Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy

Ogólnym celem tego protokołu jest poprawa badań ekologii troficznej, zwłaszcza na podstawie próbek terenowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu ekologii sieci troficznej, takie jak wpływ gatunków inwazyjnych na interakcje troficzne. Główną zaletą jest dodatkowa aplikacja, która pozwala na większą integrację analiz troficznych dla dokładnie tych samych okazów i to, że może być stosowana przez praktycznie każdego ekologa.

Chociaż opracowaliśmy to podejście, aby zapewnić wgląd w konsumpcję zdobyczy przez konsumentów wodnych, można je również zastosować do innych celów, na przykład do określenia składu gatunkowego w próbkach makrobezkręgowców bentosowych. Procedurę zademonstruje Christian Sodemann, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć ten eksperyment, przenieś wcześniej wypreparowany przewód pokarmowy drapieżnika do dwumililitrowej probówki reakcyjnej z bezpieczną blokadą zawierającej 440 mikrolitrów buforu do ekstrakcji soli.

Natychmiast zamrozić próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu ekstrakcji DNA. Po wyjęciu próbek z zamrażarki rozpocznij ekstrakcję DNA za pomocą kleszczy, aby dodać jeden pięciomililitrowy koralik ze stali nierdzewnej do każdej probówki z próbką, a następnie pozostaw próbki na stole w temperaturze pokojowej do rozmrożenia. Za pomocą młyna perełkowego homogenizować próbki przez jedną minutę z częstotliwością 15 Hz.

Po krótkim odwirowaniu próbek dodaj do próbek 90 mikrolitrów 10% SDS i pięć mikrolitrów 10 miligramów na mililitr proteinazy K do próbek. Następnie dokładnie zawirować próbki i inkubować je w temperaturze 60 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem przy 400 obr./min na ThermoMixerze przez godzinę. Aby jeszcze bardziej przyspieszyć lizę, podczas tej inkubacji należy wirować próbki co 10 minut.

Po krótkim wirowaniu odwirowania należy odpipetować 350 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu do próbek. Wirować przez 30 sekund do jednej minuty, aby całkowicie wymieszać próbki. Następnie odwirować w temperaturze 16 200 razy g w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez 40 minut.

Tak więc jedną z najważniejszych rzeczy podczas wyjmowania próbek z wirówki jest uniknięcie przesuwania się kulek i zakłócania osadu zawierającego wszystkie cząstki, które należy usunąć na etapie. Następnie ostrożnie przenieś około 600 mikrolitrów supernatantu do nowej 1,5 mililitrowej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj 600 mikrolitrów lodowatego izopropanolu i ostrożnie odwróć rurkę kilka razy.

Przechowywać przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po wyjęciu próbek z zamrażarki odwirować je w temperaturze pokojowej 16 200 razy przez 20 minut. Wyrzuć supernatant, uważając, aby nie stracić osadu, i użyj bibuły, aby ostrożnie wysuszyć probówkę.

Umyj te granulki zawierające DNA, dodając 200 mikrolitrów 70% lodowatego etanolu, a następnie odwirowując 16, 200 razy g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant i użyć niestrzępiącej się bibuły, aby dokładnie wysuszyć probówkę. Na koniec, za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów dostosowanej do ośmiu mikrolitrów, ostrożnie usuń pozostały supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu.

Suszyć granulki, aż cały etanol odparuje. Następnie dodaj od 50 do 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, krótko zmieszaj i pozostaw na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozpuścić osad. Aby zweryfikować sprawność funkcjonalną pobranych tutaj próbek DNA, należy przetestować każdą z nich metodą PCR, używając uniwersalnych zestawów starterów odpowiednich dla danego źródła pożywienia.

Zacznij od dodania starterów, mieszanki dNTP, buforu reakcyjnego, polimerazy DNA Taq i oczyszczonej wody w 1,5 lub 2,5 mililitrowej probówce reakcyjnej i wirowania standardowej mieszaniny reakcyjnej. Teraz, dla każdej próbki DNA, przenieś jeden mikrolitr odpowiedniego ekstraktu DNA do dziewięciu mikrolitrów standardowej mieszaniny reakcyjnej na płytce PCR. Zamknij płytkę, umieść ją w termocyklerze i uruchom program PCR.

Po zakończonej reakcji PCR użyj opcji krótkiej serii mini wirówki, aby odwirować produkty PCR. Następnie wymieszaj trzy mikrolitry każdego produktu PCR z jednym mikrolitrem sześciokrotnie obciążającego barwnika. Załaduj te próbki do szczelin żelowych wcześniej przygotowanego żelu agarozowego.

Załaduj 1,5 mikrolitra drabinki DNA o długości 100 par zasad do jednego gniazda żelu jako standard rozmiaru. Zamknij pokrywę urządzenia do elektroforezy, podłącz je do źródła zasilania i uruchom żel pod napięciem 100 woltów na centymetr przez 35 minut. Po przeprowadzeniu elektroforezy usuń żel i umieść go we wcześniej przygotowanej kąpieli barwiącej na około 10 minut.

Na koniec należy wyjąć żel z kąpieli barwiącej i umieścić go w systemie dokumentacji żelu, a następnie zobrazować go zgodnie z instrukcją. Do analizy zawartości jelit drapieżników należy użyć wcześniej przygotowanych roztworów roboczych ekstraktu DNA. Wykonaj oddzielne reakcje PCR dla każdego z 16 zestawów starterów specyficznych dla grupy ofiar.

Obejmuje jedną kontrolę dodatnią z DNA pochodzącym z osobnika należącego do odpowiedniej grupy ofiar i jedną kontrolę ujemną z DNA pochodzącym od gatunku drapieżnego. Bardzo ważne jest, aby dokładnie udokumentować przypisanie próbki do każdej płytki PCR, aby uniknąć łączenia różnych próbek podczas ładowania ich na płytkę sekwencjonowania w celu wykrycia sekwencjonera działkowego i ostatecznie przypisania niewłaściwych wyników osobie konsumenta. Następnie przeprowadź reakcje PCR przy użyciu tego samego protokołu, co opisano wcześniej, dostosowanego do określonej temperatury wyżarzania i numeru cyklu dla każdego użytego zestawu starterów.

Aby wykryć amplifikowane fragmenty w tych reakcjach PCR, należy przeprowadzić zautomatyzowane analizy fragmentów w dwóch partiach, A i B. Przygotować mieszaninę zawierającą roztwór do ładowania próbki lub SLS i odpowiedni wzorzec wielkości dla każdej partii. Następnie rozmrozić wcześniej zamrożone produkty PCR z ośmiu reakcji PCR należących do odpowiedniej partii, upewniając się, że są trzymane w ciemności. Użyj opcji krótkiej serii mini wirówki, aby je odwirować.

Na płytkę sekwencjonacyjną załadować liczbę studzienek odpowiadającą liczbie próbek do analizy 22 mikrolitrami odpowiedniej mieszaniny wzorcowej wielkości SLS dla każdej próbki. Następnie załaduj jeden mikrolitr produktu PCR z każdej z ośmiu reakcji PCR do odpowiednich dołków płytki. Następnie użyj opcji krótkiej serii mini wirówki płytkowej, aby ostrożnie odwirować tę mieszaninę.

Następnie przykryj każdą studzienkę jedną kroplą oleju mineralnego. Następnie napełnij studzienki reakcyjne płytki buforowej 250 do 300 mikrolitrami buforu do separacji DNA. Użyj oprogramowania sekwencera kapilarnego, aby utworzyć konfigurację próbki zgodnie z instrukcjami producenta.

Należy upewnić się, że przydział próbek w konfiguracji próbki jest zgodny z przydziałem próbki na płytce sekwencjonowania oraz że zestaw próbki zawiera metodę odpowiednią do przetworzenia odpowiedniej partii. Podczas analizy wyników ważne jest, aby wizualnie ponownie sprawdzić elektroferogram każdej próbki i potwierdzić/odtwierdzić każdy pik wywołany dla każdego zestawu starterów markerów osobno i wstawić niewywołane piki, które spełniają kryteria zestawu starterów markerów, lub usunąć nieprawidłowe. Po przeprowadzeniu eksperymentów żywieniowych w celu określenia skuteczności specyficznych dla grupy zestawów starterów ustalonych dla analiz PCR wykonanych w tym protokole, wyniki PCR z wykorzystaniem DNA z przewodu pokarmowego drapieżnika przeanalizowano przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym, a także polimorfizmu konformacji jednoniciowej lub SSCP.

Elektroforeza w żelu agarozowym ujawniła pojedyncze prążki dwuniciowego DNA, których nie można było rozróżnić między różnymi badanymi gatunkami ofiar. W przeciwieństwie do tego, elektroforeza SSCP odniosła sukces w rozróżnianiu różnych gatunków ofiar poprzez porównanie próbek zawartości jelit z próbkami referencyjnymi. DNA wyekstrahowane z jelita roztocza wodnego po eksperymencie z karmieniem zostało zsekwencjonowane w różnych okresach czasu po spożyciu zdobyczy.

Od jednej do 50 godzin po karmieniu względne ilości wykrytego DNA ofiary uległy znacznemu zmniejszeniu. DNA wyekstrahowane z inwazyjnego obunoga, jelita Dikerogammarus villosus, zostało przetestowane pod kątem DNA ofiar makrobezkręgowców przy użyciu 16 specyficznych dla grupy zestawów starterów opisanych w tym protokole. Tylko 16% zawartości jelit D. villosus było dodatnich dla DNA należącego do któregokolwiek z 16 docelowych taksonów ofiar.

Co więcej, DNA 12 badanych taksonów ofiar znaleziono w co najmniej jednej próbce, podczas gdy DNA czterech taksonów nigdy nie zostało wykryte. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o upewnieniu się, że użyte startery są specyficzne dla taksonów w danym systemie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób rozszerzyć swoje badania nad interakcjami troficznymi, uzupełniając metody rutynowo stosowane w twoim laboratorium o analizy genetyczne.