Name: System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę przesiewową opartą na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek promujących różnicowanie astroglialne komórek macierzystych glejaka. Technika ta umożliwia badanie szlaków sygnałowych utrzymujących GSC w stanie nieróżnicowanym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została częściowo wsparta przez NIH R01CA187780.

UWAGA: Astroglejowe i neuronalne systemy reporterowe lentiwirusa zostały zakupione jako wstępnie zapakowane, skoncentrowane preparaty lentiwirusowe. Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu techniki cytometrii przepływowej. Ponadto, aby w pełni wykorzystać ten protokół, użytkownik będzie potrzebował dostępu do cytometru przepływowego o dużej przepustowości (akceptuje płytki 96-dołkowe jako źródło próbki).
1. Lentiwirusowy system reporterowy transkrypcji
UWAGA: We wszystkich analizach cytometrii przepływowej używaj komórek rodzicielskich, nietransdukowanych lub komórek transdukowanych wektorowo (niefluorescencyjnych) do ustalenia wyjściowej fluorescencji. Zauważ również, że na wszystkich etapach, na których wymagane jest mechaniczne rozcieranie, bądź delikatny. Ostre wycieranie może zabić znaczną liczbę delikatnych GSC i wpłynąć na wyniki cytometrii przepływowej.
<ol>
	<li>Płytka 1x106 komórek w 2 ml kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych na płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Transdukuj komórki, dodając reporter lentiwirusa przy wielokrotności infekcji (moi) równej 5.</li>
	<li>Dodać 2 μl polibrenu, aby uzyskać końcowe stężenie 8 μg/ml.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia zastąp pożywkę wzrostową, aby usunąć niezwiązanego wirusa. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubować przez 24 godziny.</li>
	<li>Zebrać 0,5 ml całkowitej objętości; odwirować komórki w temperaturze 360 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i usunąć supernatant przez aspirację. Dodać 0,5 ml świeżej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych do pozostałych komórek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w celu dalszej ekspansji.</li>
	<li>Dodać 200 μl odczynnika dysocjacyjnego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dysocjuj komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół. 
	UWAGA: Ostre roztarcie może spowodować znaczne zabicie GSC, całkowitą dysocjację osiąga się zwykle po 20 - 30 razy.</li>
	<li>Aby zminimalizować przyczepianie się lub agregację komórek, dodaj 800 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), aby uzyskać końcową objętość 1 ml.</li>
	<li>Przenieść 200 μl zawiesiny każdej komórki do dołka zawierającego 96-dołkową płytkę.</li>
	<li>Do tej procedury należy użyć laboratoryjnego cytometru przepływowego z 96-dołkową płytką, wyposażonego w niebieski laser do wzbudzenia i z możliwością wykrywania białka zielonej fluorescencji. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej z co najmniej 10 000 żywotnych komórek dla każdego akwizycji.</li>
	<li>Określ procent komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
2. Wybór, Ekspansja i Walidacja Subklonów
<ol>
	<li>Komórki płytki w 100 μl pożywki z nerwowych komórek macierzystych o gęstości 0,7 komórki na dołek na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Hodowla klonów przez 11 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Ten krok jest w dużym stopniu zależny od typu komórki i prawdopodobnie będzie wymagał dostosowania w oparciu o użytą linię komórkową. Z reguły średnica kuli ≥ 100 μm jest dobrym wskaźnikiem obecności klonogennych GSC w neurosferach.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr FITC zaznacz studzienki zawierające pojedynczą neurosferę, w której ~1-5% komórek jest GFP-dodatnich. 
	UWAGA: Określenie dokładnego procentu komórek GFP-dodatnich nie jest w tym momencie zbyt krytyczne. Każdy z subklonów zostanie później oceniony za pomocą cytometrii przepływowej. Ten krok jest wykonywany w celu zmniejszenia całkowitej liczby klonów do analizy, z naciskiem na neurosfery, które pochodzą z niezróżnicowanego, GFAP-ujemnego GSC.</li>
	<li>Rozwijaj wybrane klony reporterowe, aż będzie wystarczająca liczba komórek do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Studzienka sub-konfluentna z 6-dołkowej płytki zawierającej ≤ 1,5x105 komórek/ml powinna zapewnić wystarczającą liczbę komórek. 
	UWAGA: Szczegółowa procedura izolacji i rozszerzania GSC jest dostępna pod adresem 17.</li>
</ol>
3. Oznaczanie ekspresji GFAP:GFP za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Pobrać podwielokrotność komórek (0,5 ml) z każdego klonu reporterowego i nietransdukowanych kontroli w celu określenia dokładnego procentu komórek GFP-dodatnich. Biorąc pod uwagę klony reporterowe, które zawierają ~1 - 5% komórek GFP-dodatnich.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 360 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant przez aspirację.</li>
	<li>Do każdej osadki dodać 200 μl odczynnika do dysocjacji komórek i inkubować probówki w łaźni wodnej nastawionej na 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie rozcieraj komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki (zwykle od 20 do 30 razy).</li>
	<li>Aby zminimalizować przyłączanie lub agregację komórek, dodaj 800 μl HBSS do końcowej objętości 1 ml.</li>
	<li>Przenieść 200 μl na studzienkę 96-dołkowej płytki z każdej zawiesiny komórek.</li>
	<li>Do tej procedury należy użyć laboratoryjnego cytometru przepływowego z 96-dołkową płytką. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej z co najmniej 10 000 żywotnych komórek dla każdego akwizycji.</li>
</ol>
4. Test samoodnawiania ELDA do oceny zdolności klonogenicznej
UWAGA: Dla kontroli, zarówno komórki rodzicielskie, nietransdukowane, jak i transdukowane lentiwirusem z ekspresją GFP, powinny być używane do określenia względnego potencjału klonogennego linii reporterowych różnicowania GSC do oryginalnych kultur GSC, z których pochodzą.
<ol>
	<li>Dysocjuj subklony reporterowe różnicowania na zawiesiny jednokomórkowe, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Płytki komórkowe na 96-dołkowych płytkach w 100 μl kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych o gęstości komórek w zakresie od 5 do 500 komórek na studzienkę.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 9 do 11 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Oceń dodatnie dołki poprzez bezpośrednią wizualizację neurosfer pod mikroskopem świetlnym. Studnia powinna być uważana za "pozytywną", jeśli zawiera co najmniej jedną dużą neurosferę.</li>
	<li>Podłącz dane: całkowitą liczbę przeanalizowanych odwiertów i liczbę odwiertów dodatnich za pomocą interfejsu online ELDA dostępnego pod adresem http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.</li>
</ol>
5. Przygotowanie rozcieńczenia biblioteki leków
<ol>
	<li>Wyjąć płytki biblioteczne z magazynu w temperaturze -80 °C, przykryć folią aluminiową (chronić związki wrażliwe na światło). Rozmrażać przez około 30 minut do godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyj 12-kanałowego pipetora wielokanałowego, aby rozcieńczyć związki z biblioteki do 0,2 mM w kompletnym pożywce z nerwowych komórek macierzystych. Rozcieńczyć DMSO do 10% w podłożu wzrostowym 
	UWAGA: Końcowe stężenie DMSO powinno wynosić 0,1% po dodaniu do komórek. Wyższe stężenie DMSO w kulturze może powodować toksyczność. Z tego powodu zaleca się zbadanie wrażliwości na DMSO w zastosowanej linii komórkowej przed zabiegiem.</li>
	<li>Użyj DMSO jako kontroli nośnika do traktowania komórek znajdujących się w lewej i prawej kolumnie każdej płytki (kolumny 1 i 12; Studnie od A do H).</li>
	<li>Przykryj rozcieńczone tabliczki biblioteczne folią aluminiową i włóż oryginalne płytki biblioteczne do zamrażarki w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
6. Ekran narkotykowy
UWAGA: Komórki traktowane DMSO powinny być używane do ustawiania podstawowej fluorescencji i dostosowywania bramkowania.
<ol>
	<li>Płytka 5x103 komórki w 96-dołkowej płytce w 99 μl kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych.</li>
	<li>Używając 12-kanałowego pipetora wielokanałowego, potraktuj komórki rozcieńczonymi związkami bibliotecznymi o końcowym stężeniu 2 μM (1 μL 0,2 mM leku w 99 μl zawiesiny komórek) lub DMSO (kontrola). Inkubować płytki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Za pomocą 12-kanałowego pipetora wielokanałowego dodać 150 μl odczynnika do dysocjacji komórek do każdego dołka i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dysocjację komórek należy delikatnie rozcierać za pomocą 12-kanałowego pipetora wielokanałowego, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki (zwykle od 20 do 30 razy). Ilość czasu potrzebna do całkowitej dysocjacji neurosfer będzie się różnić w zależności od linii GSC. Chociaż zalecany odczynnik do dysocjacji komórek (patrz materiały) jest bezpieczny, a inkubacja trwająca do 45 minut nie miała wpływu na żywotność w wielu testowanych liniach GSC, sprawdź, czy każda linia GSC ma być użyta w badaniach przesiewowych. 
	UWAGA: Końcowa objętość w każdym dołku powinna wynosić około 250 μl (100 μl zawiesiny komórkowej + 150 μl odczynnika do dysocjacji komórek).</li>
	<li>Określić procent komórek wykazujących ekspresję reportera GFAP:GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj standardowej strategii bramkowania. Najpierw narysuj rozproszenia do przodu i z boku, aby uzyskać ogólne pojęcie o rozmiarze i żywotności komórki. Następnie umieść bramę na żywotnej populacji jednokomórkowej. Jest to populacja, dla której zostanie oznaczona zielona fluorescencja (eGFP). Każdy związek, który powoduje wzrost odsetka komórek dodatnich pod względem GFP o ponad trzy odchylenia standardowe w stosunku do kontroli (traktowany DMSO), jest uważany za pozytywne "trafienie". Próg ten powinien być dostosowany w zależności od konkretnego zastosowania i pożądanej rygorystyczności. 
	UWAGA: W przypadku ekranu o wysokiej przepustowości zaleca się użycie pojedynczego subklonu reportera GSC. Po zidentyfikowaniu trafienia każde trafienie powinno zostać zweryfikowane pod kątem dodatkowych subklonów zgłaszających z tej samej linii GSC. Aby zwiększyć pewność prawdziwych trafień, zaleca się również testowanie związków przeciwko subklonom reporterowym wyizolowanym z różnych linii neurosfer GSC.</li>
</ol>

<ol><li>Maher, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+glioma%3A+genetics+and+biology+of+a+grave+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).</li>
<li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+maintenance+in+glioblastoma%3A+a+social+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network.</a> Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Sul, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+gliomas%3A+new+translational+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Malignant gliomas: new translational therapies.</a> Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).</li>
<li>Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+promotes+medulloblastoma+survival+via+Bc%2FII%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II.</a> Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).</li>
<li>Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+inhibition+of+glioblastoma+xenograft+initiation+and+clonogenic+growth+following+in+vivo+Notch+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade.</a> Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).</li>
<li>Schreck, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+target+Hes1+directly+modulates+Gli1+expression+and+Hedgehog+signaling%3A+a+potential+mechanism+of+therapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance.</a> Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).</li>
<li>Warrell, R. P. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+therapy+of+acute+promyelocytic+leukemia+with+tretinoin+%28all-trans-retinoic+acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid).</a> N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).</li>
<li>Piccirillo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).</li>
<li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).</li>
<li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2FCD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).</li>
<li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+monocarboxylate+transporter-4+depletes+stem-like+glioblastoma+cells+and+inhibits+HIF+transcriptional+response+in+a+lactate-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner.</a> Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li>
<li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).</li>
<li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas gdy większość wcześniejszych badań nad GSC koncentrowała się przede wszystkim na markerach, które je definiują, w tym badaniu zdecydowaliśmy się przyjąć odwrotne podejście. Skupiamy się przede wszystkim na zróżnicowanych potomkach generowanych przez GSC (np. komórki wyrażające markery astroglejowe i neuronalne). Tutaj demonstrujemy wykorzystanie wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych leków opartego na komórkach, który opiera się na ludzkiej ekspresji GFP zależnej od promotora GFAP. Wszystkie eksperymenty...

Ostatnie badania wykazały, że nowotwory zawierają małą populację komórek, określanych jako rakowe komórki macierzyste (CSC) lub komórki inicjujące nowotwór, które są odpowiedzialne za progresję nowotworu, przerzuty i odporność na chemio- i radioterapie 1,2. Obecność nowotworowych komórek macierzystych i ich bardziej zróżnicowanych potomków w obrębie nowotworów jest uważana za ważny czynnik sprzyjający heterogeniczności wewnątrznowotworowej, a tym samym stanowi główną przeszkodę w leczeniu nowotworów3. Hierarchia komórek nowotworowych, przedstawiona przez teorię rakowych komórek macierzystych, zainspirowała rozwój nowych strategii leczenia nowotworów 4. Jednym z podejść do celowania w nowotworowe komórki macierzyste jest identyfikacja i hamowanie szlaków sygnałowych, o których wiadomo, że są wymagane podczas rozwoju embrionalnego dotkniętego narządu. Rzeczywiście, my i inni opublikowaliśmy wcześniej wiele artykułów opisujących ciągłe zapotrzebowanie na szlaki sygnałowe istotne dla neuronalnych komórek macierzystych Sonic Hedgehog i Notch w glejaku5,6,7. Prace te pomogły w ugruntowaniu przesłanek dla kilku badań klinicznych GBM. Drugim podejściem do celowania w nowotworowe komórki macierzyste jest promowanie ich różnicowania. Podejście to spotkało się z dużym poparciem ze względu na korzystne wyniki badań przedklinicznych i klinicznych w leczeniu ostrej białaczki promielocytowej kwasami retinowymi (ATRA, analog witaminy A). W tym przypadku stwierdzono, że ATRA usuwa blok dojrzewania i promuje różnicowanie komórek rakowych8. Niedawno Piccirillo i współpracownicy elegancko wykazali, że BMP-4 promuje różnicowanie GSC w astrocyty ze znaczącym działaniem anty-GBM in vitro i in vivo9.
Uzasadnienie obecnego badania opiera się na podejściu "inżynierii odwróconej" do celów GSC. Biorąc pod uwagę ogromną heterogeniczność obecną w GBM i słabe różnicowanie będące jedną z cech charakterystycznych raka, zapytaliśmy, czy możemy promować bardziej korzystny fenotyp - różnicowanie się do stanu podobnego do astrocytów. W tym przypadku nie mamy wcześniejszej wiedzy na temat szlaków sygnałowych, które utrzymują GSC w danej próbce guza, ale raczej dążymy do osiągnięcia pożądanego fenotypu (np. dodatniego wyniku GFAP).
Ten raport opisuje procedury używane do ustanowienia linii reporterowych różnicowania GSC od transdukcji kultur wzbogaconych GSC do selekcji klonalnej GSC. Zastosowane linie neurosfery glejaka zostały stworzone w laboratorium profesora Angelo Vescovi od pacjentów z rozpoznaniem glejaka pierwotnego w Szpitalu San Raffaele - Mediolan we Włoszech. Linie te zostały szeroko przebadane w kilku publikacjach 6,10,11,12,13,14. Zdecydowanie zaleca się, aby osoby, które są zainteresowane wdrożeniem tych technik w swoim laboratorium, określiły znaczenie reportera dla zdolności do samoodnawiania się komórek macierzystych raka w komórkach, które planują badać (dotyczy to każdego zgłaszającego). W tym celu dostępny jest szczegółowy protokół dla jednego z testów klonogennych in vitro akceptowanych w tej dziedzinie15,16. Na końcu znajduje się szczegółowy protokół opisujący wykorzystanie różnicujących linii reporterowych w badaniu przesiewowym leków opartym na cytometrii przepływowej. Warto zauważyć, że podobnie jak w przypadku opisanego tutaj systemu różnicowania astrogleju, udało nam się ustalić i zweryfikować linie reporterowe GSC integrujące reporter MAP2:GFP (różnicowanie neuronalne). W związku z tym metodologie opisane w tym artykule mogą być stosowane do badania różnicowania komórkowego w różnych liniach komórkowych.
Niektóre z liczb w tym raporcie można znaleźć w niedawnej publikacji: "Atracurium Besylate i inne czynniki blokujące przewodnictwo nerwowo-mięśniowe promują różnicowanie astrogleju i wyczerpują komórki macierzyste glejaka18.

<table><tbody><tr><td>ESGRO Complete Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SF006</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Zbilansowany roztwór soli Hanka)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Wirus)</td><td>SBI (System Biosciences)</td><td>SR10015VA-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylny jednorazowy odczynnik zbiorniki</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T25 cm&sup2; Kolba Termo Wentylacyjna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130189</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T75 cm&sup2; Termo wentylowany</td><td>Fisher Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa Ovation, 12-kanałowa, 0,5 - 20uL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0020</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa Ovation, 12-kanałowa, 5-250uL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0250</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowe końcówki do pipet 25 i mu; </td><td>l VistaLab Technologies</td><td>4060-1002</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowe 12-kanałowe końcówki do pipet 250 &mu; l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-9025</td><td></td></tr><tr><td>Guava easyCyte 5HT Stacjonarny cytometr przepływowy</td><td>EMD Millipore</td><td>0500-4005</td><td></td></tr><tr><td>NIH Kolekcje kliniczne 1 i 2 biblioteki małych cząsteczek</td><td>Evotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Do przygotowania pożywki z nerwowych komórek macierzystych (500 ml)</td><td></td><td></td><td>Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBio.com</td><td>A-421-250</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>DMEM/F12 10X</td><td>Corning</td><td>90-091-PB</td><td>1X</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>0,0002%</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4036</td><td>5,4 mM</td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen (ITS -G) (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>41400-045</td><td>1X</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td>14,5 mM</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) 100X</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1X</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td>16 nM</td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5780</td><td>4.8 & mikro; M</td></tr><tr><td>Basic FGF (FGF2), Human</td><td>GoldBio</td><td>1140-02-50</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF, Human</td><td>GoldBio</td><td>1150-04-100</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Filtr butelkowy, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>Służy do filtrowania mediów sterylizacyjnych</td></tr></tbody></table>

system badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym i najbardziej śmiertelnym pierwotnym nowotworem mózgu u dorosłych, powodującym około 14 000 zgonów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych. Mediana przeżycia po rozpoznaniu wynosi mniej niż 15 miesięcy przy maksymalnej resekcji chirurgicznej, radioterapii i chemioterapii temozolomidem. Wyzwania związane z opracowywaniem skuteczniejszych metod leczenia GBM stają się coraz bardziej oczywiste i obejmują jego nieustępliwą inwazyjność, oporność na standardowe leczenie, złożoność genetyczną i zdolność adaptacji molekularnej oraz subpopulacje komórek GBM o fenotypowych podobieństwach do normalnych komórek macierzystych, zwanych tutaj komórkami macierzystymi glejaka (GSC). Ponieważ GSC są niezbędne do wzrostu i progresji guza, terapia oparta na różnicowaniu stanowi realną metodę leczenia tych nieuleczalnych nowotworów. 
Poniższy protokół opisuje zbiór procedur mających na celu stworzenie wysokoprzepustowej platformy przesiewowej, mającej na celu identyfikację małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju GSC. Sercem systemu jest reporterowy konstrukt różnicowania fibrylarnego białka fibrylarnego gleju (GFAP). Protokół zawiera następujące procedury ogólne: 1) ustanowienie linii raportujących zróżnicowanie SGR; 2) badanie/walidacja znaczenia osoby zgłaszającej dla samoodnawiania się/zdolności klonogennej Sekretariatu Generalnego; oraz (3) badania przesiewowe leków oparte na cytometrii przepływowej o dużej pojemności. 
Platforma przesiewowa zapewnia proste i niedrogie podejście do identyfikacji małych cząsteczek, które sprzyjają różnicowaniu GSC. Co więcej, wykorzystanie bibliotek leków zatwierdzonych przez FDA ma potencjał do identyfikacji środków, które mogą być szybciej ponownie wykorzystane. Oczekuje się również, że terapie, które promują różnicowanie rakowych komórek macierzystych, będą działać synergistycznie z obecnymi terapiami "standardowej opieki", które, jak wykazano, są ukierunkowane i eliminują przede wszystkim bardziej zróżnicowane komórki rakowe.

Trzy niezależne linie neurosfer pochodzące od pacjentów zostały transdukowane lentiwirusem z reporterem astroglialnym kodującym białko fluorescencyjne zielone (GFP) połączone w jednej ramce odczytu z kasetą oporności na Zeocin i sterowane przez element promotora ludzkiego GFAP (Rycina 1). Następnie wyizolowano poszczególne klony poprzez wysianie 0,7 komórki na studzienkę w płytce 96-dołkowej (Rycina 2), po czym przeprowadzono pom...

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przesiewanie bibliotek małych cząsteczek w poszukiwaniu czynników promujących różnicowanie astroglialne w macierzystych komórkach glejaka wielopostaciowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad macierzystymi komórkami nowotworowymi, takie jak określenie szlaków sygnalizacyjnych niezbędnych do utrzymania macierzystych komórek glejaka wielopostaciowego w stanie nieróżnicowania. Prawidłowe wykonanie tej techniki pozwala na bezpośrednią identyfikację małych cząsteczek, które promują różnicowanie macierzystych komórek glejaka wielopostaciowego.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię glejaka wielopostaciowego w zespole Ehlersa-Danlosa, ponieważ zmniejszenie odsetka komórek macierzystych glejaka może obniżyć prawdopodobieństwo nawrotu. Metodę tę można również zastosować do badania różnicowania w inne linie komórkowe przy użyciu innych konstruktów reporterowych. Nasz raport jest pierwszym, który ustanawia wysokoprzepustowe podejście do przesiewania czynników wymuszających różnicowanie komórek macierzystych glejaka.Praca z cząsteczkami lentiwirusów w komórkach nowotworowych pochodzących od pacjentów może

flow-cytometry-based-drug-screening-system-for-identification-small

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie barwnika fluorescencyjnego estru succinimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) do identyfikacji i separacji różnych subpopulacji komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym na podstawie częstotliwości podziałów komórkowych.

Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym z wykorzystaniem karboksyfluoresceiny w postaci estru sukcynimidylowego (CFSE)

W tym filmie opisujemy metodę podkreślającą użyteczność testu bioluminescencyjnego do czułych i szybkich badań przesiewowych leków. Leki te mogą być testowane samodzielnie lub w połączeniu w celu oceny synergizmu w ich sposobie działania.

Test oparty na bioluminescencji komórkowej: wysokoprzepustowa metoda kombinatorycznych badań przesiewowych leków

Ten film demonstruje technikę generowania linii reporterowej komórek macierzystych glejaka w celu identyfikacji różnicowania komórek macierzystych glejaka (GSC) w astroglej. Przedstawiono w nim etapy związane z wysiewaniem GSC, transdukcją ich za pomocą lentiwirusa kodującego GFP i określaniem ekspresji reporterowej GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Lentiwirusowy transkrypcyjny system reporterowy do generowania linii reporterowej różnicowania komórek macierzystych glejaka

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Komórki macierzyste glejaka (GSC) to niewielka część komórek nowotworowych, które odgrywają kluczową rolę w inicjacji nowotworu, angiogenezie i oporności na leki w glejaku (GBM), najbardziej rozpowszechnionym i wyniszczającym pierwotnym guzie mózgu. Obecność GSC sprawia, że GBM jest bardzo oporny na większość pojedynczych leków docelowych, dlatego potrzebne są wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych w celu zidentyfikowania potencjalnie skutecznych terapii skojarzonych. Protokół opisuje...

Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj metodę przesiewową opartą na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek promujących różnicowanie astroglialne komórek macierzystych glejaka. Technika ta umożliwia badanie szlaków sygnałowych utrzymujących GSC w stanie nieróżnicowanym.

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka (Wideo) | JoVE Journal

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Przeglądaj więcej filmów