In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Procesy neowaskularne są charakterystyczną cechą kilku powszechnych patologii ocznych. Do najważniejszych należą wysiękowa zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (w skrócie Wet AMD), proliferacyjna retinopatia cukrzycowa oraz retinopatia wcześniaków. Zaburzenia te łącznie odpowiadają za większość przypadków ślepoty prawnej na całym świecie i wiążą się z dodatkowymi powikłaniami ocznymi, takimi jak krwotok do ciała szklistego i jaskra neowaskularne.

Jednakże, mimo ich powszechności, opcje terapeutyczne w przypadku schorzeń naczyniowych oka są ograniczone. Obecnym standardem leczenia neowaskularyzacji związanej z AMD oraz proliferacyjną retinopatią cukrzycową jest wtryskiwanie do ciała szklistego humanizowanych przeciwciał skierowanych przeciwko kluczowemu mediatorowi angiogenezy i neowaskularyzacji – czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego, czyli VEGF. Niemniej jednak, pomimo skuteczności w hamowaniu progresji choroby i poprawie widzenia funkcjonalnego, iniekcje do ciała szklistego są kosztowne i nie są całkowicie pozbawione ryzyka.

Powikłania mogą obejmować infekcje, zapalenie wnętrza gałki ocznej, odwarstwienie siatkówki oraz krwotok do wnętrza oka. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych opcji terapeutycznych, które byłyby skuteczne, bezpieczne i mniej kosztowne. W celu usprawnienia rozwoju leków na zaburzenia neowaskularne kluczowe znaczenie mają modele zwierzęce małych zwierząt.

Tego rodzaju modele muszą być powtarzalne, posiadać ustalone i zwalidowane odczyty oraz punkty końcowe, a w idealnym przypadku wykorzystywać klinicznie istotny związek referencyjny jako kontrolę pozytywną. W niniejszym protokole przedstawimy mysi model neowaskularyzacji naczyniówki (CNV), który jest jednym z najczęściej stosowanych modeli zarówno do badania mechanizmów patofizjologicznych przyczyniających się do CNV, jak i do opracowywania nowych środków antyneowaskularyzacyjnych. W modelu CNV błona Brucha jest uszkadzana za pomocą lasera argonowego.

Inicjuje to procesy neowaskularyzacji pochodzące z naczyniówki. Zastosowanie podłużnego obrazowania in vivo za pomocą optycznej koherencji tomografii w domenie widmowej, w skrócie SD-OCT, oraz angiografii z fluoresceiną, umożliwia śledzenie proliferacji i regresji CNV. Dzięki temu można ocenić skuteczność oraz przebieg czasowy nowych interwencji farmakologicznych.

Niedawne osiągnięcia w przetwarzaniu obrazów pozwalają ponadto na zautomatyzowaną segmentację w celu pomiaru grubości siatkówki, zapewniając metodologię wolną od błędu obserwatora do oceny występowania obrzęku. W niniejszym opracowaniu omówimy przydatność nowego oprogramowania InVivoVue Diver firmy Leica Microsystems do zautomatyzowanej segmentacji warstw siatkówki w mysim modelu CNV. Na koniec przeanalizujemy, w jaki sposób analiza histologiczna preparatów całej siatkówki może uzupełnić podłużne obrazowanie in vivo w tym modelu.

Do każdego oka podaje się jedną kroplę tropikamidu w celu rozszerzenia źrenic. Następnie zwierzę jest delikatnie umieszczane w uchwycie do pozycjonowania gryzoni. Myszy ustawia się tak, aby odsłonić oko, a następnie unieruchamia za pomocą uchwytu do nosa oraz kawałka taśmy laboratoryjnej delikatnie przyklejonej na grzbiecie.

Następnie, w celu nawilżenia, na oko nanosi się kroplę środka smarującego, a nadmiar płynu ostrożnie usuwa się za pomocą tamponów z papieru filtrującego. Na koniec stolik zostaje wyrównany przed urządzeniem OCT w celu wykonania obrazowania OCT wyjściowego. Przed zastosowaniem lasera przeprowadzane jest obrazowanie metodą spektralnej optycznej koherentnej tomografii (OCT) in vivo w stanie wyjściowym, aby zweryfikować brak nieprawidłowości w siatkówce.

Ostrożnie wyjmij mysz z uchwytu. Na szkiełko nakrywkowe nałóż jedną kroplę żelu Viscotears w celu aplanacji rogówki. Ustaw mysz tak, aby główka nerwu wzrokowego znajdowała się w centrum, a następnie skup wiązkę lasera na nabłonku barwnikowym siatkówki.

Wykonaj trzy strzały laserem, omijając naczynia krwionośne siatkówki na pozycjach godziny czwartej, ósmej i dwunastej wokół nerwu wzrokowego. Po wykonaniu wszystkich strzałów laserem sprawdź napięcie gałki ocznej, aby upewnić się, że nie wystąpiły krwawienia do siatkówki. Następnie ponownie ustaw mysz w uchwycie i przeprowadź angiografię z fluoresceiną oraz obrazowanie OCT, aby potwierdzić uszkodzenie błony Brucha.

W przypadku angiografii z fluoresceiną, najpierw ustaw ostrość na obszarach oparzeń laserowych, korzystając z trybu odbicia podczerwieni, który umożliwia wizualizację miejsc podania lasera. Ostrożnie wstrzyknij 0,1 ml 5% soli sodowej fluoresceiny na około 20 g masy ciała myszy, nie zmieniając pozycji oka myszy. Rozpocznij wykonywanie obrazów angiografii z fluoresceiną na poziomie naczyniówki oraz na poziomie siatkówki, w odstępach około 30 s.

Ustaw oko do obrazowania OCT w taki sam sposób jak poprzednio i rozpocznij obrazowanie. Uśrednianie sygnału SD-OCT pozwala na lepszą wizualizację szczegółowej morfologii siatkówki, co pokazano w tej sekwencji. Po wykonaniu obrazowania SD-OCT ostrożnie wyjmij mysz z uchwytu.

Nanieś środek smarujący do obu oczu. Na tym etapie można zdecydować o odwróceniu znieczulenia poprzez podskórny wtrysk atipamezolu, antagonisty receptora alfa-2 dla medetomidyny, lub poczekać na wybudzenie zwierzęcia z narkozy. Powtórz obrazowanie in vivo SD-OCT i FA u znieczulonych zwierząt w dniach kontrolnych: piątym, dziesiątym i czternastym.

Do pomiarów grubości siatkówki należy wykorzystać funkcję automatycznej segmentacji w oprogramowaniu InVivoVue Diver. W przypadku zdrowej siatkówki całkowita grubość siatkówki jest definiowana jako grubość wszystkich warstw, od warstwy włókien nerwowych do RPE. W zdrowej siatkówce automatyczna segmentacja może precyzyjnie wykryć poszczególne warstwy siatkówki, co przedstawiono na tym przykładzie.

Warto wspomnieć, że w miejscach występowania CNV należy przeprowadzić ręczny pomiar grubości siatkówki oddzielnie dla każdego miejsca zmiany CNV. Pomiar wykonuje się od warstwy włókien nerwowych do linii umownej przebiegającej przez warstwę RPE. Niniejsza sekwencja przedstawia schemat postępowania przy ręcznych pomiarach grubości w miejscach występowania zmian CNV.

Warstwa włókien nerwowych znajduje się u góry, a naczyniówka u dołu obrazu. Za pomocą myszy lub touchpada ręcznie wyznacza się granice warstwy włókien nerwowych oraz naczyniówki, a oprogramowanie automatycznie oblicza całkowitą grubość siatkówki na podstawie tych współrzędnych. Na tej rycinie przedstawiono obrazy seryjne wykonane co 20 sekund na poziomie naczyniówki.

Obraz pierwszy uzyskano w trybie odbicia podczerwieni. Pozostałe wykonano po dostryperitonealnym wstrzyknięciu fluoresceiny. Białe strzałki na obrazie pierwszym wskazują miejsca naświetlone laserem, w których w późniejszych punktach czasowych widoczny jest wyciek fluoresceiny, zaznaczony białymi strzałkami na obrazie 18.

Na tym obrazie przedstawiono sekwencję obrazowania FA wykonaną na poziomie siatkówki. Biała strzałka na obrazie 18 wskazuje miejsce laserowe, w którym wyciek fluoresceiny pojawia się szybciej niż w dwóch pozostałych miejscach, zaznaczonych okręgami na obrazie 18. Ta figura podsumowująca przedstawia przebieg czasowy obrazów SD-OCT.

W punkcie wyjściowym, bezpośrednio po laseroterapii oraz w punktach kontrolnych w piątym, dziesiątym i czternastym dniu. Podsumowując, protokół podłużnego obrazowania in vivo zmian CNV z wykorzystaniem SD-OCT i FA umożliwia szybką, multimodalną i wiarygodną klasyfikację patologii CNV oraz obecności obrzęku siatkówki. Dziękujemy za zainteresowanie.