Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opisanie sposobu, w jaki bakteriofagi są syntetyzowane na podstawie ich genomu przy użyciu systemu translacji transkrypcji bez komórek E. coli. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii syntetycznej, takie jak wyjaśnienie mechanizmów samoorganizacji molekularnej w żywych organizmach. Główną zaletą tej techniki jest wszechstronność platformy.

Wiele systemów biologicznych można w pełni podsumować i precyzyjnie dostroić do analizy eksperymentalnej. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania blaszek fagowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj końcówki sterylnej pipety Pasteura do rdzenia i usuń pojedynczą płytkę nazębną.

Wdmuchnij płytkę nazębną w rozcieńczone komórki. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Aby sprawdzić, czy infekcja jest pełna, weź próbkę o objętości 500 mikrolitrów do 1,5-mililitrowej probówki i dodaj 10 mikrolitrów chloroformu.

Natychmiast zwirować mieszaninę z dużą prędkością i obserwować, czy roztwór klaruje się, co wskazuje na zakażenie fagami. Gdy komórki zostaną w pełni zainfekowane, inkubuj przez kolejne dwie godziny. Następnie dodaj DNazę przed odwirowaniem komórek w temperaturze 8 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Wyrzuć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach 1X Tris chlorku magnezu. Dodaj 500 mikrolitrów chloroformu i wiruj z dużą prędkością, aby zlizować komórki. Klarować przez odwirowanie w temperaturze 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przenieś supernatant do 15-mililitrowej stożkowej rurki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj cztery gradienty sacharozy od 5 do 45%, pipetując 2,5 mililitra 45% sacharozy do czterech probówek ultrawirówek. Na wierzch warstwy nałożyć około 2,6 mililitra 5% sacharozy, zatrzymując się, gdy płyn dotrze do dwóch milimetrów od krawędzi tuby.

Mieszaj gradienty, obracając rurę przechylającą za pomocą przyrządu do formowania gradientu przez 43 sekundy pod kątem 86 stopni i 23 obr./min. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra dodać 500 mikrolitrów zbiorczej zawiesiny fagowej, doprowadzając końcówkę do kontaktu z powierzchnią cieczy i bardzo powoli dozując objętość na wierzch gradientu sacharozy, uważając, aby nie wymieszać się przez szybkie pipetowanie. Wirować przy 70 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zanurz kaniulę w roztworze, aż końcówka znajdzie się wyśrodkowana na samej górnej krawędzi pasma faga. Usunąć opaskę, pociągając za tłok strzykawki, aż większość pasma faga zostanie usunięta. Następnie dodać objętość sacharozy z zawieszonym fagiem do trzech lub czterech probówek ultrawirówek.

Napełnij probówki na głębokość od trzech do czterech milimetrów od górnej części rurki zimnym 1XTM. Przykryj probówki folią parafinową i odwróć do wymieszania. Umieść probówki z powrotem w ultrawirówce i spędź w temperaturze 145 000 razy g przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Szybko odlej supernatant i odcedź do góry nogami na jednorazowych chusteczkach. Podziel od 200 do 400 mikrolitrów zimnego 1XTM na wszystkie granulki i ponownie zawiesić na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nie jest wymagane potrząsanie.

Dzień przed wykonaniem miana przygotuj na noc kulturę komórek gospodarza E. coli w 10 mililitrach pożywki wzrostowej LB i pozostaw kulturę w inkubatorze wstrząsającym ustawionym na 250 obr./min i 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową, pipetując 5,25 mililitra górnego agaru, 220 mikrolitrów rozcieńczonych próbek fagów i 50 mikrolitrów komórek bakteryjnych gospodarza do 14-mililitrowej probówki hodowlanej. Zakryj probówkę hodowlaną i wiruj z dużą prędkością.

Pobrać dwie płytki hodowlane z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie powoli dodawaj 2,5 mililitra mieszanki głównej do środka pierwszego talerza. Delikatnie obróć płytkę ręcznie, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę wzorcową, tak aby obejmowała całą płytkę hodowlaną.

Odczekaj 20 minut, aby zapewnić zestalenie górnego agaru. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do siedmiu godzin. Policz blaszki i określ stężenie faga dla każdej próbki reakcyjnej.

Rozcieńczyć porcję materiału fagowego do 400 mikrolitrów buforem 1XTM w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Dodać równą objętość chloroformu Tris fenol do rozcieńczenia. Delikatnie potrząsaj mieszaniną na laboratoryjnym bujaku lub ręcznie przez pięć minut.

Następnie odwirować powstałą emulsję w ilości 17 000 g w wirówce stołowej przez pięć do 10 minut. Usuń górną fazę wodną do nowej rurki, uważając, aby nie naruszyć granicy międzyfazowej. Powtórz te kroki dodatkowo dwa razy, co daje w sumie trzy ekstrakcje fenolowe.

Przenieś fazę wodną do świeżej probówki i dodaj równą objętość chloroformu. Wstrząśnij i odwiruj przed przeniesieniem próbki wodnego DNA do czystej probówki. Następnie dodaj 0,4 objętości trzech molowych octanu sodu i trzy objętości 95% etanolu.

Umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby wytrącić się przez noc. Wirować z prędkością 17 000 g w wirówce stołowej przez 10 do 15 minut. Usunąć i wyrzucić supernatant przez dekantację lub pipetowanie.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu i delikatnie potrząśnij rurką, aż granulka swobodnie unosi się na dnie tuby. Po odwirowaniu usuń i wyrzuć etanol, uważając, aby nie naruszyć osadu. Po dodaniu etanolu i odwirowaniu jak poprzednio, usuń i wyrzuć etanol po raz drugi, ponownie uważając, aby nie naruszyć osadu.

Suszyć pelety na powietrzu na blacie przez 30 do 60 minut. Po wyschnięciu dodaj 50 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do osadu i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza do ponownego zawieszenia. Określ stężenie DNA za pomocą pomiarów absorpcji w 280 nanometrach.

Aby przeprowadzić reakcję bezkomórkową, należy poddzielić wskazaną objętość surowego ekstraktu, 33% końcowej objętości reakcji, do probówki mikrowirówkowej. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z wykazem w protokole tekstowym. Dodać odpowiednią objętość każdego składnika do ekstraktu surowego.

Po dodaniu ostatniego składnika homogenizuj reakcję przez wirowanie. Następnie podziel mieszankę wzorcową na n probówek do mikrowirówek. Następnie dodaj wskazane woluminy składników zmiennych do głównej tablicy mix.

Dodaj wodę do każdej reakcji, aby osiągnąć pożądaną końcową objętość reakcji przed wirowaniem. Następnie inkubować probówki do mikrowirówek w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez co najmniej osiem godzin lub przez noc. Po przygotowaniu komórek do miana faga, jak opisano w protokole tekstowym, należy określić miano końcowego roztworu LB do reakcji bezkomórkowej, jak pokazano wcześniej w tym filmie.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki bezkomórkowej reakcji syntetyzującej faga phi X 174. Ta blaszka fagowa pokazuje udaną reakcję fagową, która została nachylona w odpowiednim rozcieńczeniu, co jest widoczne w policzalnej liczbie blaszek. Jednak udana reakcja może objawić się słabo, jeśli współczynnik rozcieńczenia jest zbyt niski w stosunku do wydajności fagowej reakcji.

Tabliczka ta pokazuje niezliczoną ilość tabliczek. Pokazano tutaj płytkę z niejednorodnym rozmieszczeniem blaszek fagowych z powodu niewystarczającej równowagi wstępnej temperatury płytki hodowlanej. Podczas miana faga płytka hodowlana zestaliła reakcję w prawej dolnej części płytki.

Warunki stłoczenia molekularnego mają silny wpływ na syntezę fagów dla phi X 174, a T7.In szczególności wydajność fagów dla T7 spada o trzy rzędy wielkości, gdy stężenie PEG spada z czterech do 2% wagowo. Po opanowaniu oczyszczanie fagów i ekstrakcję DNA można przeprowadzić w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo. Reakcja bezkomórkowa trwa zaledwie kilka godzin, gdy nie ma żadnych problemów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować fagi, ekstrahować i oczyszczać ich DNA, a następnie wykorzystywać wynik do odtworzenia w pełni zakaźnego faga przy użyciu bezkomórkowego systemu reakcji. Praca z fenolem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy nosić środki ostrożności, takie jak fartuch laboratoryjny, ochrona oczu i rękawice. Wszystkie prace z otwartymi pojemnikami fenolu należy wykonywać w dygestorium.