Name: Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj metodę pasywnego CLARITY do trójwymiarowej rekonstrukcji naczyń krwionośnych jajnika myszy. Technika ta umożliwia wizualizację sieci kapilar w pęcherzykach jajnikowych i badanie ich relacji przestrzennych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez granty z Chińskiego Specjalnego Funduszu dla Postdoców (nr 2014T70392 dla YF), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81673766 dla YF), New Teacher Priming Fund, Fundacji Zuoxue Uniwersytetu Fudan oraz Projektu Rozwoju Shanghai Peak Disciplines-Integrative Medicine (20150407).

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były zgodne z wytycznymi Komisji Etyki Zwierząt w Shanghai Medical College, Fudan University (numer zatwierdzenia 20160225-013).
1. Przygotowanie przezroczystego jajnika myszy
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów
	<ol>
		<li>Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) (1 M, pH 7,6) z 0,1% Triton X-100 (PBST). Aby przygotować 1 l 10x PBS roztworu podstawowego, wymieszaj 87 g NaCl, 3,1 g NaH2PO4 · 2H2O i 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. Dodaj dH2O do 1 L i mieszaj ~ 2 h. Doprowadzić do pH 7,4 za pomocą 1 N NaOH i przechowywać w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć ten 10-krotny roztwór podstawowy w stosunku 1/10 za pomocądH2O, a następnie uzyskać 0,1% Triton X-100 w PBS.</li>
		<li>Przygotować roztwór hydrożelu (pH 7,5) przez zmieszanie 4% (wag./obj.) roztworu paraformaldehydu (PFA), 4% (wag./obj.) akrylamidu, 0,05% (wag./obj.) bisakryloamidu i 0,25% (wag./obj.) inicjatora VA-044 w podwójnie destylowanej wodzie na lodzie.</li>
		<li>Przygotować roztwór klarujący (pH 8,5), mieszając 200 mM buforu boranu sodu zawierającego 4% (wag./obj.) dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie podwójnie destylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja przezsercowa i przygotowanie jajników
	<ol>
		<li>Utrzymuj wszystkie roztwory na lodzie podczas wszystkich zabiegów.</li>
		<li>Znieczulić dorosłą samicę myszy C57BL/6 typu dzikiego wstrzyknięciem dootrzewnowym roztworu pentobarbitalu (0,35 mg/kg). Gdy nie wykaże reakcji na uszczypnięcie palca, mysz jest odpowiednio znieczulona.</li>
		<li>Użyj taśmy klejącej, aby przymocować mysz z kończynami rozciągniętymi na płaskiej płycie piankowej.</li>
		<li>Odsłoń serce przez nacięcie wyrostka mieczykowatego przez klatkę piersiową, skórę i kości nożyczkami.</li>
		<li>Wykonać nacięcie w prawym przedsionku zwierzęcia, a następnie przetoczyć lewą komorę 20 ml lodowatego 1x PBS przy 10 ml / min.</li>
		<li>Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia z co najmniej 20 ml roztworu hydrożelu o stężeniu 10 ml/min.</li>
		<li>Naciąć nożyczkami skórę nad brzuchem wzdłuż linii przyśrodkowo-brzusznej, która odsłania całą enterocelię, i usunąć jelita. Zbierz jajniki, a także macicę, aby zachować integralność morfologii jajników.</li>
		<li>Usuń tkankę tłuszczową wokół jajnika pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odgazowywanie
	<ol>
		<li>Umieścić jajniki w 10 ml roztworu hydrożelu w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia przez 3 dni.</li>
		<li>Przenieś jajnik do probówki o pojemności 5 ml i napełnij probówkę roztworem hydrożelu. Rozciągnij parafilm na górnej części tuby, a następnie owiń parafilm wokół szyjki tuby. 
		Uwaga: Upewnij się, że między parafilmem a roztworem hydrożelu nie ma pęcherzyków.</li>
		<li>Umieścić probówkę na wytrząsarce w inkubatorze w temperaturze 37 °C na maksymalnie 3 godziny, aby umożliwić polimeryzację hydrożelu.</li>
		<li>Usuń jajnik z żelu za pomocą szpatułki i ostrożnie usuń nadmiar żelu z okolic jajnika za pomocą bibuły. Umyj jajnik cztery razy za pomocą 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozliczanie pasywne
	<ol>
		<li>Zanurz jajnik w 10 ml roztworu oczyszczającego. Delikatnie wstrząsnąć z prędkością 80 obr./min w temperaturze 37 °C, aby rozpocząć proces oczyszczania.</li>
		<li>W pierwszym tygodniu zmieniaj roztwór co 3 dni. Po tygodniu odświeżaj roztwór oczyszczający raz w tygodniu, aż jajnik stanie się czysty. Zwykle proces ten trwa około 2-3 tygodni. 
		UWAGA: Jajnik może być bezpośrednio wybarwiony immunologicznie lub może być przechowywany w azydku sodu (0,02%) w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni przed barwieniem immunologicznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Przemyć jajnik dwukrotnie w PBST w dniu 1 w temperaturze 37 °C na shakerze.</li>
	<li>Inkubować jajnik na wytrząsarce w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych/PBST (Tabela 1) w 2-3 dniu w temperaturze 37 °C. W prezentowanej pracy pierwszorzędowymi przeciwciałami były cząsteczka adhezji komórek płytkowo-śródbłonkowych 1 (CD31) i hydroksylaza tyrozynowa rozcieńczona odpowiednio w stosunku 1:10 i 1:50 w PBST. 
	Uwaga: Jeśli stosuje się dwa lub więcej rodzajów przeciwciał pierwszorzędowych, upewnij się, że istnieją różne źródła pochodzenia zwierzęcego.</li>
	<li>Przeciwciała pierwszorzędowe zmyć buforem PBST w temperaturze 37 °C w dniu 4 na shakerze.</li>
	<li>Inkubować jajnik z pożądanymi przeciwciałami drugorzędowymi w PBST w dniu 5-6 w temperaturze 37 °C na wytrząsarce. W prezentowanej pracy przeciwciałami drugorzędowymi były Alexa Flour 488 dla hydroksylazy tyrozynowej i Alexa Flour 594 dla CD31 rozcieńczonej w stosunku 1:50 w PBST.</li>
	<li>Zmyć przeciwciała drugorzędowe buforem PBST w temperaturze 37 °C w dniu 7 na shakerze.</li>
	<li>Przenieś tkankę do roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła w celu homogenizacji indeksu refrakcji w 8 dniu. Połóż chusteczkę na papierze z liniami siatki, aby sprawdzić jej przejrzystość wizualną, sprawdzając, czy linie siatki są widoczne. Gdy tkanka zostanie w pełni oczyszczona, można ją zobrazować.</li>
	<li>Wykonaj cylinder szpachlowy, który mógłby po prostu otoczyć tkankę, a następnie uformuj go w kształt podkowy i mocno dociśnij zewnętrzny grzbiet do szkiełka szkiełkowego, aby uzyskać szczelną przestrzeń. Wysokość szpachli powinna być nieco wyższa niż jajnik.</li>
	<li>Ostrożnie umieść oczyszczony jajnik w środku szpachli i dodaj roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła. Mocno przyłóż naczynie ze szklanym dnem na kit i użyj szpachli do zamocowania naczynia.</li>
</ol>
3. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Do obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego w panelu "Ni-E" wybierz soczewkę (w tym przypadku soczewkę obiektywową 25X zanurzoną w wodzie, 1.1-NA, 2 mm-WD) o odpowiedniej odległości roboczej (w tym przypadku 2.0 mm).</li>
	<li>W panelu "Akwizycja" wybierz liczbę kanałów. Tutaj użyj trzech kanałów.
	<ol>
		<li>Najpierw użyj zakładki "port oka" i joysticka kontrolera XY, aby przesunąć tkankę do środka pola, sprawdzając przez okulary mikroskopu.</li>
		<li>Po wyłączeniu światła migawki kliknij zakładkę "na żywo", aby dostosować "moc lasera", "HV (wzmocnienie)" i "przesunięcie" dla każdego kanału osobno. Wyższa moc lasera i HV mogą prowadzić do wyższych sygnałów, a wyższe przesunięcie może zmniejszyć szum tła.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni "Rozmiar skanowania" i "Liczba". Użyj rozmiaru skanu 1024 x 1024μm2 i liczby od 4 do 8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ustawieniu jakości obrazu w celu zdefiniowania głębokości tkanki w panelu "Korekcja intensywności Z" i po umieszczeniu soczewki na najwyższej warstwie jajnika (w środku tkanki) i dostosowaniu akwizycji dla górnej warstwy, kliknij przycisk "plus", aby zdefiniować górną warstwę.
	<ol>
		<li>Przesuń soczewkę w dół i ustaw odpowiednią moc HV i lasera dla dolnej części tkanki i dodaj informacje o najniższej warstwie do tabeli korekcji intensywności Z. Kliknij "Do ND", aby zsynchronizować ustawienie z panelem "Akwizycja ND".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W panelu "Akwizycja ND" najpierw ustaw liczbę kroków skanowania. Następnie zaznacz zakładki "Z" i "Duży obraz".
	<ol>
		<li>Przejdź do okna "Skanuj duży obraz", aby zdefiniować rozmiar pola zgodnie z granicą tkanki za pomocą wizualizacji tkanek przez okulary. Wróć do panelu "Akwizycja ND", aby wprowadzić rozmiar obszaru skanowania ("pól") i wybrać nakładanie się od 10% do 15%.</li>
		<li>Kliknij "Uruchom korekcję Z", a nie "Uruchom teraz", aby automatycznie ustawić odpowiednią wartość HV, moc lasera i przesunięcie dla każdej warstwy i poczekać, aż obraz zostanie przetworzony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 3D Rekonstrukcja poszczególnych mieszków włosowych i ich naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Najpierw użyj ImageJ5, aby otworzyć oryginalny plik sieciowej usługi informacyjnej. Kliknij przycisk "Obraz" i wybierz "Kolor" i "Podziel kanały". Następnie kliknij "Plik" i osobno zapisz kanały jako serie plików tiff, korzystając z opcji "Sekwencje obrazów" w "Zapisz jako".</li>
	<li>Użyj Imaris, aby otworzyć jedną z serii plików tiff. Kliknij przycisk "Edytuj" i wybierz "Dodaj kanały", aby dodać pozostałe kanały. Nazwę i kolor kanału można zmienić w zakładkach "Regulacja wyświetlania". Grubość tkanki może wymagać korekty w panelu "Właściwości obrazu" na liście rozwijanej w sekcji "Edycja".</li>
	<li>Aby przyciąć 3D końcowe obrazy i usunąć nadmiar części, kliknij przycisk "Edytuj" i wybierz "Przytnij 3D". Rozmiar pola można dostosować, przeciągając obramowanie.</li>
	<li>Aby zrekonstruować sygnały naczynia za pomocą algorytmu Filaments w panelu Surpass, kliknij przycisk "Filamenty", aby utworzyć nowy filament i kliknij dalej.
	<ol>
		<li>Aby zdefiniować największą i najcieńszą średnicę, przejdź do panelu "Plaster" i znajdź naczynie śledzące. Odległość zostanie automatycznie pokazana w panelu "Zmierz" po wybraniu dwóch punktów na maksymalnej szerokości statku.</li>
		<li>Wróć do panelu "Przekrocz" i wprowadź zmierzoną szerokość, a następnie kliknij Dalej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj próg punktu początkowego i początkowego. W panelu "Kamera" wybierz "Wybierz". Jeśli niektóre z automatycznie utworzonych kul muszą zostać usunięte, naciśnij Shift i kliknij punkt. Wybierając opcję "Nawiguj" i poruszając myszą, można obrócić strukturę, aby upewnić się, że wszystkie właściwe punkty zostały zachowane, a następnie kliknąć przycisk Dalej.</li>
	<li>Wybierz najwyższy próg dla lokalnego kontrastu i kliknij przycisk Dalej. Nie wybieraj opcji "Wykryj kolce" i kontynuuj finalizację rekonstrukcji cylindra naczynia krwionośnego. Kolor można edytować, klikając zakładkę "Kolor". Dane statystyczne można pobrać w panelu "Statystyka" zrekonstruowanego filamentu. Nadmiarowe części można usunąć w panelu "Edycja". 
	UWAGA: Inne algorytmy mogą być używane do pomiaru objętości całkowitych mieszków włosowych lub ścian mieszków włosowych. W prezentowanej pracy oocyty zostały oznaczone przez autofluorescencję obu przeciwciał drugorzędowych. Ze względu na dużą ilość danych, do analizy danych wykorzystano serwer stacji roboczej.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
UWAGA: Dane analizy obrazu są przedstawiane jako średnie ± standardowych błędów.
<ol>
	<li>Wykonaj porównania między pęcherzykami za pomocą testu t dla niezależnej próbki i użyj testu korelacji Pearsona, aby porównać współczynniki korelacji ściany pęcherzyka i długości naczyń włosowatych. Ustaw wartość P <0,05 jako granicę istotności statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, H. M., Russell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+vasculature+in+the+ovary%3A+development%2C+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease.</a> Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).</li>
<li>McFee, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+signal+transduction+blocks+follicle+progression+but+does+not+necessarily+disrupt+vascular+development+in+perinatal+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries.</a> Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).</li>
<li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ%2C+the+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+platelet+endothelial+cell+adhesion+molecule-1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice.</a> Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).</li>
<li>Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+expression+of+alpha+%281%29-+and+beta+%282%29-adrenoceptors+and+p75+neurotrophin+receptors+in+rats+with+steroid-induced+polycystic+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries.</a> Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).</li>
<li>Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annual+and+periovulatory+changes+in+tyrosine+hydroxylase+activity+in+the+ovary+of+the+catfish+Heteropneustes+fossilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis.</a> Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Serotonergic+Fibers+in+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+the+CLARITY%2FCUBIC+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique.</a> J Vis Exp. (108), e53673(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum%3A+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Sci Rep. 6, 26013(2016).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).</li>
<li>Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+ovarian+follicular+antrum+and+follicular+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid.</a> Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).</li>
<li>Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-follicle+barrier+%28BFB%29+in+disease+and+in+ovarian+function%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function.</a> Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clear%28T%29%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v16/n8/full/nn.3447.html">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationalisation+and+validation+of+an+acrylamide-free+procedure+in+three-dimensional+histological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging.</a> PLOS ONE. 11, e0158628(2016).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27627784">Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+three-dimensional+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue.</a> Sci Rep. 7, 9895(2017).</li>
<li>Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+an+essential+role+of+vasoconstriction+in+rupture+of+the+ovarian+follicle+at+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).</li>
<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biol Reprod. 93 (113), (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu prezentujemy obrazowanie 3D w celu oceny zależności między naczyniami włosowatymi a poszczególnymi rosnącymi pęcherzykami. W naszej poprzedniej pracy przy użyciu tego samego protokołu 9 badaliśmy role dużego naczynia krwionośnego, interakcji między pęcherzykami i lokalizacji pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy. Pasywne podejście CLARITY pozwoliło nam na zbadanie mikro- i makronaczyniowości, folikulogenezy oraz wzajemnych powiązań między ciałkami żółtymi a pęcherzykami...

Pęcherzyk jest podstawową strukturalną i funkcjonalną jednostką jajnika, a jego rozwój jest ściśle związany z unaczynieniem w jajniku. Naczynia krwionośne dostarczają składniki odżywcze i hormony do mieszków włosowych, a tym samym odgrywają ważną rolę we wzroście i dojrzewaniu mieszków włosowych1.
Połączenie technologii, w tym selektywnych markerów naczyń krwionośnych, transgenicznych modeli myszy i rozwoju farmaceutycznego, poszerzyło naszą wiedzę na temat sieci naczyniowych jajników, angiogenezy i funkcji naczyń krwionośnych w folikulogenezie. Jajnik jest znany jako narząd aktywny, ponieważ przebudowuje różne tkanki i sieci naczyniowe podczas folikulogenezy i owulacji. Taka aktywna przebudowa wielkości i struktury naczyń krwionośnych jest wymagana dla biologicznej funkcji rozwoju i rekrutacji pęcherzyków.
Tradycyjne metody histologiczne i histomorfometryczne wykorzystujące wycinki jajników i znakowanie immunologiczne naczyń krwionośnych są ograniczone do dwuwymiarowych (2D) obrazów2. Wraz z rozwojem technologii rekonstrukcji trójwymiarowej (3D), obrazy 2D wycinków tkanek mogą nakładać się na siebie, aby utworzyć strukturę 3D, ale ta metoda nadal ma pewne ograniczenia - cięcie tkanki może zniszczyć mikrostruktury, często brakuje niektórych części tkanki, a wykonanie rekonstrukcji 3D z obrazów uzyskanych z plasterków wymaga znacznego nakładu pracy. Obrazowanie 3D całych tkanek za pomocą mikroskopii konfokalnej może przezwyciężyć wiele z tych ograniczeń, ale metody te ograniczają się do oceny angiogenezy w zarodkowym jajniku3. Stosowanie metod oczyszczania całych tkanek, takich jak CLARITY4 może zwiększyć wizualizowaną objętość, aby rozwiązać te problemy w jajnikach po urodzeniu i dorosłych, a takie metody zapewniają optyczny klirens jajnika bez żadnych deformacji strukturalnych. Obrazowanie architektury 3D nienaruszonego jajnika zapewnia dokładną bazę danych obrazów dla oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak pakiet oprogramowania Imaris wykorzystany w tej pracy.
Przebudowa jajnika w okresie dorosłym jest częścią dynamicznego systemu fizjologicznego, co czyni jajnik doskonałym modelem do badań nad regulacją angiogenezy. Ponadto ocena roli naczyń krwionośnych jajników w stanach patologicznych żeńskiego układu rozrodczego, takich jak zespół policystycznych jajników lub rak jajnika, może być badana poprzez obrazowanie całej tkanki jajnika. Opracowanie pasywnej metody CLARITY i zastosowanie zaawansowanego oprogramowania do analizy obrazu dostarczyło szczegółowych informacji przestrzennych na temat relacji między naczyniami krwionośnymi a strukturami jajników, takimi jak pęcherzyki włosowe.

<table><tbody><tr><td>Akrylamid</td><td></td><td>Vetec v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Mąka Alexa 488 (rozcieńczenie 1:50)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Mąka Alexa 594 (rozcieńczenie 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Bisakryloamid</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem o czarnych ściankach (Willco-Dish)</td><td>Ted Pella</td><td>14032</td><td></td></tr><tr><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall Kwas borowy</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy dwunastowodny (Na2HPO4 12H2O)</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sinopharm Chemical Odczynnik</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1/CD31, cząsteczka adhezji komórek płytkowo-śródbłonkowych 1 (rozcieńczenie 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>Fotoinicjator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>Dihydrofosforan sodu dwuwodny (NaH2PO4 2H2O)</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny 20040718</td><td></td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td></td><td>dodecylosiarczan sodu</td><td>30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>Hydroksylaza tyrozyny (TH, rozcieńczenie 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem clarity

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Jajnik jest głównym organem żeńskiego układu rozrodczego i jest niezbędny do produkcji żeńskich gamet oraz do kontrolowania układu hormonalnego, ale skomplikowane relacje strukturalne i trójwymiarowe (3D) architektury naczyniowe jajnika nie są dobrze opisane. Aby uwidocznić połączenia 3D i architekturę naczyń krwionośnych w nienaruszonym jajniku, pierwszym ważnym krokiem jest optyczne uwidocznienie jajnika. Aby uniknąć kurczenia się tkanek, zastosowaliśmy pasywną metodę CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) w celu oczyszczenia nienaruszonego jajnika. Barwienie immunologiczne, zaawansowana wielofotonowa mikroskopia konfokalna i rekonstrukcje obrazów 3D zostały następnie wykorzystane do wizualizacji naczyń jajnikowych i naczyń włosowatych pęcherzykowych. Stosując to podejście, wykazaliśmy istotną dodatnią korelację (P <0,01) między długością naczyń włosowatych pęcherzykowych a objętością ściany pęcherzyka.

Zaadaptowaliśmy pasywną metodę CLARITY do szybkiego i prostego sposobu pasywnego klarowania jajników, zachowując architekturę pęcherzykową i naczyniową oraz uzyskując najwyższy sygnał fluorescencyjny z oznakowanych markerów naczyń i pęcherzyków. Trójwymiarową architekturę naczyń pęcherzykowych określono za pomocą immunosteningu na CD31, marker komórek śródbłonkowych6. Barwienie CD31 w jajnikach dorosłych myszy prześledzono za pomocą algorytmu Filament, co wykazało ...

Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie pełnego trójwymiarowego obrazu rozkładu naczyń włosowatych w pęcherzykach jajnikowych myszy oraz przedstawienie ich wzajemnych relacji. Jajnik jest kluczowym organem w reprodukcji i endokrynologii. Należy policzyć pęcherzyki na każdym etapie rozwoju oraz komórki somatyczne.Ponadto, w przeciwieństwie do innych narządów, jajnik nie wykazuje powtarzającego się rozgałęzienia jednostki funkcjonalnej. Lokalny układ naczyniowy, wraz z układem nerwowym, może ulegać znacznym zmianom w każdym cyklu menstruacyjnym u dorosłych samic. Zastosowanie pasywnego utrwalania w jajniku pozwala nam zobaczyć ogólny rozkład oraz powiązania między tymi komórkami i pęcherzykami w jajniku.Kluczowym aspektem tej metody jest to, że wywiera ona minimalny wpływ na jajnik, umożliwiając jednocześnie uwidocznienie różnych markerów. Dzięki rekonstrukcji obrazu mikroskopowego przygotowaliśmy mapę jajnika. Można na niej wyraźnie zaobserwować szczegóły naczyń, neuronów oraz pęcherzyków.Do analizy obrazów wykorzystano wybrane funkcje oprogramowania Imaris w celu oceny zależności między jajnikiem a strukturami. Należy przygotować roztwory do perfuzji zgodnie z instrukc

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

To badanie przedstawia protokół odwracalnego oczyszczania tkanek, barwienia immunologicznego, renderowania 3D i analizy sieci naczyniowych w próbkach ludzkich kosmków łożyskowych rzędu 1 - 2 mm3.

Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Tutaj opisujemy, porównujemy i kontrastujemy dwie różne techniki dokładnego liczenia pęcherzyków w stałych tkankach jajnika myszy.

Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Zmiany w przepływie krwi w jajnikach w okresie przedowulacyjnym są niezbędne do owulacji. Ultrasonografia Dopplera była stosowana u ludzi i dużych zwierząt do oceny hemodynamiki jajnika i perfuzji. Przedstawiono protokół stosowania ultrasonografii Dopplera w celu oceny hemodynamiki jajników w fazie przedowulacyjnej i okołoowulacyjnej u myszy.

Ultrasonografia Dopplera do obrazowania na żywo i ilościowej funkcji naczyń jajników u myszy

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Poznaj metodę pasywnego CLARITY do trójwymiarowej rekonstrukcji naczyń krwionośnych jajnika myszy. Technika ta umożliwia wizualizację sieci kapilar w pęcherzykach jajnikowych i badanie ich relacji przestrzennych.

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

Przeglądaj więcej filmów