System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka
January 10th, 2018
Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.
Ogólnym celem tej procedury jest badanie przesiewowe bibliotek małych cząsteczek pod kątem czynników promujących różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworowych komórek macierzystych, takie jak to, jakie są szlaki sygnałowe, które są wymagane do utrzymania komórek macierzystych glejaka w stanie niezróżnicowanym. Prawidłowe wykonanie tej techniki pozwala na prostą identyfikację małych cząsteczek, które sprzyjają różnicowaniu komórek macierzystych glejaka.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię glejaka Ehlersa-Danlosa, ponieważ zmniejszenie odsetka komórek macierzystych glejaka może zmniejszyć prawdopodobieństwo nawrotu. Metoda ta może być również stosowana do ustawiania różnicowania w innych liniach komórkowych przy użyciu innych konstruktów reporterowych. Nasz raport jest pierwszym, w którym ustanowiono wysokoprzepustowe podejście do badań przesiewowych w poszukiwaniu czynników, które zmuszają komórki macierzyste glejaka do różnicowania.
Praca z cząsteczkami lentiwirusa w komórkach nowotworowych pochodzących od pacjentów może być niezwykle niebezpieczna. Dlatego zawsze należy postępować zgodnie ze standardową procedurą pracy z patogenami przenoszonymi przez krew. Na początek wysiew milion komórek macierzystych glejaka lub GSC w dwóch mililitrach kompletnego podłoża do wzrostu nerwowych komórek macierzystych na sześciodołkowej płytce.
Następnie transdukuj komórki za pomocą reportera lentiwirusa przy wielokrotności infekcji równej pięciu. Do mieszaniny komórek i wirusów dodaj dwa mikrolitry polibrenu tak, aby końcowe stężenie wynosiło osiem mikrogramów na mililitr i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez noc. Po inkubacji należy wymienić pożywkę wzrostową, aby usunąć niezwiązanego wirusa.
I odwirować komórki pod ciśnieniem 360 razy G przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać pożywkę i umieścić komórki z powrotem w sześciodołkowej płytce. I kontynuuj inkubację komórek przez 24 godziny.
Zbierz 0,5 mililitra całkowitej objętości kultury. Komórki osadu przez wirowanie w temperaturze 360 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zawieś komórki w 0,5 mililitra świeżej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych.
Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić rozszerzanie się przez co najmniej 72 godziny. Dodać 200 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego i inkubować przez pięć minut w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Dysocjuj komórki, delikatnie pipiąc w górę iw dół.
Do zdysocjowanych komórek dodaj 800 mikrolitrów HBSS, aby zapewnić minimalne przyłączanie lub agregację komórek. Następnie przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny każdej komórki do studzienek 96-dołkowej płytki. Określić procent komórek wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej.
Rejestruj co najmniej 10 000 żywotnych komórek w każdym akwizycie. We wszystkich analizach cytometrii przepływowej należy użyć macierzystych komórek nietransdukcyjnych lub komórek niefluorescencyjnych transdukowanych wektorem w celu ustalenia fluorescencji wyjściowej. Aby wybrać i namnażać poszczególne subklony, komórki nasienne o gęstości 0,7 komórki na studzienkę w 100 mikrolitrach pożywki z nerwowych komórek macierzystych na 96-dołkowej płytce.
Utrzymuj te klony w kulturze przez 11 dni. Zwróć uwagę na neurosfery o średnicy większej niż 100 mikronów. Wcześniej ustaliliśmy tę wielkość odcięcia, aby retrospektywnie określić, czy neuorsfera została poprowadzona przez samoodnawiającą się komórkę macierzystą glejaka.
Ten rozmiar odcięcia może wymagać optymalizacji podczas pracy z różnymi modelami komórek glejaka. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr FITC i zaznacz studzienki zawierające pojedynczą neurosferę, w której około 1% do 5% komórek jest GFP-dodatnich. Po znakowaniu rozmnośnij poszczególne klony, aż dostępna będzie wystarczająca liczba komórek do analizy cytometrii przepływowej.
Zakładając, że klony reporterowe zawierają od 1% do 5% komórek GFP-dodatnich, zbierz 0,5 mililitra z każdego klonu wraz z równą ilością nietransdukowanych komórek kontrolnych, aby określić dokładny procent komórek GFP-dodatnich. Po zagnieżdżeniu komórek w temperaturze 360 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant. Dodaj 200 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego do każdej osadki i inkubuj probówki w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.
Po inkubacji należy rozcierać komórki około 20 do 30 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie dodaj 800 mikrolitrów HBSS, aby zapewnić minimalne przyłączanie lub agregację komórek. Teraz przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny każdej komórki do studzienek z 96-dołkową płytką.
Na koniec wykonaj cytometrię przepływową, rejestrując co najmniej 10 000 żywotnych komórek w każdym akwizycie. Aby ocenić zdolność klonogenną, należy przygotować zawiesiny pojedynczych komórek subklonów reporterowych różnicowania, dzieląc komórki około 20 do 30 razy. Następnie umieść te komórki w 100 mikrolitrach kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych o gęstości około pięciu do 500 komórek na studzienkę na 96-dołkowych płytkach.
Utrzymuj te komórki w hodowli przez dziewięć do 11 dni. Szukaj neurosfer pod mikroskopem świetlnym. Studnia zawierająca co najmniej jedną dużą neurosferę jest uważana za pozytywną.
Biorąc pod uwagę rodzicielskie komórki nietransdukowane i komórki transdukowane lentiwirusem GFP-dodatnim jako dane kontrolne, dane wejściowe całkowitej analizowanych studzienek i liczby komórek dodatnich na interfejsie internetowym ELDA. Aby rozpocząć badania przesiewowe, umieść 5000 komórek w 99 mikrolitrach kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych na 96-dołkowej płytce. Następnie za pomocą 12-kanałowego pipetora potraktuj komórki dwumikromolowym końcowym stężeniem rozcieńczonych związków bibliotecznych lub kontrolą DMSO.
Inkubować komórki przez 72 godziny. Teraz dodaj 150 mikrolitrów odczynnika do dysocjacji komórek za pomocą 12-kanałowego pipetora do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie delikatnie rozcieraj komórki w każdym dołku około 20 do 30 razy za pomocą 12-kanałowego pipetora, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
Teraz wykonaj cytometrię przepływową i określ procent komórek wyrażających reporter GFAP:GFP. Najpierw określ rozmiar i żywotność komórki z rozproszenia do przodu i z boku, a następnie bramkuje żywotną populację komórek. Następnie określ komórki GFP-dodatnie w żywotnej populacji komórek.
Wzrost odsetka komórek z dodatnim wynikiem GFP o trzy odchylenia standardowe w stosunku do kontroli uważa się za dodatnie trafienie, które można dostosować w celu dostosowania do preferencji użytkownika co do rygorystyczności. Pokazano reprezentatywne obrazy subklonów GSC HSR-GBM1 wyrażających niskie i wysokie poziomy GFAP:GFP. Subklony dodatnie pod względem ekspresji GFAP: GFP zostały wybrane za pomocą cytometrii przepływowej dla linii neurosfery pochodzącej od pacjenta.
W tym przypadku niski GFAP:GFP wskazuje, że mniej niż 5% komórek w klonie jest GFP-dodatnich, podczas gdy wysoki GFAP:GFP wskazuje, że więcej niż 75% komórek w klonie jest GFP-dodatnich. Wyniki te pokazują, że zdolność subklonów o niskiej zawartości GFAP do samoodnawiania się in vitro jest wyższa niż ich odpowiedników o wysokiej GFAP, jak określono przez ELDA. Dlatego subklony GH są bardziej zróżnicowane niż subklony GL.
Na koniec biblioteki leków poddano badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania czynników zdolnych do indukowania różnicowania astrogleju w GSC. Stwierdzono, że 12 leków znacznie zwiększa odsetek komórek wykazujących ekspresję reportera GFAP:GFP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak test alamarBlue, test klonogenny w pożywce półstałej, wstrzyknięcie ksenografu bocznego lub wewnątrzczaszkowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ selektywnych leków na proliferację komórkową i klonogenność in vitro oraz rakotwórczość in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować związki zdolne do indukowania różnicowania astrogleju w komórkach macierzystych glejaka.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół przesiewający do identyfikacji małych cząsteczek, które wspierają różnicowanie astroglialne w komórkach macierzystych glioblastoma (GSC). Metoda wykorzystuje reporter różnicowania komórek macierzystych, gdzie ekspresja ulepszonego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promoter GFAP.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia nowotworowa
- Badania nad komórkami macierzystymi
Tło
- Komórki macierzyste glioblastoma (GSC) są kluczowe w rozumieniu nawrotu glioblastoma.
- Identyfikowanie szlaków, które utrzymują GSC w stanie niesprecyzowane jest istotne.
- Różnicowanie astroglialne może zmniejszać populacje GSC.
- To badanie wprowadza metodę przesiewającą o wysokiej wydajności dla czynników różnicujących.
Cel badania
- Przesiewanie bibliotek małych cząsteczek w poszukiwaniu czynników promujących różnicowanie astroglialne w GSC.
- Zbadanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w utrzymanie GSC.
- Zapewnienie metody stosowanej do innych linii komórkowych z wykorzystaniem różnych konstrukcji reporterów.
Zastosowane metody
- Przesiewanie o wysokiej wydajności bibliotek małych cząsteczek.
- Wykorzystanie systemu reportera różnicowania komórek macierzystych.
- Ocena ekspresji eGFP napędzanej przez ludzki promoter GFAP.
- Analiza efektów różnicowania na komórkach macierzystych glioblastoma.
Główne wyniki
- Identyfikacja małych cząsteczek, które skutecznie wspierają różnicowanie astroglialne.
- Wgląd w szlaki sygnałowe wymagane dla utrzymania GSC.
- Potencjalne implikacje terapeutyczne dla zmniejszenia nawrotu glioblastoma.
- Ustanowienie nowego podejścia do przesiewającego badania o wysokiej wydajności.
Wnioski
- Opracowany protokół jest skuteczny w przesiewaniu czynników promujących różnicowanie.
- Wyniki mogą przyczynić się do strategii terapeutycznych przeciwko glioblastoma.
- Ta metoda może być zaadaptowana do innych badań nad różnicowaniem.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This flow cytometry-based screening system enables biopharma R&D to identify small molecules that promote differentiation of glioblastoma stem cells, addressing a key mechanism of tumor recurrence. By quantifying astroglial differentiation via GFAP:GFP reporter expression, the platform provides predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for oncology pipelines. The approach supports lead identification and portfolio triage through scalable, reproducible assays compatible with FDA-approved drug library screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking small molecule treatment to astroglial differentiation in patient-derived GSCs.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative flow cytometry readouts of GFP-positive cells.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying compounds that reduce stemness and self-renewal capacity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a high-throughput flow cytometry platform for screening compound libraries with Z'-factor compatible metrics.
- Quantitative Output: Measures percentage of GFP-positive cells as a direct readout of differentiation efficacy.
- Scalability: Compatible with 96-well format and 12-channel pipetting for screening thousands of compounds.
- Reporter Flexibility: GFAP:GFP construct can be substituted with other lineage-specific promoters for broad target validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human glioblastoma stem cell biology using patient-derived neurospheres.
- Translational Continuity: Differentiation phenotype aligns with astroglial maturation, a clinically relevant endpoint.
- Preclinical De-risking: Identifies compounds that reduce clonogenic potential, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: GFAP expression serves as a translational biomarker for astroglial commitment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, enabling phenotypic screening of differentiation-inducing agents in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of signaling pathways governing GSC maintenance via small molecule perturbation.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through flow cytometry gating and viability controls.
- Analytics: Enables quantitative comparison of compound effects using GFP-positive cell percentages and statistical hit calling (3 SD over control).
- Translational Research: Connects to preclinical validation by identifying agents that reduce tumorigenic potential in stem cell-enriched populations.
- Enterprise Reuse: Platform is adaptable to other cancer stem cell models and differentiation endpoints via reporter exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into differentiation pathways and reduces ambiguity in stem cell-targeted mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized transduction, selection, and flow cytometry protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by prioritizing compounds with differentiation activity over cytotoxic effects alone.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying differentiation inducers that may synergize with standard-of-care therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, flow cytometry, and neural stem cell culture.
- Dependent on flow cytometer with FITC detection and 96-well plate automation compatibility.
- Necessitates standardization of reporter validation and clonogenic assays across cell lines.
- Adaptation to other models may require optimization of neurosphere size cutoffs and differentiation thresholds.
- Practical limitations include variability in primary GSC cultures and need for careful viability gating.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Generation of Lentiviral Transcriptional Reporter Cell Lines
3:47
Subclone Selection, Expansion, and Validation
4:47
Determination of GFAP:GFP Expression by Flow Cytometry
5:58
ELDA Self-renewal Assay to Assess Clonogenic Capacity
7:01
Drug Screen
8:27
Results: Selection and Drug Screening of Glioblastoma Stem Cell Subclones
9:46
Conclusion
