Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila
20 października 2017
Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.
Ogólnym celem tej techniki jest wizualizacja morfologii pojedynczych komórek w złożonych tkankach anatomicznych, upraszczając w ten sposób badanie interakcji komórek u Drosophila. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące złożonych morfologii i interakcji komórek komórkowych z wykorzystaniem muszki owocowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować do badania morfologii pojedynczych komórek w dowolnej tkance i na dowolnym etapie rozwoju.
Procedurę zademonstruje Anja Kieser, technik z naszego laboratorium. Technika MCFO modyfikuje standardową technikę FlpOut w następujący sposób. Rekombinaza FLP szoku cieplnego i różne reportery pozostają pod kontrolą UAS, jednak każdy reporter ma wspólny szkielet w postaci mirystoylowanego superfolderu GFP, do którego wstawiono kopie znacznika epitopu.
Powstałe w ten sposób niefluorescencyjne białka nazywane są GFP spaghetti monster i są identyfikowane z przeciwciałami. W zależności od liczby wycięć ulega ekspresji różna kombinacja epitopów. Ponieważ promotor HSP jest lekko aktywny w temperaturze 25 stopni Celsjusza, ustaw krzyżówki w temperaturze 18 stopni Celsjusza, gdzie jest naprawdę nieaktywny.
Następnie poczekaj około 20 dni, aby uzyskać generację F1. Posortuj samice i samce F1 do oddzielnych fiolek. Aby je zszokować termicznie, najpierw przenieś je do fiolek ze świeżą żywnością, gdy mają od trzech do czterech dni.
Młodsze muchy mogą być zbyt delikatne na szok cieplny. Następnie przenieść fiolki do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zanurz je głęboko, aby zapewnić jednorodny szok cieplny.
W przypadku rzadkiego znakowania komórek glejowych zacznij od pięciu do ośmiu minut szoku cieplnego, a następnie zoptymalizuj. Optymalny czas szoku cieplnego będzie słabo oznaczał komórki docelowe, a jego zależność zależy od konkretnego używanego sterownika GAL4. Po szoku cieplnym połóż fiolki poziomo na ławce na kilka minut, aby je schłodzić.
Teraz zacznij utrzymywać muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza w tych samych fiolkach. Po dwóch dniach wyraz twarzy reportera będzie optymalny, a muchy będzie można wypreparować. W ramach przygotowań umieść na lodzie trzy studnie głębinowe.
Napełnij jedną studzienkę 70% etanolem, jedną PBS, a trzecią pożywką do hodowli komórkowych S2. Następnie załaduj trzycentymetrową miskę preparacyjną wyłożoną czarnym silikonem zimnym S2. Przeprowadź całe rozbiory w S2, aby utrzymać zdrowe tkanki. Teraz znieczul muchy dwutlenkiem węgla.
Następnie za pomocą kleszczy lub pióra umieść muchy w zimnym 70% etanolu na około 30 sekund, a następnie w zimnym PBS na około 30 sekund, a następnie przenieś je do zimnego S2. W ten sposób umyj wszystkie muchy, które mają zostać wycięte. Zwykle wystarczy do 10 much jednego genotypu. Teraz, w ciągu 30 minut, wypreparuj wszystkie mózgi.
Najpierw odłącz głowę od reszty ciała i wyrzuć ciało. Trzymaj głowę wolną ręką przez cały okres sekcji, w przeciwnym razie bardzo trudno będzie ją odzyskać. Następnie wyciągnij jedno oko, chwytając tkankę tylko tuż pod siatkówką.
Następnie odciągnij drugie oko i w ten sposób odsłoń mózg i otaczające tkanki. Następnie usuń całą tkankę tchawicy i pozostały naskórek wokół mózgu, aż tkanka mózgowa będzie wyglądać na czystą. Cała tkanka tchawicy musi zostać usunięta, aby uzyskać optymalne wyniki barwienia.
To wszystko, co jest potrzebne, aby przygotować mózg do fiksacji. Kontynuuj sekcję wszystkich mózgów, trzymając wypreparowane mózgi w zimnym S2. Postaraj się przygotować do 10 mózgów na probówkę mikrowirówki, aby uzyskać optymalne barwienie. Przenieś izolowane mózgi za pomocą końcówki pipety P10 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów z roztworem utrwalającym.
Nigdy nie dotykaj mózgu za pomocą kleszczy. Inkubować tkanki chronione przed światłem. Unikaj zasysania mózgu podczas przenoszenia roztworu.
Aby usunąć utrwalacz, użyj trzech lub więcej 15-minutowych myć roztworem myjącym. Następnie zablokuj tkanki roztworem blokującym na 30 minut lub dłużej. Następnie zastąp roztwór blokujący pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze płuczącym i inkubuj mózgi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aby usunąć przeciwciała pierwszorzędowe, należy użyć trzech godzinnych płukań w roztworze do mycia. Następnie dodaj wtórne przeciwciała sprzężone z fluoroforem w roztworze do płukania i inkubuj mózgi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Aby całkowicie zmyć niezwiązane przeciwciała, należy użyć trzech godzinnych płukań w roztworze do mycia, a następnie dłuższego płukania PBS.
Następnie zamontuj mózgi. Przygotuj dwa szkiełka nakrywkowe z przekładką do wyobraźni. W przekładce i na dodatkowe szkiełko nakrywkowe nanieść 10 mikrolitrów podłoża montażowego ze środkiem zapobiegającym blaknięciu.
Następnie, za pomocą pipety P10, przenieś mózgi na szkiełko nakrywkowe, umieszczając je obok pożywki wraz z odrobiną PBS. Nie pozwól, aby chusteczka wyschła. Teraz ostrożnie przenieś mózgi do podłoża montażowego za pomocą pipety, a na koniec przenieś je do podłoża w przekładce i ułóż je za pomocą kleszczy.
Następnie usuń samoprzylepną wkładkę z przekładek i przymocuj szkiełko nakrywkowe. Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe, lekko dociskując za pomocą kleszczy i natychmiast przystąp do obrazowania lub przechowuj szkiełka w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszej analizy. Korzystając z opisanych metod, trzy różne reportery znakowane błoną są utrzymywane w milczeniu przez terminatory transkrypcji otoczone miejscami FRT.
Kiedy zwierzęta zostały poddane szokowi cieplnemu, rekombinaza FLP uległa ekspresji i losowo usunięto terminatory, co doprowadziło do ekspresji różnych kombinacji reporterów. Ogólnie rzecz biorąc, różne kombinacje reporterów zapewniają siedem różnych kolorów, dzięki czemu wiele morfologii pojedynczych komórek może być wizualizowanych i badanych indywidualnie. Za pomocą EG-GAL4 i ALG-GAL4 przetestowano różne czasy szoku cieplnego.
Znakowanie pojedynczych komórek analizowano w obszarze płata antenowego mózgu. Sterownik EG-GAL4 ulega ekspresji w otaczających komórkach glejowych, które wszystkie są osłonięte na powierzchni płata antenowego. Dla porównania, glej podobny do astrocytów, na który celował ALG-GAL4, obejmował głównie nienakładające się na siebie obszary płata czułkowego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać pojedyncze komórki w roztworze. W celu zrozumienia ich złożonych i anatomicznych relacji z wykorzystaniem Drosophila i w zasadzie oraz w organizmie modelowym, w którym można zastosować system binarny GAL4 UIS. Próbując tej procedury po raz pierwszy, ważne jest, aby pamiętać najpierw o optymalizacji czasu szoku cieplnego i przestrzeganiu w jak największym stopniu poszczególnych kroków protokołu barwienia w celu uzyskania najlepszych rezultatów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę wizualizacji morfologii pojedynczych komórek oraz badania oddziaływań międzykomórkowych u Drosophila z wykorzystaniem systemu ekspresji Gal4/UAS. Technika ta upraszcza badanie złożonych tkanek anatomicznych i może być dostosowana do różnych tkanek oraz etapów rozwoju.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
Wstęp
- Komórki wykazują różnorodne morfologie i oddziaływania.
- Zrozumienie tych oddziaływań jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- System Gal4/UAS jest wszechstronnym narzędziem do badań nad ekspresją genów.
- Drosophila służy jako skuteczny organizm modelowy dla takich badań.
Cel badania
- W celu wizualizacji morfologii pojedynczych komórek w złożonych tkankach.
- W celu zbadania oddziaływań międzykomórkowych w kontekście rozwojowym.
- W celu adaptacji metody do różnych tkanek i etapów rozwoju.
Zastosowane metody
- Technika MCFO modyfikuje technikę FlpOut.
- Wykorzystuje rekombinazę FLP indukowaną szokiem termicznym oraz reportery kontrolowane przez UAS.
- Wykorzystuje mirystoilowany superfolder GFP z tagami epitopowymi.
- Zdemonstrowane przez technika laboratoryjnego.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja morfologii pojedynczych komórek.
- Głębsze zrozumienie oddziaływań międzykomórkowych.
- Adaptowalność techniki w odniesieniu do różnych tkanek.
- Potencjał zastosowania na różnych etapach rozwoju.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na zgłębienie złożonych oddziaływań komórkowych.
- Można ją szeroko stosować w badaniach z zakresu biologii rozwoju.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę w celu głębszego zrozumienia zjawisk.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie morfologii komórek glejowych i wzorców ich oddziaływań in vivo jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka związanego z hipotezami dotyczącymi celów neurobiologicznych oraz dla właściwego doboru modeli przedklinicznych. Technika MultiColor FlpOut (MCFO) umożliwia wysokorozdzielcze znakowanie pojedynczych komórek w złożonych tkankach, co wspiera mechanistyczną weryfikację ryzyk poprzez wyjaśnienie architektury komórkowej i relacji przestrzennych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w procesach walidacji celów w ramach programów odkryć w dziedzinie neuronauk.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę morfologii i organizacji przestrzennej podtypów gleju w celu weryfikacji hipotez dotyczących celów badawczych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji architektury pojedynczych komórek w nienaruszonej tkance nerwowej.
Przesiewy i opracowywanie analiz
- Wartość naukowa: Generuje ilościowo rozróżnialne znaczniki pojedynczych komórek do przesiewu morfologicznego i mapowania interakcji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia uzyskanie zestandaryzowanego, rzadkiego znakowania kompatybilnego z odczytami analiz opartych na obrazowaniu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób, umożliwiając szczegółowe fenotypowanie gleju w modelach Drosophila służących do badania funkcji neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przejście od oceny morfologicznej na etapie odkryć do przepływów pracy w walidacji przedklinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika MCFO integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając opartą na hipotezach ocenę struktury i oddziaływań komórek glejowych, co pozwala na dobór celów terapeutycznych i weryfikację istotności modelu przed etapami identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez wysokorozdzielczą wizualizację morfologii gleju i wzorców przestrzennych in vivo.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowane, rzadkie znakowanie pojedynczych komórek w celu obrazowego przesiewania fenotypowego architektury gleju.
- Analityka: Generuje wielokolorowe odczyty, które pozwalają na ilościowe porównanie kształtu komórek, ich terytoriów oraz wzorców interakcji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy dane morfologiczne z etapu odkryć z modelami przedklinicznymi poprzez ustalenie punktów odniesienia dla fenotypu gleju.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi wielokrotnego użytku platformę znakowania, którą można zastosować w różnych tkankach neuronalnych i stadiach rozwojowych Drosophila.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów glejowych poprzez bezpośrednią wizualizację morfologii i interakcji pojedynczych komórek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki kontrolowanej indukcji szokiem termicznym oraz optymalizacji rzadkiego znakowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, zapewniając pewność morfologiczną w kwestii istotności celu i wierności modelu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów glejowych z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zwalidowanych fenotypów strukturalnych i przestrzennych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu genetyki Drosophila, systemów GAL4/UAS oraz protokołów indukcji rekombinazy Flp za pomocą szoku termicznego.
- Zależne od dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej oraz detekcji opartej na przeciwciałach dla reporterów z tagami epitopowymi (HA, FLAG, V5).
- Wymaga optymalizacji czasu trwania szoku termicznego w celu uzyskania rzadkiego znakowania dla konkretnych driverów GAL4.
- Obejmuje ustandaryzowane procedury dysekcji, fiksacji i immunostainingu w celu zachowania integralności tkanki i jakości sygnału.
- Ograniczone do detekcji tagów epitopowych zamiast fluorescencji na żywo, co wymaga przetwarzania utrwalonych tkanek oraz etapów immunostainingu.
