Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym
11 września 2017
Opisujemy użycie mikrodysekcji laserowej do uzyskania próbek różnych populacji komórek z różnych regionów mózgu do analizy genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na badanie zróżnicowanych skutków urazowego uszkodzenia mózgu w określonych obszarach mózgu szczura.
Ogólnym celem tego protokołu mikrodysekcji laserowej jest zebranie komórek z określonych obszarów mózgu dotkniętych urazowym uszkodzeniem mózgu do analizy molekularnej. Nazywam się doktor Helen Hellmich. Mój asystent, Harris Weisz, który jest studentem Patofizjologii Człowieka i Medycyny Translacyjnej na Wydziale Medycznym Uniwersytetu w Teksasie, zademonstruje, w jaki sposób wykorzystujemy metody mikrodysekcji laserowej w naszych badaniach nad urazami mózgu.
Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów i konsekwencji zmian wywołanych przez TBI w dyskretnych obszarach mózgu, takich jak kora czołowa, która kontroluje funkcje wykonawcze. I hipokamp, który jest ważny dla procesów zależnych od pamięci. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy badać wpływ procesu chorobowego na wiele dyskretnych regionów mózgu lub poszczególne typy komórek z tego samego mózgu.
Przed jakąkolwiek procedurą LCM, która obejmuje analizę transkrypcyjną, należy oczyścić wszystkie powierzchnie detergentem eliminującym RNace, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i degradacji RNA. Odzyskaj tkankę mózgową z magazynu. I umieścić w cyrościcie schłodzonym do minus 20 stopni Celsjusza.
Pozwól mózgowi zrównoważyć się z temperaturą komory kriostatu przez około dziesięć minut. Umieść mózg brzuszną stroną do góry, na prześcieradle gazy na górze stolika kriostatu. Za pomocą czystego żyletki RNA odetnij tylną część tylko rostralną do móżdżku i część tuż przed skrzyżowaniem wzrokowym.
Umieść niewielką ilość medium o optymalnej temperaturze cięcia w dwóch oddzielnych formach kriogenicznych. Umieść mózg zawierający czołową korę asocjacyjną i rdzeń jądra półleżącego w jednej krioformie wewnętrzną stroną do dołu. Dodać wystarczającą ilość pożywki OCT, aby pokryć tkankę.
Powtórz ten krok z kawałkiem tkanki mózgowej zawierającej hipokamp i jądro nadskrzyżowaniowe. Pozostawić pożywkę OCT do całkowitego zamrożenia przez około 20 minut w kriostacie. Gdy tkanka i podłoże OCT zostaną całkowicie zamrożone, wyciśnij niewielką ilość OTC na głowicę montażową.
Wciśnij zamrożony kriomold na głowicę montażową i pozwól OCT całkowicie zamarznąć, aby forma zawierająca tkankę była bezpiecznie przymocowana do głowicy. Przymocuj mocowanie głowicy do uchwytu sekcyjnego i dokręć. Wyreguluj kąt cięcia w stosunku do ostrza kriostatu za pomocą dźwigni regulacyjnych, aby zapewnić równomierne cięcie sekcji.
Ustaw grubość przekroju na 30 mikronów. Podczas cięcia bloku tkankowego zawierającego hipokamp i SEN, należy ciąć, aż skrzyżowanie wzrokowe zostanie spłaszczone na poziomie 0,48 milimetra, gdy pojawi się trzecia komora. Następnie od tego momentu zbierz skrawki do SEM, delikatnie umieszczając szkiełka z membrany polietylenowo-naptalanu etylenu o temperaturze pokojowej na wierzchu pociętej tkanki.
Wizualnie upewnij się, że szkiełko przylega do szkiełka, potwierdzając, że tkanka i OTC są całkowicie stopione na szkiełku. Przechowywać wszystkie szkiełka z skrawkami tkanek w kriostacie do czasu barwienia. Zatrzymaj odcinki zbiorcze na bregma 0,72 milimetra, gdy rozpocznie się dekusacja nadoptyczna.
W przypadku zbierania hipokampa należy ciąć, aż rogi zakrętu zębatego warstwy komórek ziarnistych będą widoczne w odległości 3,00 milimetrów. Zbieraj sekcje, aż podpola CA hipokampa zostaną połączone w sekcjach koronalnych na bregma 4,78 milimetra. Pozwala to na pełne pobranie hipokampa pod kraniotomię i miejsce urazu.
Przed barwieniem umyj wszystkie naczynia i obszar barwienia w dygestoriach chemicznych z detergentem eliminującym RNazę. Wyjmij stojak boczny z kriostatu i umieść w dygestorium. Pozwól szkiełkom się rozgrzać przez 30 sekund.
Skrawki zabarwić fioletem krezylowym i zabarwić solą fizjologiczną. Pozostaw stojak z poplamionymi szkiełkami do wyschnięcia na powietrzu nie dłużej niż dziesięć minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Po wysuszeniu natychmiast przejdź do LCM.
Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury LCM do analizy RNA należy przetrzeć obszar pobierania i obszar wokół urządzenia detergentem eliminującym RNAzę i 100% etanolem. Przestaw przełącznik zasilania na jednostce generującej laser na podczerwień przed włączeniem podstawy mikroskopu i poczekaj, aż system zostanie zainicjowany przed uruchomieniem oprogramowania z pulpitu. Po uruchomieniu i uruchomieniu oprogramowania przez kolejne kroki inicjalizacji otwórz panel konfiguracji oprogramowania i naciśnij przycisk obecnego etapu.
Etap modułowy przesunie się do pozycji, w której makra LCM będą ładowane i rozładowywane. Umieść do trzech prowadnic membranowych pióra w uchwytach z matową krawędzią skierowaną w prawo. Wybierz obszar obsługi nasadki i szkiełka obok odpowiedniego szkiełka i kliknij pole wyboru MEM, aby poinformować oprogramowanie, że szkiełka membranowe zostały załadowane.
Następnie kliknij żądany slajd, który chcesz najpierw przechwycić. Aby przechwycić obraz kafelkowy dla lokalizacji tkanki i orientacji umieszczenia czapek, wybierz obraz na pasku narzędzi i wybierz opcję uzyskaj przegląd. Umieść kursor nad obszarem na obrazie sąsiadującym, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Umieść zakończenie w środku regionu.
Oprogramowanie automatycznie umieści nasadkę na wybranej pozycji. Po zlokalizowaniu laserów na podczerwień i UV wybierz opcję rysowania odręcznego w okienku wybierz narzędzia. Za pomocą rysika do ekranu dotykowego narysuj obwód obszaru zainteresowania, uważając, aby nie stracić kontaktu między ekranem dotykowym a główką rysika.
Upewnij się, że punkt początkowy i końcowy są ze sobą połączone. W celu zbierania hipokampa wychwytuj laserowo podpola hipokampa CA1, CA2 i CA3, zaczynając od bregma 3,00 milimetra i wykorzystując całkowicie uformowaną ziarnistą warstwę zakrętu zębatego jako fizyczny punkt orientacyjny identyfikacji morfologicznej. Po pobraniu przesuń makro nasadki LCM do pozycji kontroli jakości i sprawdź, czy tkanka jest całkowicie przylegająca, upewniając się wizualnie, że tkanka przecięta promieniami UV jest przymocowana do membrany.
Konieczne jest, aby laser UV przecinał całą tkankę. Niezastosowanie się do tego spowoduje niepełne przyleganie tkanek do czapeczki LCM. Następnie szybko umieść każdą nakrętkę w wolnej od RNAZ 0,5 mililitra probówce reakcyjnej o cienkich ściankach, zawierającej 100 mikrolitrów buforu komórkowego lisus.
Krótko zmieszać próbki, aby zapewnić kompletne rozszczepienie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do przeprowadzenia dalszej analizy genomowej. Poniżej znajdują się reprezentatywne obrazy wycinków tkanek pobranych od strony epcilateralnej miejsca urazu za pomocą funkcji lasera w podczerwieni i UV w systemie LCM. Jest to obszar czołowej kory asocjacyjnej.
Ten obraz przedstawia ten sam region po pobraniu. A to jest tkanka na czapce po pobraniu. Na tym zdjęciu przedstawiono składniki warstw przymięsnych CA1, CA2 i CA3 hipokampa znajdujących się obok w pełni uformowanych rogów warstwy ziarnistej zakrętu zębatego.
Zebrano regiony CA2 i CA3, a te populacje komórek są widoczne na czapce. W tym przypadku obszar jądra półleżącego rdzenia proksymalnego adrostralnego do spoidła przedniego był celem został wiernie odtworzony na czapce. Wreszcie, jądro nadskrzyżowaniowe rostralne do skrzyżowania nadwzrokowego zostało przechwycone przez LCM po TBI.
Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do przetworzenia jednego mózgu w ciągu około ośmiu godzin. Obejmuje to przetwarzanie tkanek, barwienie i LCM. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza epigenetyczna, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wzorców metylacji lub ekspresji mikronicznej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać LCM na wielu obszarach mózgu w tym samym mózgu.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie laserowej mikrodysekcji (LCM) w celu pozyskania specyficznych populacji komórek z różnych obszarów mózgu szczura do analizy ekspresji genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na lepsze zrozumienie zróżnicowanego wpływu urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) na poszczególne regiony, takie jak kora czołowa i hipokamp.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Analiza molekularna
Wstęp
- TBI może wywoływać zróżnicowane efekty w różnych obszarach mózgu.
- Zrozumienie tych efektów na poziomie komórkowym wymaga zastosowania precyzyjnych technik pobierania próbek.
- LCM umożliwia ukierunkowaną analizę konkretnych typów komórek bez zanieczyszczeń.
- Badanie to niesie ze sobą zarówno praktyczne, jak i metodologiczne implikacje dla badań z zakresu neuronauki.
Cel badania
- Wykorzystanie LCM do izolacji komórek mózgu dotkniętych TBI.
- Analiza ekspresji genów i mikroRNA istotnych dla TBI.
- Wyjaśnienie molekularnych następstw TBI w wybranych obszarach mózgu.
Zastosowane metody
- Podstawową wykorzystaną platformą jest laserowa mikrosekcja wycinająca (LCM).
- Model biologiczny obejmuje tkanki mózgu szczura, ze szczególnym uwzględnieniem obszarów dotkniętych TBI.
- Badanie określa krytyczne ramy czasowe dla przygotowania tkanek, ich sekcjonowania oraz barwienia.
- W całym protokole kładziony jest nacisk na staranne kroki zapobiegające kontaminacji.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja docelowych populacji komórek z obszarów takich jak kora czołowa i hipokamp.
- Wgląd w zmiany indukowane przez TBI na poziomie molekularnym, stanowiący podstawę dla przyszłych badań mechanistycznych.
- Zidentyfikowanie krytycznych etapów sekcjonowania i barwienia w celu niezawodnego pobrania RNA.
Wnioski
- Badanie wykazuje, w jaki sposób LCM może ułatwić ukierunkowane analizy molekularne skutków TBI.
- Wnioski obejmują lepsze zrozumienie mechanizmów neuronalnych dotkniętych urazem.
- Metoda ta zwiększa precyzję w badaniach nad neuronauką i otwiera możliwości poszukiwań terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Mikrosekcyjna analiza laserowa (LCM) umożliwia precyzyjne profilowanie molekularne poszczególnych obszarów mózgu dotkniętych urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI), wspierając walidację celów poprzez analizę ekspresji genów i mikroRNA w rozdzielczości przestrzennej. Podejście to redukuje zakłócenia sygnałów pochodzące z heterogenicznych tkanek, zwiększając pewność prognostyczną w procesie ograniczania ryzyka mechanistycznego w badaniach nad szlakami TBI. Poprzez izolację odpowiedzi specyficznych dla danego regionu z tego samego zwierzęcia, LCM poprawia ciągłość translacyjną oraz efektywność selekcji projektów w badaniach neurobiologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację obszarów dotkniętych TBI, takich jak kora czołowa i hipokamp, w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia biologicznie zoptymalizowaną walidację celów terapeutycznych dzięki analizie molekularnej z rozdzielczością przestrzenną, bez artefaktów wynikających z dysocjacji tkanki.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie regionowych zmian w ekspresji genów z wynikami funkcjonalnymi w procesach wykonawczych i pamięciowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych analiz genomicznych poprzez zachowanie integralności przestrzennej i naturalnego rozmieszczenia obszarów mózgu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność analiz dzięki sekcjonowaniu prowadzonemu przez punkty orientacyjne anatomiczne z wykorzystaniem atlasu mózgu szczura.
- Wartość skalowalności: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez dostarczenie ilościowych, specyficznych dla regionu odczytów molekularnych z poszczególnych obszarów mózgu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zachowuje istotność w kontekście choroby, umożliwiając analizę zmian w ekspresji genów i mikroRNA indukowanych przez TBI w anatomicznie zdefiniowanych obszarach mózgu.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspiera decyzje dotyczące rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, umożliwiając podłużne profilowanie molekularne od etapu odkryć po etapy przedkliniczne.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Koncentruje się na wartości prognostycznej poprzez izolację przyczynowych zmian molekularnych w konkretnych regionach, a nie na średnich wartościach dla całej tkanki.
Integracja potoku i przepływu pracy
LCM wpisuje się w kontinuum odkryć, od identyfikacji celu, poprzez optymalizację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, umożliwiając analizę mechanizmów TBI opartą na hipotezach w kluczowych obszarach mózgu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez izolację specyficznych populacji komórek z obszarów dotkniętych urazami, takich jak jądro półleżące (nucleus accumbens core) oraz jądro nadskrzyżowaniowe (suprachiasmatic nucleus).
- Przesiew: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu cięciu w określonych współrzędnych bregma oraz przetwarzaniu w warunkach wolnych od RNaz w celu uzyskania wiarygodnej wydajności RNA.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych, w tym profilów ekspresji genów i mikroRNA z tkanki pobranej za pomocą mikrodysekcji laserowej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z pracami przedklinicznymi, umożliwiając analizę epigenetyczną i metylacyjną po przeprowadzeniu LCM, zgodnie z opisem w protokole.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi wielokrotnie wykorzystywalną metodę w różnych modelach chorób, której zasady można zastosować w badaniach nad ekspresją genomiczną w innych kontekstach urazów lub chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej poprzez walidację celów oraz redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w analizie szlaków TBI.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zastosowaniu sekcji w kriotomie, prowadzenia według atlasu oraz przepływów pracy z kontrolą aktywności RNazy.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach poprzez izolację specyficznych dla regionu odpowiedzi molekularnych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja dostosowana do ryzyka oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na dopasowaniu biomarkerów rozdzielonych przestrzennie.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu neuroanatomii, sekcjonowania w kriosztacie oraz obsługi instrumentarium do laserowej mikrodysekcji uchwytowej.
- Konieczne jest zapewnienie środowiska wolnego od RNaz, kriosztatu w temperaturze -20°C, optymalnego medium do cięcia (OCT) oraz systemów laserowych UV/IR.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów barwienia, zbierania sekcji i ładowania kapturek pomiędzy zespołami neurobiologii i biologii molekularnej.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie współrzędnych sekcjonowania względem bregmy dla różnych obszarów mózgu i modeli zwierzęcych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność rygorystycznej kontroli zanieczyszczeń oraz biegłość techniczną w prowadzeniu śladu laserem UV w celu zapewnienia pełnego przylegania tkanki.
