System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka
10 stycznia 2018
Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.
Ogólnym celem tej procedury jest badanie przesiewowe bibliotek małych cząsteczek pod kątem czynników promujących różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworowych komórek macierzystych, takie jak to, jakie są szlaki sygnałowe, które są wymagane do utrzymania komórek macierzystych glejaka w stanie niezróżnicowanym. Prawidłowe wykonanie tej techniki pozwala na prostą identyfikację małych cząsteczek, które sprzyjają różnicowaniu komórek macierzystych glejaka.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię glejaka Ehlersa-Danlosa, ponieważ zmniejszenie odsetka komórek macierzystych glejaka może zmniejszyć prawdopodobieństwo nawrotu. Metoda ta może być również stosowana do ustawiania różnicowania w innych liniach komórkowych przy użyciu innych konstruktów reporterowych. Nasz raport jest pierwszym, w którym ustanowiono wysokoprzepustowe podejście do badań przesiewowych w poszukiwaniu czynników, które zmuszają komórki macierzyste glejaka do różnicowania.
Praca z cząsteczkami lentiwirusa w komórkach nowotworowych pochodzących od pacjentów może być niezwykle niebezpieczna. Dlatego zawsze należy postępować zgodnie ze standardową procedurą pracy z patogenami przenoszonymi przez krew. Na początek wysiew milion komórek macierzystych glejaka lub GSC w dwóch mililitrach kompletnego podłoża do wzrostu nerwowych komórek macierzystych na sześciodołkowej płytce.
Następnie transdukuj komórki za pomocą reportera lentiwirusa przy wielokrotności infekcji równej pięciu. Do mieszaniny komórek i wirusów dodaj dwa mikrolitry polibrenu tak, aby końcowe stężenie wynosiło osiem mikrogramów na mililitr i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez noc. Po inkubacji należy wymienić pożywkę wzrostową, aby usunąć niezwiązanego wirusa.
I odwirować komórki pod ciśnieniem 360 razy G przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać pożywkę i umieścić komórki z powrotem w sześciodołkowej płytce. I kontynuuj inkubację komórek przez 24 godziny.
Zbierz 0,5 mililitra całkowitej objętości kultury. Komórki osadu przez wirowanie w temperaturze 360 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zawieś komórki w 0,5 mililitra świeżej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych.
Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić rozszerzanie się przez co najmniej 72 godziny. Dodać 200 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego i inkubować przez pięć minut w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Dysocjuj komórki, delikatnie pipiąc w górę iw dół.
Do zdysocjowanych komórek dodaj 800 mikrolitrów HBSS, aby zapewnić minimalne przyłączanie lub agregację komórek. Następnie przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny każdej komórki do studzienek 96-dołkowej płytki. Określić procent komórek wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej.
Rejestruj co najmniej 10 000 żywotnych komórek w każdym akwizycie. We wszystkich analizach cytometrii przepływowej należy użyć macierzystych komórek nietransdukcyjnych lub komórek niefluorescencyjnych transdukowanych wektorem w celu ustalenia fluorescencji wyjściowej. Aby wybrać i namnażać poszczególne subklony, komórki nasienne o gęstości 0,7 komórki na studzienkę w 100 mikrolitrach pożywki z nerwowych komórek macierzystych na 96-dołkowej płytce.
Utrzymuj te klony w kulturze przez 11 dni. Zwróć uwagę na neurosfery o średnicy większej niż 100 mikronów. Wcześniej ustaliliśmy tę wielkość odcięcia, aby retrospektywnie określić, czy neuorsfera została poprowadzona przez samoodnawiającą się komórkę macierzystą glejaka.
Ten rozmiar odcięcia może wymagać optymalizacji podczas pracy z różnymi modelami komórek glejaka. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr FITC i zaznacz studzienki zawierające pojedynczą neurosferę, w której około 1% do 5% komórek jest GFP-dodatnich. Po znakowaniu rozmnośnij poszczególne klony, aż dostępna będzie wystarczająca liczba komórek do analizy cytometrii przepływowej.
Zakładając, że klony reporterowe zawierają od 1% do 5% komórek GFP-dodatnich, zbierz 0,5 mililitra z każdego klonu wraz z równą ilością nietransdukowanych komórek kontrolnych, aby określić dokładny procent komórek GFP-dodatnich. Po zagnieżdżeniu komórek w temperaturze 360 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant. Dodaj 200 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego do każdej osadki i inkubuj probówki w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.
Po inkubacji należy rozcierać komórki około 20 do 30 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie dodaj 800 mikrolitrów HBSS, aby zapewnić minimalne przyłączanie lub agregację komórek. Teraz przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny każdej komórki do studzienek z 96-dołkową płytką.
Na koniec wykonaj cytometrię przepływową, rejestrując co najmniej 10 000 żywotnych komórek w każdym akwizycie. Aby ocenić zdolność klonogenną, należy przygotować zawiesiny pojedynczych komórek subklonów reporterowych różnicowania, dzieląc komórki około 20 do 30 razy. Następnie umieść te komórki w 100 mikrolitrach kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych o gęstości około pięciu do 500 komórek na studzienkę na 96-dołkowych płytkach.
Utrzymuj te komórki w hodowli przez dziewięć do 11 dni. Szukaj neurosfer pod mikroskopem świetlnym. Studnia zawierająca co najmniej jedną dużą neurosferę jest uważana za pozytywną.
Biorąc pod uwagę rodzicielskie komórki nietransdukowane i komórki transdukowane lentiwirusem GFP-dodatnim jako dane kontrolne, dane wejściowe całkowitej analizowanych studzienek i liczby komórek dodatnich na interfejsie internetowym ELDA. Aby rozpocząć badania przesiewowe, umieść 5000 komórek w 99 mikrolitrach kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych na 96-dołkowej płytce. Następnie za pomocą 12-kanałowego pipetora potraktuj komórki dwumikromolowym końcowym stężeniem rozcieńczonych związków bibliotecznych lub kontrolą DMSO.
Inkubować komórki przez 72 godziny. Teraz dodaj 150 mikrolitrów odczynnika do dysocjacji komórek za pomocą 12-kanałowego pipetora do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie delikatnie rozcieraj komórki w każdym dołku około 20 do 30 razy za pomocą 12-kanałowego pipetora, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
Teraz wykonaj cytometrię przepływową i określ procent komórek wyrażających reporter GFAP:GFP. Najpierw określ rozmiar i żywotność komórki z rozproszenia do przodu i z boku, a następnie bramkuje żywotną populację komórek. Następnie określ komórki GFP-dodatnie w żywotnej populacji komórek.
Wzrost odsetka komórek z dodatnim wynikiem GFP o trzy odchylenia standardowe w stosunku do kontroli uważa się za dodatnie trafienie, które można dostosować w celu dostosowania do preferencji użytkownika co do rygorystyczności. Pokazano reprezentatywne obrazy subklonów GSC HSR-GBM1 wyrażających niskie i wysokie poziomy GFAP:GFP. Subklony dodatnie pod względem ekspresji GFAP: GFP zostały wybrane za pomocą cytometrii przepływowej dla linii neurosfery pochodzącej od pacjenta.
W tym przypadku niski GFAP:GFP wskazuje, że mniej niż 5% komórek w klonie jest GFP-dodatnich, podczas gdy wysoki GFAP:GFP wskazuje, że więcej niż 75% komórek w klonie jest GFP-dodatnich. Wyniki te pokazują, że zdolność subklonów o niskiej zawartości GFAP do samoodnawiania się in vitro jest wyższa niż ich odpowiedników o wysokiej GFAP, jak określono przez ELDA. Dlatego subklony GH są bardziej zróżnicowane niż subklony GL.
Na koniec biblioteki leków poddano badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania czynników zdolnych do indukowania różnicowania astrogleju w GSC. Stwierdzono, że 12 leków znacznie zwiększa odsetek komórek wykazujących ekspresję reportera GFAP:GFP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak test alamarBlue, test klonogenny w pożywce półstałej, wstrzyknięcie ksenografu bocznego lub wewnątrzczaszkowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ selektywnych leków na proliferację komórkową i klonogenność in vitro oraz rakotwórczość in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować związki zdolne do indukowania różnicowania astrogleju w komórkach macierzystych glejaka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół przesiewowy służący do identyfikacji małych cząsteczek promujących różnicowanie astroglialne w macierzystych komórkach glejaka wielopostaciowego (GSCs). Metoda ta wykorzystuje reporter różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest sterowana przez ludzki promotor GFAP.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia nowotworów
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wprowadzenie
- Komórki macierzyste glejaka wielopostaciowego (GSCs) są kluczowe dla zrozumienia nawrotów glejaka wielopostaciowego.
- Niezbędna jest identyfikacja szlaków, które utrzymują GSCs w stanie niedróżnicowanym.
- Dróżnicowanie astroglialne może prowadzić do redukcji populacji GSCs.
- Niniejsze badanie wprowadza metodę wysokoprzepustowego przesiewania czynników różnicujących.
Cel badania
- Przesiewanie bibliotek małych cząsteczek w celu znalezienia czynników promujących różnicowanie astroglialne w GSC.
- Badanie szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w utrzymanie GSC.
- Przedstawienie metody możliwej do zastosowania w innych liniach komórkowych przy użyciu innych konstruktów reporterowych.
Zastosowane metody
- Wysokoprzepustowy przesiew bibliotek małych cząsteczek.
- Wykorzystanie systemu reporterowego różnicowania komórek macierzystych.
- Ocena ekspresji eGFP sterowanej przez ludzki promotor GFAP.
- Analiza wpływu różnicowania na macierzyste komórki glejaka wielopostaciowego.
Główne wyniki
- Identyfikacja małych cząsteczek skutecznie promujących różnicowanie astroglialne.
- Wgląd w szlaki sygnalizacyjne niezbędne do utrzymania GSC.
- Potencjalne implikacje terapeutyczne w zakresie ograniczania nawrotów glejaka wielopostaciowego.
- Ustanowienie nowego podejścia do przesiewowego badania wysokoprzepustowego.
Wnioski
- Opracowany protokół jest skuteczny w badaniu czynników promujących różnicowanie.
- Wyniki mogą przyczynić się do opracowania strategii terapeutycznych przeciwko glejakowi wielopostaciowemu.
- Metoda ta może zostać dostosowana do innych badań nad różnicowaniem.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten system przesiewowy oparty na cytometrii przepłyewowej umożliwia działom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym identyfikację małych cząsteczek promujących różnicowanie komórek macierzystych glejaka, co pozwala na zaadresowanie kluczowego mechanizmu nawrotów nowotworu. Dzięki ilościowemu określaniu różnicowania astrogljalnego poprzez ekspresję reportera GFAP:GFP, platforma ta zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego dla projektów onkologicznych. Podejście to wspiera identyfikację wiodących związków oraz selekcję portfolio poprzez skalowalne i powtarzalne testy zgodne z przesiewami bibliotek leków zatwierdzonych przez FDA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceuticals
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez powiązanie leczenia małymi cząsteczkami z różnicowaniem astroglialnym w GSC pochodzących od pacjentów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe odczyty cytometrii przepływowej komórek GFP-dodatnich.
- Wartość prognostyczna: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez identyfikację związków zmniejszających cechy macierzystości oraz zdolność do samoodnowy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Ustanowienie wysokoprzepustowej platformy cytometrii przepływowej do przesiewania bibliotek związków z parametrami zgodnymi z czynnikiem Z'.
- Wynik ilościowy: Pomiar procentu komórek GFP-dodatnich jako bezpośredni odczyt skuteczności różnicowania.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatem 96-dołkowym oraz 12-kanałowym pipetowaniem w celu przesiewania tysięcy związków.
- Elastyczność reportera: Konstrukt GFAP:GFP może zostać zastąpiony innymi promotorami specyficznymi dla danej linii komórkowej w celu szerokiej walidacji celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje biologię ludzkich komórek macierzystych glejaka używając neurosfer pochodzących od pacjentów.
- Ciągłość translacyjna: Fenotyp różnicowania jest zgodny z dojrzewaniem astroglialnym, co stanowi istotny klinicznie punkt końcowy.
- Prekliniczna redukcja ryzyka: Identyfikuje związki redukujące potencjał klonogenny, co dostarcza informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
- Zgodność z biomarkerami: Ekspresja GFAP służy jako biomarker translacyjny dla różnicowania w kierunku linii astroglialnej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta jest włączana do wczesnych etapów procesów odkrywania leków, po identyfikacji celu, a przed optymalizacją wiodących związków, umożliwiając przesiew fenotypowy czynników indukujących różnicowanie w systemie istotnym dla danej choroby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków sygnalizacyjnych regulujących utrzymanie GSC za pomocą perturbacji małymi cząsteczkami.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki bramkowaniu w cytometrii przepływowej oraz kontrolom żywotności.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie efektów związków na podstawie procentowej zawartości komórek GFP-dodatnich oraz statystycznego wyznaczania trafień (3 SD powyżej kontroli).
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez identyfikację czynników redukujących potencjał tumorigenny w populacjach wzbogaconych w komórki macierzyste.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma jest dostosowywalna do innych modeli rakowych komórek macierzystych i punktów końcowych różnicowania poprzez wymianę reportera.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: dostarcza wglądu w mechanizmy szlaków różnicowania i zmniejsza niejednoznaczność w mechanizmach ukierunkowanych na komórki macierzyste.
- Wartość operacyjna: zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom transdukcji, selekcji i cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: poprawia efektywność kapitałową poprzez priorytetyzację związków o aktywności różnicującej nad tymi wykazującymi wyłącznie efekty cytotoksyczne.
- Wpływ na portfolio: umożliwia postęp dostosowany do ryzyka poprzez identyfikację induktorów różnicowania, które mogą działać synergistycznie z terapiami standardowymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie transdukcji lentiwirusowej, cytometrii przepływowej oraz hodowli neuronalnych komórek macierzystych.
- Metoda jest zależna od cytometru przepływowego z detekcją FITC oraz kompatybilnością z automatyzacją płytek 96-dołkowych.
- Konieczna jest standaryzacja walidacji reporterów i testów klonogennych w różnych liniach komórkowych.
- Adaptacja do innych modeli może wymagać optymalizacji progów wielkości neurosfer oraz progów różnicowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność w pierwotnych kulturach GSC oraz konieczność dokładnego wyznaczania bramki żywotności (viability gating).
Częste pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Generation of Lentiviral Transcriptional Reporter Cell Lines
3:47
Subclone Selection, Expansion, and Validation
4:47
Determination of GFAP:GFP Expression by Flow Cytometry
5:58
ELDA Self-renewal Assay to Assess Clonogenic Capacity
7:01
Drug Screen
8:27
Results: Selection and Drug Screening of Glioblastoma Stem Cell Subclones
9:46
Conclusion
