Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tego protokołu sekcji mózgu Drosophila jest uzyskanie nienaruszonych mózgów od dorosłych much, które można wykorzystać w szerokim zakresie zastosowań, takich jak immunofluorescencja, lokalizacja białek znakowanych GFP i eksperymenty hodowlane ex-vivo. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii rozwojowej i neuronauki, takie jak rola określonych białek i szlaków sygnałowych oraz ustalanie wzorców połączeń neuronalnych podczas rozwoju mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że po opanowaniu zapewnia szybką i skuteczną metodę immunologicznej identyfikacji defektów morfologicznych w określonych obszarach dorosłego mózgu.

Ta procedura może być trudna do nauczenia, ponieważ usunięcie egzoszkieletu z głowy muchy może wymagać dużej ostrożności i praktyki. Twoje ruchy muszą być powolne i przemyślane, a ramiona sekcji muszą być dobrze podparte, aby pozostać stabilnym. Dobrym pomysłem jest ćwiczenie na muchach czerwonookich, a następnie muchach białookich, zanim faktycznie przeanalizujemy interesujące nas genotypy do rzeczywistych eksperymentów.

Aby przygotować się do sekcji, umieść znieczulone muchy na zimnej metalowej podkładce lub na szalce Petriego na lodowi. Alternatywnie użyj podkładki przeciwmuchowej, która emituje dwutlenek węgla. Następnie umieść niewielką ilość PTN na środku naczynia do preparacji, aby utworzyć bąbelek PTN.

Następnie pod mikroskopem stereoskopowym wypełnij pole widzenia pęcherzykiem PTN przy równomiernym oświetleniu. Teraz manipuluj muchami tak, aby były brzuchem do góry, i przenieś jedną przez brzuch do PTN. Całkowicie zanurz zwierzę w PTN i wykonaj całą sekcję zanurzoną w PTN.

Drugą parą kleszczy chwyć trąbkę i oderwij głowę od ciała. Czasami trąba zostanie usunięta, ale głowa pozostanie przymocowana do ciała. Jeśli tak się stanie, chwyć przyśrodkową krawędź jednej siatkówki i przyłóż siłę boczną, aby zdjąć głowę.

Odrzuć brzuch i klatkę piersiową. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby głowa znajdowała się w PTN. Połączenia między centralnym mózgiem a VNC oczywiście nie mogą być analizowane przy użyciu tej metody.

Następnie chwyć przyśrodkową krawędź lewej siatkówki na krawędzi centralnego otworu w naskórku i powoli odciągnij kleszcze bezpośrednio od siebie, aby zapobiec rozerwaniu płata wzrokowego, który jest nieprzezroczystą strukturą pokrytą białą, żylastą tchawicą. W miarę dysocjacji siatkówki następuje niewielki spadek napięcia. Aby zapobiec rozdarciu mózgu, niezwykle ważne jest, aby chwycić przyśrodkową krawędź każdego oka i bardzo powoli rozsunąć kleszcze.

Zbyt szybkie poruszanie się może spowodować zmianę morfologii mózgu lub uszkodzenie tkanki mózgowej. Jak pokazano tutaj, chwyć naskórek każdą parą kleszczy i bardzo powoli pociągnij je w przeciwnych kierunkach. Jeśli zostanie to zrobione prawidłowo, naskórek powinien oddzielić się od tkanki mózgowej, pozostawiając mózg nienaruszony.

Do tego kroku potrzebne są bardzo ostre kleszcze. Następnie ostrożnie usuń otaczający naskórek kawałek po kawałku. Usuwając uporczywie przyczepione naskórki, może pomóc zabezpieczyć mózg, chwytając pozostały VNC, aby uniknąć zmiażdżenia mózgu.

Na koniec użyj pipety P200, aby przenieść wypreparowane mózgi do studzienki na płytce wypełnionej PTN w celu utrwalenia i barwienia immunologicznego. Pod mikroskopem użyj pipety P200, aby przenieść od 10 do 15 wypreparowanych mózgów o tym samym genotypie do 0,5 mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej 4% paraformaldehydem rozcieńczonym w PTN. Następnie inkubuj mózgi przez 20 minut, powoli kołysząc w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu pozwól mózgom osiąść na dnie rurki, a następnie usuń utrwalacz. Następnie wykonaj dwa szybkie mycia z 500 mikrolitrami PTN na pranie. Wymień PTN, gdy tylko mózgi osiądą w probówce.

Następnie wykonaj trzy długie prania z użyciem PTN, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Po tych płukaniach mózgi mogą być przechowywane przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PTN. Po usunięciu ostatniego płukania PTN, inkubować mózgi w 0,5 mililitra roztworu blokującego przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej i z delikatnym mieszaniem.

Po usunięciu roztworu blokującego dodaj przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubuj mózgi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni z delikatnym mieszaniem. Usunąć przeciwciało pierwotne za pomocą pułku myjącego PTN z pięcioma płukaniami. A następnie zastosuj przeciwciała drugorzędowe.

Pozwól tym przeciwciałom inkubować się z tkankami przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem za pomocą kołysania. Po inkubacji mózgów w wtórnym roztworze przeciwciał zastosuj pułk płukania PTN. Po każdym myciu należy przykryć próbki folią, a na koniec usunąć jak najwięcej buforu.

Następnie dodaj 75 mikrolitrów fluorescencyjnego środka do mocowania zapobiegającego blaknięciu i przelej mózgi i pożywkę do i z końcówki pipety tylko raz. Rurkę można następnie zawinąć w folię i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni, ale najlepiej przystąpić bezpośrednio do montażu. Aby zamontować mózgi, zbuduj zjeżdżalnię mostową.

Umieść dwie szkiełka nakrywkowe w odległości około 1 centymetra od siebie na dodatnio naładowanym szkiełku. Upewnij się, że dodatnio naładowana strona jest skierowana do góry. Następnie przyklej szkiełka nakrywkowe do szkiełka lakierem do paznokci i pozwól lakierowi całkowicie wyschnąć przed kontynuowaniem.

Następnie umieść szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie odpipetuj mózg i pożywkę w przestrzeń między szkiełkami nakrywkowymi. Pamiętaj, aby dostosować oświetlenie, aby poprawić wizualizację mózgu. Następnie zassaj dodatkowe media montażowe ze szkiełka, uważając, aby uniknąć mózgu.

Następnie odchodować pozostały nadmiar nośnika montażowego. Pozwoli to na dokładniejsze ustawienie mózgów. Teraz, używając kleszczy, zorientuj mózgi w siatkowy wzór, z płatami czułkowymi skierowanymi do góry.

Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na mózgach i użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie górnego szkiełka nakrywkowego, które są przymocowane do dolnych szkiełek nakrywkowych. Teraz załaduj środkową wnękę świeżymi nośnikami montażowymi kroplami, umożliwiając wciągnięcie nośnika pod szkiełko nakrywkowe za pomocą kapilary. Gdy ubytek zostanie wypełniony, uszczelnij go całkowicie za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.

Opisana metoda może być wykorzystana do wizualizacji prawie każdej struktury w dorosłym mózgu, w tym ciał grzybów. Ten obszar mózgu jest niezbędny do uczenia się i zapamiętywania. Ciała grzybów można łatwo uwidocznić za pomocą przeciwciał, które rozpoznają białko fasciculiny 2.

Białko to ulega silnej ekspresji w płatach alfa i beta, a także w centralnie położonym ciele elipsoidalnym. Technika ta pozwoliła na zidentyfikowanie wielu procesów komórkowych wymaganych do prawidłowego prowadzenia aksonów neuronów ciała grzyba. Zakłócenie tych procesów powoduje różnorodny wachlarz zmutowanych fenotypów, takich jak nieprawidłowa projekcja aksonów w obszarze linii środkowej mózgu i brak płatów alfa.

Te zmutowane fenotypy są często nie w pełni penetrujące i dlatego wymagają zbadania wielu mózgów. W celu zbadania autonomicznej roli białka w odnajdywaniu ścieżek aksonów, technika Markhama może być również wykorzystana do wizualizacji decyzji dotyczących kierowania aksonami poszczególnych zmutowanych neuronów GFP dodatnich lub dzikich na niefluorescencyjnym tle typu dzikiego. Opisana tutaj metoda pozwala na wiarygodną i powtarzalną wizualizację praktycznie obszaru mózgu dorosłego osobnika Drosophila.

Tutaj skupiliśmy się na neuronach ciała grzyba. W wersji tekstowej tego protokołu zademonstrowaliśmy również wizualizację płatów nerwu wzrokowego. W innych badaniach wykorzystano podobne techniki do wizualizacji między innymi pars intercerebralis, neuronów zegarowych i neuronów projekcyjnych płatów czułkowych.

Po opanowaniu każdy mózg można wyciąć w ciągu 3 do 5 minut, jeśli zostanie to wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ustabilizowaniu ramion w pobliżu mikroskopu. Ważne jest również, aby poruszać się powoli i usuwać małe kawałki naskórka pojedynczo.

Zbyt szybkie poruszanie się może spowodować niepożądane uszkodzenie leżącej pod spodem tkanki mózgowej. Oprócz wykorzystania wypreparowanych mózgów do eksperymentów mikroskopowych opartych na immunofluorescencji, tkanka mózgowa może być również wykorzystana do dodatkowych eksperymentów.