Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Ogólnym celem tego protokołu barwienia immunologicznego jest ocena gęstości synaptycznej w wycinkach mózgu ex vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki i jest przydatna podczas badania zmian gęstości synaps, obserwowanych w chorobach neurodegeneracyjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona półilościowe oszacowanie gęstości synaps, które można porównać między warunkami eksperymentalnymi przygotowanymi w tym samym czasie.

Zacznij od umieszczenia mózgu myszy na szalce Petriego. Następnie usuń móżdżek i niewielką część kory czołowej za pomocą skalpela, a następnie wykonaj hemisekcję w dół na linii środkowej mózgu. Obróć jedną półkulę na stronę, która właśnie została przecięta, i przyklej ją do stolika wibratomu.

Wlej lodowaty ACSF do komory mikrotomu i natlenić roztwór. Wytnij odcinki o grubości od 200 do 300 mikronów w całym obszarze zainteresowania. W przypadku hipokampa należy uzyskać około trzech do czterech plasterków na półkulę.

Użyj plastikowej pipety Pasteura, aby przenieść plastry do komory o kontrolowanej temperaturze zanurzonej w natlenionym ACSF. Utrzymuj w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po upływie 30 minut przenieść plastry do 24-dołkowej płytki zawierającej 4% paraformaldehydu z 4% sacharozą i utrwalić na 20 minut do jednej godziny w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu umyj plastry trzy razy w 1x PBS przez 10 minut za każdym razem. Aby rozpocząć barwienie immunofluorescencyjne, zastąp PBS w dołkach plastrowych buforem blokującym i przepuszczalnym, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez cztery do sześciu godzin na wytrząsarce. Pod koniec etapu blokowania rozcieńczyć przeciwciało przeciwko vGlut1 jeden do 2 000 w buforze blokującym i przepuszczalnym.

Należy pamiętać, że rozcieńczenie to może się różnić w zależności od firmy i partii użytego przeciwciała. Inkubuj plastry w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj potrząsającej platformy energicznym ruchem.

Równomierne rozmieszczenie przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych jest ważne dla optymalnego barwienia. Z naszego doświadczenia wynika, że energiczne potrząsanie umożliwia najlepszą penetrację przeciwciał. Po inkubacji w przeciwciałie pierwszorzędowym należy umyć plastry trzy razy w PBS przez 10 minut za każdym razem, tak jak poprzednio.

Podczas ostatniego płukania rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w ilości 1 do 500 w buforze blokującym. Następnie inkubuj plastry w tym roztworze przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że plastry są chronione przed światłem, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło.

Po umyciu plastrów, tak jak poprzednio, za pomocą pędzla ostrożnie wyjmij plastry z płytki 24-dołkowej i ułóż je równomiernie na wstępnie oznaczonych szkiełkach podstawowych. Dodaj kroplę podłoża montażowego na wierzch każdego plasterka. A następnie delikatnie połóż szklane szkiełko nakrywkowe na plastrach, uważając, aby nie tworzyć się pęcherzyków powietrza.

Chronić przed światłem i pozostawić szkiełka do wyschnięcia na co najmniej trzy do czterech dni w temperaturze pokojowej. Przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez krótki czas. Ale do długotrwałego przechowywania trzymaj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Zacznij od użycia obiektywu 10x lub 20x, aby zidentyfikować region hipokampa, który ma być obrazowany, w tym przypadku synapsy między neuronami piramidowymi CA1 a aksonami pobocznymi Schaffera. Zmień obiektyw na 40-krotny lub 63-krotny zanurzony w olejku i upewnij się, że anatomia plastra jest nienaruszona, identyfikując ciągłe neuryty i zorganizowaną strukturę. Użyj markera neuronalnego, takiego jak MAP2, jako odniesienia.

Dostosuj ustawienia dla każdego kanału, aby uzyskać optymalny sygnał i kontrast o rozdzielczości 1 024 na 1 024 pikseli. Ustaw intensywność każdego lasera, aby uniknąć nasycenia jakichkolwiek pikseli. Oceń głębokość, na której barwienie jest równe, a następnie ustaw oprogramowanie tak, aby uzyskiwało stosy obrazów o co najmniej ośmiu równoodległych płaszczyznach 250 nm.

Następnie weź trzy sąsiadujące ze sobą reprezentatywne stosy obrazów z tego samego obszaru zainteresowania na wycinek. Powtórzyć pobieranie w co najmniej trzech plasterkach na warunek i od sześciu do ośmiu zwierząt na grupę badaną. Synapsy pobudzające można zidentyfikować na podstawie kolokalizacji między vGlut1 i PSD95, na co wskazują białe strzałki na obrazie w większym powiększeniu.

Blokada sygnalizacji Wnt w dorosłym hipokampie poprzez indukcję antagonisty Wnt Dkk1 powoduje utratę synaps pobudzających, szczególnie w warstwie promieniowej CA1. Procent synaps pobudzających między myszami kontrolnymi i iDkk1 określono ilościowo i stwierdzono, że jest on znacznie niższy u zwierząt transgenicznych iDkk1. Synapsy hamujące można zidentyfikować na podstawie kolokalizacji między vGat i Gephyrin.

Procent synaps hamujących między myszami kontrolnymi i iDkk1 określono ilościowo i nie wykryto żadnej istotnej różnicy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zachować jak największą ostrożność przy plastrach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać gęstość synaptyczną w wycinkach mózgu ex vivo.