Name: In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj multimodalne obrazowanie in vivo mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem przy użyciu SD-OCT i angiografii fluoresceinowej. Ta metoda umożliwia śledzenie progresji CNV i ocenę terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Yuliyi Naumchuk (Loyola University Chicago) i Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) za doskonałe wsparcie techniczne i wideograficzne. Program badawczy dr Kaja jest wspierany przez Dr. John P. and Therese E. Mulcahy Endowed Professorship in Ophthalmology na Uniwersytecie Loyola w Chicago.

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz Dyrektywą WE 86/609/EWG dotyczącą eksperymentów na zwierzętach, przy użyciu protokołów zatwierdzonych i monitorowanych przez Fińską Radę ds. Doświadczeń na Zwierzętach.
1. Model CNV myszy indukowany laserem 5
<ol>
	<li>Sprawdź oczy zwierzęcia makroskopowo pod kątem jakichkolwiek nieprawidłowości.</li>
	<li>Zważ mysz.</li>
	<li>Obliczyć i przygotować odpowiednią ilość środków znieczulających do użycia w zależności od masy ciała zwierzęcia, np. mieszaninę medetomidyny (1 mg/kg), ketaminy (75 mg/kg) i wody destylowanej (0,9% roztwór NaCl) w stosunku 1:1,5:2,5 lub ketaminy (40-75 mg/kg), ksylazyny (5 mg/kg) i wody destylowanej (0,9% roztwór NaCl) w stosunku 1:2,5:1; dla myszy 20 g, wstrzyknąć 0,1 ml mieszaniny.</li>
	<li>Wstrzyknąć środek znieczulający dootrzewnowo.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce i poczekaj, aż zwierzę zostanie znieczulone. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona z powodu braku odruchu pedałowania.</li>
	<li>Zapewnić stosowanie laserowego sprzętu ochrony osobistej.</li>
	<li>Włącz lampę szczelinową i laser diodowy 532 nm.</li>
	<li>Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Nałóż jedną kroplę Tropicamidu na rozszerzenie źrenic. Odczekaj 3-5 minut do pełnego (3 mm) rozszerzenia źrenic.</li>
	<li>Umieść mysz na stoliku lampy szczelinowej.</li>
	<li>Umieść jedną kroplę płynnego żelu okulistycznego na szkiełku nakrywkowym, aby wyrównać rogówkę.</li>
	<li>Ustaw oko myszy tak, aby głowa nerwu wzrokowego znajdowała się pośrodku.</li>
	<li>Ustaw moc lasera na 100 mW, czas trwania na 100 ms, a rozmiar plamki na 50 μm.</li>
	<li>Skoncentruj wiązkę lasera na nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE).</li>
	<li>Wykonaj trzy strzały laserowe w jedno oko, omijając naczynia krwionośne siatkówki, idealnie w pozycjach godziny 4, 8 i 12 wokół nerwu wzrokowego. Po wszystkich strzałach laserowych sprawdź dno oka pod kątem braku krwawienia z siatkówki. Oko przeciwległe służy jako kontrola nielaserowa.</li>
	<li>Wyrzuć szkiełko nakrywkowe i umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Nałóż jedną kroplę żelu PEG na oba oczy.</li>
</ol>
2. SD-OCT 6,7
<ol>
	<li>Umieść mysz w stadium wyrównania gryzoni i unieruchom głowę.</li>
	<li>Ustaw obiektyw systemu SD-OCT (np. Bioptigen/Leica Envisu R2200) tak, aby był skierowany w stronę oka podczas obrazowania in vivo za pomocą kontrolerów X-stage i Y.</li>
	<li>Wykonaj skany SD-OCT, aby zweryfikować pęknięcia błony Brucha: gdy SD-OCT zeskanuje całe oko, ręcznie przesuń linię odniesienia w miejscach laserowanych. Pęknięcia błony Brucha powinny być wyraźnie widoczne w obszarach laserowych (patrz Rysunek 1).</li>
</ol>
3. Angiografia fluoresceinowa 7,8,9
<ol>
	<li>Wyjmij mysz z uchwytem i umieść ją w systemie FA (np. Heidelberg Spectralis HRA2).</li>
	<li>Skoncentruj się na obszarach oparzeń laserowych dna oka w trybie odbicia podczerwonego z głową nerwu wzrokowego pośrodku okienka widzenia.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,1 ml 5% soli sodowej fluoresceiny dla myszy 20 g podskórnie lub dootrzewnowo.</li>
	<li>Skoncentruj się na poziomie naczyniówki.</li>
	<li>Zrób zdjęcie z poziomu ostrości naczyniówki.</li>
	<li>Ponownie ustaw ostrość na poziomie siatkówki i zrób zdjęcie.</li>
	<li>Odczekaj 30 s i powtórz kroki 3.4-3.6.</li>
	<li>Wyjmij mysz z uchwytu i umieść ją na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Odwróć znieczulenie za pomocą α2-antagonisty medetomidyny, atipamezolu (0,5 mg/kg, i.p.) lub poczekaj na powrót do zdrowia zwierzęcia po znieczuleniu.</li>
	<li>Powtórzyć obrazowanie in vivo SD-OCT i FA u znieczulonych zwierząt w 5, 10 i 14 dniu obserwacji.</li>
</ol>
4. Klasyfikacja CNV
<ol>
	<li>Oceń uszkodzenie błony Brucha na podstawie obrazów OCT i obrazów FA naczyniówki wykonanych bezpośrednio po laserowaniu w dniu 0 w następujący sposób: 
	0 - Membrana Brucha nie została uszkodzona 
	1 - udane uszkodzenie błony Brucha</li>
	<li>Oceń obecność CNV w laserowych miejscach, w których doszło do wycieku, zaobserwowanego, porównując dynamikę sygnału fluoresceiny w serii obrazów FA siatkówki w następujący sposób: 
	0 - normalny wygląd siatkówki 
	0,5 - słabe zabarwienie przecieku 
	1.0 - nieszczelne obszary CNV 
	Uwaga: Użyj obrazowania OCT w celu dodatkowego potwierdzenia CNV lub w wątpliwym FA, gdzie obecność płynu śródsiatkówkowego na obrazach OCT sugerowałaby klasyfikację CNV.</li>
</ol>
5. Pomiary grubości siatkówki
<ol>
	<li>Użyj zautomatyzowanego oprogramowania do segmentacji do pomiarów grubości siatkówki. Upewnij się, że całkowita grubość siatkówki jest brana pod uwagę jako grubość wszystkich warstw od warstwy włókien nerwowych do RPE (zdrowe miejsca pomiaru) lub do wyimaginowanej linii łączącej RPE wokół miejsca uszkodzenia (miejsca laserowe) (patrz również <silna klasa = "xfig">Rysunek 7).</li>
</ol>

<ol><li>Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+experimental+choroidal+neovascularization+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol.+Chic.+Ill+1960%22%5BJournal%5D)">A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat.</a> Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).</li>
<li>Tobe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+neovascularization+in+mice+with+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).</li>
<li>Seo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+inhibition+of+retinal+and+choroidal+neovascularization+by+oral+administration+of+a+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor.</a> Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).</li>
<li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> J Vis Exp. (106), e53502(2015).</li>
<li>Giani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PloS One. 10, e0132643(2015).</li>
<li>Sheets, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotectin+D1+attenuates+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse.</a> Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).</li>
<li>Hoerster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+and+ex-vivo+characterization+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+variability+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol.+Albrecht+Von+Graefes+Arch.+Klin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).</li>
<li>Sulaiman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Optical+Coherence+Tomography+Quantification+Method+for+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther.+Off.+J.+Assoc.+Ocul.+Pharmacol.+Ther.+Off.+J.+Assoc.+Ocul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).</li>
</ol>

Autor, dr Symantas Ragauskas, jest pracownikiem (naukowcem) i udziałowcem firmy Experimentica Ltd., która oferuje usługi badawcze na zlecenie z wykorzystaniem przedklinicznego modelu CNV zastosowanego w tym artykule.
Autorka Ewa Kiełczewski jest pracownikiem (inżynier ds. aplikacji badawczych, OCT) firmy Leica Microsystems, która produkuje systemy SD-OCT używane w tym artykule.
Autor, Joseph Vance, jest pracownikiem (dyrektorem sprzedaży NA OCT) firmy Leica Microsystems, która produkuje systemy SD-OCT używane w tym artykule. Joseph Vance jest również prezesem i dyrektorem zarządzającym Spective, LLC.
Autor, dr Simon Kaja, jest konsultantem, dyrektorem naukowym i udziałowcem Experimentica Ltd., organizacji zajmującej się badaniami przedklinicznymi na zlecenie, która oferuje usługi badań kontraktowych, w tym przedkliniczny model CNV wykorzystany w tym artykule. Dr Simon Kija jest również dyrektorem generalnym K&P Scientific, LLC, firmy konsultingowej zajmującej się naukami przyrodniczymi, a także profesorem okulistyki im. dr Johna P. i Therese E. Mulcahy na Uniwersytecie Loyola w Chicago, Stritch School of Medicine. Warunki tej umowy zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Loyola w Chicago zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów.
Autor, dr Giedrius Kalesnykas, jest pracownikiem (CEO) i udziałowcem firmy Experimentica Ltd., która oferuje usługi badań kontraktowych z wykorzystaniem przedklinicznego modelu CNV zastosowanego w tym artykule.

Obrazowanie multimodalne oferuje cenne narzędzia do oceny patologii CNV. W tym miejscu przedstawiliśmy protokół obrazowania składający się z FA, SD-OCT i automatycznej segmentacji w celu szybkiej, powtarzalnej i wiarygodnej oceny patologii CNV. Potwierdzono pęknięcie błony Brucha po podaniu lasera. Ponadto zastosowanie SD-OCT na tym etapie pozwoliło również na natychmiastową wizualizację ewentualnych krwotoków śródsiatkówkowych i podsiatkówkowych, co może zaburzyć interpretację wyników. Nieszczelności siatkówki oceniano ...

Pierwsza udana próba naśladowania patologii ludzkiego CNV u gryzoni została zademonstrowana prawie trzy dekady temu za pomocą lasera kryptonowego u szczurów Long-Evans1. Następnie laser kryptonowy został użyty do przerwania błony Brucha w najpopularniejszym szczepie myszy, C57BL/6J2,3,4. Wskaźnik powodzenia indukcji CNV zweryfikowano za pomocą FA i barwień histologicznych. Szybki rozwój nieinwazyjnych metod obrazowania, takich jak OCT, przyczynił się do rozwoju dziedziny przedklinicznych modeli gryzoni. Możliwość monitorowania zmian morfologicznych w siatkówce w wielu punktach czasowych w tym samym oku znacząco przyczynia się do zmniejszenia wykorzystania zwierząt i zwiększa skuteczność w badaniach eksperymentalnych. Ocena histologiczna zmian CNV jest dość prosta i wymaga oznakowania nieprawidłowego wzrostu naczyń wokół miejsca podania lasera, akwizycji obrazu i oszacowania obszaru/objętości za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Natomiast metody obrazowania in vivo wprowadzają bardziej złożone analizy patologii CNV i jej interpretację.
Tutaj prezentujemy prostą i stosunkowo szybką metodę stopniowania indukcji, progresji i regresji CNV za pomocą FA, SD-OCT oraz metody automatycznej segmentacji w mysim modelu CNV indukowanym laserem.

<table><tbody><tr><td>Medetomidyna (nazwa handlowa Domitor)</td><td>Orion</td><td>Vnr 01 56 02</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Intervet</td><td>Vnr 51 14 85</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td>B Braun</td><td>357 0340</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Ksylazyna (nazwa handlowa Rompun weterynarz)</td><td>Bayer</td><td>vnr 14 89 99</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Tropicamid</td><td>Santen</td><td>Vnr 04 12 36</td><td>Rozszerzenie źrenic środek</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Alcon</td><td>Vnr 44 54 81</td><td>Smar</td></tr><tr><td>Systane</td><td>Alcon</td><td>&nbsp;-</td><td>Smar</td></tr><tr><td>5% Sól sodowa fluoresceiny</td><td>Sigma</td><td>Aldrich F6377-100G</td><td>Środek fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Atipamezole (nazwa handlowa Antisedan)</td><td>Orion</td><td>Vnr 47 19 53</td><td>Znieczulenie</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laserowo indukowana neowaskularyzacja naczyniówkowa (CNV) jest dobrze znanym modelem naśladującym mokrą formę zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). W tym protokole staramy się przeprowadzić czytelnika nie tylko przez techniczne rozważania dotyczące generowania zmian indukowanych laserem w celu wywołania procesów neowaskularnych, ale raczej skupić się na potężnych informacjach, które można uzyskać z multimodalnego obrazowania podłużnego in vivo przez cały okres obserwacji.
Indukowany laserowo mysi model CNV został wygenerowany przez podanie laserem diodowym. Do monitorowania indukcji, progresji i regresji CNV wykorzystano multimodalne techniki obrazowania in vivo. Po pierwsze, bezpośrednio po laserowaniu wykonano optyczną koherentną tomografię koherentną w domenie spektralnej (SD-OCT) w celu sprawdzenia pęknięcia błony Brucha. Późniejsze obrazowanie in vivo za pomocą angiografii fluoresceinowej (FA) potwierdziło udane uszkodzenie błony Brucha na podstawie seryjnych obrazów uzyskanych na poziomie naczyniówki. Podłużna obserwacja proliferacji i regresji CNV w dniach 5, 10 i 14 po wykonaniu laserowania przy użyciu zarówno SD-OCT, jak i FA. Przedstawiono prostą i niezawodną klasyfikację nieszczelnych wycieków CNV na podstawie obrazów FA. Automatyczna segmentacja do pomiaru całkowitej grubości siatkówki, w połączeniu z ręcznym zastosowaniem kalibru do pomiaru grubości siatkówki w miejscach CNV, pozwala na bezstronną ocenę obecności obrzęku. Na koniec przeprowadza się weryfikację histologiczną CNV za pomocą barwienia izolektyną GS-IB4 na płaskich naczyniówkach. Barwienie jest progowe, a obszar dodatni izollektyny jest obliczany za pomocą ImageJ.
Ten protokół jest szczególnie przydatny w badaniach terapeutycznych wymagających wysokoprzepustowych badań przesiewowych patologii CNV, ponieważ umożliwia szybką, multimodalną i wiarygodną klasyfikację patologii CNV i obrzęku siatkówki. Ponadto SD-OCT o wysokiej rozdzielczości umożliwia rejestrację innych patologicznych cech charakterystycznych, takich jak nagromadzenie płynu podsiatkówkowego lub śródsiatkówkowego. Metoda ta nie daje jednak możliwości zautomatyzowania analizy objętości CNV z obrazów SD-OCT, która musi być wykonywana ręcznie.

Pęcherzyk lub krwawienie podsiatkówkowe bezpośrednio po laseroterapii nie zawsze są widoczne. Dlatego badanie SD-OCT jest szczególnie istotne dla weryfikacji uszkodzenia błony Blocha. Rysunek 1 przedstawia przykład obrazowania OCT w różnych punktach czasowych po zastosowaniu lasera.
<img alt="Obrazowanie siatkówki w ciągu 14 dni; schemat przedstawia progresję zmiany; wyniki badań okulistycznych." cl...

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Procesy neowaskularne są charakterystyczną cechą kilku powszechnych patologii ocznych. Do najważniejszych należą wysiękowa zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (w skrócie Wet AMD), proliferacyjna retinopatia cukrzycowa oraz retinopatia wcześniaków. Zaburzenia te łącznie odpowiadają za większość przypadków ślepoty prawnej na całym świecie i wiążą się z dodatkowymi powikłaniami ocznymi, takimi jak krwotok do ciała szklistego i jaskra neowaskularne.Jednakże, mimo ich powszechności, opcje terapeutyczne w przypadku schorzeń naczyniowych oka są ograniczone. Obecnym standardem leczenia neowaskularyzacji związanej z AMD oraz proliferacyjną retinopatią cukrzycową jest wtryskiwanie do ciała szklistego humanizowanych przeciwciał skierowanych przeciwko kluczowemu mediatorowi angiogenezy i neowaskularyzacji – czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego, czyli VEGF. Niemniej jednak, pomimo skuteczności w hamowaniu progresji choroby i poprawie widzenia funkcjonalnego, iniekcje do ciała szklistego są kosztowne i nie są całkowicie pozbawione ryzyka.Powikłania mogą obejmować infekcje, zapalenie wnętrza gałki ocznej, odwarstwienie siatkówki oraz krwotok do wnętrza oka. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych opcji terapeutycznych, które byłyby skuteczne, bezpieczne i mniej kosztowne. W celu usprawnienia rozwoju leków na zaburzenia neowaskularne kluczowe znaczenie mają modele zwierzęce małych zwierząt.Tego rodzaju modele muszą być powtarzalne, posiadać ustalone i zwalidowane odczyty oraz punkty końcowe, a w idealnym przypadku wykorzystywać klinicznie istotny związek referencyjny jako kontrolę pozytywną. W niniejszym protokole przedstawimy mysi model neowaskularyzacji naczyniówki (CNV), który jest jednym z najczęściej stosowanych modeli zarówno do badania mechanizmów patofizjologicznych przyczyniających się do CNV, jak i do opracowywania nowych środków antyneowaskularyzacyjnych. W modelu CNV błona Brucha jest uszkadzana za pomocą lasera argonowego.Inicjuje to procesy neowaskularyzacji pochodzące z naczyniówki. Zastosowanie podłużnego obrazowania in vivo za pomocą optycznej koherencji tomografii w domenie widmowej, w skrócie SD-OCT, oraz angiografii z fluoresceiną, umożliwia śledzenie proliferacji i regresji CNV. Dzięki temu można ocenić skuteczność oraz przebieg czasowy nowych interwencji farmakologicznych.Niedawne osiągnięcia w przetwarzaniu obrazów pozwalają ponadto na zautomatyzowaną segmentację w celu pomiaru grubości siatkówki, zapewniając metodologię wolną od błędu obserwatora do oceny występowania obrzęku. W niniejszym opracowaniu omówimy przydatność nowego oprogramowania InVivoVue Diver firmy Leica Microsystems do zautomatyzowanej segmentacji warstw siatkówki w mysim modelu CNV. Na koniec przeanalizujemy, w jaki sposób analiza histologiczna preparatów całej siatkówki może uzupełnić podłużne obrazowanie in vivo w tym modelu.Do każdego oka podaje się jedną kroplę tropikamidu w celu rozszerzenia źrenic. Następnie zwierzę jest delikatnie umieszczane w uchwycie do pozycjonowania gryzoni. Myszy ustawia się tak, aby odsłonić oko, a następnie unieruchamia za pomocą uchwytu do nosa oraz kawałka taśmy laboratoryjnej delikatnie przyklejonej na grzbiecie.Następnie, w celu nawilżenia, na oko nanosi się kroplę środka smarującego, a nadmiar płynu ostrożnie usuwa się za pomocą tamponów z papieru filtrującego. Na koniec stolik zostaje wyrównany przed urządzeniem OCT w celu wykonania obrazowania OCT wyjściowego. Przed zastosowaniem lasera przeprowadzane jest obrazowanie metodą spektralnej optycznej koherentnej tomografii (OCT) in vivo w stanie wyjściowym, aby zweryfikować brak nieprawidłowości w siatkówce.Ostrożnie wyjmij mysz z uchwytu. Na szkiełko nakrywkowe nałóż jedną kroplę żelu Viscotears w celu aplanacji rogówki. Ustaw mysz tak, aby główka nerwu wzrokowego znajdowała się w centrum, a następnie skup wiązkę lasera na nabłonku barwnikowym siatkówki.Wykonaj trzy strzały laserem, omijając naczynia krwionośne siatkówki na pozycjach godziny czwartej, ósmej i dwunastej wokół nerwu wzrokowego. Po wykonaniu wszystkich strzałów laserem sprawdź napięcie gałki ocznej, aby upewnić się, że nie wystąpiły krwawienia do siatkówki. Następnie ponownie ustaw mysz w uchwycie i przeprowadź angiografię z fluoresceiną oraz obrazowanie OCT, aby potwierdzić uszkodzenie błony Brucha.W przypadku angiografii z fluoresceiną, najpierw ustaw ostrość na obszarach oparzeń laserowych, korzystając z trybu odbicia podczerwieni, który umożliwia wizualizację miejsc podania lasera. Ostrożnie wstrzyknij 0,1 ml 5% soli sodowej fluoresceiny na około 20 g masy ciała myszy, nie zmieniając pozycji oka myszy. Rozpocznij wykonywanie obrazów angiografii z fluoresceiną na poziomie naczyniówki oraz na poziomie siatkówki, w odstępach około 30 s.Ustaw oko do obrazowania OCT w taki sam sposób jak poprzednio i rozpocznij obrazowanie. Uśrednianie sygnału SD-OCT pozwala na lepszą wizualizację szczegółowej morfologii siatkówki, co pokazano w tej sekwencji. Po wykonaniu obrazowania SD-OCT ostrożnie wyjmij mysz z uchwytu.Nanieś środek smarujący do obu oczu. Na tym etapie można zdecydować o odwróceniu znieczulenia poprzez podskórny wtrysk atipamezolu, antagonisty receptora alfa-2 dla medetomidyny, lub poczekać na wybudzenie zwierzęcia z narkozy. Powtórz obrazowanie in vivo SD-OCT i FA u znieczulonych zwierząt w dniach kontrolnych: piątym, dziesiątym i czternastym.Do pomiarów grubości siatkówki należy wykorzystać funkcję automatycznej segmentacji w oprogramowaniu InVivoVue Diver. W przypadku zdrowej siatkówki całkowita grubość siatkówki jest definiowana jako grubość wszystkich warstw, od warstwy włókien nerwowych do RPE. W zdrowej siatkówce automatyczna segmentacja może precyzyjnie wykryć poszczególne warstwy siatkówki, co przedstawiono na tym przykładzie.Warto wspomnieć, że w miejscach występowania CNV należy przeprowadzić ręczny pomiar grubości siatkówki oddzielnie dla każdego miejsca zmiany CNV. Pomiar wykonuje się od warstwy włókien nerwowych do linii umownej przebiegającej przez warstwę RPE. Niniejsza sekwencja przedstawia schemat postępowania przy ręcznych pomiarach grubości w miejscach występowania zmian CNV.Warstwa włókien nerwowych znajduje się u góry, a naczyniówka u dołu obrazu. Za pomocą myszy lub touchpada ręcznie wyznacza się granice warstwy włókien nerwowych oraz naczyniówki, a oprogramowanie automatycznie oblicza całkowitą grubość siatkówki na podstawie tych współrzędnych. Na tej rycinie przedstawiono obrazy seryjne wykonane co 20 sekund na poziomie naczyniówki.Obraz pierwszy uzyskano w trybie odbicia podczerwieni. Pozostałe wykonano po dostryperitonealnym wstrzyknięciu fluoresceiny. Białe strzałki na obrazie pierwszym wskazują miejsca naświetlone laserem, w których w późniejszych punktach czasowych widoczny jest wyciek fluoresceiny, zaznaczony białymi strzałkami na obrazie 18.Na tym obrazie przedstawiono sekwencję obrazowania FA wykonaną na poziomie siatkówki. Biała strzałka na obrazie 18 wskazuje miejsce laserowe, w którym wyciek fluoresceiny pojawia się szybciej niż w dwóch pozostałych miejscach, zaznaczonych okręgami na obrazie 18. Ta figura podsumowująca przedstawia przebieg czasowy obrazów SD-OCT.W punkcie wyjściowym, bezpośrednio po laseroterapii oraz w punktach kontrolnych w piątym, dziesiątym i czternastym dniu. Podsumowując, protokół podłużnego obrazowania in vivo zmian CNV z wykorzystaniem SD-OCT i FA umożliwia szybką, multimodalną i wiarygodną klasyfikację patologii CNV oraz obecności obrzęku siatkówki. Dziękujemy za zainteresowanie.

in-vivo-multimodal-imaging-analysis-mouse-laser-induced-choroidal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Niniejszy protokół opisuje implantację i ocenę czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Poznaj multimodalne obrazowanie in vivo mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem przy użyciu SD-OCT i angiografii fluoresceinowej. Ta metoda umożliwia śledzenie progresji CNV i ocenę terapii.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Przeglądaj więcej filmów