Name: Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metody indukcji włochatych korzeni i analizy ekspresji promotora specyficznego dla brodawek w fasoli zwyczajnej Phaseolus vulgaris. Protokół umożliwia badanie regulacji genów w symbiozie z bakteriami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (grant no. IN219916 do M.L, a IA205117 do M.K. A) oraz Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (stypendium CONACYT nr 240614 dla M.L.).

1. Identyfikacja, izolacja i klonowanie promotora NIN P. vulgaris
<ol>
	<li>Zidentyfikuj sekwencję promotora dla genu będącego przedmiotem zainteresowania. Dostępnych jest kilka baz danych genomu i narzędzi do analizy roślin, takich jak Phytozome, Ensembl Plants, NCBI itp. Promotor roślin strączkowych P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) został użyty w tym badaniu20.</li>
	<li>Zaprojektuj oligonukleotydy do klonowania enzymów Gateway lub tradycyjnych enzymów restrykcyjnych w zależności od użytego systemu wektorów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Standardowe (25-35 pz), odsolone podkłady działają dobrze. Wskazane są odwrotne sekwencje oligo, które znajdują się między promotorem a genem.</li>
	<li>Amplifikować region promotora PvNIN (lub region promotora genu będącego przedmiotem zainteresowania) ze świeżo wyizolowanego genomowego DNA P. vulgaris przy użyciu zestawu oligonów specyficznego dla promotora. Użyj polimerazy o wysokiej wierności w następujących warunkach PCR: 95 °C przez 5 minut; 30 cykli (95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min); i 72 °C przez 5 min.</li>
	<li>Uruchomić amplifikowany fragment na 1% żelu agarozowym pod napięciem 60 V na tacce żelowej o wymiarach 7 x 10 cm, a następnie wymyć odpowiedni amplikon (700 pz, <silna klasa="xfig">Rysunek 1B) i sklonować do wektora pENTR/D-TOPO zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przekształć 2 μl reakcji w kompetentne komórki Escherichia coli, korzystając z instrukcji producenta i płytkując 150 μl mieszaniny transformacyjnej na bracie lizogennym (LB) uzupełnionym 50 mg/l kanamycyną (Kan50). Wyhodować posiane komórki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Wybierz 3-6 kolonii i hoduj je przez noc w pożywce LB zawierającej Kan50. Wyizolować plazmidowe DNA przy użyciu wybranej metody i przeanalizować plazmid metodą PCR przy użyciu specyficznych dla wektora oligonukleotydów M13. Do PCR użyj 100 ng plazmidu, 0.3 pm oligonukleotydów, 10X buforu PCR, polimerazy 0.5 U Taq DNA i 10 mM dNTP.</li>
	<li>Stosować następujące warunki amplifikacji PCR: 95 °C przez 3 min; 30 cykli (95 °C przez 30 s, 58 °C przez 30 s, 72 °C przez 75 s) i 72 °C przez 7 min. Wizualizuj produkty PCR na 1% żelu agarozowym. Upewnij się, że poprawne insercje mają pasmo 1,024 pz, a wektory bez wstawień będą miały pasmo 324 pz (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Przeprowadź reakcję LR między wektorem wejściowym (pENTR/D-TOPO-PvNIN) a wektorem docelowym pBGWFS7.021 przy użyciu dostępnej w handlu mieszanki enzymów zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przekształć 2 μl reakcji LR w kompetentne komórki E. coli przy użyciu standardowych technik opisanych w instrukcjach producenta i rozlać 150 μl mieszaniny transformacyjnej na LB uzupełnionej 100 mg/l spektynomycyny (Spe100). Wyhodować posiane komórki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Zbierz około 5 kolonii i hoduj je przez noc w pożywce LB zawierającej Spe100. Wyizolować DNA plazmidu za pomocą wybranej metody i przeanalizować plazmid metodą PCR przy użyciu oligonukleotydów specyficznych dla promotora.</li>
	<li>Użyj warunków PCR z kroku 1.3. Wizualizuj produkty PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację. Amplikony wynoszą 700 pz.</li>
	<li>Zsekwencjonuj dodatni plazmid pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D) z oligonukleotydami specyficznymi dla promotora, aby zweryfikować autentyczność insertu.</li>
	<li>Przekształć plazmidy w szczep A. rhizogenes K599 (jednak można użyć dowolnych innych szczepów A. rhizogenes). Dodaj 2 μl preparatu plazmidowego do 50 μl elektrokompetentnych ogniw i elektroporuj w kuwecie 1 mm z następującymi ustawieniami: 1,8 kV, 25 μF i 200 Ω.</li>
	<li>Odzyskaj komórki w ~ 500 μL pożywki SOC i wstrząsaj w temperaturze 28 °C przez 2 godziny. Płytka na LB-Spe100 i rosnąć w temperaturze 28 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Wykonaj badania przesiewowe kolonii, jak wspomniano w kroku 1.7 i użyj warunków PCR, jak w kroku 1.3. Wytwarzaj zapasy glicerolu z dodatnich klonów i przechowuj je w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Jako kontrolę ujemną należy użyć kultury A. rhizogenes zawierającej pusty wektor pBGWFS7.0.</li>
</ol>
2. A. Rhizogenes przekształcił owłosione korzenie fasoli zwyczajnej
<ol>
	<li>Wysterylizuj nasiona fasoli (P. vulgaris cv. Negro Jamapa) (około 20) w 50 ml 96% etanolu przez 1 minutę i wyrzuć etanol; następnie dodaj 50 ml 20% wybielacza (podchlorynu sodu) przez 10 minut, stale mieszając w okapie z przepływem laminarnym. Usuń wybielacz i umyj go w nadmiarze sterylnej wody 3 razy. 
	UWAGA: Inne odmiany P. vulgaris mogą być używane do indukcji owłosionych korzeni</li>.
	<li>Wysterylizowane nasiona należy kiełkować na sterylnych bibułach filtracyjnych zwilżonych roztworem Broughton & Dilworth (B&D)22 (Tabela 1) przez 2 dni w ciemności w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Dzień przed przemianą przygotuj następujące elementy:
	<ol>
		<li>Usunąć 150 μl kultury A. rhizogenes zawierającej wektor binarny (przygotowany w krokach 1.13 i 1.14) na stałym LB Spe100 i rosnąć w temperaturze 28 °C przez noc.</li>
		<li>Napełnij probówkę o pojemności 15 ml roztworem B&D i zastąp nakrętkę dwuwarstwową folią aluminiową. Złóż to w szklanej probówce o średnicy 22 cm zawierającej 10 ml roztworu B&D (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2C) i autoklawuj to.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu przemiany należy zgromadzić następujące sterylne materiały w okapie z przepływem laminarnym: kiełkujące nasiona z kroku 2.2, płytkę hodowlaną z kroku 2.3.1, probówki z kroku 2.3.2, sterylną wodę podwójnie destylowaną (10 ml), pipety i końcówki do pipet, sterylne kleszki i strzykawki o pojemności 3 ml.</li>
	<li>Za pomocą wygiętej końcówki o pojemności 200 μl zeskrobać komórki A. rhizogenes z płytki do probówki mikrowirówkowej i ponownie zawiesić w 1 ml podwójnie sterylnej wody. Podobnie, należy oddzielnie przygotować komórki kontrolne wektorów.
	<ol>
		<li>Delikatnie wymieszaj komórki, aby ponownie zawiesić. Nie wirować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj otwór o średnicy 3 mm w folii aluminiowej probówek z kroku 2.3.2 za pomocą sterylnej końcówki pipety.</li>
	<li>Zbierz komórki (promotor lub kontrola wektora) z kroku 2.5 za pomocą strzykawki i lekko nakłuj hipokotyle kiełkujących nasion końcówką igły (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2G). 
	UWAGA: Upewnij się, że igła wnika (4-6 razy) w tkankę naczyniową i wstrzyknij małe (~ 5 μL) krople komórek na ranie w różnych miejscach wokół hipokotylu.</li>
	<li>Ostrożnie włożyć korzenie wstrzykniętych sadzonek do 3-milimetrowego otworu w 15 ml probówce zawierającej roztwór B&D. Włóż cały zestaw do szklanych probówek o pojemności 22 ml i uszczelnij je, aby utrzymać wilgotność.</li>
	<li>Inkubować probówki w komorze wzrostowej utrzymywanej w temperaturze 28 °C przy świetle 16 godzin: 8 godzin ciemnego fotoperiodu. 
	Uwagi: 3-4 dni po inkubacji rośliny dorastają do krawędzi szklanych probówek o pojemności 22 ml. Na tym etapie zdejmij nasadki i uszczelnij obręcz parafilmem wokół trzpienia, jak pokazano na Rysunek 2I.</li>
	<li>Obserwuj modzel w miejscach zranień po 5-7 dniach i znajdź ~ 2 cm owłosione korzenie do 10-12 dni po transformacji. 
	UWAGA: Ważne jest, aby stale utrzymywać roztwór B&D zarówno w plastikowych, jak i szklanych tubach.</li>
	<li>Po 2 tygodniach usuń pierwotny korzeń, przycinając łodygę 2 cm poniżej owłosionych korzeni i przeszczep pierwotne korzenie do doniczek zawierających sterylny wermikulit. Utrzymuj rośliny w komorze wzrostowej (16 h światła: 8 h ciemności w temperaturze 28 °C) i nawadniaj roztworem B&D.</li>
</ol>
3. Analiza promotora: Ekspresja promotora NIN w guzkach ryzobialnych fasoli zwyczajnej
<ol>
	<li>W celu indukcji guzków korzeniowych zaszczepić Rhizobium tropici lub Rhizobium etli (które są kompatybilne z fasolą zwyczajną) w 100 ml pożywki PY (0,5 g peptonu, 0,3 g ekstraktu drożdżowego) uzupełnionej 700 mM CaCl2 i 20 mg mL-1 kwasu nalidyksowego. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny z wytrząsaniem przy 300 obr./min. 
	Uwaga: W przypadku transgenicznego Rhizobium można zastosować wszelkie specyficzne antybiotyki.</li>
	<li>Granulować komórki w wirówce przez 3 minuty w temperaturze pokojowej 2 800 x g i ponownie zawiesić w 10 ml 10 mMMgSO4. Dostosować OD komórek do 0,6 przy OD600 przez rozcieńczenie 10 mMMgSO4.</li>
	<li>Zaszczepić 1-2 ml kultury (przygotowanej z kroku 3.2) na roślinę (zarówno promotor, jak i kontrolę wektora), aby wywołać wzrost guzków na owłosionych korzeniach. Nawadniaj rośliny roztworem B&D z ograniczoną ilością azotu (2 mM KNO3), aby pobudzić nodulację.</li>
	<li>W zależności od potrzeby eksperymentalnej zbierz owłosione korzenie w różnych punktach czasowych. Pobrać próbki do badania nici infekcji między 3-5 dniami po inokulacji (dpi). 
	Uwaga: Guzki pierwotne i młode guzki można badać odpowiednio w rozdzielczości 6-9 dpi i 10-12 dni. Wreszcie, dojrzałe i funkcjonalne guzki można badać w rozdzielczości 14-21 dpi, a guzki starcze w > 28 dpi.</li>
	<li>Przetwórz korzeń/guzki pod kątem aktywności genów reporterowych (GUS lub GFP). Analizuj aktywność GUS zgodnie z protokołem opisanym przez Jefferson23. Obserwuj GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wzbudzić fluorescencję GFP za pomocą niebieskiego lasera argonowo-jonowego (488 nm) i zebrać wyemitowaną fluorescencję od 510 do 540 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+promoters+and+cis-actingregulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements.</a> Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).</li>
<li>Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+Thirst+for+Genome+Sequencing%2C+Data+Interpretation%2C+and+Database+Usage+in+Genomic+Era%3A+The+Road+towards+Fast-Track+Crop+Plant+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+Research+International%22%5BJournal%5D)">Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement.</a> Genetics Research International. , 684321(2015).</li>
<li>Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation%2C+transient+transformation+of+leaf+mesophyll+protoplasts+and+improved+Agrobacterium-mediated+leaf+disc+infiltration+of+Phaseolus+vulgaris%3A+Tools+for+rapid+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis.</a> BMC Biotechnol. 16 (1), 53(2016).</li>
<li>Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+of+a+symbiosis-specific+phosphate+transporter+is+mediated+by+a+transient+reorientation+of+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).</li>
<li>Kryvoruchko, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MtSWEET11%2C+a+Nodule-Specific+Sucrose+Transporter+of+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).</li>
<li>Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+cortical+cell+division+during+root+nodule+development+in+Lotus+japonicus+is+accompanied+by+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response.</a> Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).</li>
<li>Suzaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreduplication-mediated+initiation+of+symbiotic+organ+development+in+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus.</a> Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+phosphate+transporter+GmPT5+regulates+phosphate+transport+to+nodules+and+nodulation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean.</a> Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).</li>
<li>Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Functional+Analysis+of+a+Novel+Group+of+Legume-specific+WRKY+and+Exo70+Protein+Variants+from+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean.</a> Sci Rep. 6, 32090(2016).</li>
<li>Montiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene+is+required+for+root+infection+by+Rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia.</a> Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).</li>
<li>Arthikala, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PvRbohB+negatively+regulates+Rhizophagus+irregularis+colonization+in+Phaseolus+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris.</a> Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).</li>
<li>Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RbohB+a+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene%2C+enhances+symbiosome+number%2C+bacteroid+size%2C+and+nitrogen+fixation+in+nodules+and+impairs+mycorrhizal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization.</a> New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).</li>
<li>Barraza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+PvTRE1+enhances+nodule+biomass+and+bacteroid+number+in+the+common+bean%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean.</a> New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autophagy-related+kinase+is+essential+for+the+symbiotic+relationship+between+Phaseolus+vulgaris+and+both+rhizobia+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).</li>
<li>Nanjareddy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legume+TOR+Protein+Kinase+Regulates+Rhizobium+Symbiosis+and+Is+Essential+for+Infection+and+Nodule+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development.</a> Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).</li>
<li>Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+Vicia+faba+L.+gene+VfEnod12+encoding+an+early+nodulin+is+active+in+cortical+cells+and+nodule+primordia+of+transgenic+hairy+roots+of+Vicia+hirsuta+as+well+as+in+the+prefixing+zone+II+of+mature+transgenic+V.+hirsuta+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules.</a> Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).</li>
<li>Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Sesbania+rostrata+leghemoglobin+glb3+gene+5%27-upstream+region+in+transgenic+Lotus+corniculatus+and+Nicotiana+tabacum+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants.</a> Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).</li>
<li>Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+network+governing+nodule+organogenesis+and+infection+in+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus.</a> Nat Commun. 12, 1-10 (2010).</li>
<li>Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseolus+vulgaris+RbohB+functions+in+lateral+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development.</a> Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).</li>
<li>Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+expressed+genes+in+mycorrhized+and+nodulated+roots+of+common+bean+are+associated+with+defense%2C+cell+wall+architecture%2C+N+metabolism%2C+and+P+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182328(2017).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+leghemoglobin+synthesis+in+snake+beans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control of leghemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li>
<li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1178271/">Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system.</a> Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).</li>
<li>Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+soybean+hairy+roots+and+propagation+of+the+soybean+cyst+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode.</a> Planta. 210 (2), 195-204 (2000).</li>
<li>Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Composite+Plants+in+Medicago+truncatula+used+for+Nodulation+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2633(2011).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+expression+of+hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules.</a> Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).</li>
<li>Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e795">Hairy Root Transformation in Lotus japonicus.</a> Bio-protocol. 3 (12), e795(2013).</li>
<li>Jacobs, T. B., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+CRISPR+Vector+Construction+and+Characterization+of+DNA+Modifications+by+Generation+of+Tomato+Hairy+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots.</a> J. Vis. Exp. (110), e53843(2016).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformation+of+the+Phaseolus+spp.%3A+a+tool+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics.</a> Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas analizy funkcjonalnej genów, badanie wzorców ekspresji genów odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu przestrzennej i czasowej regulacji genów in vivo. Dobrze znaną metodą badania wzorców ekspresji genów jest klonowanie regionu promotora genu będącego przedmiotem zainteresowania, przed genami reporterowymi, takimi jak geny markerów fluorescencyjnych (GFP, RFP itp.) lub β-glukuronidaza. W tym artykule wybraliśmy region promotorowy genu specyficznego dla symbiozy guzków korzeniowych (RNS), NIN, w celu ...

Promotorzy są ważnymi narzędziami biologii molekularnej, które odgrywają kluczową rolę w zrozumieniu regulacji ekspresji interesujących genów. Promotory to sekwencje DNA znajdujące się przed kodonem inicjującym translację sekwencji genów i przenoszą centralną informację regulacyjną genów; Dlatego ich prawidłowa adnotacja i charakterystyka są niezbędne do zrozumienia funkcji genów. W zależności od wzorców ekspresji, promotory roślinne są klasyfikowane jako konstytutywne, specyficzne dla tkanki lub specyficzne dla etapu rozwoju i indukowalne1. Postępy w technologiach transkryptomicznych, ulepszenia w modelowaniu komputerowym i dostępność coraz większej liczby sekwencji genomu dla różnych gatunków roślin ułatwiły przewidywanie sekwencji promotorowych na dużą skalę2.
Z drugiej strony, kluczowe jest również ustanowienie narzędzi oceny promotorów i technik transformacji genetycznej, które są szybkie, wydajne i powtarzalne. W przeciwieństwie do innych roślin modelowych, funkcjonalna charakterystyka genów rośliny strączkowej fasoli zwyczajnej (P. vulgaris) jest utrudniona głównie ze względu na oporny charakter Phaseolus sp. dla stabilnej transformacji genetycznej. Systemy transformacji przejściowej służą jako alternatywa dla szybkich badań nad charakterystyką funkcjonalną genów3. W badaniach nad symbiozą roślin strączkowych interakcja między rośliną żywicielską rośliny strączkowej a bakterią ryzobialną jest jednym z najłatwiejszych do opanowania systemów modelowych do analizy funkcjonalnej genów specyficznych dla guzków i badań promotorów. Do tej pory scharakteryzowano kilka promotorów roślin strączkowych związanych z tymi symbiozami, a mianowicie: Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT58, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, itd. Elementy cis bezpośrednio wpływają na regulację genów. Czynnik transkrypcyjny ENBP1A wiąże się z regionem regulatorowym Cis (-692 pz) wczesnej noduliny VfENOD12, co ułatwia ekspresję genu reporterowego w zawiązkach guzków Vicia faba16. Zastąpienie regionów regulatorowych Cis (od -161 do -48 pz) specyficznego dla guzków promotora leghemoglobiny GLB3 heterologicznymi skróconymi promotorami δ-p35S i δ-pNOS spowodowało utratę swoistości guzków i zmniejszoną aktywność promotora17.
Poprzednie raporty pokazują, że czynnik transkrypcyjny NIN jest niezbędny do zainicjowania infekcji ryzobialnej w komórkach rzęsatych korzenia i jest również niezbędny do organogenezy guzków u L. japonicus18. W niniejszym badaniu opisano protokół identyfikacji, izolacji, klonowania i charakterystyki specyficznego dla guzków promotora w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej. Aby to osiągnąć, wybraliśmy specyficzny dla symbiozy ryzobialnej promotor NIN P. vulgaris i sklonowaliśmy go w fuzji transkrypcyjnej do chimerycznego reportera wzmocnionego GUS::GFP. Co więcej, protokół ten opisuje szybki i wszechstronny system transformacji genetycznej u P. vulgaris przy użyciu owłosionych korzeni wywołanych przez A. rhizogenes. System ten generuje owłosione korzenie w mniej niż 2 tygodnie po transformacji. Na koniec oceniliśmy czasoprzestrzenną ekspresję promotora NIN w brodawkach korzeniowych skolonizowanych przez rhizobia za pomocą barwienia GUS.
Opisana tutaj procedura może być przydatna nie tylko do badania nodulacji i mikoryzacji11 roślin strączkowych, ale także do badania wzorców ekspresji promotorów w korzeniach19. Co więcej, protokół ten jest łatwy w użyciu w niewyspecjalizowanych laboratoriach.

<table><tbody><tr><td>Startery do testu qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Forward</td><td>CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Reverse</td><td>CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Forward</td><td>GTA AAA CGA CGG CCA G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Reverse</td><td>CAG GAA ACA GCT ATG AC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Zestaw do klonowania</td><td>Invitrogen</td><td>K243520</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme Mix&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791100</td><td></td></tr><tr><td>pBGWFS7.0&nbsp;</td><td>Biologia systemów roślinnych</td><td>https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/</td><td></td></tr> <tr><td>Platynowa polimeraza DNA Taq</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelem PureLink</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa polimeraza DNA Pfx</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Certyfikowana biologia molekularna Agaroza</td><td>Bio-Rad</td><td>1613102</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615-25G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan spektynomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Pepton bakteriologiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>wapniaSigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nalidyksowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Żelowy roztwór ładujący</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7654</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma</td><td>Sigma 1-14K</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka dokumentacji żelu</td> Inkubator z wytrząsaniem <td>Carestream</td><td>Gel Logic 212 PRO</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ SHKE6000 6000 - 115VAC</td><td>Thermo scientific</td><td>EW-51708-70</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostu roślin</td><td>MRC</td><td>PGI-550RH</td><td></td></tr><tr><td>Kabina z horyzontalnym laminarnym przepływem powietrza</td><td>Lumistell</td><td>LH-120</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DM4500 B</td><td></td></tr><tr><td>Petridish</td><td>sym laboratorios</td><td>90X15</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Fisher scientific</td><td>53223</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Wirówka stożkowa Probówki</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>22 mL szklane probówki</td><td>Thomas scientific</td><td>45048-16150</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

Sekwencje poprzedzające sekwencje kodujące geny są określane jako sekwencje promotorowe. Badanie wzorców ekspresji promotorów jest bardzo ważne dla zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennych wzorców ekspresji genów docelowych. Z drugiej strony kluczowe znaczenie ma również ustanowienie narzędzi oceny promotorów i technik transformacji genetycznej, które są szybkie, wydajne i powtarzalne. W tym badaniu zbadaliśmy czasoprzestrzenny wzorzec ekspresji promotora powstania guzków specyficznego dla symbiozy ryzobialnej (NIN) Phaseolus vulgaris w transgenicznych korzeniach owłosionych. Korzystając z baz danych genomu roślinnego i narzędzi analitycznych, zidentyfikowaliśmy, wyizolowaliśmy i sklonowaliśmy promotor NIN P. vulgaris w fuzji transkrypcyjnej z chimeryczną reporterową β-glukuronidazą (GUS) wzmocnioną GUS::GFP. Ponadto protokół ten opisuje szybki i wszechstronny system transformacji genetycznej u P. vulgaris przy użyciu owłosionych korzeni wywołanych przez Agrobacterium rhizogenes. System ten generuje ≥2 cm owłosione korzenie w ciągu 10 do 12 dni po transformacji. Następnie oceniliśmy czasoprzestrzenną ekspresję promotora NIN w owłosionych korzeniach zaszczepionych Rhizobium w okresowych odstępach czasu po inokulacji. Z uzyskanych przez nas wyników zobrazowanych przez działalność GUS wynika, że promotor NIN był aktywny w procesie guzowania. Podsumowując, niniejszy protokół pokazuje, jak zidentyfikować, wyizolować, sklonować i scharakteryzować promotor roślin w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej. Co więcej, protokół ten jest łatwy w użyciu w niewyspecjalizowanych laboratoriach.

Celem niniejszego badania była ocena spatiotemporalnego wzorca ekspresji specyficznego dla brodawek białka NIN u P. vulgaris. W tym celu wybrano region o długości 700 bp położony powyżej kodonu startowego translacji genu NIN i zaprojektowano zestaw oligosów, jak przedstawiono na Rysunku 1A. Przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności fragment promotora NIN został namnożony, wyizolowany (Rysunek 1B) i sklonowany ...

Analizy ekspresji promotorów są kluczowe dla lepszego zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennej ekspresji docelowych genów. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół identyfikacji, izolacji i klonowania promotora roślin. Ponadto opisujemy charakterystykę promotora specyficznego dla guzków w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej.

Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Włochate korzenie są wykorzystywane do uzyskania przekształconych korzeni w gatunku Phaseolus z konstruktem reporterowym. Powstałe korzenie transgeniczne służą do badania ekspresji genu reporterowego. Badania ekspresji promotorów są kluczowe dla zrozumienia czasowo-przestrzennych wzorców ekspresji genów.Dzisiaj zaprezentujemy metodologię indukowania korzeni włosych oraz przeanalizujemy wzorce ekspresji promotora w transgenicznych korzeniach włosych w warunkach symbiozy z grudkami korzeniowymi u Phaseolus. Estrada-Navarrete i współpracownicy opracowali wcześniej system korzeni włosych indukowanych przez Agrobacterium rhizogenes u Phaseolus. Obecna metoda pozwoli przyspieszyć czas indukcji korzeni włosych, poprawiając tym samym wszechstronność tego systemu.Procedury zaprezentują mój kolega Manoj-Kumar Arthikala oraz studenci studiów licencjackich Alma Leticia i Brenda Mariana z mojego laboratorium. W pierwszej kolejności należy wyszukać sekwencję genu NIN w bazie danych genomu Phaseolus vulgaris w serwisie Phytozome, a następnie wybrać wymaganą długość sekwencji powyżej kodonu ATG. Zaprojektuj oligonukleotydy na podstawie przeprowadzonej analizy odpowiedniej sekwencji promotora.Śwież

plant-promoter-analysis-identification-characterization-root-nodule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy sposób wykorzystania kompozytowych roślin z korzeniami włochatymi do badania interakcji między roślinami a ryzobiami oraz procesu nodulacji u gatunku Medicago truncatula, który jest trudny do transformacji.

Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

System Lateral Root Induible System (LRIS) pozwala na synchroniczną indukcję korzeni bocznych i jest prezentowany dla Arabidopsis thaliana i kukurydzy.

System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest zbadanie transkryptomicznej odpowiedzi izolowanych endosferą Bacillus mycoides na wysięki z korzenia ziemniaka. Metoda ta ułatwia identyfikację ważnych genów bakteryjnych zaangażowanych w interakcje roślina-mikroorganizm i zasadniczo ma zastosowanie do innych endofitów i roślin, z niewielkimi dostosowaniami.

Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka

Wizualizacja i pomiar wzrostu korzeni in situ jest niezwykle trudne. Przedstawiamy konfigurowalną metodę rhizobox do śledzenia rozwoju i proliferacji korzeni w czasie w odpowiedzi na wzbogacenie w składniki odżywcze. Metoda ta służy do analizy różnic genotypowych w plastyczności korzeni kukurydzy w odpowiedzi na organiczne źródło azotu.

Zoptymalizowany protokół Rhizobox do wizualizacji wzrostu korzeni i reakcji na zlokalizowane składniki odżywcze

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

Użycie specyficznych glikozydaz do usuwania cukrów z glikoprotein, a następnie przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE, jest cenną metodą wykrywania modyfikacji glikanowych w próbkach białek i stanowi dobry wybór do wstępnych badań z zakresu glikobiologii. Zmiany występujące po deglikozylacji można wykryć jako przesunięcia w mobilności w żelu lub poprzez barwienie odczynnikami wrażliwymi na glikany.

Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Poznaj metody indukcji włochatych korzeni i analizy ekspresji promotora specyficznego dla brodawek w fasoli zwyczajnej Phaseolus vulgaris. Protokół umożliwia badanie regulacji genów w symbiozie z bakteriami.

Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

Przeglądaj więcej filmów