In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

Procesy neowaskularne są charakterystyczną cechą kilku powszechnych patologii oczu. Przede wszystkim wysiękowe zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem lub wysiękowe AMD w skrócie, proliferacyjna retinopatia cukrzycowa i retinopatia wcześniaków. Łącznie zaburzenia te odpowiadają za większość przypadków ślepoty prawnej na całym świecie i są związane z dodatkowymi powikłaniami ocznymi, takimi jak krwotok do ciała szklistego i jaskra neowaskularna.

Jednak pomimo ich rozpowszechnienia, możliwości terapeutyczne zaburzeń neowaskularnych oczu są ograniczone. Obecnym standardem opieki nad neowaskularyzacją związaną z AMD i proliferacyjną retinopatią cukrzycową jest doszklistkowe wstrzyknięcie humanizowanych przeciwciał skierowanych przeciwko krytycznemu mediatorowi angiogenezy i neowaskularyzacji, czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego lub VEGF. Jednak pomimo skuteczności w powstrzymywaniu postępu choroby i poprawie widzenia funkcjonalnego, zastrzyki doszklistkowe są kosztowne i dalekie od ryzyka.

Powikłania mogą obejmować infekcje, zapalenie wnętrza gałki ocznej, odwarstwienie siatkówki i krwotok oczny. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowatorskich opcji leczenia, które są skuteczne, bezpieczne i mniej kosztowne. Aby przyspieszyć opracowywanie leków na choroby neowaskularne, kluczowe znaczenie mają modele małych zwierząt.

Takie modele muszą być powtarzalne, mieć ustalone i zwalidowane odczyty i punkty końcowe, a w idealnym przypadku wykorzystywać klinicznie istotny związek referencyjny, który będzie służył jako kontrola pozytywna. W tym protokole przedstawimy mysią neowaskularyzację naczyniówkową lub model CNV, który jest jednym z najczęściej stosowanych modeli zarówno do badania mechanizmów patofizjologicznych przyczyniających się do CNV, jak i do opracowywania nowych leków przeciwneowaskularnych. W modelu CNV membrana Brucha jest pękana za pomocą lasera argonowego.

Inicjując w ten sposób procesy neowaskularne wywodzące się z naczyniówki. Zastosowanie podłużnego obrazowania in vivo za pomocą spektralnej optycznej koherentnej tomografii (w skrócie SD-OCT) oraz angiografii fluoresceinowej zapewnia środki do śledzenia proliferacji i regresji CNV. A tym samym ocenić skuteczność i przebieg w czasie nowatorskich interwencji farmaceutycznych.

Najnowsze postępy w przetwarzaniu obrazów pozwalają ponadto na automatyczną segmentację w celu pomiaru grubości siatkówki, zapewniając wolną od uprzedzeń badaczy metodologię oceny obecności obrzęku. W tym artykule omówimy przydatność nowego oprogramowania InVivoVue Diver firmy Leica Microsystems do automatycznej segmentacji warstw siatkówki w mysim modelu CNV. Na koniec omówimy, w jaki sposób analiza histologiczna całych wierzchowców siatkówki może uzupełniać podłużne obrazowanie in vivo w tym modelu.

Pojedyncza kropla tropikamidu jest nakładana na każde oko w celu rozszerzenia źrenic. Następnie zwierzę jest delikatnie umieszczane w fazie wyrównywania gryzoni. Mysz jest dostosowana do ekspozycji oka i zabezpieczona za pomocą uchwytu na nos i kawałka taśmy laboratoryjnej umieszczonego delikatnie na plecach.

Następnie na oko nakłada się kroplę lubrykantu w celu nawilżenia, a nadmiar płynu ostrożnie usuwa się za pomocą wacików z bibuły filtracyjnej. Na koniec stolik jest ustawiany przed urządzeniem OCT w celu obrazowania OCT na linii bazowej. Obrazowanie in vivo w optycznej koherentnej tomografii koherentnej w domenie spektralnej wykonuje się na początku badania, przed zastosowaniem lasera, w celu sprawdzenia braku nieprawidłowości siatkówki.

Delikatnie wyjmij mysz z uchwytu. Umieść jedną kroplę żelu Viscotears na szkiełku nakrywkowym, aby nanieść rogówkę. Ustaw mysz tak, aby głowa nerwu wzrokowego znajdowała się pośrodku, a wiązkę lasera skup na nabłonku barwnikowym siatkówki.

Wykonaj trzy strzały laserowe, omijając naczynia krwionośne siatkówki w pozycjach godziny czterech, ósmej i dwunastej wokół nerwu wzrokowego. Sprawdź jędrność oka po wszystkich strzałach laserowych pod kątem braku krwawienia z siatkówki. Tak jak poprzednio, wyrównaj mysz w uchwycie i wykonaj angiografię fluoresceinową oraz obrazowanie OCT, aby potwierdzić uszkodzenie błony Brucha.

W przypadku angiografii fluoresceinowej najpierw skupia się na obszarach oparzeń laserowych za pomocą trybu odbicia w podczerwieni, który pozwala na wizualizację miejsc, w których zastosowano laser. Ostrożnie wstrzyknij 0,1 mililitra 5% soli sodowej fluoresceiny na około 20 gramów masy ciała myszy bez zmiany pozycji oczu myszy. Rozpocznij wykonywanie zdjęć angiografii fluoresceinowej na poziomie naczyniówki i na poziomie siatkówki, mniej więcej co 30 sekund.

Ustaw oko do obrazowania OCT jak poprzednio i rozpocznij obrazowanie. Uśrednienie sygnału SD-OCT pomaga lepiej zobrazować szczegółową morfologię siatkówki, jak pokazano w tej sekwencji. Po wykonaniu obrazowania SD-OCT ostrożnie wyjmij mysz z uchwytu.

Nałóż lubrykant na oba oczy. W tym momencie możesz zdecydować się na odwrócenie znieczulenia poprzez podskórne wstrzyknięcie antagonisty alfa-2 medetomidyny, atipamezolu lub poczekać na powrót zwierzęcia do zdrowia po znieczuleniu. Powtórz obrazowanie in vivo SD-OCT i FA u znieczulonych zwierząt w piątym, 10 i 14 dniu obserwacji.

Korzystaj z funkcji automatycznej segmentacji w oprogramowaniu InVivoVue Diver do pomiarów grubości siatkówki. W przypadku zdrowej siatkówki całkowita grubość siatkówki jest uważana za grubość wszystkich warstw, od warstwy włókien nerwowych do RPE. W zdrowej siatkówce automatyczna segmentacja może dokładnie wykryć poszczególne warstwy siatkówki, jak widać w tym przykładzie.

Warto nadmienić, że w miejscach, w których występuje CNV, ręczny pomiar grubości siatkówki powinien być wykonywany osobno dla każdego miejsca zmiany chorobowej CNV. Od warstwy włókien nerwowych do wyimaginowanej linii przechodzącej przez warstwę RPE. Ta sekwencja przedstawia przebieg pracy dla ręcznych pomiarów grubości w miejscach, w których występują zmiany CNV.

Warstwa włókien nerwowych znajduje się na górze, naczyniówka na dole obrazu. Za pomocą myszy lub touchpada granice warstwy włókien nerwowych i naczyniówki są określane ręcznie, a oprogramowanie automatycznie oblicza całkowitą grubość siatkówki na podstawie tych współrzędnych. Rysunek przedstawia obrazy seryjne wykonywane co 20 sekund na poziomie naczyniówki.

Obraz pierwszy został uzyskany w trybie odbicia w podczerwieni. Natomiast pozostali po dootrzewnowym wstrzyknięciu fluoresceiny. Białe strzałki na zdjęciu wskazują na miejsca laserowe, które pokazują wyciek fluoresceiny w późniejszych punktach czasowych, wyróżnione białymi strzałkami na zdjęciu 18.

Ten obraz przedstawia seryjne obrazowanie FA uzyskane na poziomie siatkówki. Biała strzałka na zdjęciu 18 wskazuje na miejsce nadane laserem, które pokazuje wyciek fluoresceiny pojawiający się szybciej niż pozostałe dwa, obrysowane okręgami na zdjęciu 18. Ten rysunek podsumowujący przedstawia przebieg czasowy obrazów SD-OCT.

Na początku badania, bezpośrednio po laserze, a punkty czasowe obserwacji w piątym, 10 i 14 dniu. Podsumowując, protokół podłużnego obrazowania in vivo zmian CNV za pomocą obrazowania SD-OCT i FA pozwala na szybką, multimodalną i wiarygodną klasyfikację patologii CNV i obecności obrzęku siatkówki. Dziękujemy za zainteresowanie.