Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich
12 września 2017
Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.
Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest pomiar uwalniania neuroprzekaźników u zwierząt zachowujących się w stanie czuwania. Chociaż ten film demonstruje zastosowanie w neuronauce behawioralnej, z możliwością scharakteryzowania określonego uwalniania neuroprzekaźników w odniesieniu do określonych zdarzeń behawioralnych, technika ta może być stosowana w wielu innych subdyscyplinach neuronauki, takich jak wstrzykiwanie leków. Główną zaletą tej techniki jest jej gotowy charakter do pomiaru uwalniania neuroprzekaźników w czasie zbliżonym do rzeczywistego in vivo.
Zacznij od wstrzyknięcia 500 mikrogramów progesteronu w 0,1 mililitra oleju z nasion bawełny, podskórnie, na cztery godziny przed wprowadzeniem samca, aby wywołać receptywność seksualną. Pamiętaj, aby przetestować każde zwierzę na początku ciemnej fazy ich cyklu dobowego, ponieważ zachowania społeczne gryzoni podlegają zmianom w warunkach testowania w świetle białym i czerwonym. Roztwory kalibracyjne należy przygotować na świeżo w dniu badania w szklanych probówkach wirówkowych o pojemności 20 mililitrów.
W przypadku roztworu analitu rozpuść 7,4 miligrama kwasu L-glutaminowego w 10 mililitrach ultra czystej wody, delikatnie odwracając probówkę. Następnie przygotuj roztwór interferencyjny, rozpuszczając 176,1 miligramów AA w 10 mililitrach ultra czystej wody. Skonfiguruj kalibrację, umieszczając mieszadło magnetyczne na podstawie podstawowego statywu laboratoryjnego.
Umieść 20-mililitrową zlewkę z płaszczem na mieszadle magnetycznym i clamp na miejscu za pomocą średniego dwubolcowego clamp. Podłączyć zlewkę z płaszczem do łaźni wodnej z obiegiem, aby podgrzać roztwór buforowy do 37 stopni Celsjusza. Dodaj mieszadło magnetyczne i 20 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o stężeniu 100 milimolowym lub PBS do zlewki z płaszczem.
Następnie umieść uchwyt do kalibracji czujnika na górze zlewki z płaszczem i ustaw czterokanałowy przedwzmacniacz kalibracyjny na górze, zabezpieczając go na miejscu za pomocą kąta prostego clamp. Następnie podłącz przedwzmacniacz do urządzenia do kondycjonowania i akwizycji danych, aby zarejestrować dane kalibracyjne. Zbadaj czułość każdego biosensora enzymatycznego na glutaminian przed zapisem eksperymentalnym, umieszczając sondę w uchwycie kalibracyjnym, na zlewce z płaszczem, zanurzając wnękę czujnikową i pewną część przewodu odniesienia chlorku srebra w roztworze buforowym.
Zainicjuj nowe nagranie w interfejsie komputera, korzystając z bezpłatnego oprogramowania do pobierania danych. Następnie podłącz każdy testowany czujnik do portu w czterokanałowym przedwzmacniaczu kalibracyjnym. Pozwól, aby czujniki osiągnęły stabilną linię bazową.
Rozpocznij dodawanie zastrzyków analitu, gdy czujniki osiągną stabilną linię podstawową. Za pomocą otworu w uchwycie kalibracyjnym wprowadzić końcówkę pipety do roztworu buforowego. Następnie użyj narzędzia do szybkiej adnotacji w oprogramowaniu do nagrywania, aby dodać adnotację, kiedy zostanie wykonane wstrzyknięcie.
Następnie wykonaj 10 mikromolowych wstrzyknięć glutaminianu, odpipetowując 40 mikrolitrów roztworu analitu do roztworu buforowego. Poczekaj, aż czujnik ustabilizuje się między dodatkami. Następnie dodać trzy wstrzyknięcia roztworu analitu przed dodaniem pojedynczego wstrzyknięcia z zakłócającego roztworu AA.
Wyłożyć komorę badawczą ściółką pobraną z klatki domowej zwierzęcia. Wyjmij obdurator okluzyjny z kaniuli prowadzącej i włóż elektrodę z włókna węglowego lub sondę enzymatyczną przez wałek prowadzący. Podłącz czujnik do systemu nagrywania.
Następnie ustabilizuj połączenie czujnika, przykręcając mocowanie kołkowe do mocowania głowicy. Następnie umieść zwierzę w komorze testowej. Rozpocznij nagrywanie sygnału amperometrycznego wideo i czasowo zablokowanego w oprogramowaniu.
Pozwól czujnikowi zrównoważyć się w mózgu przed testami eksperymentalnymi. Następnie wprowadź samca bodźca do komory testowej. Po pierwszym zamontowaniu z włożeniem prącia przez samca bodźca, kontynuuj nagrywanie przez dodatkowe 10 do 30 minut, w zależności od celów eksperymentalnych.
Na koniec, po testach behawioralnych, odłącz czujnik żeński. Usuń oba chomiki z komory testowej, a także ściółkę, aby wyczyścić komorę przy użyciu 70% etanolu. Zacznij od oglądania i opisywania filmów, za pomocą bezpłatnego oprogramowania do pobrania na rynku, w zwolnionym tempie, aby precyzyjnie zakodować zachowania związane z sygnałem amperometrycznym.
Umieść adnotację Start Lordosis w kadrze, gdy samica inicjuje zgięcie grzbietowe grzbietu i odchyla ogon do góry. Adnotacja Koniec lordozy, gdy samica kończy tę postawę, co często występuje, gdy samica dostosowuje się do innego miejsca w komorze testowej. Następnie dodaj adnotację Start AI, gdy samica znajduje się w pozycji lordozy, a samiec przesuwa pysk w kierunku okolicy odbytu i narządów płciowych samicy, gdzie może wystąpić wąchanie, lizanie lub dotykanie jej okolicy krocza.
Adnotacja Koniec SI, gdy samiec usunie pysk z bliskiej odległości od okolicy odbytu i narządów płciowych samicy. Następnie dodaj adnotację do Start Mount, gdy samiec zbliża się i kładzie przednie łapy na samicy w pozycji dosiadania, niezależnie od orientacji próby dosiadania. Podobnie, dodaj adnotację do rozpoczęcia intromisji, gdy udane pchnięcie uzyska zamontowany męski dostęp prącia do pochwy kobiety.
W stosownych przypadkach dodaj adnotację Ejakulat, którą można zauważyć po ruchu bieżnika tylną stopą samca. Na koniec dodaj adnotację End Intromission i End Mount jednocześnie w kadrze, gdy samiec usunął dwie przednie łapy, a tym samym nie ma kontaktu z samicą. Ze względu na częstą niemożność wizualizacji jego wycofania, jednocześnie zakoduj te dwa zachowania, aby zapewnić spójność i niezawodność we wszystkich atakach godowych.
Na karcie plik wybierz funkcję Eksportuj i wybierz zakładkę TSV, aby zapisać pomiary napięcia jako plik rozszerzenia TSV. Otwórz każdy plik za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych i zapisz jako XLS/XLSX. Na koniec ręcznie dodaj adnotacje dotyczące rozpoczęcia lordozy przed kryciem w tym samym czasie, gdy rozpoczyna się zachowanie lordozy, które obejmuje również zachowanie wierzchowca, a także na początku nowego ataku godowego, jeśli samica pozostaje w pozycji lordozy.
Podczas napadów godowych przejściowość dopaminergiczna w jądrze zasiedziałym powstaje podczas wprowadzania lub przerwy w pochwie przez samca. Podobny wzorzec zaobserwowano u innych zwierząt w odniesieniu do uwalniania glutaminianu. Z szybkim przemijaniem, które odpowiada indywidualnym przerwaniom w rdzeniu jądra półleżącego grzbietowego podczas napadu kopulacyjnego.
Po opanowaniu tej techniki, nie licząc przygotowawczych operacji sterotaktycznych, można wykonać w ciągu jednego dnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że każdy czujnik jest sprawny. Chociaż ten film pokazuje nagranie z pojedynczą sondą, to podejście można rozszerzyć na jednoczesne podwójne nagrywanie.
Ale to dodaje warstwę złożoności, która nie jest trywialna. Ten film jest pokazany w warunkach oświetleniowych, aby zapewnić dobrą widoczność. Jednak nasze eksperymenty behawioralne przeprowadzamy w ciemnych warunkach, a parametr ten może być zmieniany w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak późniejsza analiza histologiczna wycinków mózgu, w celu zidentyfikowania i potwierdzenia dokładnego umieszczenia czujnika. Dodatkowo, dalsza analiza danych, z wykorzystaniem zakodowanych danych behawioralnych, może być przeprowadzona w odniesieniu do dowolnych parametrów, które są interesujące. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neuronauki do zbadania uwalniania neuroprzekaźników, w tym neuroprzekaźników nieaktywnych elektrycznie, takich jak glutaminian, w czasie zbliżonym do rzeczywistego u obudzonych zwierząt.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kalibrować sondy glutaminergiczne, sondy implantacyjne, przeprowadzić eksperyment behawioralny mierzący zmiany w uwalnianiu neuroprzekaźników do różnych składników zachowania i zakodować te dane do późniejszej analizy. Nie zapominaj o tym, że podczas pracy z żywymi zwierzętami należy być wrażliwym na ich komfort i ogólne samopoczucie, aby zapewnić najlepsze wyniki i zwierzętom
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje pomiar uwalniania dopaminy i glutaminianu podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samic chomików z wykorzystaniem rejestracji amperometrycznej przy stałym potencjale oraz technologii biosensorów enzymatycznych. Technika ta pozwala na uzyskanie wysokiej rozdzielczości czasowej dynamiki neurotransmiterów u czuwających zwierząt wykazujących określoną aktywność, dostarczając istotnych informacji z zakresu neuronauki behawioralnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neuronauka behawioralna
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Dopamina i glutaminian odgrywają kluczowe role w mechanizmach nagrody.
- Pomiar uwalniania neuroprzekaźników może pomóc w zrozumieniu zachowania.
- Technologie o wysokiej rozdzielczości czasowej zwiększają precyzję eksperymentalną.
Cel badania
- Aby scharakteryzować uwalnianie neurotransmiterów w odniesieniu do konkretnych zdarzeń behawioralnych.
- Aby zbadać reakcje behawioralne podczas kopulacji u samic chomików.
- Aby zademonstrować użyteczność technologii enzymatycznych biosensorów u zwierząt w stanie czuwania.
Zastosowane metody
- Zastosowane techniki obejmowały amperometryczne pomiary przy stałym potencjale z wykorzystaniem elektrod z włókna węglowego.
- Układ eksperymentalny polegał na monitorowaniu zachowań reakcyjnych u samic chomika po wywołaniu podatności seksualnej za pomocą hormonów.
- Kluczowe etapy obejmowały zachowanie ostrożności w kwestii ekspozycji na światło oraz terminową kalibrację systemów sensorów.
- Obserwacje behawioralne zostały zsynchronizowane z sygnałami amperometrycznymi w celu przeprowadzenia precyzyjnej analizy.
Główne wyniki
- Badanie szczegółowo opisuje uwalnianie neuroprzekaźników podczas zachowań kopulacyjnych, podkreślając dynamikę czasową.
- Odnotowano istotne spostrzeżenia dotyczące przejściowego charakteru dopaminy w kontekście kopulacji.
- Adnotacje behawioralne wykazały wyraźne korelacje między pomiarami fizjologicznymi a obserwowanymi działaniami.
Wnioski
- Niniejsza praca prezentuje niezawodną metodę rejestracji dynamiki neuroprzekaźników podczas zachowań.
- Zrozumienie czasu uwalniania neuroprzekaźników pogłębia wiedzę na temat zachowań rozrodczych.
- Wyniki te mogą przyczynić się do szerszych zastosowań w neuronauce behawioralnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar dynamiki neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym podczas naturalnych zachowań umożliwia mechanistyczną weryfikację hipotez dotyczących celów terapeutycznych w badaniach nad szlakami nagrody. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w identyfikacji wiodących związków poprzez powiązanie zmian neurochemicznych z konkretnymi zdarzeniami behawioralnymi. Technologia ta ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji związków modulujących OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez korelację przejściowych zmian stężeń dopaminy i glutaminianu z konkretnymi zdarzeniami behawioralnymi, takimi jak intruzja pochwowa.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez jednoczesny pomiar neuroprzekaźników elektroaktywnych i nieelektroaktywnych w modelach zwierząt budzących się i wykazujących aktywność behawioralną.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie ilościowych, zsynchronizowanych czasowo odczytów neurochemicznych, które wyjaśniają mechanizm działania podczas zachowań związanych z nagrodą.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biosensorowe do dalszego przesiewu poprzez ustanowienie protokołów kalibracji dla detekcji glutaminianu i dopaminy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność analizy dzięki amperometrii przy stałym potencjale oraz biosensingowi enzymatycznemu z wykorzystaniem systemów buforowych z kontrolą temperatury.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w różnych paradygmatach behawioralnych dzięki gotowym rozwiązaniom w zakresie przygotowania czujników i przepływu akwizycji danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wykazuje użyteczność systemu w kontekście chorobowym poprzez pomiar uwalniania neuroprzekaźników podczas naturalnie nagradzających zachowań seksualnych u samic chomików.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez korelację przejściowych zmian neurochemicznych z konkretnymi fazami zachowań kopulacyjnych (np. intromisją, ejakulacją).
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza niejednoznaczność w ocenie zaangażowania celu poprzez zapewnienie bezpośredniego pomiaru dynamiki neuroprzekaźników in vivo w czasie rzeczywistym.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając precyzyjnych czasowo danych neurochemicznych powiązanych z zachowaniem.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez pomiar uwalniania dopaminy i glutaminianu podczas określonych epok behawioralnych w jądrze półleżącym.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość analizy poprzez ustanowienie stabilnej linii bazowej i walidację wtrysku analitytu przed rejestracją behawioralną.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zsynchronizowane czasowo, które umożliwiają porównanie odpowiedzi neurochemicznych w różnych warunkach behawioralnych i grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z pracami przedklinicznymi, wykazując użyteczność w naturalnie nagradzającym paradygmacie behawioralnym, istotnym dla obwodów motywacyjnych i nagrody.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalna metoda oceny wpływu związków na uwalnianie neurotransmiterów w wielu modelach behawioralnych i badaniach nad podawaniem leków.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniemu pomiarowi przejściowości neurotransmiterów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zastosowaniu skalibrowanych biosensorów enzymatycznych oraz amperometrii ze stałym potencjałem i kontrolą temperatury.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie neurochemicznych danych zsynchronizowanych czasowo z zachowaniem, co wyjaśnia stopień zaangażowania celu i modulację szlaków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez powiązanie dynamiki neurochemicznej z konkretnymi efektami behawioralnymi, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach opracowywania leków w obszarze OUN.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chirurgii stereotaktycznej, kalibracji czujników oraz metodologii neuronauki behawioralnej.
- Niezbędne jest oprzyrządowanie, w tym urządzenia do kondycjonowania i akwizycji danych, łaźnie wodne do utrzymania buforu w temperaturze 37°C oraz przedwzmacniacze czterokanałowe.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania czujników, protokołów adnotacji behawioralnych oraz procedur eksportu danych (z TSV do XLS/XLSX).
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, w tym warunki testowania cyklu światło/ciemność oraz protokoły przygotowania hormonalnego.
- Uwzględniono ograniczenia praktyczne, takie jak czas stabilności czujnika, konieczność walidacji funkcjonalnej przed rejestracją oraz wzrost stopnia złożoności przy jednoczesnej rejestracji za pomocą dwóch sond.
