Name: Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj syntezę bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli. Ta metoda pozwala badać mechanizmy samoorganizacji molekularnej w biologii syntetycznej z dużą precyzją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez Biuro Badań Marynarki Wojennej o numerze N00014-13-1-0074 (dla V.N.), grant Human Frontier Science Program numer RGP0037/2015 (dla V.N.) oraz grant Binational Science Foundation 2014400 (dla V.N.).

<ol><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol Adv. , (2011).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metab Eng. , (2011).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2FmL+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+cell-free+expression+toolbox%3A+application+to+synthetic+gene+circuits+and+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells.</a> ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+expanded+cell-free+protein+synthesis+using+endogenous+pyrrolysyl+orthogonal+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system.</a> Biotechnol Bioeng. , (2015).</li>
<li>Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-standard+amino+acid+incorporation+into+proteins+using+Escherichia+coli+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis.</a> Frontiers in Chemistry. 2, (2014).</li>
<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).</li>
<li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+DNA+for+Rapid+Prototyping+of+Synthetic+Biological+Circuits+in+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System.</a> Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth Biol. , (2016).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Phys Rev Lett. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-synthesis+of+protein+nanoassemblies%3A+tubes%2C+rings%2C+and+doughnuts%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts.</a> Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunoblot+assay+reveals+that+bacteriophage+T4+thymidylate+synthase+and+dihydrofolate+reductase+are+not+virion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins.</a> J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762(2013).</li>
<li>Shin, J. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J Biol Eng. , (2010).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+amino+acid+mixtures+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems.</a> Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+biochemical+reactions+within+cells+differ+from+those+in+test+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes.</a> J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+for+protein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding for protein assembly.</a> Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).</li>
<li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding%3A+biochemical%2C+biophysical%2C+and+physiological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li>
</ol>

Autorzy deklarują następujące konkurencyjne interesy finansowe: Laboratorium Noireaux otrzymuje fundusze na badania od MYcroarray, dystrybutora zestawu do ekspresji białek bezkomórkowych MYtxtl.

Podążając za techniką Chen i wsp.14 W przypadku SPMC krytyczny etap jest osiągany przy określaniu właściwych warunków nadkażenia. Parametrem, który najściślej kontroluje zdolność szczepu gospodarza do wytrzymania nadkażenia, jest często początkowe stężenie infekującego faga. Komórki gospodarza muszą znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu przed początkowym zakażeniem bardzo małą ilością faga. W końcu również osiągnie wzrost logarytmiczny, a celem jest umożliwienie liczbom fagów szybk...

W ciągu ostatniej dekady, technologia ekspresji bezkomórkowej została opracowana z myślą o nowych zastosowaniach w powstających multidyscyplinarnych obszarach badawczych związanych z biologią syntetyczną i ilościową. Pierwotnie używane do ekspresji białek niezależnie od żywego organizmu, nowe bezkomórkowe systemy TXTL zostały opracowane zarówno dla nauk podstawowych, jak i stosowanych1,2, znacznie rozszerzając zakres tej technologii. Nowa generacja platform TXTL została zaprojektowana tak, aby była przyjazna dla użytkownika, bardziej wydajna (osiągająca 2 mg/ml syntezy białek w trybie wsadowym3), bardziej wszechstronna na poziomie transkrypcji4 oraz modułowa, aby łatwo integrować nowe naturalne lub syntetyczne funkcje, które rozszerzają możliwości istniejących systemów biologicznych5,6. W szczególności bezkomórkowe systemy TXTL stały się przydatne do szybkiego prototypowania programów genetycznych, takich jak elementy regulatorowe lub małe obwody genetyczne7,8,9, skracając cykl projektowania, budowy i testowania do kilku dni. Co ciekawe, nowe systemy TXTL są również zdolne do przetwarzania dużych programów DNA, takich jak pełna synteza colifagów10,11, wykazując wystarczająco silne wyniki, aby wspierać rekonstrukcję aktywnych żywych istot kodowanych w genomowym DNA.
TXTL oferują wiele zalet technicznych w porównaniu z tradycyjnymi konstruktywnymi testami biochemicznymi in vitro. Bezkomórkowy TXTL łączy proces ekspresji genów z produktem końcowym w zredukowanym i otwartym środowisku, w przeciwieństwie do złożonej cytoplazmy żywej komórki. TXTL wykorzystuje DNA do rekonstrukcji systemów biochemicznych in vitro, co dzięki nowoczesnym technikom składania DNA jest niedrogie i szybkie, a także nie wymaga wymagających wymagających rygorystycznych etapów oczyszczania białek. Ekspresja bezkomórkowa zapewnia bezpośredni dostęp do większości składników w reakcjach biochemicznych, umożliwiając w ten sposób głębszą analizę oddziaływań molekularnych12. W reakcji TXTL można dowolnie zmieniać ustawienia biochemiczne i biofizyczne, co jest prawie niemożliwe w żywej komórce. Biorąc pod uwagę te zalety i ostatnie ulepszenia, technologia TXTL staje się coraz bardziej popularna jako alternatywna platforma dla biologii syntetycznej i ilościowej. Podczas gdy społeczność badawcza korzystająca z TXTL szybko się rozwija, a TXTL staje się standardową technologią w bioinżynierii, konieczne jest zrozumienie, w jaki sposób korzystać z takich platform, aby opracować odpowiednie praktyki związane z przeprowadzaniem reakcji TXTL i interpretacją wyników.
W tym artykule opisujemy, jak używać systemu TXTL składającego się wyłącznie z E. coli do syntezy, w reakcjach jednogarnkowych, bakteriofagów z ich genomu11, takich jak MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) i T7 (dsDNA, 40 kb). Pokazujemy, jak ilość syntetyzowanych fagów zmienia się w odniesieniu do niektórych ustawień biochemicznych reakcji (stężenia magnezu i potasu). Stłoczenie molekularne, emulowane przez szereg stężeń PEG 8000, ma dramatyczny wpływ na syntezę fagów w ciągu kilku rzędów wielkości. Realizacja tak dużych układów biochemicznych w reakcjach z pojedynczą probówką, które jednocześnie podsumowują procesy transkrypcji, translacji i samoorganizacji, jest interesująca dla odpowiedzi na podstawowe pytania związane z biologią i biofizyką10 (regulacja genów, samoorganizacja), a także dla rozwoju zastosowań, takich jak zmiana przeznaczenia funkcji fagów do budowy nowych nanostruktur13. Oprócz praktycznej wiedzy na temat TXTL zapewniamy metody amplifikacji fagów, ekstrakcji i oczyszczania genomu oraz kwantyfikacji fagów za pomocą testu płytki nazębnej. Metody przedstawione w tym manuskrypcie są odpowiednie dla badaczy, którzy używają systemów bezkomórkowych opartych na ekstrakcie z E. coli i są zainteresowani bakteriofagami.
Protokoły przedstawione w tej pracy można podsumować w następujący sposób: 1) Amplifikacja fagów (Dzień 1: przygotowanie komórek inokulacyjnych, dzień 2: pojedyncza płytka, wzrost i koncentracja wielu fagów, a dzień 3: oczyszczanie faga), 2) Ekstrakcja dwuniciowego DNA genomu (ekstrakcja fenolem/chloroformem), oraz 3) Bezkomórkowa reakcja fagowa i eksperyment z mianem (Dzień 1: płytki z komórkami gospodarza i wykonanie płytek agarowych, Dzień 2: Reakcja bezkomórkowa i wstępna hodowla komórek gospodarza oraz Dzień 3: Hodowla komórek gospodarza i miano faga).

<table><tbody><tr><td>Probówki do ultrawirowania</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Ekspres do gradientów</td><td>BioComp Gradient Master</td><td>patrz Anal Biochem. 1985 lipiec; 148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Monojekt strzykawkowy i kaniula</td><td></td><td>8881513918 i 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Licznik płytek nazębnych</td><td>Nowy Brunszwik Naukowy</td><td>licznik kolonii Model C-110</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>System bezkomórkowy</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>Model 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB receptura</td><td></td><td></td> płytki <td>agarowej 25 g/L podłoża Luria-Bertani (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents numer produktu BP1426) i 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - numer produktu 214010).</td></tr></tbody></table>

synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na e. coli

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Nowa generacja bezkomórkowych systemów transkrypcyjno-translacyjnych (TXTL), zaprojektowana tak, aby miała większą wszechstronność i modułowość, zapewnia nowe możliwości wykonywania podstawowych i stosowanych nauk w reakcjach probówkowych. W ciągu ostatniej dekady bezkomórkowy TXTL stał się potężną techniką dla szerokiego zakresu nowatorskich multidyscyplinarnych obszarów badawczych związanych z biologią ilościową i syntetyczną. Nowe platformy TXTL są szczególnie przydatne do konstruowania i badania systemów biochemicznych poprzez wykonywanie syntetycznych lub naturalnych obwodów genowych. Metody in vitro Projekt TXTL okazał się wygodny w szybkim prototypowaniu elementów regulatorowych i sieci biologicznych, a także w rekapitulacji mechanizmów samoorganizacji molekularnej występujących w organizmach żywych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób zakaźne bakteriofagi, takie jak MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) i T7 (dsDNA), są w całości syntetyzowane z ich genomu w reakcjach jednogarnkowych przy użyciu Escherichia coli, bezkomórkowego systemu TXTL. Syntezę trzech colifagów określa się ilościowo za pomocą testu płytki nazębnej. Pokazujemy, w jaki sposób wydajność zsyntetyzowanego faga zależy od ustawień biochemicznych reakcji. Stłoczenie molekularne, emulowane przez kontrolowane stężenie PEG 8000, wpływa na ilość syntetyzowanych fagów o rzędy wielkości. Opisujemy również, jak amplifikować fagi i jak oczyszczać ich genomy. Zestaw protokołów i wyników przedstawionych w tej pracy powinien zainteresować multidyscyplinarnych badaczy zajmujących się bezkomórkową biologią syntetyczną i bioinżynierią.

Przedstawiamy cztery reprezentatywne wyniki. Na Rysunku 1 prezentujemy zestaw kontroli negatywnych, aby upewnić się, że bezkomórkowy system TXTL oraz zapasy DNA faga nie są zanieczyszczone żywymi komórkami E. coli. Weryfikujemy, czy bezkomórkowy system TXTL jest wolny od zanieczyszczeń w postaci nienaruszonych komórek E. coli, wysiewając na płytki zarówno nieinkubowany, jak i inkubowany roztwór reakcyjny pozbawiony DNA genomowego (<strong cl...

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest opisanie procesu syntezy bakteriofagów z ich genomu z wykorzystaniem całkowicie bezkomórkowego systemu transkrypcji i translacji E.coli. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii syntetycznej, takie jak wyjaśnienie mechanizmów molekularnego samozłożania w systemach żywych. Główną zaletą tej techniki jest wszechstronność platformy.Wiele systemów biologicznych można w pełni odtworzyć i precyzyjnie dostosować do analizy eksperymentalnej. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania plam fagowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Używając końcówki sterylnej pipety Pasteura, wytnij i usuń pojedynczą plamę.Wydmuchaj plamkę do rozcieńczonych komórek. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Aby sprawdzić pełną infekcję, pobierz próbkę o objętości 500 µL do probówki 1,5 mL i dodaj 10 µL chloroformu.Natychmiast wymieszaj mieszaninę na vortexie z dużą prędkością i sprawdź, czy roztwór staje się klarowny, co wskazuje na infekcję fagową. Po całkowitym zainfekowaniu komórek inkubuj je przez kolejne dwie godziny. Następnie dodaj DNazę przed wirowaniem komórek przy 8 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odciąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić pellet w 10 mililitrach 1X Tris magnesium chloride. Dodać 500 mikrolitrów chloroformu i mieszać w wortexie z dużą prędkością w celu lizy komórek. Przejrzystość uzyskać poprzez wirowanie przy 12 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przelej nadsącz do 15 ml probówki stożkowej i przechowuj w temperaturze 4 °C. Przygotuj cztery gradienty sacharozy od 5% do 45%, pipetując 2,5 ml 45% sacharozy do czterech probówek do ultrawirówki. Nałóż na wierzch około 2,6 ml 5% sacharozy, kończąc, gdy ciecz osiągnie poziom 2 mm od krawędzi probówki.Wymieszaj gradienty poprzez obrót probówki za pomocą urządzenia do tworzenia gradientów przez 43 sekundy pod kątem 86 stopni przy 23 RPM. Używając pipety o objętości 1 ml, dodaj 500 µL połączonej zawiesiny fagów, przykładając końcówkę do powierzchni cieczy i bardzo powoli dozując objętość na górną część gradientu sacharozy, uważając, aby nie wymieszać próbek poprzez szybkie pipetowanie. Wirować przy 70 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.Zanurz tępo zakończoną kaniulę w roztworze, aż jej końcówka znajdzie się w centrum górnej krawędzi prążka faga. Usuń prążek, pociągając tłok strzykawki, aż do momentu usunięcia większości prążka faga. Następnie dodaj objętość sacharozy z zawieszonym fagiem do trzech lub czterech probówek do ultrawirówki.Napełnij probówki zimnym 1XTM do poziomu od trzech do czterech milimetrów od górnej krawędzi. Przykryj probówki folią parafinową i odwróć, aby wymieszać zawartość. Umieść probówki z powrotem w ultrawirówce i wiruj z prędkością 145 000 ×g przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Szybko odlej nadsącz i osusz probówki, odwracając je do góry dnem na jednorazowych chłonnych ręcznikach. Rozdziel od 200 do 400 µL zimnego 1XTM pomiędzy wszystkie osady i resuspenduj przez noc w temperaturze 4 °C. Wstrząsanie nie jest wymagane.Dzień przed wyznaczeniem mian, przygotować kulturę komórek gospodarza E.coli w 10 mililitrach pożywki LB i pozostawić kulturę w inkubatorze z wytrząsarką ustawionym na 250 RPM i 37 stopni Celsius overnight. Następnie przygotować mieszaninę główną, pipetując 5,25 mililitra agaru wierzchniego, 220 mikrolitrów rozcieńczonych próbek fagów oraz 50 mikrolitrów komórek bakteryjnych gospodarza do probówki hodowlaniej o pojemności 14 mililitrów. Zamknąć probówkę i wymieszać na vortexu z dużą prędkością.Wyjmij dwie płytki hodowlane z inkubatora ustawionego na 37 °C. Następnie powoli dodaj 2,5 ml master mixu do centrum pierwszej płytki. Delikatnie obracaj płytkę ręcznie, aby równomiernie rozprowadzić master mix tak, aby pokrył on całą powierzchnię płytki hodowlanej.Odczekać 20 minut, aby zapewnić zestalenie agaru wierzchniego. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez od czterech do siedmiu godzin. Policzyć plak i określić stężenie fagów dla każdej próbki z reakcji.Rozcieńcz część zapasu faga do 400 µL za pomocą buforu 1XTM w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Do rozcieńczenia dodaj równą objętość Tris fenol chloroform. Mieszaninę wstrząsaj delikatnie na kołysarce laboratoryjnej lub ręcznie przez pięć minut.Następnie odwiruj otrzymaną emulsję przy 17 000 ×g w wirówce stołowej przez 5 do 10 minut. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki, uważając, aby nie naruszyć granicy międzyfazowej. Powtórz te kroki jeszcze dwukrotnie, aby przeprowadzić łącznie trzy ekstrakcje fenolem.Przenieść fazę wodną do nowej probówki i dodać równą objętość chloroformu. Wstrząsnąć i odwirować przed przeniesieniem wodnej próbki DNA do czystej probówki. Następnie dodać 0,4 objętości trzy molowego octanu sodu oraz trzy objętości 95% etanolu.Umieść probówkę w zamrażarce w temperaturze -20 °C w celu wytrącenia przez noc. Odwiruj w wirówce stołowej przy 17 000 ×g przez 10 do 15 minut. Usuń i wylej supernatant, poprzez zlanie go lub odpipecowanie.Następnie należy dodać 500 µL 70% etanolu i delikatnie wstrząsnąć probówką, aż osad oddzieli się od jej dna. Po wirowaniu należy usunąć i wylać etanol, uważając, aby nie naruszyć osadu. Po ponownym dodaniu etanolu i odwirowaniu, należy po raz drugi usunąć i wylać etanol, ponownie dbając o to, by nie naruszyć osadu.Osad suszyć na powietrzu na blacie przez 30 do 60 minut. Po wyschnięciu dodać do osadu 50 µL wody podwójnie destylowanej i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w celu resuspensji. Stężenie DNA określić za pomocą pomiarów absorpcji przy 280 nm.Aby przeprowadzić reakcję bezkomórkową, odmień wskazaną objętość surowego ekstraktu, stanowiącą 33% końcowej objętości reakcji, do probówki do mikrowirówki. Przygotuj mieszaninę główną (master mix) zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj odpowiednią objętość każdego składnika do surowego ekstraktu.Po dodaniu ostatniego składnika należy ujednolicić mieszaninę reakcyjną za pomocą vortexera. Następnie podzielić master mix na n probówek do mikrocentryfugi. W kolejnym kroku do serii probówek z master mixem dodać określone objętości zmiennych komponentów.Do każdej reakcji dodać wodę, aby osiągnąć pożądany końcowy objętość reakcji przed mieszaniem w wortexie. Następnie inkubować probówki do mikrocentryfugi w temperaturze 29 °C przez co najmniej osiem godzin lub przez noc. Po przygotowaniu komórek do miana fagów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, oznaczyć miano końcowego, wolnego od komórek roztworu reakcyjnego w LB, tak jak zaprezentowano wcześniej w tym filmie.Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki reakcji bezkomórkowej syntezy faga phi X 174. Płytka z plakami fagowymi obrazuje udaną reakcję faga, której miano określono przy odpowiednim rozcieńczeniu, o czym świadczy policzalna liczba plaków. Należy jednak pamiętać, że udana reakcja może być słabo widoczna, jeśli czynnik rozcieńczenia jest zbyt niski w stosunku do wydajności faga w danej reakcji.Na tej płytce widoczna jest niezliczalna liczba placków. Przedstawiona tutaj płytka wykazuje niejednorodne rozmieszczenie placków fagowych z powodu niewystarczającej preekwilibracji temperatury płytki z kulturą. Podczas oznaczania miana fagów, kultura na płytce zastygła w dolnej prawej części.Warunki zagęszczenia molekularnego (molecular crowding) mają silny wpływ na syntezę fagów phi X 174 oraz T7. W szczególności wydajność fagów T7 spada o trzy rzędy wielkości, gdy stężenie PEG spada z 4% do 2% masowych w objętości. Po opanowaniu techniki, oczyszczanie fagów i ekstrakcja DNA mogą zostać przeprowadzone w ciągu dwóch dni, jeśli proces zostanie wykonany prawidłowo. Reakcja bezkomórkowa trwa zaledwie kilka godzin, pod warunkiem braku problemów technicznych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak hodować fagi, ekstrahować i oczyszczać ich DNA oraz jak wykorzystać uzyskany materiał do rekonstytucji w pełni zakaźnych fagów przy użyciu bezkomórkowego systemu reakcyjnego. Praca z fenolem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak fartuch laboratoryjny, ochrona oczu i rękawiczki. Wszystkie prace z otwartymi pojemnikami zawierającymi fenol powinny być prowadzone w dygestorium.

synthesis-infectious-bacteriophages-an-e-coli-based-cell-free

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Poznaj syntezę bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli. Ta metoda pozwala badać mechanizmy samoorganizacji molekularnej w biologii syntetycznej z dużą precyzją.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Przeglądaj więcej filmów