Name: Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu u czuwających samic chomików syryjskich podczas zachowań godowych. Amperometria stałopotencjałowa z enzymatycznymi biosensorami umożliwia rejestrację neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować studentowi Danielowi Korusowi za pomoc w uruchomieniu kodu Matlab oraz studentowi Alexowi Boettcherowi za pomoc w prowadzeniu eksperymentów behawioralnych. Projekt ten jest wspierany przez NSF IOS 1256799 R.L.M. oraz przez National Institute on Drug Abuse of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer T32DA007234.

<ol><li>Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2953244/">Overview of brain microdialysis.</a> Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7, Unit 7.1.1-7.1.28 (2009).</li>
<li>Chaurasia, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAPS-FDA+Workshop+white+paper%3A+Microdialysis+principles%2C+application+and+regulatory+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives.</a> Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).</li>
<li>Lindsay, S., Kealey, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsay%2C+S+%22High+performance+liquid+chromatography%22">High performance liquid chromatography</a>. , John Wiley and Sons. New York, NY. (1987).</li>
<li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).</li>
<li>Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+glutamate+release+in+the+brain+using+a+dual+enzyme-based+electrochemical+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor.</a> Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).</li>
<li>Agnesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+instantaneous+neurotransmitter+concentration+system-based+amperometric+detection+of+dopamine%2C+adenosine%2C+and+glutamate+for+intraoperative+neurochemical+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring.</a> J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).</li>
<li>Erksine, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solicitation+behavior+in+the+estrous+female+rat%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Beh%22%5BJournal%5D)">Solicitation behavior in the estrous female rat: A review.</a> Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).</li>
<li>Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+involvement+of+the+shell+and+core+subterritories+of+the+nucleus+accumbens+in+latent+inhibition+and+amphetamine-induced+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity.</a> Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).</li>
<li>Heidbreder, C., Feldon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+neurochemical+and+locomotor+responses+are+expressed+differentially+across+the+anteroposterior+axis+of+the+core+and+shell+subterritories+of+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens.</a> Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).</li>
<li>Pierce, R. C., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+produces+sensitized+increases+in+locomotion+and+extracellular+dopamine+preferentially+in+the+nucleus+accumbens+shell+of+rats+administered+repeated+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine.</a> J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).</li>
<li>Pfaff, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPfaff%2C+DW+%22Drive%3A+Molecular+and+physiological+analyses+of+a+simple+reproductive+behavior%22">Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior</a>. , The M.I.T. Press. Cambridge, MA. (1999).</li>
<li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postcopulatory+sexual+receptivity+in+the+female+hamster%3A+The+role+of+the+ovary+and+the+adrenal%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Behav%22%5BJournal%5D)">Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal.</a> Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%2C+8th+ed%22">Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed</a>. , The National Academies Press. New York, NY. National Research Council (2011).</li>
<li>Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdialysis+study+of+ventral+striatal+dopamine+during+sexual+behavior+in+female+Syrian+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Beh+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters.</a> Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%224+Channel+EEG%2FEMG%2FBiosensor+Manual+V005%22">4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005</a>. , Pinnacle Technology. (2012).</li>
<li>Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).</li>
<li>Pellis, S. M., Pellis, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+rates+of+attack%2C+defense+and+counterattack+during+the+developmental+decrease+in+play+fighting+by+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats.</a> Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).</li>
<li>Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16492118">The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts.</a> Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).</li>
<li>Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+extracellular+glutamate+induced+by+natural+arousing+stimuli+and+intravenous+cocaine+in+the+nucleus+accumbens+shell+and+core%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core.</a> J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).</li>
<li>Kapelsohn, K. I. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/3745">Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology.</a> Protoc Exch. , (2015).</li>
<li>Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiegel%2C+HI+%22The+Hamster%3A+Reproduction+and+Behavior%22">The Hamster: Reproduction and Behavior</a>. , Plenum Press. New York, NY. (1985).</li>
<li>Day, J. J., Carelli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleus+accumbens+and+pavlovian+reward+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The nucleus accumbens and pavlovian reward learning.</a> Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).</li>
<li>Meisel, R. L., Mullins, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+experience+in+female+rodents%3A+Cellular+mechanisms+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences.</a> Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).</li>
<li>Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0079612308613357">The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens.</a> Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).</li>
<li>Hedges, V. L., Staffend, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+reproduction+in+females+as+a+predisposing+factor+for+drug+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction.</a> Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż jest to stosunkowo proste, podczas stosowania tej techniki mogą pojawić się pewne problemy. Po pierwsze, stereotaktyczne rozmieszczenie sond musi być precyzyjne: w przeciwieństwie do mikrodializy, która pobiera próbki z szerszego promienia środowiska zewnątrzkomórkowego otaczającego sondę, ta technika pozwala tylko na pomiar neuroprzekaźnika, który ma bezpośredni kontakt z sondą. Po drugie, w przypadku zapisu z włókna węglowego, ze względu na małą szerokość włókna, może dojść do pęknięcia, a sondę należy włożyć z...

Możliwość pomiaru uwalniania neuroprzekaźników u zwierząt zachowujących się w stanie czuwania pozwala badaczom na powiązanie określonych zachowań z przestrzennymi i czasowymi wzorcami neurotransmisji - potężne narzędzie do badania mechanizmów i obwodów leżących u podstaw zarówno naturalnych, jak i funkcyjnych zachowań w czasie rzeczywistym. Historycznie rzecz biorąc, mikrodializa była stosowana do pomiaru zarówno substancji reaktywnych, jak i niereaktywnych w środowisku zewnątrzkomórkowym mózgu1. Technika ta wykorzystuje ciągły przepływ wodnego roztworu o podobnym składzie jonowym do płynu zewnątrzkomórkowego, przez sondę mikrodializacyjną składającą się z małego trzonka z końcówką wykonaną z półprzepuszczalnej membrany z pustych włókien 2. Po wprowadzeniu sondy, neuroprzekaźniki lub inne interesujące nas anality mogą przenikać przez półprzepuszczalną błonę przez pasywną dyfuzję, a następnie być zbierane w odstępach czasu w celu późniejszej analizy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), techniki chemii analitycznej powszechnie stosowanej do oddzielania, identyfikacji i ilościowego oznaczania składników w niejednorodnej mieszaninie3.
Chociaż mikrodializa jest czułą techniką, która może być użyta do pomiaru praktycznie każdego interesującego analitu, rozdzielczość czasowa jest niska, z maksymalnymi częstotliwościami próbkowania rzędu minut do dziesiątek minut1,2. Wynalezienie szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV), techniki, która opiera się na potencjale redoks form elektroaktywnych, może wyjaśnić niemal chwilowe stężenia analitu będącego przedmiotem zainteresowania w płynie zewnątrzkomórkowym. W skrócie (patrz Robinson et al.4 dla obszernego przeglądu), elektroda jest stosowana do podnoszenia i obniżania napięcia w sposób trójkątnej fali w szybkim tempie czasowym4. Gdy napięcie znajduje się w prawidłowym zakresie, interesujący go związek jest wielokrotnie utleniany i redukowany. To utlenianie i redukcja powoduje ruch elektronów, który wytwarza mały prąd przemienny. Szybkość skanowania odbywa się w skali subsekundowej, przy czym utlenianie i redukcja związków zachodzą w mikrosekundach. Odejmując prąd tła wytwarzany przez sondę od prądu wynikowego, można wygenerować wykres napięcia w funkcji prądu unikalny dla każdego związku. Ponieważ skala czasowa oscylacji napięcia jest znana, dane te można wykorzystać do obliczenia wykresu prądu w funkcji czasu. W ten sposób względne stężenia związku można określić, o ile znana jest liczba elektronów przenoszonych w każdej reakcji utleniania i redukcji4.
Ta specyfika chemiczna i wysoka rozdzielczość czasowa sprawiają, że FSCV jest potężną techniką wykrywania zmieniających się stężeń chemicznych in vivo. Jednak pomimo tych licznych zalet, technika ta wymaga rozległej wiedzy technicznej oraz drogiego sprzętu i konfiguracji. Co więcej, nieelektroaktywnych neuroprzekaźników (np. glutaminianu) nie można zmierzyć za pomocą tej techniki. Na szczęście postęp technologiczny w dziedzinie elektrochemii5, a także komercjalizacja tych wynalazków, wprowadziły stosunkowo proste podejście do pomiaru nieelektroaktywnych neuroprzekaźników u obudzonych zwierząt bez uszczerbku dla precyzji czasowej - technika znana jako technologia biosensorów enzymatycznych. Technika ta wykorzystuje enzymatyczną konwersję nieelektroaktywnego neuroprzekaźnika będącego przedmiotem zainteresowania na dwa substraty, z których jednym jest elektroaktywny nadtlenek wodoru, który jest wykrywany jako amperometryczny prąd utleniania generowany przez przyłożony potencjał5. Dostępne na rynku sondy biosensorów (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1) selektywnie mierzą interesujące nas anality, konkurencyjnie zmniejszając udział interferencji endogennych. W przypadku glutaminianu udział powszechnego interferencyjnego kwasu askorbinowego (AA) jest konkurencyjnie redukowany do mierzonego prądu poprzez kolokalizację oksydazy AA na aktywnej powierzchni enzymatycznej czujnika, przekształcając AA w nieelektroaktywną dihydroaskorbinian i wodę. Ponadto ujemnie naładowana warstwa polimeru Nafion obecna pod warstwą enzymatyczną wyklucza endogenne związki anionowe.
Ten sam eksperymentalny zestaw biosensorów może mierzyć elektroaktywne neuroprzekaźniki, jak w FSCV, ale zamiast tego wykorzystuje zapis o stałym potencjale6. W przeciwieństwie do napięcia oscylacyjnego stosowanego w FSCV, w nagraniu o stałym potencjale napięcie jest utrzymywane na poziomie potencjału redoks dla badanego analitu. Chociaż jest mniej selektywne chemicznie niż FSCV, ponieważ wiele neuroprzekaźników może mieć ten sam potencjał redoks, w obszarach mózgu, które w przeważającej mierze skłaniają się ku jednemu neuroprzekaźnikowi, charakter tego podejścia "pod klucz" przeważa nad brakiem specyficzności chemicznej.
Możliwość pomiaru uwalniania neuroprzekaźników zarówno elektrycznych, jak i nieelektroaktywnych w czasie zbliżonym do rzeczywistego i powiązania ich z konkretnymi zdarzeniami behawioralnymi daje możliwość zbadania zbieżnego uwalniania neuroprzekaźników. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zastosowanie tego systemu do badania neurotransmisji zarówno dopaminy, jak i glutaminianu w odpowiedzi na naturalną nagrodę u obudzonych chomików. Celem niniejszej pracy jest szczegółowe przedstawienie procesu pomiaru uwalniania tego neuroprzekaźnika podczas zachowań seksualnych u samic chomików, w celu wykazania jego wykonalności do badania innych zachowań i paradygmatów eksperymentalnych.
Chomiki są idealnym modelem do wykorzystania w nagraniach elektrochemicznych 
Historycznie rzecz biorąc, modele szczurów i myszy były wykorzystywane w badaniu zachowań seksualnych. Te gatunki gryzoni angażują się w dynamiczną sekwencję kopulacyjną, obejmującą liczne zachowania samic, które obejmują skakanie, rzucanie się i poruszanie uszami, aby zwabić samca do pogoni i ostatecznie dosiąść samicy7. Dosiadanie przez samca (z penetracją pochwy lub bez) trwa tylko kilka sekund, podczas których samica angażuje się w swoją postawę zachowania seksualnego (określaną jako lordoza) również tylko przez kilka sekund, zanim wznowi aktywne zachowania nagabywania. Ten wzorzec zachowania, składający się z wysokiego poziomu aktywności przeplatanego krótkimi okresami bezruchu, jest problematyczny w pomiarze neurotransmisji u zachowujących się zwierząt. Po pierwsze, w nagraniach amperometrycznych mogą występować artefakty ruchowe, które nie są związane z aktywnością neuronalną. Po drugie, lokomocja jest związana z uwalnianiem określonych neuroprzekaźników w określonych obszarach mózgu. Na przykład, uwalnianie dopaminy zostało sprzężone z aktywnością lokomotoryczną w prążkowiu grzbietowym i brzusznym8,9, odkrycie, które stanowiło podstawę do pomiarów dopaminy w mikrodializie po podaniu psychostymulantu10. Ponieważ typowe dla samic zachowania nagabywania u większości gryzoni obejmują wysoki poziom aktywności lokomotorycznej i są reprezentowane przez większość 10-minutowego testu zachowań seksualnych, utrudnia to przypisanie zmian w neurotransmisji wyraźnym składnikom zachowań seksualnych, które łącznie trwają tylko kilka minut.
Aby przeanalizować profil neurochemiczny kobiecych zachowań seksualnych, to laboratorium szukało gatunku, u którego występuje minimalna aktywność lokomotoryczna towarzysząca zachowaniom seksualnym. Sekwencja kopulacyjna u chomików syryjskich (Mesocricetus auratus) jest idealna do zapisów neurochemicznych ze względu na brak zachowań związanych z nagabą, które zwykle obserwuje się u szczurów i myszy11. W konsekwencji samice chomików wejdą i utrzymają pozycję lordozy przez ponad 9 minut z 10-minutowej sesji testowej12. Przy braku obcych ruchów lokomotorycznych samicy można uzyskać zapisy elektrochemiczne in vivo, które można powiązać ze składnikami interakcji seksualnych z samcem.
Napady kopulacyjne u chomików 
Po wprowadzeniu samca zwierzęcia stymulacyjnego do komory testowej, samiec początkowo zaangażuje się w badanie odbytu i narządów płciowych (AI) samicy, zanim ją wsiądzie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Aby samiec mógł dosiąść konia, samica musi przyjąć receptywną postawę seksualną znaną jako lordoza, w której wygina plecy w łuk i odchyla ogon, aby dosiadający samiec mógł uzyskać dostęp prącia do jej pochwy. Samiec dosiada samicy, chwytając ją za zad obiema łapami (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B) i zaczyna pchać, próbując uzyskać intromisję prącia (<silna klasa="xfig">Ryc. 2C). Samiec dopadnie samicę (bez włożenia), a także wprowadzi się kilka razy, zanim ostatecznie osiągnie wytrysk. Ta sekwencja wierzchowców i intromisji prowadzących do wytrysku jest określana jako "atak kopulacyjny". Samce będą miały kilka napadów kopulacyjnych w ciągu jednej sesji.

<table><tbody><tr><td>Dąb Nembutal</td><td>Pharmaceuticals Inc.</td><td>76478-501-50</td><td>Pentobarbital do wstrzykiwań sodu, USP. W tym laboratorium używa się 8,5 mg/100 g masy ciała, wstrzykiwanego dootlenowo.&nbsp;</td></tr><tr><td>Lek przeciwbólowy Loxicom&nbsp;</td><td>Laboratoria Norbrook&nbsp;</td><td>6451603670</td><td>NLPZ przeciwzapalne i przeciwbólowe stosowane do kontroli bólu pooperacyjnego. Ogólne: meloksykam.&nbsp;</td></tr><tr><td>Antybiotyk Enroflox&nbsp;</td><td>Laboratoria Norbrook&nbsp;</td><td>5552915411</td><td>Antybiotyk fluorochinolonowy w profilaktyce zakażeń pooperacyjnych. Ogólne: Enrofloksacyna.</td></tr><tr><td>Beuthanasia-D&nbsp;</td><td>Merck Animal Health</td><td>00061047305</td><td>Pentobarbital Sód, Fenytoina Środek do eutanazji sodu.</td></tr><tr><td>kostne</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8111-16</td><td>Śruba kościana 1/8" (opakowanie 16 sztuk) służy do mocowania czapki czaszki do czaszki.</td></tr><tr><td>Akryl dentystyczny (Bosworth Duz-All)</td><td>Bosworth&nbsp;</td><td>166261C&nbsp;</td><td>Samoutwardzalny akryl dentystyczny służy do budowy nasadki czaszki do mocowania kaniuli i mocowania głowy do czaszki.</td></tr><tr><td>Konfiguracja biosensora sprzętowego&nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8400-K2</td><td>Pinnacle oferuje kompletne zestawy sprzętowe dla nowych użytkowników naszego systemu biosensorów na uwięzi dla szczurów. Zestawy zawierają komutator, przedwzmacniacz oraz system kondycjonowania i akwizycji danych</td></tr><tr><td>Podstawowy pakiet komputera wideo</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>9000-K1</td><td>Podstawowy pakiet komputerowy zawiera wstępnie skonfigurowany komputer z dużą ilością miejsca na dysku twardym, monitor o wysokiej rozdzielczości, klawiaturę i mysz, zasilacz awaryjny oraz wszystkie niezbędne.</td></tr><tr><td>Kamera Video EQ700 EverFocus&nbsp; pakiet</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>&nbsp; 9000-K10&nbsp;</td><td>Kamera noktowizyjna EQ700 z niezależnym źródłem podczerwieni została zakupiona w pakiecie wideokomputera Pinnacle. Dostępne są również opcje kamery kopułkowej (9000-K9) i kamery HD (9000-K11).</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przejęcia Sirenia</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>Darmowy - dostępny do pobrania z pinnaclet.com</td><td>Sirenia&nbsp; Acquisition zapewnia pojedynczą platformę do rejestrowania danych z dowolnego systemu sprzętowego Pinnacle. Oprogramowanie oferuje synchronizację wszystkich strumieni danych, ustawienia konfigurowane przez użytkownika, konsolidację danych i wiele opcji eksportu. Ponadto oprogramowanie zawiera podstawowe moduły przeglądu i analizy zapisów z biosensorów. Syrenia&nbsp; Dostarcza bezpłatne oprogramowanie typu ll-in-one, które idealnie nadaje się do gromadzenia i przeglądania danych.</td></tr><tr><td>Szczur na uwięzi&nbsp; in vitro&nbsp; zestaw kalibracyjny</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7000-K2-T-BAS&nbsp;</td><td>Aby powiązać bieżące zmiany mierzone przez bioczujnik z rzeczywistymi zmianami stężenia analitu, konieczna jest kalibracja bioczujnika przed implantacją zwierzęciu. Proces ten potwierdza również integralność i selektywność czujników. Zestaw kalibracyjny zawiera zlewkę z płaszczem 20 ml (#7058), mieszadło magnetyczne 1/2" na 1/8" (#7059), zacisk kątowy (#7056), zacisk z pojedynczym bolcem z 2 bolcami (#7055), 4-kanałowy preamplifer kalibracyjny (#7053) i uchwyt kalibracyjny (#7051).&nbsp;</td></tr><tr><td>Wymieszaj talerz&nbsp;</td><td>Corning</td><td>6795-410D</td><td>Mieszadło cyfrowe Corning, 5" x 7", 120 VAC używane do wirowania mieszadła magnetycznego w zlewce z płaszczem podczas in vitro kalibracji biosensorów glutaminianu.</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna z możliwością cyrkulacji w pętli zamkniętej</td><td>PolyScience</td><td>8006A11B</td><td>PolyScience 8006A11B 6L Standardowa cyfrowa podgrzewana kąpiel cyrkulacyjna, łaźnia wodna 120VAC została użyta z plastikową rurką do podgrzania zlewki z płaszczem do temperatury fizjologicznej.&nbsp;</td></tr><tr><td>Czujnik z włókna węglowego z kaniulami szczurzymi BASi</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7002-CFS</td><td>Elektroda z włókna węglowego służąca do rejestracji neuroprzekaźnictwa dopaminy.</td></tr><tr><td>Elektroda referencyjna Ag/AgCl</td><td>firmy Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7065</td><td>Niezbędny do nagrań z włókna węglowego.</td></tr><tr><td>Biosensory glutaminianu&nbsp;</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7001&nbsp;</td><td>Sonda biosensoryczna enzymatyczna służąca do rejestracji neuroprzekaźnictwa glutaminergicznego.</td></tr><tr><td>Kaniule prowadzące BASi</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7030&nbsp;</td><td>Kaniule prowadzące wszczepione w obszar mózgu zainteresowania w celu prowadzenia sondy.</td></tr><tr><td>Plastikowa kaniula BASi dla szczurów&nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7011&nbsp;</td><td>Headmount stabilizuje sondę i mocuje się do potencjostatu.</td></tr></tbody></table>

pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

Możliwość mierzenia uwalniania neuroprzekaźników w szybkiej skali czasowej pozwala na powiązanie wzorców neurotransmisji z określonymi zachowaniami lub manipulacjami; potężne narzędzie do wyjaśniania podstawowych mechanizmów i obwodów. Podczas gdy technika mikrodializy jest stosowana od dziesięcioleci do pomiaru prawie każdego analitu będącego przedmiotem zainteresowania w mózgu, technika ta jest ograniczona pod względem rozdzielczości czasowej. Alternatywnie, woltamperometria cykliczna szybkiego skanowania jest zarówno czasowo precyzyjna, jak i niezwykle czuła; Ponieważ jednak ta trudna technicznie metoda opiera się na elektroaktywności badanego analitu, możliwość wykrycia substancji nieelektroaktywnych (np. neuroprzekaźnika glutaminianu) jest wyeliminowana. W tym artykule szczegółowo opisano zastosowanie systemu "pod klucz", który łączy amperometrię o stałym potencjale i biodetekcję enzymatyczną w celu pomiaru zarówno elektroaktywnych, jak i nieelektroaktywnych neuroprzekaźników z precyzją czasową. Połączenie tych dwóch potężnych technik pozwala na stosunkowo łatwy pomiar zarówno tonicznej, jak i fazowej neurotransmisji oraz pozwala na jednoczesne rejestrowanie wielu neuroprzekaźników. Celem tego manuskryptu jest zademonstrowanie procesu pomiaru neurotransmisji dopaminy i glutaminianu in vivo przy użyciu naturalnie nagradzającego zachowania (tj. zachowania seksualnego) u samic chomików, z ostatecznym celem wykazania technicznej wykonalności tego testu do badania innych zachowań i paradygmatów eksperymentalnych.

Wykorzystując opisaną powyżej metodologię kodowania elektrochemicznego i behawioralnego, laboratorium to rozpoczęło charakteryzację wahań tonicznych i fazowych zarówno dopaminy, jak i glutaminianu podczas rejestracji in vivo zachowań seksualnych. Dzięki wysokiej rozdzielczości czasowej tej metodologii możemy dokładniej opisać neurotransmisję podczas zachowań seksualnych, a także przypisać specyficzne zmiany w wzorcach uwalniania do odpowiadających im zmian tonicznych podczas kopu...

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest pomiar uwalniania neuroprzekaźników u budzących się i wykazujących określoną aktywność zwierząt. Chociaż niniejsze wideo demonstruje zastosowanie metody w neuronauce behawioralnej, z możliwością charakterystyki uwalniania konkretnych neuroprzekaźników w odniesieniu do określonych zdarzeń behawioralnych, technikę tę można zastosować w wielu innych poddyscyplinach neuronauki, na przykład przy wstrzykiwaniu leków. Główną zaletą tej techniki jest jej gotowość do bezpośredniego zastosowania w celu pomiaru uwalniania neuroprzekaźników in vivo w czasie zbliżonym do rzeczywistego.Rozpocznij od podskórnego wstrzyknięcia 500 µg progesteronu w 0,1 ml oleju bawełnianego na cztery godziny przed wprowadzeniem samca, aby wywołać receptywność seksualną. Należy upewnić się, że każde zwierzę jest badane na początku ciemnej fazy ich cyklu dobowego, ponieważ zachowania społeczne gryzoni ulegają zmianom w warunkach testowania przy świetle białym i czerwonym. Roztwory kalibracyjne należy przygotować na świeżo w dniu testu w szklanych probówkach do wirowania o pojemności 20 ml.Aby przygotować roztwór analityczny, rozpuść 7,4 mg kwasu L-glutaminowego w 10 ml ultra czystej wody, delikatnie odwracając probówkę. Następnie przygotuj roztwór interferencyjny, rozpuszczając 176,1 mg AA w 10 ml ultra czystej wody. Do przeprowadzenia kalibracji ustaw mieszadło magnetyczne na podstawie standardowego laboratoryjnego statywu.Umieść zlewkę z płaszczem o pojemności 20 ml na mieszadle magnetycznym i przymocuj ją za pomocą średniego zacisku dwuszczepowego. Podłącz zlewkę z płaszczem do cyrkulacyjnej łaźni wodnej, aby podgrzać roztwór buforowy do 37 °C. Do zlewki z płaszczem włóż mieszadło magnetyczne i wlej 20 ml 100 mM soli fosforanowo-buforowanej (PBS).Następnie umieść uchwyt do kalibracji czujnika na górze zlewki z płaszczem, a na nim ustaw czterokanałowy przedwzmacniacz kalibracyjny, mocując go za pomocą zacisku kątowego. Następnie podłącz przedwzmacniacz do urządzenia do przetwarzania i akwizycji danych w celu rejestracji danych kalibracyjnych. Przed rejestracją eksperymentalną przetestuj czułość każdego enzymatycznego biosensora na glutaminian, umieszczając sondę w uchwycie kalibracyjnym na zlewce z płaszczem, tak aby komora pomiarowa oraz część srebrnego drutu referencyjnego (AgCl) były zanurzone w roztworze buforowym.Rozpocznij nowe nagrywanie w interfejsie komputera, korzystając z bezpłatnego, pobieranego oprogramowania akwizycyjnego. Następnie podłącz każdy testowany czujnik do portu w czterokanałowym przedwzmacniaczu kalibracyjnym. Odczekaj, aż czujniki osiągną stabilną linię bazową.Rozpocznij dodawanie wtryskiwań analitycznych, gdy czujniki osiągną stabilną linię bazową. Używając otworu w uchwycie kalibracyjnym, wprowadź końcówkę pipety do roztworu buforowego. Następnie, korzystając z narzędzia szybkich klawiszy adnotacji w oprogramowaniu rejestrującym, oznacz moment wykonania wtryskiwania.Następnie wykonaj wstrzyknięcia glutaminianu o stężeniu 10 µM, pipetując 40 µL roztworu analitu do roztworu buforowego. Odczekaj do ustabilizowania się sygnału czujnika pomiędzy kolejnymi dodatkami. Następnie wykonaj trzy wstrzyknięcia roztworu analitu, a po nich jedno wstrzyknięcie z roztworu interferenta AA.Wyłóż komorę testową ściółką pobraną z domowej klatki zwierzęcia. Usuń szczelny obturator z kaniuli prowadzącej i wprowadź elektrodę z włókna węglowego lub sondę enzymatyczną przez trzpień prowadzący. Podłącz czujnik do systemu rejestrującego.Następnie należy ustabilizować połączenie czujnika, przykręcając mocowanie pinu do uchwytu głowowego. Potem umieść zwierzę w komorze testowej. Rozpocznij nagrywanie wideo oraz zsynchronizowanego czasowo sygnału amperometrycznego w programie komputerowym.Należy odczekać, aż czujnik wyrówna potencjał w mózgu przed rozpoczęciem testów eksperymentalnych. Następnie do komory testowej wprowadza się samca stymulującego. Po pierwszym montowaniu z penetracją penisem przez samca stymulującego, należy kontynuować rejestrację przez kolejne 10 do 30 minut, w zależności od celów eksperymentalnych.Na koniec, po zakończeniu testów behawioralnych, odłącz czujnik samicy. Usuń oba chomiki z komory testowej, a także ściółkę, aby wyczyścić komorę przy użyciu 70% etanolu. Następnie przystąp do przeglądania i adnotowania nagrań wideo za pomocą bezpłatnego, komercyjnego oprogramowania dostępnego do pobrania, wykorzystując tryb spowolnionego tempa w celu precyzyjnego zakodowania zachowań zsynchronizowanych w czasie z sygnałem amperometrycznym.Oznacz Start Lordosis w klatce, w której samica rozpoczyna zgięcie grzbietu w dół (lordozę) i unosi ogon do góry. Oznacz End Lordosis w momencie, gdy samica kończy przyjmować tę postawę, co często zdarza się, gdy samica przemieszcza się w inne miejsce w komorze testowej. Następnie oznacz Start AI w momencie, gdy samica znajduje się w postawie lordozy, a samiec kieruje pysk w stronę obszaru anogenitalnego samicy, gdzie może dojść do wąchania, lizania lub ocierania się o jej krocze.Oznacz koniec AI (End AI), gdy samiec odsunie pysk z bliskiego sąsiedztwa okolicy anogenitalnej samicy. Następnie oznacz początek mountingu (Start Mount), gdy samiec zbliża się i kładzie przednie łapy na samicy w postawie kopulacyjnej, niezależnie od orientacji próby mountingu. Podobnie oznacz początek intromisji (Start Intromission), gdy skuteczne pchnięcia zapewnią zamontowanemu samcowi dostęp członkiem do pochwy samicy.W stosownych przypadkach należy oznaczyć Ejakulację, którą można rozpoznać po ruchu deptania tylną łapą samca. Na koniec, jednocześnie oznacz Koniec Intromisji oraz Koniec Montowania w klatce, w której samiec odsunął dwie przednie łapy i tym samym nie ma już kontaktu z samicą. Ze względu na częsty brak możliwości wizualizacji momentu wycofania, oba te zachowania należy kodować jednocześnie, aby zapewnić spójność i niezawodność analizy poszczególnych aktów kopulacyjnych.W zakładce plik wybierz funkcję Eksportuj i przejdź do karty TSV, aby zapisać pomiary napięcia jako plik z rozszerzeniem TSV. Otwórz każdy plik w programie do arkuszy kalkulacyjnych i zapisz go w formacie XLS/XLSX. Na koniec ręcznie dodaj adnotacje wskazujące początek lordozy w trakcie przedkopulacyjnej interakcji w momencie rozpoczęcia zachowania lordozy, które obejmuje również zachowanie montowania, a także na początku nowej serii kopulacji, jeśli samica pozostaje w postawie lordozy.Podczas aktów kopulacyjnych w jądrze półleżącym pojawiają się przejściowe zmiany poziomu dopaminy w momencie wprowadzania penisa do pochwy lub podczas przerw w penetracji dokonywanych przez samca. Podobny wzorzec zaobserwowano u innych zwierząt w odniesieniu do uwalniania glutaminianu. Szybkie zmiany te, występujące w rdzeniu grzbietowym jądra półleżącego, odpowiadają poszczególnym przerwom w trakcie aktu kopulacyjnego.Po opanowaniu techniki, nie licząc przygotowawczych zabiegów stereotaktycznych, procedurę tę można przeprowadzić w ciągu jednego dnia. Podczas wykonywania tego zabiegu należy upewnić się, że każdy czujnik jest sprawny. Chociaż w tym filmie zaprezentowano rejestrację za pomocą jednej sondy, metodę tę można rozszerzyć na jednoczesną rejestrację dwukanałową.Dodaje to jednak poziom złożoności, który nie jest trywialny. Prezentacja w tym filmie odbywa się w warunkach oświetlenia w celu zapewnienia lepszej widoczności. Jednakże nasze eksperymenty behawioralne przeprowadzamy w warunkach ciemności, a parametr ten może być zmieniany w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak późniejsza analiza histologiczna skrawków mózgu, w celu zidentyfikowania i potwierdzenia dokładnego rozmieszczenia czujników. Ponadto, z wykorzystaniem zakodowanych danych behawioralnych, można przeprowadzić dalszą analizę danych w odniesieniu do dowolnych parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do badania uwalniania neurotransmiterów, w tym neurotransmiterów nieelektroaktywnych, takich jak glutaminian, w czasie zbliżonym do rzeczywistego u budzących się zwierząt wykazujących aktywność behawioralną.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak kalibrować sondy glutaminergiczne, implantować sondy, przeprowadzać eksperyment behawioralny mierzący zmiany w uwalnianiu neuroprzekaźników w odpowiedzi na różne komponenty zachowania oraz kodować te dane do późniejszej analizy. Proszę pamiętać, że podczas pracy z żywymi zwierzętami należy dbać o ich komfort i ogólny dobrostan, aby zapewnić najlepsze wyniki badań oraz pomyślność zwierząt.

measuring-vivo-changes-extracellular-neurotransmitters-during

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje wszczepienie elektrod i kaniul u znieczulonego szczura w celu pomiaru uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym za pomocą potencjostatu oraz infuzji leków w celu modulacji aktywności dopaminergicznej w brzusznej części nakrywki.

Monitorowanie uwalniania dopaminy w modelu szczurzym za pomocą manipulacji receptorem neuronów dopaminergicznych VTA

Ten protokół opisuje dwie różne manipulacje środowiskowe oraz równoległy protokół infuzji mózgu do badania wywołanych przez środowisko zmian w mózgu, leżących u podstaw adaptacyjnego zachowania i naprawy mózgu u dorosłych myszy.

Środowiskowe modulacje liczby neuronów dopaminowych śródmózgowia u dorosłych myszy

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną tablicę do dołków, która jest zestawem testów behawioralnych, który zawiera cechy otwartego pola i tradycyjnej tablicy do dołków. Układ ten umożliwia analizę różnicową nieuwarunkowanych zachowań małych ssaków laboratoryjnych, a także analizę zdolności poznawczych.

Zmodyfikowana tablica z otworami - pomiar zachowania, funkcji poznawczych i interakcji społecznych u myszy i szczurów

Ten artykuł opisuje nowy protokół ilościowego pomiaru motywacji społecznej u myszy za pomocą warunkowania instrumentalnego dla nagrody społecznej. Protokół jest przydatny do pomiaru motywacji społecznej w mysich modelach autyzmu i innych zaburzeń zachowań społecznych.

Kwantyfikacja motywacji społecznej u myszy za pomocą warunkowania instrumentalnego

Opisujemy protokół wywoływania nagradzających i nienagradzających doświadczeń u muszek owocowych (Drosophila melanogaster) przy użyciu dobrowolnego spożycia etanolu jako miary zmian w stanach nagrody.

Prosty sposób na zmierzenie zmian w zachowaniu związanym z poszukiwaniem nagrody za pomocą Drosophila melanogaster

Ten protokół mierzy przestrzenne uczenie się i pamięć za pomocą labiryntu Barnesa. Nowatorski paradygmat damy w niebezpieczeństwie służy do oceny aktywności lokomotorycznej i zachowań prospołecznych u myszy.

Analiza uczenia się przestrzennego i zachowań prospołecznych u myszy przy użyciu paradygmatów labiryntu Barnesa i damy w niebezpieczeństwie

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza informacji na temat jednoczesnej elektroencefalografii (EEG) i oceny behawioralnej w czasie rzeczywistym. Omówiliśmy wszystkie kroki związane z tym protokołem jako atrakcyjnym rozwiązaniem dla badaczy z wielu dziedzin neuronauki, szczególnie w obszarach uczenia się i pamięci.

Jednoczesne monitorowanie bezprzewodowego testu elektrofizjologii i pamięci behawioralnej jako narzędzia do badania neurogenezy hipokampa

Modele gryzoni są cennymi narzędziami do badania podstawowych zachowań związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD). W tym artykule wyjaśniamy dwa testy behawioralne do modelowania podstawowych cech ASD u myszy: samopielęgnację, który ocenia powtarzające się zachowanie, oraz trzykomorowy test interakcji społecznych, który dokumentuje upośledzenia społeczne.

Strategie oceny zachowań podobnych do autystycznych u myszy

Model objadania się został ustalony u myszy korzystających z przerywanego dostępu do M&amp;M's (bardzo smacznego pokarmu składającego się z tłuszczu i cukru). Myszy z przerywanym dostępem do tego wysokotłuszczowego i bogatego w cukier pokarmu wykazywały zachowania podobne do stresu, zwiększone spożycie kalorii i preferencję dla tego pokarmu w stosunku do standardowej karmy w porównaniu z myszami z ciągłym dostępem do pokarmu lub bez niego.

Model przerywanego napadowego spożycia u myszy

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Poznaj metodę pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu u czuwających samic chomików syryjskich podczas zachowań godowych. Amperometria stałopotencjałowa z enzymatycznymi biosensorami umożliwia rejestrację neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym.

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Przeglądaj więcej filmów