Analiza dyfrakcyjna oparta na Fourierze żywych Caenorhabditis elegans
13 września 2017
Ten manuskrypt opisuje, jak rozróżniać różne nicienie za pomocą sygnatur dyfrakcyjnych dalekiego pola. Porównujemy lokomocję 139 dzikich i 108 "rolkowych" C. elegans, uśredniając częstotliwości związane z czasową sygnaturą dyfrakcyjną Fraunhofera w jednym miejscu za pomocą lasera o fali ciągłej.
Ogólnym celem tej opartej na Fourierze analizy dyfrakcyjnej jest scharakteryzowanie lokomocji C elegans w czasie rzeczywistym, gdy gatunek porusza się swobodnie w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii, opisując reakcje gatunków na różne gęstości roztworu lub mutanty lokomotoryczne. Metoda ta służy jako podstawa do analizy fourierowskiej gatunków mikroskopowych.
Ma tę zaletę, że każdy mikroskopijny gatunek będzie miał swoje unikalne widmo Fouriera. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat lokomocji C elegans, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ znalezienie nicienia w kuwecie, pod wiązką lasera, może być trudne.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, próbując dowiedzieć się więcej o zachowaniu podczas pływania na podstawie czasowego sygnału dyfrakcyjnego, który sam w sobie jest sygnałem zaszumionym. Aby rozpocząć, zabezpiecz laser helowo-neonowy w pobliżu lewego tylnego rogu stołu optycznego i podłącz go do źródła zasilania. Umieść filtr o neutralnej gęstości między laserem a lokalizacją próbki, tak aby wiązka lasera przeszła przez filtr przed dotarciem do próbki.
Korzystając z dwóch aluminiowych lusterek kierowniczych na przedniej powierzchni, zbuduj peryskop, zabezpieczając pierwsze lusterko za filtrem o neutralnej gęstości. Następnie zabezpiecz drugie lustro około 10 centymetrów poniżej pierwszego lustra, aby dać miejsce na sterowanie wiązką laserową. Włóż kuwetę między lustra i ustaw wiązkę lasera i kuwetę tak, aby wiązka laserowa przepływała pionowo przez kuwetę.
Następnie zabezpiecz fotodiodę naprzeciwko drugiego lustra, tak aby jej czujnik był skierowany w stronę lustra. Następnie umieść kuwetę wypełnioną wodą na stojaku. Dostosuj wysokość podstawy i kąty luster pierwszego i drugiego tak, aby wiązka lasera przechodziła przez kuwetę i była kierowana w pobliżu, ale nie bezpośrednio na fotodiodę.
Użyj dźwigni, aby upewnić się, że stojak tworzy równą powierzchnię dla kuwety. Jeśli stojak nie jest wypoziomowany, dokonaj odpowiednich regulacji, aż zostanie wypoziomowany. Na koniec podłącz fotodiodę do oscyloskopu cyfrowego za pomocą dołączonego USB i podłącz ją do komputera.
Załaduj oprogramowanie oscyloskopu i ustaw częstotliwość próbkowania na co najmniej osiem herców, aby wystarczająco rozwiązać cykl zaśmiecania robaka. Użyj cienkiego, spłaszczonego szpikulca z drutu platynowego, aby przenieść cztery dorosłe nicienie na świeżą płytkę Petriego wypełnioną agarem NGM. Następnie wyjmij jednorazową plastikową kuwetę z opakowania, uważając, aby dotykać kuwety tylko jej prążkowanymi bokami.
Następnie za pomocą mikropipety odpipetuj wodę destylowaną do kuwety, aż kuweta zostanie wypełniona w około 80% wodą destylowaną. Umieścić szalkę Petriego zawierającą C elegans pod lunetą preparacyjną. Następnie użyj platynowego kilofa, aby usunąć jeden dojrzały C elegans z szalki Petriego i zanurz go w kuwecie.
Przesuwaj kilof w kółko, aby w razie potrzeby usunąć nicienie. Z nicieniami należy obchodzić się delikatnie i nie potrząsać kuwetą. Potrząsanie kuwetą może spowodować, że robaki przestaną reagować.
Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w kuwecie, napełnij kuwetę wodą destylowaną, aż lekko drgnie nad górną częścią kuwety. Następnie napełnij nakrętkę wodą i szybko załóż nakrętkę na kuwetę. Za pomocą papieru do soczewek usuń wszelkie kropelki wody, które mogły rozlać się na kuwetę.
Dodatkowo użyj papieru do soczewek, aby usunąć wszelkie małe pozostałe kropelki. Włącz laser helowo-neonowy i dostosuj ustawienie częstotliwości tak, aby wytwarzał czerwoną wiązkę. Następnie włącz czujnik.
Trzymaj kuwetę za prążkowane boki i delikatnie ją przechylaj, aż nicienie znajdą się mniej więcej na środku kuwety. Następnie umieść kuwetę na statywie w układzie optycznym, centrując robaka w wiązce laserowej przemieszczającej się od lustra pierwszego do zwierciadła drugiego. Następnie umieść fotodiodę we wzorze dyfrakcyjnym tak, aby położenie fotodiody i centralne maksimum wzoru dyfrakcyjnego nie pokrywały się.
Następnie obróć filtry o neutralnej gęstości tak, aby z fotodiody było zauważalne napięcie. Pamiętaj, aby ograniczyć światło za pomocą filtra o neutralnej gęstości, aby zapobiec nasyceniu fotodiody. Płaska linia oznacza przesycenie lub brak intensywności.
Gdy poruszający się wzór dyfrakcyjny jest widoczny, zbierz dane za pomocą fotodiody, klikając przycisk start w oprogramowaniu, sterując oscyloskopem podczas monitorowania ruchu robaka. Kontynuuj wykonywanie pomiarów, aż robak wyjdzie z wiązki laserowej, a wzór dyfrakcyjny zniknie. Jeśli kuweta jest porysowana, wyrzuć ją wraz z robakiem i zacznij od nowa.
Po około 20 sekundach zatrzymaj proces zbierania danych, klikając przycisk stop w oprogramowaniu oscyloskopu. Zapisz dane każdej wersji próbnej w formacie tekstowym oddzielonym przecinkami lub w formacie tekstowym. Zbierz co najmniej 50 zestawów danych dla każdego fenotypu i użyj od ośmiu do 10 zwierząt w badaniu.
Przykłady modelowanych sekwencyjnych ruchów robaków i odpowiadających im wzorów dyfrakcyjnych przedstawiono tutaj. Modelowane wzory dyfrakcyjne jakościowo przypominają wzorce eksperymentalne i wskazują, że symulacja z powodzeniem modelowała nicienie. Ponadto można przedstawić ilościowo sygnatury dyfrakcyjnej czasowej walca i c eleganów typu dzikiego.
Jak widać tutaj, każdy nicień miota się w różnym tempie i amplitudzie. Średnie cyfrowe transformaty Fouriera pozwalają na identyfikację nicieni na podstawie amplitudy ich widma częstotliwości dyfrakcyjnej. Widmo robaków typu dzikiego jest zdominowane przez niższe częstotliwości niż widmo ruchu rolkowego.
Oto przykład oscylacji w, którą można traktować jako dwa przeciwstawne ruchy morza. W przeciwieństwie do tego, wałek będzie w większości tworzył c z jednej strony i wygląda tak. Badając częstotliwości, ruch w jest bardziej złożony, ujawniając więcej wtórnych niskich częstotliwości niż ruch c.
Po opanowaniu jednego zestawu danych można zebrać w ciągu około dwóch minut, jeśli technika jest wykonywana prawidłowo. Ustawienie optyki dla serii zestawów danych zajmuje około 20 do 30 minut. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby obchodzić się z C elegans z ostrożnością, aby zachować integralność ich lokomocji.
Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy zastosować inne metody, takie jak rekonstrukcja ciągnika i analiza nieliniowa, aby dowiedzieć się więcej o ruchu C elegans. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią do bardziej dogłębnego zbadania mutantów lokomotorycznych u C elegans. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć całkiem dobre zrozumienie, jak generować wzory dyfrakcyjne dla żywych nicieni i jak je analizować.
Nie zapominaj, że praca z laserami może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania zabiegu należy podjąć środki ostrożności, takie jak to, aby lasery nie poruszały się na poziomie oczu.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę analizy dyfrakcyjnej w oparciu o transformatę Fouriera w celu charakteryzacji lokomocji C. elegans w czasie rzeczywistym. Poprzez analizę czasowych sygnatur dyfrakcji Fraunhofera badacze mogą odróżnić fenotypy typu dzikiego od fenotypów „Roller” na podstawie wzorców ich lokomocji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Mikroskopia
Wstęp
- C. elegans służy jako organizm modelowy do badania lokomocji i neurobiologii.
- Każdy mikroskopijny gatunek posiada unikalne widmo Fouriera, które może dostarczyć informacji na temat ich zachowania.
- Analiza lokomocji może pomóc w zrozumieniu reakcji gatunków na zmiany środowiskowe.
- Występują trudności z lokalizacją nicieni w obrębie układu eksperymentalnego.
Cel badania
- Opracowanie metody analizy lokomocji C. elegans w czasie rzeczywistym.
- Rozróżnienie różnych fenotypów na podstawie wzorców ich lokomocji.
- Zapewnienie podstaw do analizy Fouriera, którą można zastosować do różnych gatunków mikroskopijnych.
Zastosowane metody
- Konfiguracja lasera helowo-neonowego i układu optycznego do analizy dyfrakcyjnej.
- Wykorzystanie fotodiody i cyfrowego oscyloskopu do gromadzenia danych o ruchu nicieni.
- Przygotowanie próbek C. elegans w kontrolowanym środowisku.
- Gromadzenie danych i analiza wzorów dyfrakcyjnych w celu zidentyfikowania charakterystyki lokomocji.
Główne wyniki
- Zaobserwowano wyraźne wzory dyfrakcyjne dla typu dzikiego oraz mutantów Roller C. elegans.
- Średnie cyfrowe transformaty Fouriera ujawniły różnice w częstotliwościach lokomocji.
- Metoda ta skutecznie wymodelowała ruch nicieni i dostarczyła ilościowych danych.
- Zbiór danych był efektywny, co pozwoliło na przeprowadzenie wielu prób w krótkim czasie.
Wnioski
- Analiza dyfrakcyjna oparta na transformacie Fouriera jest skuteczna w badaniu lokomocji C. elegans.
- Metodę tę można dostosować do innych organizmów mikroskopowych.
- Zrozumienie wzorców lokomocji może przyczynić się do badań neurobiologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia bezznakową charakterystykę lokomocji mikroorganizmów w czasie rzeczywistym poprzez analizę Fouriera sygnatur dyfrakcyjnych, zapewniając ilościowy odczyt fenotypowy dla zastosowań w neurobiologii i biofizyce. Wspiera ona walidację celów poprzez powiązanie mutacji genetycznych z mierzalnymi efektami behawioralnymi, co ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania. Podejście to oferuje skalowalną i wielokrotnego użytku platformę do przesiewania fenotypów lokomotorycznych u gatunków mikroskopowych, zwiększając pewność prognostyczną w systemach modelowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację zaburzeń genetycznych z odrębnymi widmami częstotliwości lokomocji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezetykietowy, w czasie rzeczywistym screening fenotypowy, bez konieczności stosowania znaczników fluorescencyjnych lub reporterów genetycznych.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na rozróżnienie fenotypów typu dzikiego i mutantów za pomocą wzorów dyfrakcyjnych poddanych transformacie Fouriera, co wspiera biologiczną ocenę ryzyka celów lokomotorycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje ilościowe, powtarzalne wyniki w dziedzinie częstotliwości, odpowiednie do wysokoprzepustowego screeningu fenotypowego.
- Skalowalność: Pozwala na zebranie ponad 50 zestawów danych na jeden fenotyp przy użyciu 8–10 zwierząt na próbę, co zapewnia solidność statystyczną.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Służy jako baza dla analizy Fouriera, którą można zastosować do dowolnych gatunków mikroskopowych o unikalnych sygnaturach spektralnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy fenotypy neurobehawioralne u C. elegans z potencjalnymi deficytami lokomocyjnymi istotnymi dla chorób w modelach wyższego rzędu.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wykorzystuje uśrednione widma Fouriera do walidacji modeli obliczeniowych dynamiki kształtu nicieni, zwiększając pewność mapowania fenotypu na genotyp.
- Wsparcie decyzji: Umożliwia podejmowanie decyzji go/no-go na podstawie dywergencji widmowej między szczepami, redukując niejednoznaczność w walidacji funkcjonalnej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, sytuując charakterystykę fenotypową po manipulacjach genetycznych, a przed identyfikacją wiodących cząsteczek, dostarczając mierzalnych punktów końcowych dotyczących lokomocji w celu walidacji szlaków sygnałowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez przekształcanie złożonych zachowań pływackich w analizowalne wzorce częstotliwości za pomocą transformaty Fouriera.
- Przesiewy: Dostarcza standaryzowane odczyty oparte na dyfrakcji, które umożliwiają porównanie aktywności lokomocyjnej w zależności od tła genetycznego lub zastosowanych związków.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie widm częstotliwość-amplituda, które umożliwiają rozróżnienie szczepów fenotypowych na podstawie dominujących trybów oscylacji.
- Badania translacyjne: Łączy mikroskopijne parametry lokomocji z funkcjami neurobiologicznymi, wspierając ekstrapolację na przedkliniczne modele zaburzeń ruchu.
- Zastosowania instytucjonalne: Tworzy przenośną platformę optyczną do fenotypowania opartego na analizie Fouriera w różnych modelach mikroorganizmów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez obiektywne fenotypowanie lokomocji w dziedzinie częstotliwości.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanemu układowi optycznemu i normalizacji sygnału (dzielenie przez maksymalną intensywność).
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając szybkie fenotypowanie (2 minuty na zestaw danych) po wstępnej, 20–30 minutowej konfiguracji.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację rozbieżności fenotypowej między szczepami typu dzikiego a mutantami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie ustawiania optyki i bezpieczeństwa laserowego, aby uniknąć nasycenia sygnału i zapewnić prawidłowe uformowanie wzoru dyfrakcyjnego.
- Zależne od stabilnego lasera helowo-neonowego, fotodiody oraz cyfrowego oscyloskopu z częstotliwością próbkowania ≥8 Hz w celu rozdzielenia częstotliwości lokomocji.
- Wymaga ostrożnego obchodzenia się z próbkami, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza lub stresowi nicieni, co mogłoby zniekształcić sygnatury czasowe.
- Obejmuje ręczny transfer nicieni za pomocą platynowej igły, co stanowi wąskie gardło w przypadku adaptacji do analiz wysokoprzepustowych.
- Ograniczone do organizmów na tyle małych, aby pozostawały w zawieszeniu na drodze wiązki lasera bez osadzania się lub występowania efektów brzeżnych podczas pomiaru.
