Name: Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj syntezę bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli. Ta metoda pozwala badać mechanizmy samoorganizacji molekularnej w biologii syntetycznej z dużą precyzją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez Biuro Badań Marynarki Wojennej o numerze N00014-13-1-0074 (dla V.N.), grant Human Frontier Science Program numer RGP0037/2015 (dla V.N.) oraz grant Binational Science Foundation 2014400 (dla V.N.).

<ol><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol Adv. , (2011).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metab Eng. , (2011).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2FmL+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+cell-free+expression+toolbox%3A+application+to+synthetic+gene+circuits+and+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells.</a> ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+expanded+cell-free+protein+synthesis+using+endogenous+pyrrolysyl+orthogonal+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system.</a> Biotechnol Bioeng. , (2015).</li>
<li>Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-standard+amino+acid+incorporation+into+proteins+using+Escherichia+coli+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis.</a> Frontiers in Chemistry. 2, (2014).</li>
<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).</li>
<li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+DNA+for+Rapid+Prototyping+of+Synthetic+Biological+Circuits+in+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System.</a> Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth Biol. , (2016).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Phys Rev Lett. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-synthesis+of+protein+nanoassemblies%3A+tubes%2C+rings%2C+and+doughnuts%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts.</a> Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunoblot+assay+reveals+that+bacteriophage+T4+thymidylate+synthase+and+dihydrofolate+reductase+are+not+virion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins.</a> J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762(2013).</li>
<li>Shin, J. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J Biol Eng. , (2010).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+amino+acid+mixtures+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems.</a> Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+biochemical+reactions+within+cells+differ+from+those+in+test+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes.</a> J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+for+protein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding for protein assembly.</a> Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).</li>
<li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding%3A+biochemical%2C+biophysical%2C+and+physiological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li>
</ol>

Autorzy deklarują następujące konkurencyjne interesy finansowe: Laboratorium Noireaux otrzymuje fundusze na badania od MYcroarray, dystrybutora zestawu do ekspresji białek bezkomórkowych MYtxtl.

Podążając za techniką Chen i wsp.14 W przypadku SPMC krytyczny etap jest osiągany przy określaniu właściwych warunków nadkażenia. Parametrem, który najściślej kontroluje zdolność szczepu gospodarza do wytrzymania nadkażenia, jest często początkowe stężenie infekującego faga. Komórki gospodarza muszą znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu przed początkowym zakażeniem bardzo małą ilością faga. W końcu również osiągnie wzrost logarytmiczny, a celem jest umożliwienie liczbom fagów szybk...

W ciągu ostatniej dekady, technologia ekspresji bezkomórkowej została opracowana z myślą o nowych zastosowaniach w powstających multidyscyplinarnych obszarach badawczych związanych z biologią syntetyczną i ilościową. Pierwotnie używane do ekspresji białek niezależnie od żywego organizmu, nowe bezkomórkowe systemy TXTL zostały opracowane zarówno dla nauk podstawowych, jak i stosowanych1,2, znacznie rozszerzając zakres tej technologii. Nowa generacja platform TXTL została zaprojektowana tak, aby była przyjazna dla użytkownika, bardziej wydajna (osiągająca 2 mg/ml syntezy białek w trybie wsadowym3), bardziej wszechstronna na poziomie transkrypcji4 oraz modułowa, aby łatwo integrować nowe naturalne lub syntetyczne funkcje, które rozszerzają możliwości istniejących systemów biologicznych5,6. W szczególności bezkomórkowe systemy TXTL stały się przydatne do szybkiego prototypowania programów genetycznych, takich jak elementy regulatorowe lub małe obwody genetyczne7,8,9, skracając cykl projektowania, budowy i testowania do kilku dni. Co ciekawe, nowe systemy TXTL są również zdolne do przetwarzania dużych programów DNA, takich jak pełna synteza colifagów10,11, wykazując wystarczająco silne wyniki, aby wspierać rekonstrukcję aktywnych żywych istot kodowanych w genomowym DNA.
TXTL oferują wiele zalet technicznych w porównaniu z tradycyjnymi konstruktywnymi testami biochemicznymi in vitro. Bezkomórkowy TXTL łączy proces ekspresji genów z produktem końcowym w zredukowanym i otwartym środowisku, w przeciwieństwie do złożonej cytoplazmy żywej komórki. TXTL wykorzystuje DNA do rekonstrukcji systemów biochemicznych in vitro, co dzięki nowoczesnym technikom składania DNA jest niedrogie i szybkie, a także nie wymaga wymagających wymagających rygorystycznych etapów oczyszczania białek. Ekspresja bezkomórkowa zapewnia bezpośredni dostęp do większości składników w reakcjach biochemicznych, umożliwiając w ten sposób głębszą analizę oddziaływań molekularnych12. W reakcji TXTL można dowolnie zmieniać ustawienia biochemiczne i biofizyczne, co jest prawie niemożliwe w żywej komórce. Biorąc pod uwagę te zalety i ostatnie ulepszenia, technologia TXTL staje się coraz bardziej popularna jako alternatywna platforma dla biologii syntetycznej i ilościowej. Podczas gdy społeczność badawcza korzystająca z TXTL szybko się rozwija, a TXTL staje się standardową technologią w bioinżynierii, konieczne jest zrozumienie, w jaki sposób korzystać z takich platform, aby opracować odpowiednie praktyki związane z przeprowadzaniem reakcji TXTL i interpretacją wyników.
W tym artykule opisujemy, jak używać systemu TXTL składającego się wyłącznie z E. coli do syntezy, w reakcjach jednogarnkowych, bakteriofagów z ich genomu11, takich jak MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) i T7 (dsDNA, 40 kb). Pokazujemy, jak ilość syntetyzowanych fagów zmienia się w odniesieniu do niektórych ustawień biochemicznych reakcji (stężenia magnezu i potasu). Stłoczenie molekularne, emulowane przez szereg stężeń PEG 8000, ma dramatyczny wpływ na syntezę fagów w ciągu kilku rzędów wielkości. Realizacja tak dużych układów biochemicznych w reakcjach z pojedynczą probówką, które jednocześnie podsumowują procesy transkrypcji, translacji i samoorganizacji, jest interesująca dla odpowiedzi na podstawowe pytania związane z biologią i biofizyką10 (regulacja genów, samoorganizacja), a także dla rozwoju zastosowań, takich jak zmiana przeznaczenia funkcji fagów do budowy nowych nanostruktur13. Oprócz praktycznej wiedzy na temat TXTL zapewniamy metody amplifikacji fagów, ekstrakcji i oczyszczania genomu oraz kwantyfikacji fagów za pomocą testu płytki nazębnej. Metody przedstawione w tym manuskrypcie są odpowiednie dla badaczy, którzy używają systemów bezkomórkowych opartych na ekstrakcie z E. coli i są zainteresowani bakteriofagami.
Protokoły przedstawione w tej pracy można podsumować w następujący sposób: 1) Amplifikacja fagów (Dzień 1: przygotowanie komórek inokulacyjnych, dzień 2: pojedyncza płytka, wzrost i koncentracja wielu fagów, a dzień 3: oczyszczanie faga), 2) Ekstrakcja dwuniciowego DNA genomu (ekstrakcja fenolem/chloroformem), oraz 3) Bezkomórkowa reakcja fagowa i eksperyment z mianem (Dzień 1: płytki z komórkami gospodarza i wykonanie płytek agarowych, Dzień 2: Reakcja bezkomórkowa i wstępna hodowla komórek gospodarza oraz Dzień 3: Hodowla komórek gospodarza i miano faga).

<table><tbody><tr><td>Probówki do ultrawirowania</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Ekspres do gradientów</td><td>BioComp Gradient Master</td><td>patrz Anal Biochem. 1985 lipiec; 148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Monojekt strzykawkowy i kaniula</td><td></td><td>8881513918 i 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Licznik płytek nazębnych</td><td>Nowy Brunszwik Naukowy</td><td>licznik kolonii Model C-110</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>System bezkomórkowy</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>Model 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB receptura</td><td></td><td></td> płytki <td>agarowej 25 g/L podłoża Luria-Bertani (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents numer produktu BP1426) i 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - numer produktu 214010).</td></tr></tbody></table>

synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na e. coli

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Nowa generacja bezkomórkowych systemów transkrypcyjno-translacyjnych (TXTL), zaprojektowana tak, aby miała większą wszechstronność i modułowość, zapewnia nowe możliwości wykonywania podstawowych i stosowanych nauk w reakcjach probówkowych. W ciągu ostatniej dekady bezkomórkowy TXTL stał się potężną techniką dla szerokiego zakresu nowatorskich multidyscyplinarnych obszarów badawczych związanych z biologią ilościową i syntetyczną. Nowe platformy TXTL są szczególnie przydatne do konstruowania i badania systemów biochemicznych poprzez wykonywanie syntetycznych lub naturalnych obwodów genowych. Metody in vitro Projekt TXTL okazał się wygodny w szybkim prototypowaniu elementów regulatorowych i sieci biologicznych, a także w rekapitulacji mechanizmów samoorganizacji molekularnej występujących w organizmach żywych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób zakaźne bakteriofagi, takie jak MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) i T7 (dsDNA), są w całości syntetyzowane z ich genomu w reakcjach jednogarnkowych przy użyciu Escherichia coli, bezkomórkowego systemu TXTL. Syntezę trzech colifagów określa się ilościowo za pomocą testu płytki nazębnej. Pokazujemy, w jaki sposób wydajność zsyntetyzowanego faga zależy od ustawień biochemicznych reakcji. Stłoczenie molekularne, emulowane przez kontrolowane stężenie PEG 8000, wpływa na ilość syntetyzowanych fagów o rzędy wielkości. Opisujemy również, jak amplifikować fagi i jak oczyszczać ich genomy. Zestaw protokołów i wyników przedstawionych w tej pracy powinien zainteresować multidyscyplinarnych badaczy zajmujących się bezkomórkową biologią syntetyczną i bioinżynierią.

Przedstawiamy cztery reprezentatywne wyniki. Na Rysunku 1 prezentujemy zestaw kontroli negatywnych, aby upewnić się, że bezkomórkowy system TXTL oraz zapasy DNA faga nie są zanieczyszczone żywymi komórkami E. coli. Weryfikujemy, czy bezkomórkowy system TXTL jest wolny od zanieczyszczeń w postaci nienaruszonych komórek E. coli, wysiewając na płytki zarówno nieinkubowany, jak i inkubowany roztwór reakcyjny pozbawiony DNA genomowego (<strong cl...

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest opisanie procesu syntezy bakteriofagów z ich genomu z wykorzystaniem całkowicie bezkomórkowego systemu transkrypcji i translacji E.coli. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii syntetycznej, takie jak wyjaśnienie mechanizmów molekularnego samozłożania w systemach żywych. Główną zaletą tej techniki jest wszechstronność platformy.Wiele systemów biologicznych można w pełni odtworzyć i precyzyjnie dostosować do analizy eksperymentalnej. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania plam fagowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Używając końcówki sterylnej pipety Pasteura, wytnij i usuń pojedynczą plamę.Wydmuchaj plamkę do rozcieńczonych komórek. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Aby sprawdzić pełną infekcję, pobierz próbkę o objętości 500 µL do probówki 1,5 mL i dodaj 10 µL chloroformu.Natychmiast wymieszaj mieszaninę na vortexie z dużą prędkością i sprawdź, czy roztwór staje się klarowny, co wskazuje na infekcję fagową. Po całkowitym zainfekowaniu komórek inkubuj je przez kolejne dwie godziny. Następnie dodaj DNazę przed wirowaniem komórek przy 8 000 ×g i temperaturze

synthesis-infectious-bacteriophages-an-e-coli-based-cell-free

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Źródło: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)W niniejszym filmie zaprezentowano metodę kontrolowanej ekspresji białka kapsydu bakteriofaga Qβ w zmodyfikowanych szczepach E. coli. Powstałe białka ulegają samoroskładaniu w cząsteczki przypominające wirusy (VLP), które są następnie pozyskiwane do dalszej biokoniugacji.

Produkcja cząsteczek wirusopodobnych w zmodyfikowanych E. coli

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Poznaj syntezę bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli. Ta metoda pozwala badać mechanizmy samoorganizacji molekularnej w biologii syntetycznej z dużą precyzją.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Przeglądaj więcej filmów