Name: Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj mikrodysekcję laserową do izolacji komórek z określonych obszarów mózgu szczura dotkniętych urazem urazowym. Ta metoda umożliwia analizę ekspresji genów i mikroRNA w korze przedczołowej oraz hipokampie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Elizabeth Sumner za pomoc w edycji tego rękopisu. Finansowanie tego projektu zostało częściowo zapewnione przez The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research i RO1NS052532 HLH.

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego, Galveston, Teksas, zgodnie z zaleceniami National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition, National Research Council).
1. Pobieranie tkanek, identyfikacja regionów i sekcje
<ol>
	<li>Badany dorosły samiec, szczury Sprague-Dawley, w wieku około sześciu tygodni i ważące 250 - 300 g, na eksperymentalne uszkodzenie płynem udarowym, jak opisano w Shimamura et al.4.</li>
	<li>Dwadzieścia cztery godziny po eksperymentalnym TBI humanitarnie poddaj zwierzęta eutanazji, umieszczając je w komorze o stężeniu izofluranu 4%, aż do głębokiego znieczulenia. Upewnij się, że śmierć nastąpi przez ścięcie, wytnij mózgi i natychmiast zamroź w sproszkowanym suchym lodzie. Zamrożone mózgi należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do momentu podzielenia na sekcje.</li>
	<li>Przed jakąkolwiek procedurą LCM, która obejmuje analizę transkrypcyjną, należy oczyścić wszystkie powierzchnie detergentem eliminującym RNazę, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i degradacji RNA. 
	UWAGA: To czyszczenie obejmuje obszar używany do barwienia, kriostat, w którym tkanka jest cięta, oraz obszar wokół urządzenia LCM.</li>
	<li>Pobrać tkankę mózgową z magazynu i umieścić w kriostacie schłodzonym do temperatury -20 °C. Pozwolić mózgowi zrównoważyć się do temperatury komory kriostatu przez ~10 minut.</li>
	<li>Umieść mózg brzuszną stroną do góry na prześcieradle gazy na górze stolika kriostatu. Za pomocą czystej, wolnej od RNaz żyletki odetnij tylną część tuż obok móżdżku (można ją zachować lub wyrzucić) oraz część tuż przed skrzyżowaniem wzrokowym (och).</li>
	<li>Umieść niewielką ilość podłoża o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w dwóch oddzielnych krioformach. Umieść mózg (zawierający czołową korę asocjacyjną (FrA) i rdzeń jądra półleżącego (AcbC)) w krioformach przednią stroną do dołu. Dodać wystarczającą ilość pożywki OCT, aby pokryć tkankę.
	<ol>
		<li>Powtórz ten krok z tkanką mózgową zawierającą hipokamp (Hp) i jądro nadskrzyżowaniowe (SCN).</li>
		<li>Pozostaw pożywkę OCT do całkowitego zamrożenia na ~ 20 minut w kriostacie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy tkanka i podłoże OCT zostaną całkowicie zamrożone, wyciśnij niewielką ilość OCT na głowicę montażową i dociśnij zamrożone krioformy zawierające tkankę do głowicy montażowej. Pozwól OCT całkowicie zamarznąć, aby pleśń zawierająca tkankę była bezpiecznie przymocowana do głowy.</li>
	<li>Przymocuj mocowanie głowicy do uchwytu sekcyjnego i dokręć. Wyreguluj kąt cięcia w stosunku do ostrza kriostatu za pomocą dźwigni regulacyjnych, aby zapewnić równomierne cięcie sekcji.</li>
	<li>Ustaw grubość przekroju na 30 μm. Podczas cięcia bloku tkanki zawierającego FrA i AcbC, najpierw rozpocznij cięcie, aż kora mózgowa stanie się widoczna, a następnie rozpocznij zbieranie.</li>
	<li>Odnosząc się do Atlasu Mózgu Szczura12, przekrój i zbierz skrawki mózgu, delikatnie umieszczając szkiełka z membrany polietylenu naftalanowego (PEN) o temperaturze pokojowej na wierzchu pociętej tkanki dla FrA, aż do osiągnięcia wtórnej kory ruchowej (M2) na poziomie Bregma 5,16 mm.
	<ol>
		<li>Wizualnie upewnij się, że szkiełko przylega, sprawdzając, czy tkanka i OCT są całkowicie stopione na szkiełku. Przechowywać wszystkie szkiełka z skrawkami tkanek w kriostacie do czasu barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj sekcję, aż spoidło przednie (aca) stanie się widoczne i połączy się w jedno pełne spoidło pod widocznymi teraz komorami bocznymi (LV) na głębokości Bregma 1,80 mm.</li>
	<li>Zbieraj sekcje, aż LV pojawią się, aby połączyć się z aca na Bregma 0.84 mm.</li>
	<li>Po zakończeniu sekcji dla FrA i AcbC usuń zamontowany blok tkankowy i zastąp go blokiem zawierającym HP i SCN.</li>
	<li>Przekrój do momentu spłaszczenia och w Bregma -0,48 mm, gdy uwidoczni się trzecia komora (3 V).</li>
	<li>Zbieraj skrawki dla SCN od tego momentu aż do Bregma -0,72 mm, kiedy zaczyna się dekusacja nadoptyczna (sox). 
	UWAGA: Może być konieczne zebranie większej liczby skrawków tkanek w całym och, ponieważ SCN jest łatwo przepuszczany.</li>
	<li>W przypadku pobierania HP należy ciąć do momentu, gdy rogi zakrętu zębatego warstwy komórek ziarnistych (GrDG) będą widocznie widoczne na głębokości Bregma -3,00 mm.</li>
	<li>Zbieraj skrawki, aż podpola CA hipokampa zostaną połączone w odcinkach koronalnych pod Bregma -4,78 mm. Ten szczegół pozwala na pełne pobranie hipokampa pod kraniotomią i miejscem urazu. 
	UWAGA: Jak wykazano w poprzednich publikacjach z tego laboratorium, większość uszkodzonych komórek będzie widoczna w tym zakresie i jest to odpowiednie do analizy ekspresji genów lub mikroRNA.</li>
</ol>
2. Protokół barwienia
<ol>
	<li>Przed barwieniem umyj wszystkie naczynia i obszar barwienia w dygestoriach chemicznych z detergentem eliminującym RNazy. Preparat ten zmniejsza ryzyko degradacji RNA na skutek zanieczyszczenia.</li>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki i roztwory barwiące w wodzie wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Weź stojak ze szkiełkami przechowywanymi w kriostacie i umieść w dygestorium. Pozwól szkiełkom się rozgrzać przez 30 sekund. Umieść je w roztworach barwiących (przygotowanych z wodą wolną od nukleaz) w następujący sposób: 75% EtOH przez 1 min, woda wolna od nukleaz przez 1 min, 1% fiolet krezylowy przez 1 min, woda wolna od nukleaz przez 30 s, woda wolna od nukleaz przez 30 s, 95% EtOH przez 30 s, 100% EtOH przez 30 s, ksylen przez 3 min i ksylen przez 3 min.</li>
	<li>Pozostaw stojak do wyschnięcia na powietrzu nie dłużej niż 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Alternatywnie, umieść stojaki w eksykatorze próżniowym bez Rnazy w celu szybszego suszenia. Po wysuszeniu natychmiast przejdź do LCM.</li>
</ol>
3. Stereotaktyczny atlas sterowany laserowym mikrodyskrypcją z systemem LCM
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury LCM do analizy RNA, należy przetrzeć obszar pobierania i obszar wokół urządzenia detergentem eliminującym RNazy i 100% EtOH.</li>
	<li>Przestaw wyłącznik zasilania na jednostce generującej laser na podczerwień przed włączeniem podstawy mikroskopu i poczekaj, aż system zostanie zainicjowany przed uruchomieniem oprogramowania z pulpitu. 
	UWAGA: Jeśli nie zostanie to zrobione w tej kolejności, oprogramowanie nie rozpozna mikroskopu.</li>
	<li>Po uruchomieniu oprogramowania i przejściu przez etapy inicjalizacji, naciśnij przycisk "Obecny etap" w "Panelu ustawień" oprogramowania. Stolik modułowy przesunie się do pozycji, w której można ładować i rozładowywać czapki i slajdy makr LCM.</li>
	<li>Umieść szkiełka membranowe PEN w uchwytach (do trzech na raz) matową krawędzią skierowaną w prawo. 
	UWAGA: W przypadku umieszczenia w uchwycie w niewłaściwej orientacji oprogramowanie może nie być w stanie prawidłowo rozpoznać żądanego obszaru cięcia w podczerwieni lub UV.</li>
	<li>Kliknij pole wyboru "Mem" w "Obszarze obsługi nasadki i szkiełka" obok odpowiedniego slajdu (tj. A, B lub C). Ten krok oznacza, czy szkiełko jest szkiełkiem membranowym. Następnie kliknij żądany slajd, który chcesz najpierw przechwycić.</li>
	<li>Aby kamera wykonała kafelkowy obraz lokalizacji tkanki i orientacji w celu umieszczenia nasadki, wybierz "Obraz" na pasku narzędzi i wybierz "Uzyskaj przegląd" 
	UWAGA: Jeśli użytkownik jest zaznajomiony z pobieraną tkanką, ten krok można pominąć, używając ręcznej kulki przewijania, aby ustawić "Środek regionu" do pobrania.</li>
	<li>Umieść kursor nad obszarem na obrazie sąsiadującym (lub położeniem względnym bez obrazu sąsiadującego), kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Umieść czapkę w środku regionu". Oprogramowanie automatycznie umieści czapkę w wybranej pozycji.</li>
	<li>Wybierz lokalizację. 
	UWAGA: Aby upewnić się, że laser IR jest prawidłowo ustawiony i będzie wykrywał tylko obszary, w których oprogramowanie układa plamki, należy go zlokalizować przed kontynuowaniem.
	<ol>
		<li>Przejdź do obszaru w nasadce, w którym nie ma tkanki. Kliknij "i" w okienku "Narzędzia do mikroanalizy" i wybierz zakładkę "IR Locate". Z panelu oddaj strzał testowy w podczerwieni, aby ocenić, gdzie strzela laser na podczerwień i jaki jest rozmiar plamki.</li>
		<li>Za pomocą kursora kliknij prawym przyciskiem myszy na środku punktu IR i wybierz "Zlokalizowany punkt IR" 
		UWAGA: Rozmiar i intensywność wiązki podczerwieni można zmienić, ręcznie zmieniając "Moc, Średnicę lub Czas trwania" pod każdym oznaczeniem rozmiaru plamki lub przesuwając skalę u dołu okna dialogowego. Może być konieczne oddanie kilku strzałów próbnych, aby zapewnić odpowiednią wielkość plamki. Laser na podczerwień musi być ponownie zlokalizowany za każdym razem, gdy zmienia się położenie nasadki lub zamieniane są suwaki.</li>
		<li>W przypadku cięcia UV zlokalizuj laser UV, wybierając zakładkę "UV Locate" w oknie dialogowym. 
		UWAGA: Ponieważ laser UV i laser IR poruszają się zgodnie, nie ma potrzeby ciągłego przesuwania lasera UV za każdym razem, gdy zmienia się położenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz opcję "Rysowanie odręczne" w "Wybierz panel narzędzi". Za pomocą rysika do ekranu dotykowego narysuj obwód obszaru zainteresowania, uważając, aby nie stracić kontaktu między ekranem dotykowym a główką rysika. Upewnij się, że punkty początkowe i końcowe są ze sobą połączone. 
	UWAGA: Plamki IR zostaną umieszczone automatycznie za pomocą oprogramowania, ale użytkownik może zdecydować się na ustawienie dodatkowych miejsc, aby upewnić się, że tkanka jest przyklejona do nasadki po wykonaniu cięcia UV.</li>
	<li>W przypadku pobierania FrA należy wykonać duży laserowy przechwyt tkanki korowej do momentu, gdy kora M2 pojawi się na Bregma 5.16 mm. 
	UWAGA: Ten szczegół można zmienić w taki sposób, aby zbierane były tylko określone części FrA lub określone typy komórek.</li>
	<li>W przypadku zbierania AcbC uchwyć laserowo obszar znajdujący się w pobliżu aca. 
	Rdzeń i powłoka AcbC pełnią różne funkcje i są fizjologicznie unikalne. Dlatego ważne jest, aby jak najdokładniej śledzić atlas mózgu. Zaleca się zbieranie z nie dalszej przeszłości bregma 0,84 mm, ponieważ te dwa podregiony stają się zbyt ściśle ze sobą związane.</li>
	<li>W celu zbierania Hp uchwyć laserowo podpola CA 1, 2 i 3 hipokampa, zaczynając od Bregma 3,00 mm i używając całkowicie uformowanego GrDG jako fizycznego punktu orientacyjnego do identyfikacji morfologicznej. 
	UWAGA: Na potrzeby tego badania nie należy zbierać wartości powyżej -4,78 mm Bregma, które można wizualnie wyznaczyć jako punkt, w którym subpola Hp są stopione i skierowane brzusznie. Ten obszar został wybrany, ponieważ większość uszkodzonych neuronów można odkryć bezpośrednio pod miejscem uszkodzenia6.</li>
	<li>W przypadku zbierania SCN najpierw wizualnie zidentyfikuj gęsto upakowane jądra, które znajdują się grzbietowo do och, a następnie zbierz.</li>
	<li>Po zebraniu obszarów (wymienionych powyżej) przesuń LCM Macro Caps do "pozycji QC" i sprawdź, czy tkanka jest całkowicie przylegająca, wizualnie upewniając się, że tkanka przecięta promieniami UV jest przymocowana do membrany. Szybko umieść nakrętkę na cienkościennej probówce reakcyjnej o pojemności 0,5 ml wolnej od RNaz zawierającej 100 μl buforu do lizy komórek.</li>
	<li>Próbki należy krótko odwirować, aby zapewnić całkowitą lizę i przechowywać w temperaturze -80 °C. W tym momencie LCM może zostać wstrzymany, a próbki przechowywane do momentu wykorzystania do dalszej analizy genomowej6.</li>
</ol>

<ol><li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12886225">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li>
<li>Mills, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+transcriptome+patterns+of+the+white+and+grey+matter+corroborate+structural+and+functional+heterogeneity+in+the+human+frontal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe.</a> PLoS One. 8 (10), e78480(2013).</li>
<li>Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+in+traumatic+brain+injury%3A+lessons+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Anesthesiol%22%5BJournal%5D)">Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).</li>
<li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain%3A+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).</li>
<li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function%3A+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li>
<li>Rojo, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 6 (8), e23111(2011).</li>
<li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).</li>
<li>Shearer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+fluctuations+in+gene+expression+in+aging+hippocampal+neurons+could+be+exacerbated+by+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Clin.Exp.Res%22%5BJournal%5D)">Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury.</a> Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).</li>
<li>Caeyenberghs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+structural+networks+and+executive+deficits+in+traumatic+brain+injury+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct.Funct%22%5BJournal%5D)">Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients.</a> Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).</li>
<li>Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+nucleus+accumbens+deep+brain+stimulation+in+treatment-resistant+depression%3A+evidence+for+sustained+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy.</a> Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).</li>
<li>Karatsoreos, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Circadian+Disruption+on+Mental+and+Physical+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Neurol.Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health.</a> Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).</li>
<li>Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GABA+receptor+subunits+in+the+hippocampus+and+thalamus+after+experimental+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury.</a> Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).</li>
<li>Huusko, N., Pitkanen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+immunoreactivity+and+expression+of+GABAA+receptor+subunits+in+the+thalamus+after+experimental+TBI%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI.</a> Neuroscience. 267, 30-45 (2014).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Academic Press. (2013).</li>
<li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).</li>
<li>Hellmich, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+analysis+reveals+common+pro-survival+mechanisms+of+metyrapone+and+carbenoxolone+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 8 (1), e53230(2013).</li>
<li>Boone, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-focused+PCR+array+profiling+of+enriched+populations+of+laser+capture+microdissected+hippocampal+cells+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 10 (5), e0127287(2015).</li>
<li>Boone, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+Brain+Injury-induced+Dysregulation+of+the+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock.</a> PLoS.One. 7 (10), e46204(2012).</li>
<li>Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+overexpression+increases+cortical+neuronal+vulnerability+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury.</a> Brain Res. 1533, 122-130 (2013).</li>
<li>Hellmich, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+levels+assessed+by+CA1+pyramidal+neuron+and+regional+hippocampal+dissections+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.Dis%22%5BJournal%5D)">Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease.</a> Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).</li>
<li>Elstner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson%27s+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+tissue+preparation+for+laser+capture+microdissection%3A+application+for+cell+type-specific+miRNA+expression+profiling+in+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Genomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors.</a> BMC.Genomics. 11, 163(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniach molekularnych mózgu ssaków LCM stało się podstawową techniką. W artykule tym pokazano, że zastosowanie kombinacji laserów tnących IR i UV w systemie LCM może uchwycić zmiany genomowe w dowolnym regionie mózgu ssaków. Regiony te obejmują te, które można zidentyfikować za pomocą konwencjonalnych barwników kompatybilnych z LCM, takich jak fiolet krezylowy lub hematoksylina i eozyna. Szybkość procesu wychwytywania laserowego i zdolność do wykonywania LCM na grubszych odcinkach 30 μm na szkiełkach membranowych PEN pozwala nie tylko na uzyskanie wystarczającej ilości próbek komórek, ale także na wyizolowanie RNA z próbek LCM o odpowiedniej jakości dla wszystkich rodzajów dalszych analiz genomowych; analizy te obejmują mikromacierze16, tablice PCR17 i ilościowe PCR w czasie rzeczywistym18.
Nasze dane stanowią uzasadnienie dla badań, w których wykorzystuje się tkankę LCM. Odkryliśmy, że miR-15b jest regulowany w górę w hipokampie i korze mózgowej (ryc. 4), ale regulowany w dół w jądrze półleżącym i może być biologicznie istotny dla zrozumienia zróżnicowanych skutków TBI w mózgu. Poprzednie badanie sugerowało, że wzrost podatności neuronów korowych na uszkodzenia wynika z nadekspresji kilku miRNA, które negatywnie regulują geny sprzyjające przeżyciu, takie jak Bcl-219. Analiza skanowania docelowego pokazuje, że Bcl-2 jest również regulowany przez miR-15b; w związku z tym nasze dane sugerują mechanistyczne wyjaśnienie, dlaczego określone obszary mózgu (tj. FCx) mogą być selektywnie podatne na TBI. Ważne jest, aby pamiętać, że większość genów jest regulowana przez wiele miRNA, a skorelowanie zmian w dowolnym miRNA z określonym genem docelowym jest trudne. Co więcej, dane te wskazują, że pewne zmiany w ekspresji genów i mikroRNA mogą być wykorzystywane jako biomarkery uszkodzeń mózgu specyficznych dla regionu. Rzeczywiście, obecnie wykorzystujemy te dane w badaniach nad tym, jak nowe neuroprotekcyjne związki leków o właściwościach przeciwdepresyjnych mogą w różny sposób wpływać na ekspresję genów i mikroRNA w regionach mózgu związanych z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi. Jednym z ograniczeń naszego badania jest to, że podczas wielu etapów procesu przygotowania preparatów do LCM, integralność RNA może zostać naruszona. Protokół ten opisuje niezbędne kroki w celu ograniczenia ryzyka degradacji RNA. Kolejnym ograniczeniem jest stosunkowo mała liczebność próby wykorzystywanej do obliczeń statystycznych. W przyszłych badaniach zwiększenie wielkości próby powinno zmniejszyć wpływ różnic w ekspresji genów i miRNA wśród poszczególnych zwierząt.
Korzyści płynące z LCM są realizowane w translacyjnych badaniach genomicznych z wykorzystaniem zwierzęcych modeli chorób ludzkich i chorych tkanek 20,21,22,23. Bez możliwości uchwycenia określonych populacji komórek, profile transkrypcyjne różnych regionów mózgu byłyby niepoznawalną i nieczytelną mieszanką wielu typów komórek. Wykorzystanie metod LCM w badaniach nad urazami mózgu doprowadziło do obecnych wysiłków mających na celu określenie biomarkerów specyficznych dla regionu mózgu i zrozumienie, w jaki sposób korelują one z krążącymi biomarkerami TBI.

Mózg ssaków jest niezwykle złożony i niejednorodny, z setkami do tysięcy typów komórek1. Rzeczywiście, badania na ludziach wykazały, że w regionach takich jak kora czołowa strukturalne i funkcjonalne różnice w istocie białej i szarej znajdują odzwierciedlenie w odrębnych i rozbieżnych profilach transkrypcyjnych2. Heterogeniczność mózgu była główną przeszkodą w interpretacji danych dotyczących ekspresji genów oraz w dziedzinie uszkodzeń mózgu. Ta niejednoznaczność w badaniach przedklinicznych doprowadziła następnie do setek nieudanych prób klinicznych leczenia urazów mózgu3.
Używamy metod mikrodysekcji laserowej (LCM) do badania dysregulacji genów wywołanej urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI) w mózgu szczura4, skupiając się na hipokampie, regionie mózgu, który jest niezbędny do uczenia się i pamięci5. Możliwość laserowego wychwytywania i analizowania ekspresji genów zarówno w umierających, jak i ocalałych neuronach daje nam lepsze zrozumienie roli stochastyczności w ekspresji genów w określaniu wyniku (przeżycia neuronów) po TBI6. Techniki LCM okazały się również przydatne do badania wpływu TBI na neurony hipokampa podczas porównywania młodych i starzejących się myszy7 lub rats8.
W ostatnich badaniach badaliśmy inne regiony mózgu szczura, na które TBI miało negatywny wpływ, skupiając się na obszarach u szczurów i u ludzkich pacjentów z TBI, które są związane z funkcjami wykonawczymi (np. kora czołowa9) i choroby współistniejące TBI; te choroby współistniejące obejmują depresję (np. jądro półleżące<klasa sup="xref">10) i zaburzenia rytmu dobowego (jądro nadskrzyżowaniowe11). W poprzednich badaniach Huusko i Pitkanen12 oraz Drexel et al.13 użył LCM do zbadania ekspresji genów we wzgórzu i podwzgórzu. Nasze badanie opiera się na tych wcześniejszych obserwacjach i obejmuje cztery inne regiony mózgu. Aby zbadać specyficzne dla regionu zmiany molekularne wywołane po TBI, konieczne było zdobycie wiedzy specjalistycznej w zakresie identyfikacji i uzyskiwania typów komórek w tych regionach za pomocą systemu LCM. Lasery UV i podczerwone (IR) pozwalają na precyzyjną mikrodysekcję pożądanych obszarów mózgu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób używamy tego systemu LCM, kierowanego współrzędnymi stereotaktycznymi w atlasie mózgu szczura14, do identyfikacji i laserowego przechwytywania czterech regionów mózgu szczura, na które w różny sposób wpływa eksperymentalna metoda uszkodzenia mózgu spowodowanego płynną fuzją4.

<table><tbody><tr><td>System mikrodysekcji Arcturus Laser Capture</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane membranowe Arcturus PEN&nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure Czapki LCM</td><td>Biosystemy stosowane (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Octan fioletu krezylowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen (klasa histologiczna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof (klasa histologiczna)</td><td>UTMB Apteka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Zdolność do izolowania określonych obszarów mózgu może być utrudniona w technikach dysocjacji tkanek, które nie zachowują swojego przestrzennego rozmieszczenia. Takie techniki mogą również potencjalnie zniekształcić analizę ekspresji genów, ponieważ sam proces może zmienić wzorce ekspresji w poszczególnych komórkach. Tutaj opisujemy metodę mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) w celu selektywnego zbierania określonych obszarów mózgu dotkniętych urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI) przy użyciu zmodyfikowanego protokołu barwienia Nissl (fiolet krezylowy) i wskazówek atlasu mózgu szczura. LCM zapewnia dostęp do regionów mózgu w ich naturalnych pozycjach oraz możliwość wykorzystania anatomicznych punktów orientacyjnych do identyfikacji każdego konkretnego regionu. W tym celu LCM był wcześniej używany do badania ekspresji genów specyficznych dla regionu mózgu w TBI. Protokół ten umożliwia badanie wywołanych przez TBI zmian w ekspresji genów i mikroRNA w różnych obszarach mózgu tego samego zwierzęcia. Zasady niniejszego protokołu mogą być zmieniane i stosowane do szerokiego zakresu badań oceniających ekspresję genomu w innych chorobach i/lub modelach zwierzęcych.

Schemat przedstawiony na Rysunku 1 ilustruje ogólny przebieg pracy w procesie LCM konkretnych obszarów mózgu z wykorzystaniem atlasu oraz potencjalne zastosowania w analizach następczych. Badanie to koncentrowało się na czterech obszarach mózgu istotnych dla patofizjologii TBI oraz rozwoju chorób współistniejących: FrA, AcbC, SCN i Hp. Ograniczeniem występującym podczas LCM konkretnych obszarów mózgu jest fakt, że lokalizacje anatomiczne są często niejasne z powodu braku wyraźnych granic, co widać na Rysunku 2 (A, D, G, J). Wykorzystanie atlasu mózgu do prowadzenia sekcjonowania i laserowego wycinania konkretnych obszarów zmniejsza prawdopodobieństwo zanieczyszczenia próbki regionami mózgu innymi niż docelowe. Przy zachowaniu staranności w śledzeniu punktów orientacyjnych tkanki, zarówno podczas sekcjonowania, jak i po barwieniu Nissla, technologia LCM może zapewnić wysoce spójny sposób pozyskiwania dyskretnych populacji komórek, jąder lub obszarów15. Długoterminowym celem tych badań jest zidentyfikowanie genów i mikroRNA, które potencjalnie mogą służyć jako zastępcze, nieinwazyjne biomarkery uszkodzeń specyficznych dla danego obszaru mózgu. Pierwszym krokiem w tym procesie opracowywania biomarkerów jest charakterystyka specyficznych dla tkanki zmian transkrypcyjnych po eksperymentalnym TBI. Dane te mogą następnie zostać skorelowane ze zmianami indukowanymi urazem w krążących biofluidach.
Przedstawione procedury zostały zoptymalizowane w celu zminimalizowania ryzyka degradacji RNA, aby umożliwić analizę RNA poprzez odwrotną transkrypcję całkowitego RNA uzyskanego metodą LCM przed ilościową reakcją PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Całkowite RNA (w tym małe i duże frakcje RNA) wyizolowano za pomocą metody kolumienkowej z tkanki pobranej za pomocą mikrodysekcji laserowej z poszczególnych obszarów mózgu. Aby ocenić integralność, jakość i ilość RNA po procedurach izolacji, próbki RNA poddano krótkiej denaturacji w 70 &#176;C następnie poddano analizie za pomocą analizatora RNA. Pomiary jakościowe obejmowały analizę amplitud piku prążków rRNA 18S i 28S (Rycina 3), co może być reprezentatywne dla całkowitej degradacji, oraz przy użyciu &#34;Wskaźnik integralności RNA (RNA Integrity Number)&#34; (RIN). Przy zastosowaniu starannych technik wolnych od RNaz, RNA wyizolowane z próbek LCM zazwyczaj charakteryzuje się wartościami RIN w zakresie od 6 do 8. Niższa wartość RIN może wskazywać na niską jakość RNA i potencjalnie obniżyć dokładność analizy ekspresji genów oraz mikroRNA. Ilekroć RIN jest wyższy, rośnie pewność co do poprawności wyników uzyskanych z analizy RNA.
Analizę RT-qPCR przeprowadzono z wykorzystaniem zestawów starterów/sond dla poszczególnych genów i mikroRNA (Rysunek 4). Około 1 ng całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA i preamplifikacji przed wykonaniem qPCR zgodnie z protokołem producenta. Geny powiązane z urazem, oceniane w niniejszym badaniu, obejmowały BCL2 Associated X, Apoptosis Regulator (Bax), B-Cell CLL/Lymphoma 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related Cysteine Peptidase (Casp3), Brain Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) oraz CAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb). Wybrano miR-15b, ponieważ wykazano jego zmianę po eksperymentalnym TBI w pojedynczych obumierających neuronach. Posiada on również eksperymentalnie zwalidowane i bioinformatycznie przewidziane cele genowe o funkcjach pro-przeżywalnościowych (dane niepublikowane). Znormalizowane stosunki zmian krotności (fold-change) obliczono metodą ΔΔCt, porównując poziomy ekspresji genów i mikroRNA u zwierząt z TBI oraz w naiwnych grupach kontrolnych, przy normalizacji odpowiednio do genu endogennego (Gapdh) lub małego RNA (U6). Zmiana krotności powyżej 1 wskazuje na ogólną upregulację danego genu lub mikroRNA, a odwrotnie, zmiana krotności poniżej 1 wskazuje na downregulację. Analiza statystyczna wykazała istotne zmiany w ekspresji genów między grupą TBI a naiwną kontrolą (p&#160;≤ 0,05), które były zależne od regionu mózgu. Nie stwierdzono istotnych zmian w ekspresji miR-15b między grupą TBI a naiwną kontrolą, ale zaobserwowano tendencje do wyższej i niższej ekspresji w sposób zależny od regionu mózgu. Dane te sugerują, że w celu oceny zmian w ekspresji mikroRNA niezbędna jest dalsza optymalizacja. Możliwe jest również, że wielkość próby była zbyt mała, aby uzyskać istotność statystyczną, częściowo ze względu na naturalną zmienność ekspresji. Przyszłe badania będą obejmować zwierzęta poddane operacjom pozorowanym (sham), aby upewnić się, że zmiany ekspresji genów i mikroRNA wynikają z TBI, a nie z przygotowania chirurgicznego.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg" /> 
Rycina 1. Schemat procedury LCM z wykorzystaniem atlasu anatomicznego do późniejszych analiz genomicznych. (A-F) Procedury od przygotowania zwierząt po analizę qPCR: (A) Dorosłe samce szczurów linii Sprague Dawley (~6 tygodni życia, masa ciała 300 g) zostają poddane znieczuleniu, urazowi TBI metodą uderzenia cieczą (fluid percussion TBI), a następnie humanitarnie uśpione 24 h po urazie. (B) Seryjne przekroje (30 µm) świeżo zamrożonych mózgów są wykonywane w oparciu o współrzędne specyficznych obszarów mózgu (FrA, AcbC, Hp, SCN) z atlasu The Rat Brain autorstwa Paxinosa i Watsona. (C) Przekroje są utrwalane, barwione metodą Nissla (1% fioletu krezylowego), odwadniane i suszone na powietrzu. (D) LCM przeprowadzany jest w zidentyfikowanych obszarach mózgu przy użyciu systemu LCM. (E) Makro-kapturki LCM przenoszone są do probówek 0,5 mL wolnych od RNaz zawierających 100 μL buforu do lizy komórek i przechowywane w temperaturze -80 ºC do momentu izolacji RNA na potrzeby analiz genomicznych. RNA może następnie zostać poddane odwrotnej transkrypcji w celu analizy RT-qPCR genów lub mikroRNA, aby zbadać różnicową ekspresję celu molekularnego po TBI i/lub pomiędzy interesującymi obszarami mózgu (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg" /> 
Rycina 2. LCM obszarów mózgu objętych TBI. Reprezentatywne obrazy przekrojów tkankowych pobranych z boku ipsilateralnego względem miejsca urazu przy użyciu funkcji laserów IR i UV w systemie LCM (A-I). Tkankę sekcjonowano w kriotomie (30 µm) i nanoszono na szkiełka z membraną PEN. Następnie przekroje utrwalono, zabarwiono metodą Nissla fioletem krezylowym (1%) i odwodniono, aby zidentyfikować konkretne obszary mózgu na podstawie punktów orientacyjnych opisanych w atlasie Paxinos and Watson's The Rat Brain Atlas. (A-C) Obszar przedczołowej kory asocjacyjnej (FrA) (D-F) Elementy warstw piramidowych CA1, CA2 i CA3 hipokampa (Hp) znajdujące się obok w pełni uformowanych rogów warstwy ziarnistej zakrętu zębatego (GrDG). (G-I) Obszar jądra półleżącego (AcbC) proksymalnie i rostralnie względem commissary przedniej (aca). (J-K) Jądro nadskrzyżowaniowe (SCN) rostralnie względem skrzyżowania wzrokowego (och). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg" /> 
Rysunek 3. Reprezentatywne skany jakości RNA. Reprezentatywne elektroferogramy i powiązane obrazy żelowe RNA wyizolowanego z tkanek pobranych metodą LCM (A-D). Elektroferogramy i powiązane obrazy żelowe wykazują nienaruszone RNA na podstawie obecności pików i prążków żelowych 18s i 28s rRNA. Takie RNA nadaje się do wszystkich dalszych zastosowań, w tym do analiz genomicznych i proteomicznych. (A) RNA z przedczołowej kory stowarzyszeniowej (FrA). RIN 6.1. (B) RNA z hipokampa (Hp). RIN 4.4. (C) RNA z rdzenia jądra półleżącego (AcbC). RIN 7.3. (D) RNA z jądra nadskrzyżowaniowego (SCN). RIN 7.6. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg" /> 
Rycina 4. Analiza downstream ekspresji genów i mikroRNA w określonych obszarach mózgu za pomocą RT-qPCR. Przeprowadzono indywidualną analizę RT-qPCR dla wybranych genów (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) oraz wybranego mikroRNA (miR-15b) w obszarach mózgu wyizolowanych za pomocą mikrodysekcji laserowej po TBI (Hp i AcbC n= 5, FrA n= 4) i porównano je z nieuszkodzonymi zwierzętami naiwnymi (n= 4). Analizę genów związanych z patogenezą TBI przeprowadzono dla obszarów Hp, AcbC, FCx. Dane przedstawiono jako znormalizowane stosunki zmian krotności (fold change) w porównaniu do naiwnych kontrolnych obszarów mózgu (nieparametryczny test t z poprawką Welcha ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Różnicowa ekspresja miR-15b w różnych obszarach mózgu przedstawiona jest jako znormalizowane zmiany krotności w porównaniu do kontroli naiwnej (± SEM) (B). Dane z SCN (n=2) nie zostały uwzględnione. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Opisujemy użycie mikrodysekcji laserowej do uzyskania próbek różnych populacji komórek z różnych regionów mózgu do analizy genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na badanie zróżnicowanych skutków urazowego uszkodzenia mózgu w określonych obszarach mózgu szczura.

Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu mikrodysekcji sterowanej laserem jest pobranie komórek ze specyficznych obszarów mózgu dotkniętych urazowym uszkodzeniem mózgu w celu przeprowadzenia analizy molekularnej. Jestem doktor Helen Hellmich. Mój asystent, Harris Weisz, student programu Patofizjologii Człowieka i Medycyny Translacyjnej tutaj, w oddziale medycznym University of Texas, zademonstruje, w jaki sposób wykorzystujemy metody mikrodysekcji sterowanej laserem w naszych badaniach nad urazami mózgu.Ta metoda może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów i konsekwencji zmian wywołanych przez TBI w określonych obszarach mózgu, takich jak kora przedczołowa, która kontroluje funkcje wykonawcze, oraz hipokamp, który jest istotny dla procesów zależnych od pamięci. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania wpływu procesu chorobowego na wiele oddzielnych obszarów mózgu lub poszczególne typy komórek z tego samego mózgu.Przed każdą procedurą LCM obejmującą analizę transkrypcyjną, należy oczyścić wszystkie powierzchnie detergentem eliminującym RNazy, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji i degradacji RNA. Wyjąć tkankę mózgową z miejsca przechowywania i umieścić w kriosztacie schłodzonym do -20 °C.Pozostawić mózg do wyrównania temperatury z komorą kriostatu przez około dziesięć minut. Umieścić mózg stroną brzuszną do góry na arkuszu gazy na stole kriostatu. Za pomocą czystego ostrza do RNA odciąć część tylną tuż przed móżdżkiem oraz część znajdującą się przed skrzyżowaniem wzrokowym.Umieść niewielką ilość medium do kriostatu (OCT) w dwóch oddzielnych formach do mrożenia. Umieść mózg zawierający korę przedczołową oraz jądro treści we jednej formie, stroną wewnętrzną skierowaną w dół. Dodaj wystarczającą ilość medium OCT, aby całkowicie pokryć tkankę.Powtórz ten krok z fragmentem tkanki mózgowej zawierającym hipokamp i jądro nadskrzyżowaniowe. Pozostaw medium OCT do całkowitego zamrożenia na około 20 minut w kriotomie. Gdy tkanka i medium OCT zostaną całkowicie zamrożone, wyciśnij niewielką ilość OTC na głowicę montażową.Dociśnij zamrożoną formę kriogeniczną do głowicy montażowej i poczekaj, aż OCT całkowicie zamarznie, tak aby forma zawierająca tkankę była bezpiecznie przymocowana do głowicy. Przymocuj głowicę do uchwytu sekcyjnego i dokręć śrubę. Za pomocą dźwigni regulacyjnych ustaw kąt cięcia względem noża kriotoma, aby zapewnić równomierne wycinanie sekcji.Ustaw grubość przekroju na 30 mikronów. Podczas wykonywania przekrojów bloku tkanki zawierającego hipokamp i SEN, prowadź sekcjonowanie aż do momentu spłaszczenia skrzyżowania nerwów wzrokowych przy bregmie 0,48 milimetrów, kiedy widoczny stanie się trzeci komora mózgu. Następnie zbieraj przekroje do SEM od tego punktu, delikatnie układając na wierzchu pociętej tkanki szkiełka z błoną z polietylo-naftalenu w temperaturze pokojowej.Wizualnie upewnij się, że preparat przylega do szkiełka, potwierdzając, że tkanka i OTC całkowicie stopiły się na jego powierzchni. Przechowuj wszystkie szkiełka z sekcjami tkankowymi w kriostacie do momentu barwienia. Zaprzestań pobierania sekcji na poziomie bregma 0,72 milimetrów, gdy rozpocznie się dekusacja nadwzrokowa.W celu pobrania hipokampa należy wykonywać przekroje, aż do momentu, gdy rogi warstwy ziarnistej zakrętu zębatego staną się widoczne na poziomie 3,00 mm bregmy. Przekroje należy pobierać do czasu, aż podpola CA hipokampa zleją się w przekrojach czołowych na poziomie 4,78 mm bregmy. Pozwala to na całkowite pobranie hipokampa spod miejsca kraniotomii i urazu.Przed barwieniem należy umyć wszystkie naczynia oraz obszar barwienia w dygestorium chemicznym przy użyciu detergentu usuwającego RNazy. Wyjąć kasetę ze szkiełkami z kriostatu i umieścić ją w dygestorium. Pozostawić szkiełka do ogrzania przez 30 sekund.Zabarw skrawki fioletem krezylowym i oczyść solą fizjologiczną. Pozostaw statyw z zabarwionymi slajdami do wyschnięcia na powietrzu przez nie więcej niż dziesięć minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Po wyschnięciu niezwłocznie przystąp do LCM.Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury LCM do analizy RNA należy przetrzeć obszar pobierania oraz okolicę urządzenia detergentem eliminującym RNazy i 100% ethanol. Przed włączeniem podstawy mikroskopu należy przełączyć przełącznik zasilania w jednostce generującej laser podczerwony i poczekać na zainicjowanie systemu przed uruchomieniem oprogramowania z pulpitu. Po uruchomieniu oprogramowania i przejściu przez etapy inicjalizacji należy otworzyć panel konfiguracji oprogramowania i nacisnąć przycisk „present stage”.Modułowy stolik przesunie się do pozycji, w której można załadować i wyładować nakrętki makro oraz szkiełka LCM. Umieść do trzech szkiełek z membraną w uchwytach, tak aby matowa krawędź była skierowana w prawo. Wybierz obszar obsługi nakrętek i szkiełek obok odpowiedniego szkiełka i zaznacz pole wyboru MEM, aby poinformować oprogramowanie, że załadowano szkiełka szklane z membraną.Następnie kliknij wybrany preparat, który ma zostać przeanalizowany jako pierwszy. Aby uzyskać obraz mozaikowy w celu ustalenia lokalizacji i orientacji tkanki pod kątem rozmieszczenia nakładek, wybierz opcję image na pasku narzędzi, a następnie wybierz acquire overview. Umieść kursor nad obszarem na obrazie mozaikowym, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz place cap at region center.Oprogramowanie automatycznie nałoży nakładkę na wybraną pozycję. Po zlokalizowaniu laserów podczerwonych i UV należy wybrać opcję rysowania ręcznego w panelu narzędzi wyboru. Używając rysika ekranu dotykowego, obrysuj obwód obszaru zainteresowania, dbając o to, aby nie przerwać kontaktu między ekranem dotykowym a końcówką rysika.Należy upewnić się, że punkty początkowy i końcowy są ze sobą połączone. W przypadku pobierania materiału z hipokampa, przeprowadź laserową mikrodysekcję (LCM) podpól CA1, CA2 i CA3 hipokampa, zaczynając od poziomu 3,00 mm względem bregmy i wykorzystując w pełni uformowaną warstwę ziarnistą zakrętu zębatego jako fizyczny punkt orientacyjny do identyfikacji morfologicznej. Po zakończeniu pobierania przesuń nakładki makro LCM do pozycji QC i sprawdź, czy tkanka przylega całkowicie, wizualnie upewniając się, że wycięta promieniami UV tkanka jest przytwierdzona do membrany.Niezbędne jest, aby laser UV wyciął obszar wokół całej tkanki. Niedopełnienie tego warunku spowoduje niepełne przyleganie tkanki do nakładki LCM. Następnie szybko umieść każdą nakładkę w wolnej od RNaz probówce reakcyjnej o cienkich ściankach o pojemności 0,5 mililitra, zawierającej 100 microliters buforu do lizy komórek.Próbki należy krótko wymieszać w wortexie, aby zapewnić całkowitą lizę, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz genomicznych. Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy przekrojów tkanki pobranych z obszaru przeciwległego do miejsca urazu z wykorzystaniem funkcji laserowych podczerwonych i UV w systemie LCM. Jest to obszar przedczołowej kory asocjacyjnej.Na tym obrazie przedstawiono ten sam obszar po pobraniu próbek. Tutaj widoczna jest tkanka na zakrętce po pobraniu. Obraz ten pokazuje komponenty warstw okołorogowych CA1, CA2 i CA3 hipokampa, zlokalizowane obok w pełni uformowanych rogów warstwy ziarnistej zakrętu zębatego.Zebrano regiony CA2 i CA3, a populacje tych komórek są widoczne na nakładce. Tutaj obszar jądra półleżącego (nucleus accumbens core) położony proksymalnie i adrostralnie względem komisury przedniej został celowo wybrany i wiernie odwzorowany na nakładce. Na koniec, za pomocą LCM, po TBI pobrano jądro nadskrzyżowaniowe położone rostralnie względem skrzyżowania nadwzrokowego.Po opanowaniu tej techniki można przetworzyć jeden mózg w ciągu około ośmiu godzin. Czas ten obejmuje obróbkę tkanki, barwienie oraz LCM. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza epigenetyczna, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wzorców metylacji lub ekspresji mikronowej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić LCM w wielu obszarach mózgu w obrębie tego samego organu.

stereotactic-atlas-guided-laser-capture-microdissection-brain-regions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Furmanski, O., et al. Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)W tym filmie indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki nerwowe pochodzące z komórek macierzystych są stereotaktycznie wstrzykiwane do granicy istoty szarej i istoty białej kory głębokiej w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Przeszczepione komórki...

Stereotaktyczny przeszczep zawiesiny komórek nerwowych myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Obrazowanie dwufotonowe, sprzężone z nanodysekcją laserową, są użytecznymi narzędziami do badania procesów zwyrodnieniowych i regeneracyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym z rozdzielczością subkomórkową. Protokół ten pokazuje, jak oznaczać, obrazować i preparować pojedyncze włókna pnące w korze móżdżku in vivo.

Laserowa nanochirurgia aksonów móżdżku in vivo

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Urazowe uszkodzenia mózgu (TBI) pozostają poważnym problemem zdrowotnym. Wykorzystując model chirurgii kontrolowanego wpływu kory mózgowej, można przeprowadzić badania nad skutkami TBI i możliwymi metodami leczenia.

Kontrolowany model uderzenia kory mózgowej w przypadku urazowego uszkodzenia mózgu

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół do wywołania urazu kłutym przodomózgowia u dorosłych myszy. Rana kłuta indukuje ciężką reaktywną glejozę i tworzenie się blizn glejowych, które można następnie zbadać za pomocą standardowych metod immunohistochemicznych.

Wywoływanie reaktywnej glejozy in vivo przez uraz kłuty przodomózgowia

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Tutaj opisujemy protokół indukcji mysiego urazowego uszkodzenia mózgu poprzez kontrolowane uderzenie w korę mózgową z otwartą głową.

Mysi model kontrolowanego wpływu na korę mózgową w celu indukcji urazowego uszkodzenia mózgu

Przedstawiony tutaj protokół pokazuje technikę tworzenia modelu uszkodzenia mózgu u gryzoni. Opisana tutaj metoda wykorzystuje promieniowanie laserowe i celuje w korę ruchową.

Laserowe uszkodzenie mózgu w korze ruchowej szczurów

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Udar mózgu jest globalnym problemem, z minimalnymi możliwościami leczenia i brakiem obecnie klinicznej terapii regenerującej utraconą tkankę mózgową. W tym miejscu opisujemy metody tworzenia precyzyjnego udaru fotozakrzepowego w korze ruchowej gryzoni, a następnie wstrzykiwania biomateriałów hydrożelowych w celu zbadania ich wpływu na regenerację tkanek po udarze.

Wstrzyknięcie hydrożelowych rusztowań biomateriałowych do mózgu po udarze mózgu

Poznaj mikrodysekcję laserową do izolacji komórek z określonych obszarów mózgu szczura dotkniętych urazem urazowym. Ta metoda umożliwia analizę ekspresji genów i mikroRNA w korze przedczołowej oraz hipokampie.

Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym

Przeglądaj więcej filmów