Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY
10 grudnia 2017
Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.
Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie pełnego trójwymiarowego obrazu rozkładu naczyń włosowatych w pęcherzykach jajnikowych myszy i pokazanie ich powiązań. Jajnik jest niezbędnym narządem w rozrodzie i endokrynologii. Policz każdy inny etap rozwoju pęcherzyka i komórek somatycznych.
Ponadto, w przeciwieństwie do innych narządów, jajnik nie wykazuje powtarzających się rozgałęzień jednostki funkcjonalnej. Miejscowy układ naczyniowy może być wraz z układem nerwowym być również zdolny do ulegania poważnym zmianom w każdym cyklu miesiączkowym u dorosłych kobiet. Zastosowanie biernej jasności w jajniku pozwala nam zobaczyć ogólny rozkład i połączenie między tymi komórkami i pęcherzykami w jajniku.
Najważniejszą z kluczowych cech tego środka jest to, że ma on najmniejszy wpływ na jajnik i odpowiada za usuwanie różnych markerów. Poprzez rekonstrukcję obrazu mikroskopowego dostarczyliśmy mapę jajnika. Niektóre szczegóły naczyń krwionośnych, neuronów i mieszków włosowych można wyraźnie zaobserwować.
Do analizy obrazu wykorzystano niektóre opcje Imaris do oceny relacji między jajnikiem a strukturami. Przygotuj roztwory obfitości zgodnie z instrukcją artykułu i trzymaj je na lodzie. Znieczul myszy i upewnij się, że mysz nie reaguje na szczypanie palców.
Rozpyl etanol, wykonaj nacięcie na prawym przedsionku, a następnie natychmiast obficie lewą komorę 20 ml lodowatego PBS z prędkością 10 ml na minutę, aby wypłukać krew. Następnie obficie zwierzę zimnym roztworem hydrożelu z tą samą prędkością. Zbierz jajniki, a także macicę, aby zachować integralność morfologii jajników.
Przenieś oddzielone jajniki do zimnego roztworu hydrożelu. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń tkankę tłuszczową wokół jajnika. Dla uzyskania lepszego efektu zespolenia tkanek zalecamy usunięcie kaletki jajnika.
Jajniki należy przechowywać w roztworze hydrożelu przez trzy dni. Po trzech dniach przenieś jajniki do szklanej rurki i napełnij probówkę świeżym roztworem hydrożelu. Rozciągnij parafilm na górnej części tuby, a następnie owiń kolejny parafilm wokół szyjki tuby.
Upewnij się, że między parafilmem a roztworem hydrożelu nie ma pęcherzyków. Umieść szklaną rurkę na inkubatorze wytrząsarki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny, aż utworzy się żel. Ostrożnie usuń nadmiar żelu wokół jajników za pomocą papierowego filtra.
Umieść jajniki w probówce o pojemności 15 ml i napełnij probówkę 10 ml roztworu klarującego. Umieść probówkę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej dwa miesiące. Zmieniaj roztwór oczyszczający codziennie przez pierwsze trzy dni, a następnie co tydzień, aż jajnik zostanie oczyszczony.
Wszystkie procedury barwienia immunologicznego są wykonywane w temperaturze 37 stopni Celsjusza na shakerze. Najpierw umyj jajnik w PBST przez 24 godziny. Drugi jajnik inkubować w przeciwciałie pierwszorzędowym rozcieńczonym PBST przez dwa dni.
Po trzecie, zmyj pierwszorzędowe przeciwciała buforem PBST. Po czwarte, inkubuj jajnik z pożądanym przeciwciałem drugorzędowym w PBST przez dwa dni. Po piąte, zmyj przeciwciała drugorzędowe PBST.
Po szóste, przenieś jajnik do roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła w celu homogenizacji RI. Sprawdź przezroczystość wizualną, gdy jajnik zostanie w pełni oczyszczony, można go zobrazować. Najpierw przygotuj czyste naczynie ze szklanym dnem.
Zrób cylinder szpachlowy i uformuj go w kształt podkowy. Mocno dociśnij zewnętrzną krawędź do szkiełka szkiełkowego, aby uzyskać szczelną przestrzeń. Wysokość szpachli powinna być nieco wyższa niż jajnik.
Ostrożnie przesuń jajnik do środka i dodaj roztwór montażowy. Popchnij naczynie na kit i użyj dwóch kawałków szpachli, aby go naprawić. Gdy jajnik jest gotowy do obrazowania, można wybrać mikroskop konfokalny firmy Nikon z obiektywem 16X, aby go zobrazować.
W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego należy najpierw wybrać soczewkę w panelu Ni-E. W panelu akwizycja wybierz liczbę kanałów. Najpierw użyj zakładki Eye Port i joysticka kontrolera XY, aby przesunąć tkankę do środka pola poprzez sprawdzenie za pomocą okularów mikroskopu.
Po drugie, po wyłączeniu światła migawki kliknij zakładkę na żywo, aby dostosować moc lasera, HV i przesunięcie dla każdego kanału. W panelu Korekcja intensywności Z dostosuj akwizycję dla górnej warstwy, kliknij przycisk plusa, aby zdefiniować górę, przesuń soczewkę w dół soczewki i ustaw odpowiednią moc HV i lasera na dole tkanki i dodaj informacje o najniższej warstwie, kliknij Do ND, aby zsynchronizować ustawienie z panelem i akwizycją. A w akwizycji najpierw ustaw liczbę kroków skanowania.
Kliknij zakładki Z i duży obraz. Po drugie, przejdź do okna skanowania dużego obrazu, aby zdefiniować rozmiar pola zgodnie z granicą tkanki. Po trzecie, wróć do akwizycji ND, aby wprowadzić rozmiar pól skanowania i wybrać nakładanie się w zakresie 10 i 50%Następnie kliknij uruchom korekcję Z i poczekaj na proces obrazowania.
Najpierw użyj imagic, aby otworzyć oryginalny plik sieciowej usługi informacyjnej. Kliknij przycisk obrazu, wybierz kolor i kanały wyświetlania, a następnie kliknij plik, wybierz sekwencje obrazów i osobno zapisz je jako pliki tiff. Po drugie, użyj Imaris, aby otworzyć jeden z plików tiff.
Kliknij przycisk edycji i wybierz dodaj kanały, aby dodać resztę. Nazwę i kolor można zmienić w regulacji wyświetlacza. Grubość tkanki powinna być również skorygowana we właściwościach obrazu.
Po trzecie, kliknij przycisk edycji i wybierz Przytnij 3D, aby wyciąć dodatkową część. Najpierw kliknij przycisk filamentu i kliknij Dalej. Przejdź do panelu plasterków, znajdź naczynie śledzące i odległość, a następnie wróć do Przekrocz, wprowadź dane statyczne i kliknij Dalej.
Po drugie, dostosuj próg początkowy i nastawy. W panelu kamery wybierz wybór, naciśnij shift i kliknij punkt, aby usunąć dodatkową część. Po trzecie, wybierz najwyższy próg i kliknij Dalej.
Nie wybieraj wykrywanych punktów i idź dalej. Część nadmiaru można usunąć w panelu edycji. Kolor można edytować, klikając kolor.
Badano architekturę 3D naczyń krwionośnych jajników po barwieniu immunologicznym CD31. Strukturę 3D można obserwować za pomocą plasterków przechodzących przez inne plasterki lub przez całość za pomocą renderowania objętościowego. CD 31 to barwienie naczyń pęcherzykowych dorosłej myszy.
Poprzez rekonstrukcję naczyń włosowatych przez włókna mogliśmy wykazać związek między poszczególnymi pęcherzykami a ich naczyniami włosowatymi. Jajnik, podobnie jak kobieta, jest zawsze aktywny i wymienny. Jednak ze względu na ograniczenia tradycyjnej analizy histologicznej, bardzo trudno jest opisać relacje między tak złożonymi składnikami.
Nowo opracowana metoda, pasywna przejrzystość, może pomóc nam pokonać przeszkodę optyczną, zachować integralność całych tkanek i dostarczyć funkcjonalnych wskazówek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ta praca prezentuje adaptację pasywnej metody CLARITY do wizualizacji naczyń krwionośnych jajnika i naczynek włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy. Protokół ma na celu zapewnienie kompleksowego trójwymiarowego obrazu rozmieszczenia naczynek włosowatych w pęcherzykach jajnikowych.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Biologia Rozrodcza
- Biologia Naczyniowa
Wprowadzenie
- Jajnik odgrywa kluczową rolę w rozrodczości i endokrynologii.
- Pęcherzyki przechodzą przez różne etapy rozwoju, z których każdy charakteryzuje się odrębnymi komórkami nabłonkowymi.
- W przeciwieństwie do innych narządów, jajnik nie wykazuje powtarzającego się rozgałęziania jednostek funkcjonalnych.
- Układ naczyniowy w jajniku może ulegać znacznym zmianom w każdym cyklu menstruacyjnym.
Cel Badania
- Wizualizacja ogólnego rozmieszczenia naczynek włosowatych w pęcherzykach jajnikowych myszy.
- Zilustrowanie relacji między komórkami i pęcherzykami w jajniku.
- Wzmocnienie zrozumienia unaczynienia jajnika i jego implikacji dla zdrowia reprodukcyjnego.
Wykorzystane Metody
- Zastosowanie pasywnej techniki CLARITY.
- Trójwymiarowa rekonstrukcja naczyń krwionośnych jajnika.
- Wizualizacja naczynek włosowatych w nienaruszonych jajnikach myszy.
- Liczenie różnych etapów rozwoju pęcherzyków i komórek nabłonkowych.
Główne Wyniki
- Pomyślna wizualizacja sieci naczyń krwionośnych w pęcherzykach jajnikowych.
- Szczegółowe odwzorowanie połączeń naczyniowych między pęcherzykami.
- Wgląd w dynamiczne zmiany w unaczynieniu jajnika.
- Ustanowienie ramy dla przyszłych badań nad biologią jajnika.
Wnioski
- Pasywna metoda CLARITY skutecznie ujawnia architekturę naczyniową jajnika.
- To podejście może poszerzyć naszą wiedzę na temat funkcji i zdrowia jajnika.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać te wyniki do zbadania endokrynologii rozrodczej.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Visualizing intact ovarian vasculature in 3D enables mechanistic de-risking of reproductive target hypotheses by clarifying structural relationships between follicles and their capillary networks. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of vascular architecture that can inform target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: linking anatomical context to functional ovarian biology without tissue distortion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping follicular capillary length to follicular wall volume, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides a standardized, shrinkage-minimized clearing protocol that preserves tissue integrity for reproducible vascular analysis.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through quantitative correlation data (P<0.01) between capillary extent and follicular development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated 3D vascular maps that serve as disease-relevant systems for assessing compound effects on ovarian microstructure.
- Operational Value: Enables assay standardization via consistent immunostaining (CD31), clearing, and imaging parameters across follicles.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptable clearing and reconstruction workflows applicable to other endocrine tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-stage vascular phenotypes to preclinical models by preserving native ovarian architecture for longitudinal study.
- Mechanistic De-risking: Clarifies neurovascular interactions in the ovary, reducing ambiguity in endocrine target pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides structural biomarkers (e.g., capillary length, follicular volume) to inform go/no-go decisions in follicle-modulating programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of vascular contributions to follicle maturation, supporting lead identification through phenotypic vascular profiling, and informing preclinical validation via intact tissue phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular regulators in follicle development through direct 3D visualization of capillary networks.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared ovarian tissue with quantitative vascular outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric measurements (capillary length, follicular volume) and correlation statistics to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains histological fidelity from discovery through preclinical stages by avoiding tissue sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular mapping capability for endocrine and reproductive tissue atlases across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in ovarian vascular biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via passive CLARITY’s minimal tissue perturbation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular-related follicle phenotypes, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on vascular-structural phenotypes in follicle cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel-based tissue clearing, immunostaining, and multiphoton confocal microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including shaker incubators, refractive index matching systems, and 3D reconstruction software (e.g., Imaris).
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration, antibody validation, and imaging parameters for reproducible vascular quantification.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-ovarian tissues due to differences in density and lipid content.
- Limited by extended clearing timelines (up to two months) and the need for optimized antibody penetration in dense stromal regions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:36
Perfusion and Ovary Preparation
3:00
Degassing and Passive CLARITY
5:01
Immunostaining
5:50
Confocal Imaging
8:37
3D Reconstruction of Ovarian Structure
11:04
Results: Representative 3D Passive CLARITY Images of Cleared Ovary
12:00
Conclusion
