie przemieszczaniu się kulek, aby nie zakłócić osadu zawierającego wszystkie cząstki, które mają zostać usunięte w tym kroku. Następnie ostrożnie przenieś około 600 µL supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 mL, dbając o to, by nie naruszyć osadu. Dodaj 600 µL lodowatego izopropanolu i ostrożnie odwróć probówkę kilka razy.Przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc. Po wyjęciu próbek z zamrażarki odwirować je z prędkością 16 200 ×g w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Odlać nadsącz, uważając, aby nie zgubić osadu, a następnie ostrożnie osuszyć probówkę za pomocą chusteczki papierowej.Przemyj te osady zawierające DNA, dodając 200 µL 70% lodowatego etanolu, a następnie wirując przy 16 200 ×g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ostrożnie odlej nadsącz i użyj niepozostawiających włókien chusteczek, aby starannie osuszyć probówkę. Na koniec, używając pipety 10 µL ustawionej na 8 µL, ostrożnie usuń pozostały nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć osadu.Suszyć osad do całkowitego odparowania etanolu. Następnie dodać od 50 do 100 µL wody wolnej od nukleaz, krótko wymieszać w wortexie i pozostawić w temperaturze 4 °C przez noc w celu rozpuszczenia osadu. Aby zweryfikować wydajność funkcjonalną tutaj wyekstrahowanych próbek DNA, należy poddać każdą z nich analizie PCR, stosując uniwersalne zestawy starterów odpowiednie dla danego źródła żywności.Zacznij od dodania starterów, mieszaniny dNTP, buforu reakcyjnego, polimerazy Taq DNA oraz oczyszczonej wody do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 lub 2,5 ml, a następnie wymieszaj standardową mieszaninę reakcyjną za pomocą wirówka typu vortex. Następnie, dla każdej próbki DNA, przenieś 1 µL odpowiedniego ekstraktu DNA do 9 µL standardowej mieszaniny reakcyjnej w płytce do PCR. Zamknij płytkę, umieść ją w termocyklerze i uruchom program PCR.Po zakończeniu reakcji PCR należy użyć opcji krótkiego wirowania w miniwirówce, aby osadzić produkty PCR na dnie probówek. Następnie należy zmieszać 3 µL każdego produktu PCR z 1 µL 6x barwnika do nakładania próbek. Tak przygotowane próbki należy nanieść do oczek wcześniej przygotowanego żelu agarozy.Nanieś 1,5 µl drabinki DNA 100 bp do jednego otworu w żelu jako standard wielkości. Zamknij pokrywę komory do elektroforezy, podłącz ją do zasilacza i prowadź elektroforezę z napięciem 100 V/cm przez 35 minut. Po zakończeniu elektroforezy wyjmij żel i umieść go w wcześniej przygotowanej kąpieli barwiącej na około 10 minut.Na koniec wyjmij żel z kąpieli barwiącej, umieść go w systemie dokumentacji żeli i zwizualizuj go zgodnie z instrukcją obsługi. Aby przeanalizować zawartość przewodu pokarmowego drapieżnika, użyj wcześniej przygotowanych roztworów roboczych ekstraktu DNA. Przeprowadź oddzielne reakcje PCR dla każdego z 16 zestawów starterów specyficznych dla grup ofiar.Należy dołączyć jedną kontrolę pozytywną z DNA z próbki należącej do odpowiedniej grupy ofiar oraz jedną kontrolę negatywną z DNA gatunku drapieżnika. Kluczowe jest dokładne udokumentowanie rozmieszczenia próbek na każdej płytce PCR, aby uniknąć pomieszania różnych próbek podczas ich nakładania na płytkę do sekwencjonowania w celu wykrycia sekwencjonera przydziałowego i w konsekwencji przypisania błędnych wyników do konkretnego osobnika konsumenta. Następnie należy przeprowadzić reakcje PCR zgodnie z wcześniej opisanym protokołem, dostosowując temperaturę przyłączania oraz liczbę cykli do każdego użytego zestawu starterów.Aby wykryć amplifikowane fragmenty w tych reakcjach PCR, należy przeprowadzić zautomatyzowane analizy fragmentów w dwóch seriach, A i B. Przygotować mieszaninę zawierającą roztwór do ładowania próbek (SLS) oraz odpowiedni standard wielkości dla każdej serii. Następnie rozmrozić wcześniej zamrożone produkty ośmiu reakcji PCR należących do odpowiedniej serii, dbając o to, aby były one przechowywane w ciemności. Użyć opcji krótkiego wirowania w miniwirówce, aby osadzić zawartość probówek.Na płytkę do sekwencjonowania nanieś do liczby dołków odpowiadającej liczbie analizowanych próbek po 22 µL odpowiedniej mieszaniny standardu wielkości SLS dla każdej próbki. Następnie do odpowiednich dołków płytki nanieś 1 µL produktu PCR z każdej z ośmiu reakcji PCR. Następnie, korzystając z opcji krótkiego wirowania w miniwirówce do płytek, ostrożnie odwirowuj tę mieszaninę.Następnie należy przykryć każdą studzienkę jedną kroplą oleju mineralnego. Potem wypełnić studzienki reakcyjne płyty buforowej od 250 do 300 µL buforu do rozdziału DNA. Użyć oprogramowania sekwenconera kapilarnego do utworzenia konfiguracji próbek zgodnie z instrukcjami producenta.Należy upewnić się, że rozmieszczenie próbek w konfiguracji próbek jest zgodne z rozmieszczeniem próbek na płytce do sekwencjonowania oraz że konfiguracja próbek zawiera metodę odpowiednią do przetworzenia danej partii. Podczas analizy wyników ważne jest, aby wizualnie sprawdzić elektroferogram każdej próbki, osobno potwierdzić lub odrzucić każdy zidentyfikowany piki dla każdego zestawu starterów markerowych oraz ręcznie wprowadzić niezidentyfikowane piki spełniające kryteria zestawu starterów markerowych lub usunąć te błędne. Po przeprowadzeniu doświadczeń z karmieniem w celu określenia skuteczności zestawów starterów specyficznych dla grup, opracowanych dla analiz PCR przeprowadzonych w niniejszym protokole, wyniki PCR z wykorzystaniem DNA z przewodu pokarmowego drapieżnika przeanalizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym oraz polimorfizmu konformacyjnego pojedynczej nici (SSCP).Elektroforeza w żelu agarozowym ujawniła pojedyncze prążki dwuniciowego DNA, których nie udało się rozróżnić pomiędzy badanymi gatunkami ofiar. W przeciwieństwie do tego, elektroforeza SSCP pozwoliła na skuteczne rozróżnienie poszczególnych gatunków ofiar poprzez porównanie próbek zawartości jelit z próbkami referencyjnymi. DNA wyekstrahowane z jelit roztocza wodnego po eksperymencie żywieniowym zostało zsekwencjonowane w różnych odstępach czasu po spożyciu ofiary.Od jednej do 50 godzin po karmieniu względne ilości wykrytego DNA ofiar uległy znacznemu zmniejszeniu. DNA wyizolowane z przewodu pokarmowego inwazyjnego obunoga, *Dikerogammarus villosus*, przebadano pod kątem obecności DNA makrobezkręgowców stanowiących ofiary, wykorzystując 16 zestawów starterów specyficznych dla grup opisanych w niniejszym protokole. Jedynie 16% zawartości przewodu pokarmowego *D. villosus* dało wynik dodatni pod kątem DNA należącego do któregokolwiek z 16 docelowych taksonów ofiar.Ponadto w co najmniej jednej próbce stwierdzono obecność DNA 12 badanych taksonów ofiar, natomiast DNA czterech taksonów nigdy nie wykryto. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że zastosowane startery są specyficzne dla taksonów występujących w badanym systemie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak rozszerzyć badania nad interakcjami troficznymi, uzupełniając rutynowo stosowane w laboratorium metody o analizy genetyczne.

laboratory-protocol-for-genetic-gut-content-analyses-aquatic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsza publikacja opisuje sposób wykorzystania systemu identyfikacji gatunków ryb Agilent Fish Species Identification System do określania gatunku ryby poprzez ekstrakcję DNA oraz przeprowadzenie analizy PCR i RFLP.

Protokół identyfikacji gatunków ryb w oparciu o DNA

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Ten protokół opisuje skuteczne podejście do hybrydyzacji in situ w celu wykrycia poziomów ekspresji mRNA i wzorców przestrzennych docelowych genów w płynie celomicznym Sipunculus nudus.

Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny

Środowiskowe testy DNA wymagają rygorystycznego projektowania, testowania, optymalizacji i walidacji przed rozpoczęciem zbierania danych terenowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który przeprowadza użytkowników przez każdy etap projektowania specyficznego dla gatunku, opartego na sondzie testu qPCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA gatunku docelowego z próbek środowiskowych.

Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA

Protokół wykrywa kluczowe geny obiegu metanu na mokradłach przybrzeżnych południowego Teksasu i wizualizuje ich rozmieszczenie przestrzenne, aby lepiej zrozumieć regulację metanu i jego wpływ na środowisko w tych dynamicznych ekosystemach.

Wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych

Poznaj metody genetyczne do analizy zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy. Technika ta poprawia badania ekologii troficznej i interakcji sieci pokarmowych.

Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy (Wideo) | JoVE Journal

Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy

Przeglądaj więcej filmów