Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie pełnego trójwymiarowego obrazu rozkładu naczyń włosowatych w pęcherzykach jajnikowych myszy oraz przedstawienie ich wzajemnych relacji. Jajnik jest kluczowym organem w reprodukcji i endokrynologii. Należy policzyć pęcherzyki na każdym etapie rozwoju oraz komórki somatyczne.

Ponadto, w przeciwieństwie do innych narządów, jajnik nie wykazuje powtarzającego się rozgałęzienia jednostki funkcjonalnej. Lokalny układ naczyniowy, wraz z układem nerwowym, może ulegać znacznym zmianom w każdym cyklu menstruacyjnym u dorosłych samic. Zastosowanie pasywnego utrwalania w jajniku pozwala nam zobaczyć ogólny rozkład oraz powiązania między tymi komórkami i pęcherzykami w jajniku.

Kluczowym aspektem tej metody jest to, że wywiera ona minimalny wpływ na jajnik, umożliwiając jednocześnie uwidocznienie różnych markerów. Dzięki rekonstrukcji obrazu mikroskopowego przygotowaliśmy mapę jajnika. Można na niej wyraźnie zaobserwować szczegóły naczyń, neuronów oraz pęcherzyków.

Do analizy obrazów wykorzystano wybrane funkcje oprogramowania Imaris w celu oceny zależności między jajnikiem a strukturami. Należy przygotować roztwory do perfuzji zgodnie z instrukcją opisaną w artykule i przechowywać je w lodzie. Mysz należy zabezać i upewnić się, że nie wykazuje ona odruchuu wycofywania łapy po uciśnięciu palca.

Spryskaj etanolem, wykonaj nacięcie w prawym przedsionku, a następnie natychmiast przemyj lewą komorę 20ml lodowatego PBS z prędkością 10ml na minutę w celu wypłukania krwi. Następnie przeprowadź perfuzję zwierzęcia zimnym roztworem hydrożelu z tą samą prędkością. Pobierz jajniki oraz macicę, aby zachować integralność morfologii jajników.

Przenieś oddzielone jajniki do schłodzonego roztworu hydrożelu. Pod stereomikroskopem usuń tkankę tłuszczową otaczającą jajnik. Dla uzyskania lepszego efektu fiksacji tkanki zaleca się usunięcie bursa ovarii.

Przechowywać jajniki w roztworze hydrożelu przez trzy dni. Po trzech dniach przenieść jajniki do szklanej probówki i wypełnić ją świeżym roztworem hydrożelu. Przykryć wierzch probówki folią Parafilm, a następnie owinąć szyjkę probówki kolejną warstwą folii Parafilm.

Upewnij się, że między parafilmem a roztworem hydrożelu nie ma pęcherzyków powietrza. Umieść szklaną probówkę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C na dwie godziny, aż do czasu utworzenia się żelu. Ostrożnie usuń nadmiar żelu wokół jajników za pomocą filtra papierowego.

Umieść jajniki w probówce 15ml i wypełnij ją 10ml roztworu przejaśniającego. Umieść probówkę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C na co najmniej dwa miesiące. Wymieniaj roztwór przejaśniający codziennie przez pierwsze trzy dni, a następnie co tydzień, aż jajniki zostaną przejaśnione.

Wszystkie procedury immunobarwienia przeprowadzono w temperaturze 37 °C na wytrząsarce. Najpierw jajnik przemyto w PBST przez 24 godziny. Następnie jajnik inkubowano w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBST przez dwa dni.

Po trzecie, wypłucz przeciwciała pierwszorzędowe buforem PBST. Po czwarte, inkubuj jajnik z wybranym przeciwciałem drugorzędowym w PBST przez dwa dni. Po piąte, wypłucz przeciwciała drugorzędowe buforem PBST.

Po szóte, przenieś jajnik do roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła w celu homogenizacji RI. Sprawdź przezroczystość wizualną; gdy jajnik zostanie całkowicie wyjaśniony, można przystąpić do obrazowania. Najpierw przygotuj czystą szalkę z szklanym dnem.

Uformuj cylinder z masy plastycznej i nadaj mu kształt podkowy. Mocno dociśnij zewnętrzną krawędź do szkiełka przedmiotowego, aby stworzyć szczelną przestrzeń. Wysokość masy plastycznej powinna być nieco większa niż wysokość jajnika.

Ostrożnie przesuń jajnik na środek i dodaj medium montażowe. Przykryj masę mocującą szalką i użyj dwóch kawałków masy, aby ją ustabilizować. Po przygotowaniu jajnika do obrazowania, do jego wizualizacji można wykorzystać konfokalny mikroskop Nikon z obiektywem 16X.

Aby przeprowadzić obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego, należy najpierw wybrać obiektyw w panelu Ni-E. W panelu akwizycji należy wybrać liczbę kanałów. Następnie, korzystając z karty Eye Port oraz dżojstika kontrolera XY, należy przesunąć tkankę na środek pola widzenia, weryfikując jej położenie poprzez okulary mikroskopu.

Po drugie, po wyłączeniu światła migawki, kliknij kartę live, aby dostosować moc lasera, napięcie HV oraz offset dla każdego kanału. W panelu Z Intensity Correction dostosuj akwizycję dla górnej warstwy: kliknij przycisk plus, aby zdefiniować górę, przesuń obiektyw w dół i ustaw odpowiednie HV oraz moc lasera dla spodu tkanki, a następnie dodaj informacje o najniższej warstwie, klikając To ND, aby zsynchronizować ustawienia z panelem i akwizycją. W sekcji akwizycji ustaw najpierw liczbę kroków skanowania.

Kliknij karty Z oraz dużego obrazu. Następnie przejdź do okna skanowania dużego obrazu, aby zdefiniować rozmiar pola zgodnie z krawędzią tkanki. W trzecim kroku wróć do akwizycji ND, aby wprowadzić rozmiar pól skanowania i wybrać zakładkę w zakresie od 10 do 50%. Następnie kliknij uruchom korekcję Z i poczekaj na zakończenie procesu obrazowania.

Najpierw użyj programu Imagic, aby otworzyć oryginalny plik NIS. Kliknij przycisk image, wybierz kanały kolorów i wyświetlania, następnie kliknij file, wybierz image sequences i zapisz je oddzielnie jako pliki tiff. Następnie użyj programu Imaris, aby otworzyć jeden z plików tiff.

Kliknij przycisk edytuj i wybierz opcję dodawania kanałów, aby dodać pozostałe. Nazwę i kolor można zmienić w ustawieniach wyświetlania. Grubość tkanki powinna zostać również skorygowana we właściwościach obrazu.

Po trzecie, kliknij przycisk edycji i wybierz opcję Crop 3D, aby odciąć nadmiarową część. Najpierw kliknij przycisk filamentu, a następnie kliknij Dalej. Przejdź do panelu slice, znajdź naczynie śledzące oraz odległość, następnie wróć do Surpass, wprowadź wartość statyczną i kliknij Dalej.

Po drugie, dostosuj próg punktu startowego i punktu zadania. W panelu kamery wybierz narzędzie zaznaczania, naciśnij klawisz shift i kliknij w punkt, aby usunąć nadmiarową część. Po trzecie, wybierz najwyższy próg i kliknij dalej.

Nie zaznaczaj punktów detekcji i przejdź dalej. Nadmiarowe elementy można usunąć w panelu edycji. Kolor można zmienić, klikając na niego.

Trójwymiarową architekturę naczyń krwionośnych jajnika zbadano po przeprowadzeniu immunobarwienia CD31. Strukturę 3D można obserwować poprzez przeglądanie poszczególnych przekrojów lub w całości za pomocą renderowania wolumetrycznego. Przeprowadzono barwienie CD31 naczyń pęcherzykowych u dorosłych myszy.

Dzięki rekonstrukcji naczyń włosowatych za pomocą włókien mogliśmy wykazać zależność między poszczególnymi mieszykami a ich naczyniami włosowatymi. Jajnik, podobnie jak organizm kobiety, jest zawsze aktywny i zmienny. Jednak ze względu na ograniczenia tradycyjnej analizy histologicznej, opisanie relacji między tak złożonymi składnikami jest bardzo trudne.

Nowo opracowana metoda, pasywna klaryfikacja, może pomóc nam pokonać przeszkody optyczne, zachować integralność całych tkanek oraz dostarczyć wskazówek funkcjonalnych.