Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

Owłosione korzenie służą do uzyskania przekształconych korzeni w Phaseolus z konstruktem reporterowym. Powstałe w ten sposób transgeniczne korzenie są wykorzystywane do badania ekspresji genu reporterowego. Badania ekspresji promotorów mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia czasoprzestrzennych wzorców ekspresji genów.

Dzisiaj zamierzamy zademonstrować metodologie indukcji owłosionych korzeni i zbadać wzorce ekspresji promotorów w transgenicznych korzeniach owłosionych w warunkach symbiozy guzków korzeniowych w Phaseolus. Estrada-Navarrete i współpracownicy wcześniej ustalili owłosiony system korzeniowy indukowany przez Agrobacterium rhizogenes w Phaseolus. Obecna metoda pomoże przyspieszyć czas trwania indukcji owłosionych korzeni, a tym samym poprawić wszechstronność systemu.

Procedury zademonstrują mój kolega Manoj-Kumar Arthikala oraz studentki Alma Leticia i Brenda Mariana z mojego laboratorium. Na początek przeszukaj sekwencję genu NIN w bazie danych genomu Phaseolus vulgaris z Phytozome i wybierz wymaganą długość sekwencji przed ATG. Zaprojektuj oligonukleotydy po odpowiedniej analizie sekwencji promotora.

Świeżo przygotowane genomowe DNA Phaseolus posłuży jako matryca do amplifikacji sekwencji promotora metodą PCR. Przygotuj główną mieszankę PCR z polimerazą Taq o wysokiej wierności i standardowymi składnikami PCR, wraz z wcześniej zaprojektowanymi oligonukleotydami. Podwielokrotność mieszanki wzorcowej rozmieścić w probówkach PCR o pojemności 2 ml i przeprowadzić amplifikację fragmentu promotora w termocyklerze i za pomocą odpowiedniego programu.

Oddzielić elektroforetycznie produkt PCR od 1,2% żelu agarozowego. Wizualizuj fragment NIN wzmocniony przy 700 parach zasad w świetle UV. Wytnij, wymyj i sklonuj fragment do wektora wejściowego bramki wektora pENTR/D-TOPO zgodnie ze standardowymi instrukcjami.

Przekształć dwa mikrolitry mieszaniny reakcyjnej w kompetentne komórki E. coli w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 50 sekund i umieść przekształcone E. coli na LB uzupełnionym 50 miligramami na litr kanamycyny. Hoduj posiane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Przeprowadzić reakcję PCR dla plazmidów wyizolowanych z losowo wybranych kolonii E. coli przy użyciu oligonukleotydów M13.

Fragment na 1024 parach zasad powinien wskazywać na dodatnie klony. Przeprowadź reakcję LR między dodatnim klonem wejściowym a docelowym wektorem binarnym. Przekształć dwa mikrolitry mieszanki reakcyjnej w E. coli i wybierz kolonie na 100 miligramach na litr spektynomycyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Amplifikuj plazmidy oligonukleotydami specyficznymi dla NIN. Dodatni klon powinien amplifikować się przy 700 parach zasad. Uporządkuj i zweryfikuj poprawność fragmentu klonu.

Zmobilizuj konstrukt promotora NIN do elektrokompetentnych komórek K599 Agrobacterium rhizogenes. I po raz kolejny potwierdź klon za pomocą oligonukleotydów specyficznych dla promotora. Nasiona Phaseolus vulgaris sterylizuje się siarką i kiełkują na sterylnej, mokrej bibule filtracyjnej przez dwa dni w ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Rozprowadzić 150 mikrolitrów komórek Agrobacterium rhizogenes z konstruktem NIN i wektorem kontrolnym na płytkach LB z selekcją spektynomycyny. Uprawiaj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Odcoatnij sadzonki Phaseolus i zeskrob komórki Agrobacterium rhizogenes za pomocą wygiętej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów z płytki.

Zawiesić ponownie w probówce Eppendorf Tube z jednym ml sterylnej wody destylowanej. Zebrać komórki Agrobacterium rhizogenes do strzykawki o pojemności trzech ml i umieścić sadzonki Phaseolus we wcześniej przygotowanym zestawie probówek. Lekko nakłuć hipokotyle kiełkujących nasion końcówką igły, jednocześnie wstrzykując komórki Agrobacterium rhizogenes.

Należy uważać, aby igła nie przeszła przez hipokotyl. Utrzymuj wstrzyknięte sadzonki w komorze wzrostowej w temperaturze 28 stopni Celsjusza z 16 godzinami światła i ośmiogodzinnym ciemnym fotoperiodem. Kalus na zranionych hipokotylach powinien być widoczny przez pięć do siedmiu dni.

Po dwóch tygodniach usuń pierwotny korzeń, przycinając łodygę dwa centymetry poniżej owłosionych korzeni i przeszczep je do doniczek zawierających sterylny wermikulit. Jednocześnie zaszczepić rośliny jednym ml Rhizobium tropici, aby wywołać guzowanie. Upewnij się, że rozcieńczyłeś kulturę Rhizobium do 6 przy OD 600.

Utrzymuj rośliny w komorze wzrostowej w temperaturze 28 stopni Celsjusza, 16 godzin światła i ośmiu godzin ciemnego fotoperiodu i nawadniaj roztworem B i D. Aby zbadać czasoprzestrzenne wzorce ekspresji promotora NIN, próbkowanie przeprowadza się w różnych punktach czasowych. Wyjmij rośliny, nie uszkadzając korzeni, i umyj korzenie bez żadnych drobinek wermikulitu.

Losowo wybierz korzenie z roślin NIN i kontrolnych, a następnie przejdź do barwienia histochemicznego GUS poprzez inkubację próbek w buforze testowym GUS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w ciemności. Obserwuj korzenie zabarwione GUS pod mikroskopem stereoskopowym i złożonym. To zdjęcie pokazuje indukowaną przez Rhizobium ekspresję promotora NIN w korzeniach pierwotnych.

Ekspresję promotora NIN można również zaobserwować w komórkach rzęsatych korzenia zakażonych Rhizobium. Ponadto ekspresję GUS można udokumentować na różnych etapach rozwoju guzka korzeniowego. Nie zaobserwowano ekspresji GUS w korzeniach sterowania wektorowego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć projektowanie konstruktów promotora i badanie wzorców ekspresji promotora w transgenicznych owłosionych korzeniach Phaseolus. System ten może być dalej rozbudowywany w celu zbadania wzorców ekspresji promotorów w innych symbiotycznych interakcjach i interakcjach patogenów u Phaseolus, a także u innych eudicots.