Name: Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Naucz się rozwarstwiania i barwienia immunofluorescencyjnego neuronów ciała grzyba oraz fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju neuronów i łączności synaptycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Changhui Pak i Alysii Vrailas Mortimer za początkowe nauczenie SMK techniki preparacji mózgu. Dziękujemy również członkom grupy laboratoryjnej Kena Moberga, szczególnie Chrisowi Roundsowi, za krytyczną lekturę manuskryptu. Przeciwciała rozpoznające Fas2 (1D4) i chaoptynę (24B10) uzyskano z Banku Hybrydoma Badań Rozwojowych. Przeciwciało 24B10 zostało zdeponowane w DSHB przez Seymoura Benzera i Nansi Colley24,60,61, przeciwciało 1D4 zostało zdeponowane w DSHB przez Corey Goodman 22,23,56. Zapasy much zostały pozyskane z Bloomington Stock Center. Pragniemy również podziękować Centrum Obrazowania MCIC Ohio Agricultural Research and Development Center (OARDC) za użycie mikroskopu konfokalnego do obrazowania mózgów na rycinach 4A i B. SMK jest wspierany przez grant z NICHD (1 R15 HD084241-01A1). M. Kahl otrzymał wsparcie z grantu NSF (NSF REU #1560061).

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana powyżej metoda preparacji i wizualizacji może być stosowana w szerokiej gamie zastosowań związanych z barwieniem immunologicznym i obrazowaniem na żywo. Nakreśliliśmy ogólny protokół barwienia immunologicznego i podkreśliliśmy jeden ze sposobów, w jaki MARCM może być wykorzystany do wizualizacji morfologii aksonalnej poszczególnych neuronów ciała grzyba. Ponadto te ogólne procedury mogą być również stosowane do obrazowania innych obszarów mózgu w stałych lub świeżo wypreparowanych mózgach dorosłych48,65. Obrazowanie na żywo może zapewnić bardziej efektywne podejście podczas analizy wzorców ekspresji pułapek wzmacniających, genów reporterowych lub linii MiMIC66, na przykład. Aby zapobiec wychwytywaniu artefaktów wynikających ze śmierci komórki podczas obrazowania na żywo GFP w nieutrwalonej tkance, mózgi należy wypreparować w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub pożywce HL348, zamontować na szkiełkach podstawowych w 1x PBS (lub HL3) i zobrazować w mniej niż 15 - 20 minut. Należy również zadbać o to, aby usunąć jak najwięcej tchawicy z wypreparowanego mózgu przed obrazowaniem, ponieważ może to zakłócać wizualizację fluorescencji GFP.
Podczas gdy warunki barwienia do oceny morfologii ciała grzyba i neuronów fotoreceptorowych są stosunkowo dobrze ustalone 24,61,67, lokalizacja określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania w tych typach komórek może wymagać rozległego rozwiązywania problemów i optymalizacji. W szczególności należy zoptymalizować kilka krytycznych etapów, w tym rozcieńczanie przeciwciał, blokowanie stężenia składnika buforowego i utrwalanie, aby uzyskać najbardziej powtarzalne i wiarygodne wyniki. W pierwszej kolejności należy określić optymalne stężenie przeciwciała pierwszorzędowego. Chociaż dostępne na rynku przeciwciała często mają sugerowane rozcieńczenie (i często początkowo zaczynamy od tego stężenia), wartości te rzadko są określane empirycznie na tkankach Drosophila. W związku z tym testowanie serii rozcieńczeń przeciwciał pierwszorzędowych, które wahają się powyżej i poniżej początkowej sugestii producenta, często skutkuje bardziej specyficznym barwieniem. Podczas gdy rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych może mieć znaczący wpływ na dokładność barwienia i powinno być precyzyjnie określone, czas inkubacji mózgów w roztworach zawierających przeciwciała pierwszorzędowe może się znacznie różnić przy niewielkim wpływie na ogólny wynik. Na przykład, zaobserwowaliśmy podobne wyniki podczas inkubacji wypreparowanych mózgów z pierwotnym przeciwciałem Fas2 przez dwa, trzy, a nawet cztery dni w temperaturze 4 °C. Chociaż zalecamy co najmniej dwie noce, inkubowaliśmy również mózgi w roztworze przeciwciał pierwotnych przez jedną noc i uzyskaliśmy powtarzalne barwienie. Co ważne, ograniczenie czasu inkubacji mózgu w przeciwciałie drugorzędowym do 3 godzin w temperaturze pokojowej (lub jednej nocy w temperaturze 4 °C) pomaga ograniczyć nieswoiste wiązanie przeciwciał drugorzędowych z tkanką mózgową.
Po drugie, może być konieczne użycie dodatkowych odczynników "blokujących" w celu wyeliminowania niepożądanego sygnału tła. Opcje obejmują zwiększenie stężenia NGS do ~10%, dodanie 1 - 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do roztworów przeciwciał blokujących i pierwszorzędowych/drugorzędowych lub wstępną adsorpcję przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C z zarodkami Drosophila (patrz odniesienie68, sekcja 2.9, krok 3).
Chociaż napisaliśmy powyższy protokół, używając PTN jako sugerowanego bufora dla wszystkich etapów fiksacji, płukania i inkubacji przeciwciał, utrwalenie tkanek w innych (takich jak PLP i PEM, wymienione w tabeli materiałów) może skutkować głębokimi różnicami w sile sygnału. Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że cyklina E jest niewykrywalna w krążkach wyobrażonych larw, gdy tkanki są utrwalone w tradycyjnym 4% paraformaldehydzie rozcieńczonym w PBS, ale jest wyraźnie widoczna, gdy tkanki są utrwalone w buforze PLP (Ken Moberg, komunikacja osobista i odniesienie69). Oprócz zmian w składnikach buforowych, zmiana czasu i temperatury utrwalenia tkanki może również znacząco wpłynąć na barwienie immunofluorescencyjne i w razie potrzeby można je określić empirycznie. Ogólnie rzecz biorąc, czas wiązania powinien być wystarczająco długi, aby umożliwić wystarczające usieciowanie składników komórkowych i długotrwałe utrzymanie ogólnej morfologii komórek, a jednocześnie być wystarczająco ograniczony, aby zapobiec nadmiernemu sieciowaniu i "zakopywaniu" epitopów białkowych. Dlatego, początkowo optymalizując warunki barwienia dla nowo nabytego przeciwciała pierwotnego, zwykle ograniczamy czas wiązania do około 20 minut i często utrwalamy tkanki w niższych temperaturach.
W każdym eksperymencie immunofluorescencyjnym należy uwzględnić kilka kontroli w celu zbadania swoistości przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, a także wpływu transgenów/tła genetycznego na obserwowany fenotyp. Aby upewnić się, czy stosowane przeciwciało pierwszorzędowe specyficznie rozpoznaje białko będące przedmiotem zainteresowania, tkanki pochodzące od much pozbawionych tego białka i/lub tkanki z nadekspresją białka powinny zostać włączone jako kontrole. Dodanie nadmiaru oczyszczonego białka antygenowego może być również uwzględnione w celu określenia, czy pierwotne przeciwciało rozpoznaje inne epitopy w mózgu muchy. Wreszcie, każdy sygnał fluorescencyjny obecny, gdy pominięte przeciwciała pierwszorzędowe są pominięte, reprezentuje poziom niespecyficznego wiązania przez wybrane przeciwciała drugorzędowe.
Należy również uwzględnić kilka ważnych kontroli w celu oceny wpływu tła genetycznego lub obecności transgenów na intensywność barwienia lub morfologię neuronów. Na przykład, muchy użyte w eksperymencie MARCM na rysunku 5 zawierają wiele transgenów (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, Tub>GAL80 i OK107-GAL4), z których każdy powinien być analizowany oddzielnie pod kątem wpływu na morfologię ciała grzyba. Jako bardzo ważne jest, aby przeanalizować morfologię ciała grzyba muszek zawierających zarówno OK107-GAL4, jak i UAS-CD8-GFP. Konieczna może być również ocena wpływu szoku cieplnego i produkcji rekombinazy Flp na rozwój ciała grzyba poprzez analizę much zawierających zarówno hsFLP, jak i FRT82B. Chociaż MARCM może dostarczyć istotnych informacji na temat tego, czy dane białko autonomicznie kontroluje prowadzenie aksonów, liczba kontroli wymaganych do dokładnego wyciągnięcia tego wniosku może być niewielkim ograniczeniem tej techniki. W mniej skomplikowanych eksperymentach stosuje się również podobne kontrole. Weźmy na przykład eksperyment, w którym system GAL4/UAS jest używany w połączeniu z transgenem RNAi w celu obniżenia ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania we wszystkich neuronach. W tym eksperymencie obecne będą co najmniej dwa transgeny: panneuronalny sterownik GAL4, taki jak elav-GAL4, oraz transgen UAS-RNAi . Morfologia neuronów ciała grzyba u muszek zawierających każdy z tych transgenów osobno powinna być badana jako dodatek do warunków doświadczalnych, w których muchy są nosicielami obu transgenów w tej samej muszce.
Wreszcie, aby ustalić, czy białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji w neuronach ciała grzyba, zwykle konieczne jest współbarwienie mózgów przeciwciałami przeciwko Fas2. Alternatywnie, białka fluorescencyjne, takie jak GFP, RFP lub CD8-GFP związane z błoną, mogą być również wyrażane za pomocą systemu GAL4/UAS i stosowane w połączeniu z przeciwciałami rozpoznającymi białko będące przedmiotem zainteresowania. Ponieważ Fas2 rozpoznaje tylko fascykulowane aksony, które tworzą α ciała grzyba i β płaty, zastosowanie napędzanego przez GAL4, związanego z błoną CD8-GFP było szczególnie przydatne do oznaczania neuronów ciała grzyba.
Wady w prowadzeniu aksonów często nie są w 100% przenikliwe i nawet mózgi o tym samym genotypie mogą wykazywać pewną zmienność. Dlatego, analizując nowo wygenerowane zmutowane allele pod kątem defektów w ciele grzyba lub znajdowania ścieżki fotoreceptorów, należy zastosować kombinację różnych alleli i podejść. W większości badań w literaturze stosuje się kilka różnych podejść w celu zbadania, czy białko odgrywa autonomiczną rolę komórki w kontrolowaniu przewodnictwa aksonalnego: i) analiza wad odnajdywania ścieżki u homozygotycznych muszek zerowych (najlepiej przy użyciu różnych alleli zerowych), ii) analiza wad odnajdywania ścieżki u muszek, w których brakuje białka będącego przedmiotem zainteresowania tylko w neuronach (zwykle za pośrednictwem RNAi), iii) analiza MARCM wad odnajdywania ścieżki, oraz iv) eksperymenty ratunkowe, w których gen ulega reekspresji w neuronach homozygotycznych muszek zerowych. Idealnie byłoby, gdyby kilkadziesiąt mózgów na genotyp zostało przeanalizowanych pod kątem wad w morfologii neuronów.
Chociaż opisany tutaj protokół koncentruje się przede wszystkim na immunofluorescencyjnej lokalizacji białek w utrwalonej tkance, opracowywanych jest kilka przyszłych zastosowań tej techniki do obrazowania żywej tkanki mózgowej. Po wypreparowaniu mózgów (zwykle w pożywkach do hodowli komórkowych) można je hodować przez kilka dni w temperaturze 25 °C. Te metody hodowli ex vivo są opracowywane w celu zbadania szerokiej gamy procesów biologicznych, takich jak aktywność białek, które promują regenerację aksonów po urazie70,71, dynamika sygnalizacji wewnątrzkomórkowej72 i rozwój neuronów73.

Chociaż układ nerwowy Drosophila jest mniejszy niż u ludzi i gryzoni, jego złożoność stanowi potężny, przystępny model do lepszego zrozumienia jego kręgowych odpowiedników. W wielu przypadkach genomy kręgowców i much kodują bardzo podobne białka, które dyktują mechanizmy rozwoju układu nerwowego. W rzeczywistości wiele genów wymaganych do rozwoju neuronów u kręgowców ma ortologi u much, w tym te zaangażowane w szlaki sygnałowe, które kontrolują wzorce, neurogenezę i przewodnictwo aksonalne1,2,3,4,5. Na przykład netryna jest ligandem wymaganym do prowadzenia aksonów u ssaków, a D. melanogaster6,7,8. Podczas gdy netyna została pierwotnie wyizolowana z embrionalnej tkanki mózgowej pisklęcia6, późniejsze badania wykazały, że netryna odgrywa zachowawczą rolę podczas rozwoju embrionalnego ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u Drosophila8. W innych badaniach wykorzystano genetyczne badania przesiewowe w embrionalnym ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila w celu zidentyfikowania konserwatywnych ligandów i receptorów wymaganych do znalezienia ścieżki zarówno u Drosophila, jak i kręgowców9.
Podczas gdy embrionalny ośrodkowy układ nerwowy muchy był szeroko stosowany w przeszłości do identyfikacji ligandów, receptorów i wewnątrzkomórkowych białek sygnalizacyjnych wymaganych do prowadzenia aksonów8,9, ostatnie prace zbadały sposoby, w jakie wiele z tych białek kontroluje również decyzje dotyczące odnajdywania ścieżki w późniejszych etapach rozwoju. W szczególności badania nad rozwojem neuronów fotoreceptorów grzyba (MB) i siatkówki (Rysunek 1) dostarczyły wglądu w mechanizmy kontrolujące odnajdywanie ścieżek, tworzenie synaps, przycinanie aksonów i kilka innych aspektów rozwoju neuronów10,11,12,13,14,15,16,17. Neurony fotoreceptorowe łączą siatkówkę muchy z obszarami mózgu dorosłego zwanymi blaszką i rdzeniem i mają kluczowe znaczenie dla przekazywania informacji wizualnych do mózgu (przejrzane przez18,19), podczas gdy neurony ciała grzyba są centralnie zlokalizowane w mózgu muchy i są niezbędne do uczenia się i pamięci20,21. Zarówno neurony fotoreceptorowe, jak i wewnętrzne neurony ciał grzybów, zwane komórkami Kenyona, wykorzystują ewolucyjnie zachowane rozproszone i zależne od kontaktu mechanizmy naprowadzania aksonów, aby znaleźć swoje postsynaptyczne cele. Oprócz tego, że są widoczne u dorosłych muszek, fotoreceptory i neurony MB mogą być również bezpośrednio wizualizowane u larw i poczwarek z przeciwciałami lub genami reporterowymi22,23,24,25. Możliwość łatwej wizualizacji tych dwóch zestawów neuronów w różnych punktach czasowych rozwoju promowała ich wykorzystanie jako doskonałych modeli dla wielu aspektów rozwoju neuronów.
Oprócz tego, że są używane jako model do zrozumienia mechanizmów prawidłowego rozwoju układu nerwowego, ostatnie badania wykazały, że muchy mogą również służyć jako dokładne modele wielu różnych chorób ludzkich, w tym Zespołu Łamliwego X (FXS)26, Niepełnosprawność intelektualna (ID)27,28,29,30,31, i inni32. Na przykład, aby zbadać funkcję molekularną genu ZC3H14, genu niedawno powiązanego z ludzką niepełnosprawnością intelektualną, stworzyliśmy model identyfikacji muchy przy użyciu allelu zerowego ortologu muchy ZC3H14, o nazwie Nab230. Muchy pozbawione Nab2 mają poważne zaburzenia pamięci i wydłużone ogony poli(A), podsumowując to, co obserwuje się u pacjentów lub linii komórkowych pochodzących od pacjentów33,34. Co ważne, muszki pozbawione Nab2 wykazują również poważne defekty morfologii mózgu w swoich dorosłych ciałach grzybów34, podobnie jak u muszek pozbawionych genu zespołu FXS, FMR135. W ten sposób muchy mogą służyć jako ważny organizm modelowy do badania zarówno normalnego rozwoju mózgu, jak i chorób, które go zakłócają.
Wreszcie, dostępność metod monitorowania zachowania o wysokiej przepustowości, w połączeniu z szerokim wachlarzem dostępnych narzędzi genetycznych, sprawiają, że Drosophila jest modelowym organizmem z wyboru do identyfikacji obszarów mózgu, które kontrolują złożone zachowania, takie jak uczenie się i pamięć, sen, zaloty, pragnienie i inne36,37,38,39. Jednym ze szczególnie przydatnych narzędzi, które znajduje się w centrum "skrzynki narzędzi" genetyka much, jest system GAL4/UAS (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Ten system40,41 wykorzystuje specyficzną tkankowo ekspresję aktywatora transkrypcji Gal4 w celu zwiększenia ekspresji genów lub transgenów poniżej sekwencji aktywującej (UAS). Modyfikacje tego systemu pozwoliły naukowcom na przykład precyzyjnie kontrolować pobudliwość określonych neuronów42,43, nadekspresję lub powalenie określonych genów będących przedmiotem zainteresowania44,45, analizować dynamikę wapnia w czasie rzeczywistym in vivo46 i wyrażać geny reporterowe w celu oznaczenia linii neuronalnych41. Połączenie systemu GAL4/UAS z rekombinacją mitotyczną pozwoliło również na stworzenie systemu Analizy Mozaiki z Systemem Repressible Cell Marker (MARCM)12,47. MARCM jest szeroko stosowany w śledzeniu pojedynczych neuronów w celu identyfikacji komponentów sygnalizacji komórkowej wymaganych do prowadzenia aksonów12,47. Chociaż te i inne techniki dostarczyły wielu cennych informacji na temat mechanizmów komórkowych wymaganych do funkcjonowania układu nerwowego, większość z nich wymaga najpierw przeprowadzenia sekcji mózgu Drosophila; Konieczne jest staranne usunięcie mózgu, aby zachować prawidłową morfologię mózgu i wzorce połączeń między obszarami mózgu. Poniższy protokół wykorzystuje ciało grzyba i neurony fotoreceptorowe jako przykładowe populacje neuronów, prowadząc Cię przez sekcję i barwienie immunofluorescencyjne mózgów dorosłych Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze/pęseta do mikrodysekcji</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia Sylgard</td><td>Oprzyrządowanie do systemów żywych</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Dostępne w amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2 Badania rozwojowe przeciwciał</td><td>Hybridoma Bank</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin</td> Badania <td>rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Przeciwciało Aves Lab</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszom</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 kozie przeciwciało wtórne przeciwko kurczakom</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszom</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyd</td><td>Mikroskop elektronowy Usługi</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Szkiełka</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Bufor fosforanowy jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na Bufor fosforanowy dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>lakier do paznokci</td><td>Usługi mikroskopu elektronowego (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>stereomikroskop</td><td>Leica S6D ze źródłem</td><td></td><td></td>światła LED KL300</tr><tr><td>Czasza 9-dołkowa (płytka punktowa)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator/rocker</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 lub 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>Czasza 35mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Potencjalne fiksacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffer</td><td></td><td></td><td>0,1 M NaPhosphate, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, zwykle składa się z 0,5 l 0,1 M buforu NaPhosphate i porcji 50 ml na raz w razie potrzeby w razie potrzeby</td></tr><tr><td>bufor</td><td></td><td></td> PLP <td>2% paraformaldehydu, 0,01 M NaI04, 0,075 M lizyna, 0,037 M NaPO4, pH 7,2, rozpuścić 0,36 g lizyny w 10 ml H2O + 7,5 ml 0,1 M NaH2PO4 pH 7,2 + 2,5 ml 0,1 M Na2HPO4 na lodzie. Bezpośrednio przed użyciem wymieszać 15 ml tego buforowanego roztworu lizyny z 50 mg NaIO4 (periodynian sodu) + 2 ml 20% wysokiej jakości paraformaldehydu (EMS) + 3 ml</td></tr><tr><td>buforu</td><td></td><td></td> H2O PEM <td>0,1 M RURY pH 7,0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, Ten bufor można wygodnie przygotować jako 2x zapas i rozcieńczyć 8% paraformaldehydem (PFA), aby uzyskać końcowe stężenie 4% PFA</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Fly Kolby dostępne w Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pan-neuronalny sterownik GAL4</td></tr><tr><td>w*;;; Sterownik OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4 dla wszystkich neuronów ciała grzyba (INSERCJA OK107-GAL4 odbywa się na 4. chromosomie)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); sterownik c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>GAL4 dla płatów alfa i beta (na 2. chromosomie)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>sterownik GAL4 dla płatów alfa i beta, zawiera również UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>Sterownik GAL4 przede wszystkim dla płatów gamma ciała grzyba (na 2. chromosomie)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>Sterownik GAL4 dla płatów gamma ciała grzyba, zawiera również UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, stado Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM, zawiera miejsce FRT i GAL80 na 2. chromosomie</td></tr><tr><td>w*, stado elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM, zawiera hsFLP, panneuronalny GAL4 i CD8-GFP na chromosomie X</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;; FRT82B, Tuba>GAL80/TM3, Sb(1); Kolba OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>MARCM do przerzucania 3. chromosomu</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT40A, Wanna>GAL80; Kolba OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>MARCM do przerzucania 2. chromosomu</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO; Kolba OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>MARCM do odwracania chromosomu X</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP znakuje powierzchnię komórki (CD8 jest białkiem transbłonowym)</td></tr> <tr><td>y(1), w*; FRTG13, stado UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM, zawiera miejsce FRT i CD8-GFP na 2. chromosomie</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Stado Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM, zawiera hsFLP i CD8-GFP na chromosomie X</td></tr><tr><td>w*; FRTG13, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM, zawiera miejsce FRT i GAL80 na 2. chromosomie</td></tr><tr><td>y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM, zawiera miejsce FRT i GAL80 na 3. chromosomie</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych drosophila melanogaster

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Rozwój układu nerwowego obejmuje sekwencyjną serię zdarzeń, które są koordynowane przez kilka ścieżek sygnałowych i sieci regulacyjnych. Wiele białek zaangażowanych w te szlaki jest ewolucyjnie zachowanych między ssakami a innymi eukariontami, takimi jak muszka owocowa Drosophila melanogaster, co sugeruje, że podobne zasady organizacji istnieją podczas rozwoju tych organizmów. Co ważne, Drosophila jest szeroko wykorzystywana do identyfikacji mechanizmów komórkowych i molekularnych regulujących procesy wymagane u ssaków, w tym neurogenezę, różnicowanie, przewodnictwo aksonalne i synaptogenezę. Muchy były również z powodzeniem wykorzystywane do modelowania różnych chorób neurorozwojowych człowieka. Tutaj opisujemy protokół krok po kroku mikrodysekcji, utrwalenia i immunofluorescencyjnej lokalizacji białek w mózgu dorosłego Drosophila. Protokół ten koncentruje się na dwóch przykładowych populacjach neuronów, neuronach ciała grzyba i fotoreceptorach siatkówki, i obejmuje opcjonalne kroki do śledzenia pojedynczych neuronów ciała grzyba za pomocą analizy mozaikowej z techniką represyjnych markerów komórkowych (MARCM). Przykładowe dane zarówno z mózgów typu dzikiego, jak i zmutowanego są pokazane wraz z krótkim opisem kryteriów punktacji dla wad kierowania aksonami. Podczas gdy protokół ten podkreśla dwa dobrze ugruntowane przeciwciała do badania morfologii ciała grzyba i neuronów fotoreceptorowych, inne regiony mózgu Drosophila i lokalizacja białek w innych regionach mózgu mogą być również badane za pomocą tego protokołu.

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu sekcji mózgu Drosophila jest uzyskanie nienaruszonych mózgów z dorosłych much, które mogą być wykorzystane w szerokim zakresie zastosowań, takich jak immunofluorescencja, lokalizacja białek znakowanych GFP oraz eksperymenty z hodowlą ex-vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii rozwoju i neuronauki, takie jak role konkretnych białek i szlaków sygnałowych oraz ustalanie wzorców łączności neuronalnej podczas rozwoju mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że po jej opanowaniu zapewnia ona szybką i skuteczną metodę immunologicznej identyfikacji defektów morfologicznych w określonych regionach mózgu dorosłego osobnika.Opanowanie tej procedury może być trudne, ponieważ usuwanie egzoszkieletu z głowy muchy wymaga dużej staranności i wprawy. Ruchy muszą być powolne i rozważne, a ramiona dyssektora muszą być dobrze podparte, aby zachować stabilność. Zaleca się ćwiczenie na muchach z czerwonymi oczami, a następnie na muchach z białymi oczami, przed przystąpieniem do sekcji genotypów interesujących w konkretnych eksperymentach.Aby przygotować się do sekcji, umieść znieczulone badane muchy na zimnej metalowej podkładce lub w płytce Petri stojącej na lodzie. Alternatywnie można użyć podkładki do much emitującej dwutlenek węgla. Następnie nanieś niewielką ilość PTN na środek naczynia do sekcji, aby utworzyć kropelkę PTN.Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, wypełnij pole widzenia pęcherzykiem PTN przy jednolitym oświetleniu. Teraz ułóż muchy tak, aby znajdowały się brzuchami do góry, i przeniesione jedną po drugiej za odwłok do PTN. Całkowicie zanurz zwierzę w PTN i przeprowadź całą sekcję w zanurzeniu w PTN.Za pomocą drugiej pary pęsety chwyć trąbek i odłącz głowę od ciała. Czasami trąbek zostanie usunięty, podczas gdy głowa pozostanie przytwierdzona do ciała. Jeśli tak się stanie, chwyć przyśrodkową krawędź jednej z siatkówek i przyłóż siłę boczną, aby usunąć głowę.Usunąć odwłok i klatkę piersiową. W tym kroku krytyczne jest utrzymanie głowy w PTN. Połączeń z mózgu centralnego do VNC nie można analizować za pomocą tej metody.Następnie chwyć przyśrodkową krawędź lewej siatkówki na brzegu otworu centralnego w kutykuli i powoli rozsuń pęsety w przeciwnych kierunkach, aby zapobiec rozerwaniu płata optycznego, który jest nieprzezroczystą strukturą pokrytą białymi, nitkowatymi tchawkami. W miarę oddzielania się siatkówki naprężenie nieznacznie spadnie. Aby zapobiec rozerwaniu mózgu, niezwykle ważne jest, aby chwycić przyśrodkową krawędź każdego oka i bardzo powoli rozsunąć pęsety.Zbyt szybkie ruchy mogą doprowadzić do zmiany morfologii mózgu lub uszkodzenia jego tkanki. Jak pokazano tutaj, należy chwycić kutykulę każdą z par pęset i bardzo powoli rozsuwać je w przeciwnych kierunkach. Jeśli czynność zostanie wykonana prawidłowo, kutykula powinna oddzielić się od tkanki mózgowej, pozostawiając mózg w nienaruszonym stanie.Do tego etapu potrzebna jest bardzo ostra pęseta. Następnie należy ostrożnie usuwać otaczającą kutykulę kawałek po kawałku. Podczas usuwania silnie przylegającej kutykuli pomocne może być unieruchomienie mózgu poprzez chwycenie pozostałego VNC, aby uniknąć zmiażdżenia mózgu.Na koniec, za pomocą pipety P200 przenieś wypreparowane mózgi do dołka płytki wypełnionej PTN w celu utrwalenia i immunostainingu. Pod mikroskopem, za pomocą pipety P200 przenieś od 10 do 15 wypreparowanych mózgów tego samego genotypu do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 0,5 mililitra wypełnionej 4%paraformaldehydem rozcieńczonym w PTN. Następnie inkubuj mózgi przez 20 minut przy powolnym kołysaniu w temperaturze pokojowej.Po utrwaleniu należy poczekać, aż mózgi opadną na dno probówki, a następnie usunąć utrwalacz. Następnie należy przeprowadzić dwa szybkie przemycia, używając 500 µL PTN na każde przemycie. Należy wymienić PTN natychmiast po opadnięciu mózgów na dno probówki.Następnie przeprowadź trzy długie płukania w PTN, stosując delikatne wstrząsanie w temperaturze pokojowej. Po tych płukaniach mózgi można przechowywać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PTN. Po usunięciu ostatniego płukania w PTN, inkubuj mózgi w 0,5 mililitrów roztworu blokującego przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, przy delikatnym wstrząsaniu.Po usunięciu roztworu blokującego należy dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym, a następnie inkubować mózgi w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez dwa dni przy łagodnym mieszaniu. Przeciwciała pierwszorzędowe należy usunąć, stosując pięciokrotny cykl płukania PTN. Następnie należy zastosować przeciwciała drugorzędowe.Przeciwciała należy inkubować z tkankami przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności, przy ciągłym kołysaniu. Po inkubacji mózgów w roztworze przeciwciał wtórnych zastosuj procedurę płukania PTN. Po każdym płukaniu próbki należy zakrywać folią, a na koniec usunąć jak największą ilość buforu.Następnie dodaj 75 µL fluorescencyjnego medium montażowego przeciwzblakaniowego i jeden raz przepłucz mózgi oraz medium przez końcówkę pipety. Probówkę można następnie owinąć folią i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni, jednak najlepiej jest bezzwłocznie przystąpić do montowania. Aby zamontować mózgi, przygotuj tzw. slajd mostkowy.Umieść dwa szkiełka nakrywkowe w odstępie około 1 centymetra na pozytywnie naładowanym szkiełku podstawnym. Upewnij się, że strona pozytywnie naładowana jest skierowana do góry. Następnie przyklej szkiełka nakrywkowe do szkiełka podstawnego za pomocą lakieru do paznokci i pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia przed przejściem do kolejnego etapu.Następnie umieść preparat pod mikroskopem stereoskopowym i pipetuj mózgi oraz medium w przestrzeń między szkiełkami nakrywkowymi. Pamiętaj o dostosowaniu oświetlenia, aby poprawić widoczność mózgów. Następnie odessaj nadmiar medium montażowego z preparatu, uważając, aby nie usunąć mózgów.Następnie odsącz pozostałą nadmiarową pożywkę montażową. Pozwoli to na dokładniejsze rozmieszczenie mózgów. Teraz, używając pęsety, ułóż mózgi w układzie siatki, tak aby ich płaty antenowe były skierowane ku górze.Następnie należy nałożyć szkiełko nakrywkę na mózgi i użyć lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie górnej nakładki przylegające do szkiełek podstawowych. Teraz należy kroplowo napełnić środkową komorę świeżym medium montażowym, pozwalając, aby medium zostało wciągnięte pod szkiełko nakrywkę poprzez działanie kapilarne. Po wypełnieniu komory należy ją całkowicie uszczelnić, używając bezbarwnego lakieru do paznokci.Opisana metoda może być wykorzystana do wizualizacji niemal każdej struktury w dorosłym mózgu, w tym ciał grzybiastych. Ten obszar mózgu jest niezbędny do procesów uczenia się i pamięci. Ciała grzybiaste można łatwo zwizualizować przy użyciu przeciwciał rozpoznających białko fasciculin 2.Białko to wykazuje wysoką ekspresję w płatach alfa i beta, a także w centralnie położonym ciele elipsoidalnym. Technika ta pozwoliła na zidentyfikowanie wielu procesów komórkowych niezbędnych do prawidłowego prowadzenia aksonów neuronów ciała grzybiastego. Zaburzenie tych procesów powoduje wystąpienie różnorodnych fenotypów mutantów, takich jak nieprawidłowa projekcja aksonów przez region linii środkowej mózgu oraz brak płatów alfa.Fenotypy mutantów tych są często niepełne pod względem penetracji, w związku z czym wymagają badania wielu mózgów. W celu zbadania autonomicznej roli białka w prowadzeniu aksonów, można również zastosować technikę Markhama do wizualizacji decyzji dotyczących prowadzenia aksonów poszczególnych neuronów mutantów lub typu dzikiego wykazujących fluorescencję GFP na niefluorescencyjnym tle typu dzikiego. Opisana tutaj metoda umożliwia wiarygodną i powtarzalną wizualizację praktycznie każdego obszaru mózgu dorosłej Drosophila.W niniejszej pracy skoncentrowaliśmy się na neuronach ciał grzybkowatych. W wersji tekstowej niniejszego protokołu przedstawiliśmy również wizualizację płatów optycznych. W innych badaniach wykorzystano podobne techniki do wizualizacji pars intercerebralis, neuronów zegara oraz neuronów projekcyjnych płatów antenowych, a także wielu innych struktur.Po opanowaniu techniki, każda głowa może zostać wypreparowana w ciągu 3 do 5 minut, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Podczas próby przeprowadzenia tego procesu ważne jest, aby stabilizować ramiona w pobliżu mikroskopu. Należy również poruszać się powoli i usuwać niewielkie fragmenty kutykuli pojedynczo.Zbyt szybkie poruszanie mogłoby spowodować niepożądane uszkodzenie podścielnej tkanki mózgu. Oprócz wykorzystania wypreparowanych mózgów w eksperymentach z mikroskopii opartej na immunofluorescencji, tkanka mózgu może być również wykorzystana do dodatkowych doświadczeń.

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie ośrodkowego układu nerwowego z państw larw Drosophila stadium.

Dissection z larw CNS na Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Ten film opisuje metodę montażu nienaruszonych mózgów dorosłych much pod zjeżdżalnią mostkową i pokazuje protokół wykonywany na immunologicznie barwionych mózgach do mikroskopii fluorescencyjnej.

Montowanie mózgów dorosłych Drosophila: metoda przygotowania szkiełek do obrazowania konfokalnego

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować mózg dorosłego Drosophila - procedura niezbędna do wizualizacji narządu, który w przeciwnym razie jest zasłonięty przez naskórek, oko i tkankę tchawicy. Przykładowy protokół przedstawia szczegółową demonstrację dającą wysokiej jakości preparaty, które można stosować do barwienia immunologicznego i metod obrazowania w neurobiologii Drosophila.

Drosophila Sekcja mózgu osoby dorosłej: metoda w neurobiologii much

Ten film demonstruje szczegółowy protokół barwienia immunologicznego do wizualizacji defektów fenotypowych w ciałach grzybów zmutowanych mózgów Drosophila. Protokół polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko Fas2, białku biorącemu udział w prowadzeniu aksonów, które ułatwia prawidłowy rozwój morfologiczny i funkcjonalny ciała grzyba.

Wizualizacja neuronów ciała grzyba w mózgach Drosophila za pomocą barwienia immunologicznego

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Mózg dorosłego Drosophila jest cennym systemem do badania obwodów neuronalnych, wyższych funkcji mózgu i złożonych zaburzeń. Skuteczna metoda wycinania całej tkanki mózgowej z małej głowy muchy ułatwi badania oparte na mózgu. Tutaj opisujemy prosty, jednoetapowy protokół preparacji dorosłych mózgów o dobrze zachowanej morfologii.

Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Naucz się rozwarstwiania i barwienia immunofluorescencyjnego neuronów ciała grzyba oraz fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju neuronów i łączności synaptycznej.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów