Name: Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj technikę MultiColor FlpOut do wizualizacji morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych w Drosophila. Metoda MCFO umożliwia badanie złożonych tkanek na różnych etapach rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Arnimowi Jenettowi, Aljoscha Nernowi i innym członkom laboratorium Rubin za porady i podzielenie się niepublikowanymi odczynnikami, a także zespołowi projektowemu Janelia Fly Light za generowanie obrazów konfokalnych. Autorzy dziękują również członkom laboratorium galijskiego za uwagi do manuskryptu.

1. Przygotowanie much do eksperymentów MultiColor FlpOut (MCFO)
UWAGA: Technika MCFO odnosi się do zmodyfikowanej wersji tak zwanego wycięcia kasety zatrzymania za pośrednictwem Flp (FlpOut). Transgeniczne muchy MCFO przenoszą promotor szoku cieplnego (hsp)-rekombinazę Flp i różne reportery pod kontrolą UAS. Każdy reporter składa się ze wspólnego szkieletu mirystoylowanego (myr) super folderowego białka zielonej fluorescencji (sfGFP), do którego wstawiono 10 kopii znacznika epitopu (np. HA, FLAG lub V5). Powstałe w ten sposób niefluorescencyjne białka noszą nazwę "spaghetti monster GFPs" (smGFPs)14 i mogą być wykryte za pomocą specyficznych przeciwciał przeciwko różnym znacznikom epitopów.
<ol>
	<li>Przelatuje krzyżowo z kasetą MCFO i hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) do odpowiednich linii sterujących glejowych GAL4 (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Ponieważ hsp jest już aktywny w temperaturze 25 °C i niewiele komórek może ulegać rekombinacji prowadzącej do niespecyficznego znakowania, należy ustawić krzyżówki w temperaturze 18 °C, aby uniknąć nieszczelności systemu. Odczekać około 20 dni w temperaturze 18 °C, aby uzyskać generację F1. Po szoku cieplnym (patrz krok 2) utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Szok cieplny
UWAGA: W zależności od miejsca wprowadzenia, wydajność hsp-Flp może się różnić; dlatego optymalny czas szoku cieplnego musi być zoptymalizowany. Do tego protokołu wykorzystano stado muchowe MCFO, w którym hsp-Flp został wprowadzony na chromosomie X (patrz tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przenieść potomstwo krzyżówki w kroku 1.1 (muchy pokolenia F1, w wieku 3-4 dni) do nowych fiolek zawierających pokarm i poddać je szokowi termicznemu w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. 
	UWAGA: Młode muchy (1-2 dniowe) są bardzo wrażliwe na szok cieplny. Odczekaj jeszcze 1 lub 2 dni przed wykonaniem szoku cieplnego, aby zmniejszyć śmiertelność spowodowaną leczeniem. Użyj niektórych much generacji F1 jako kontroli, bez szoku cieplnego.</li>
	<li>Podczas szoku cieplnego utrzymuj muchy w normalnych fiolkach z jedzeniem, aby zmniejszyć śmiertelność wywołaną stresem. Umieścić samice i samce w oddzielnych fiolkach.</li>
	<li>Upewnij się, że zanurzyłeś całą fiolkę w wodzie, aby zapewnić jednorodny szok cieplny. Użyj 5-8-minutowego wstrząsu jako odpowiedniego punktu wyjścia do rzadkiego znakowania komórek glejowych wieloma liniami sterownika GAL4; Czas trwania wstrząsu musi być zoptymalizowany dla każdego kierowcy i eksperymentu (może być konieczne krótsze lub dłuższe czasy szoku cieplnego).</li>
	<li>Po szoku cieplnym połóż fiolki poziomo na ławce na kilka minut, aby muchy mogły dojść do siebie po szoku cieplnym. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby wymiany fiolek.</li>
	<li>Utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C i poddaj je sekcji (patrz krok 3 i 4) 2 lub więcej dni po szoku cieplnym, aby uzyskać optymalną ekspresję reportera.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i roztwory do rozbioru
<ol>
	<li>W dniu sekcji należy przygotować świeży roztwór utrwalający w probówkach PCR o pojemności 200 μl, mieszając 180 μl pożywki do hodowli komórek S2 z 20 μl 20% paraformaldehydu (PFA) w celu uzyskania 2% roztworu PFA. Roztwór utrwalający należy utrzymywać na lodzie przed i w trakcie preparacji. 
	Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. 
	UWAGA: Wymieszaj 160 μl pożywki do hodowli komórkowych S2 z 40 μl 20% paraformaldehydu (PFA) w probówce PCR o pojemności 200 μl, aby przygotować 4% roztwór PFA zamiast 2% roztworu.</li>
	<li>Użyj jednej probówki PCR na genotyp z maksymalnie 8-10 mózgami na probówkę, aby uzyskać optymalne wyniki barwienia.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do płukania mózgu dla dorosłych: 0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,5% Triton X-100 w PBS. 
	UWAGA: W zależności od barwienia może być potrzebny roztwór zawierający 1% Triton X-100. Wyższe stężenie Triton X-100 zwiększa przenikanie przeciwciała do tkanki i konieczne jest barwienie obszarów leżących głęboko w tkance (np. regionów synaptycznych w mózgu dorosłego Drosophila).</li>
	<li>Przygotuj roztwór blokujący: 3% normalnej surowicy koziej, 3% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 w PBS.</li>
	<li>Roztwór do przemywania mózgu dla dorosłych i roztwór blokujący mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Umieść szklaną płytkę studni głębinowej na lodzie i napełnij każdą studzienkę następującymi roztworami: jedną z 70% etanolem, jedną z PBS i jedną z pożywką do hodowli komórek S2.</li>
</ol>
4. Sekcja mózgu dorosłego
<ol>
	<li>Umieść 3-centymetrową naczynie preparacyjne na stoliku mikroskopu stereoskopowego i napełnij je zimnym podłożem do hodowli komórek S2. Przeprowadzić wszystkie sekcje w tym podłożu, aby upewnić się, że tkanka pozostaje zdrowa podczas procedury preparacji. 
	UWAGA: Użyj naczynia preparacyjnego wyłożonego kilkoma milimetrami czarnego silikonu, który zapewnia dobry kontrast tła (na zdjęciach) i zachowaj kleszcze podczas sekcji.</li>
	<li>Znieczulić muchy o pożądanym genotypie za pomocą CO2.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć muchę za skrzydła i umyj ją w zimnym 70% etanolu przez 30 s, a następnie zimnym PBS przez dodatkowe 30 sekund.</li>
	<li>Przenieś muchę do głębokiego zagłębienia, które jest wypełnione pożywką do hodowli komórek S2.</li>
	<li>Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich much o tym samym genotypie i utrzymuj je w zimnej pożywce do hodowli komórek S2 aż do rozwarstwienia, co pozwoli zachować tkankę. 
	UWAGA: Znieczulaj tylko taką liczbę much, jaką można wyciąć w czasie około 30 minut. Długi czas inkubacji w pożywce do hodowli komórek S2 może uszkodzić tkankę.</li>
	<li>Chwyć muchę kleszczami i pod mikroskopem stereoskopowym zanurz muchę w pożywce do hodowli komórek S2.</li>
	<li>Odłącz głowę od reszty ciała. Wyrzuć ciało i trzymaj głowę zanurzoną w pożywce do hodowli komórek S2. Niezwykle ważne jest, aby przez cały czas trwania sekcji trzymać głowę kleszczami. Jeśli głowa zacznie unosić się na wodzie, trudno będzie ją odzyskać bez uszkodzenia tkanki.</li>
	<li>Rozpocznij sekcję od wyciągnięcia jednego oka, cały czas trzymając głowę co najmniej jednym kleszczem. Upewnij się, że końcówka kleszczyków znajduje się tuż pod siatkówką, aby uniknąć uszkodzenia tkanki pod spodem. Wyciągnij drugie oko i zacznij usuwać naskórek, aż pojawi się mózg.</li>
	<li>Usuń całą tkankę tchawicy i naskórek wokół mózgu, aż tkanka będzie wyglądać na czystą. Upewnij się, że usunąłeś całą tkankę tchawicy wokół mózgu, aby uzyskać optymalne wyniki barwienia; Tkanki są teraz gotowe do utrwalenia i wybarwienia.</li>
	<li>Utrzymuj wszystkie wypreparowane mózgi w zimnej pożywce do hodowli komórek S2 przed przeniesieniem ich do roztworu PFA, aby określić czas etapu utrwalania.</li>
</ol>
5. Barwienie mózgu u dorosłych
<ol>
	<li>Przenieś izolowany mózg za pomocą pipety P10 do roztworu PFA w temperaturze pokojowej (RT). Aby uniknąć uszkodzenia tkanek, nigdy nie używaj kleszczy do przenoszenia mózgu po sekcji. Wykonaj wszystkie kroki w probówkach PCR o pojemności 200 μl na nutatorze.</li>
	<li>Na wszystkich etapach, przed wyrzuceniem starego roztworu za pomocą pipety P200, pozwól mózgom osiąść na dnie probówki. Spróbuj usunąć supernatant bez zasysania tkanki. Chroń tkankę przed ekspozycją na światło.</li>
	<li>Utrwal mózgi w 200 μl 2% PFA w pożywce do hodowli komórek S2 przez 1 godzinę lub w 4% PFA przez 30 minut. Utrzymuj identyczne czasy utrwalania między próbkami w celu zwiększenia odtwarzalności.</li>
	<li>Po 3 (lub więcej) płukaniach po 15 minut każde w 200 μl roztworu do przemywania mózgu osoby dorosłej, zablokuj tkanki 200 μl roztworu blokującego na 30 minut. Możliwe są dłuższe czasy inkubacji w roztworze blokującym.</li>
	<li>Inkubować mózgi przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze do przemywania mózgu dla dorosłych w całkowitej objętości 200 μl. 
	UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od rodzaju użytego przeciwciała. Mogą być konieczne dłuższe inkubacje.
	<ol>
		<li>W celu znakowania trzech markerów MCFO należy inkubować mózgi z przeciwciałami pierwszorzędowymi anty-HA (1:500), anty-FLAG (epitop DYKDDDDK) (1:100) i anty-V5.</li>
		<li>Pierwszorzędowe przeciwciała bezpośrednio sprzężone mogą być stosowane zamiast normalnej kombinacji pierwszorzędowej + drugorzędowej (np. anty-V5:DyLight 549 (1:200)). W takim przypadku należy traktować przeciwciała bezpośrednio sprzężone jako przeciwciała drugorzędowe. 
		UWAGA: Dla każdego genotypu zachowaj kilka mózgów jako kontrolę, aby zweryfikować specyficzność barwienia. Pomiń inkubację przeciwciał pierwotnych i przejdź bezpośrednio do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć tkanki 3 razy przez 1 godzinę w 200 μl roztworu do przemywania mózgu dla dorosłych (krok 3.3) i inkubować je z drugorzędowymi koniugatami fluoroforowymi/pierwotnymi przeciwciałami bezpośrednio sprzężonymi, rozcieńczonymi w roztworze do przemywania mózgu dla dorosłych przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, w całkowitej objętości 200 μl 
	UWAGA: Przykłady odpowiednich przeciwciał: AlexaFluor 488 (1:250), przeciwciała sprzężone anty-V5:DyLight 549 (1:200) i DyLight 647 (1:100).</li>
	<li>Umyć mózgi 3 razy przez 1 godzinę w 200 μl roztworu do przemywania mózgu dla dorosłych, a następnie przepłukać końcowe w 200 μl PBS przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej; ostatni etap płukania w PBS usuwa wszelkie ślady Triton X-100 i jest niezbędny do uzyskania optymalnych wyników barwienia. Zamontuj mózgi w podłożu montażowym za pomocą środka zapobiegającego blaknięciu na szklanych szkiełkach nakrywkowych.</li>
</ol>
6. Montaż mózgów do obrazowania
<ol>
	<li>Przytnij przekładkę obrazową do odpowiedniego rozmiaru za pomocą nożyczek. W przypadku mikroskopii o wysokiej rozdzielczości umieść próbkę i przekładkę obrazową między dwoma szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. 
	UWAGA: Przekładki obrazowe to cienkie (0,12 mm grubości) samoprzylepne przekładki, które odklejają się i przyklejają do szklanych szkiełek nakrywkowych lub szkiełek mikroskopowych, umożliwiając mocowanie próbek bez kompresji.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków usuń samoprzylepną wyściółkę z jednej powierzchni i nałóż przekładkę klejem do dołu na powierzchnię szklanego szkiełka nakrywkowego (22 mm x 60 mm). Nanieść 10 μl podłoża mocującego na nowe szklane szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Za pomocą pipety P10 przenieś mózgi z probówki o pojemności 200 μl do szkiełka nakrywkowego, obok kropli podłoża mocującego. Wraz z tkankami przenieś trochę PBS, aby utrzymać mózg w roztworze.</li>
	<li>Za pomocą pipety P10 przenieś mózgi z PBS do kropli podłoża mocującego, próbując ograniczyć ilość PBS. Przenieść próbki w podłożu montażowym na szkiełko nakrywkowe za pomocą przekładki obrazowej. Użyj wystarczającej ilości nośnika montażowego, aby przykryć próbkę.</li>
	<li>Usuń drugą wkładkę samoprzylepną z górnej strony przekładki i dodaj szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbek. Końcówką kleszczy delikatnie dociśnij obszar kleju, aby uszczelnić. Natychmiast zobrazuj zamontowane tkanki lub przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.</li>
</ol>
7. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Uzyskaj stosy konfokalnych obrazów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40X (NA = 1,2, zanurzenie w wodzie) lub obiektywem 63X (NA = 1,4, zanurzenie w oleju) (rozmiary pikseli = 1,024 x 1,024 w płaszczyźnie xy; Odległość między dwoma sekcjami konfokalnymi = 0,5 μm). Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie detektora w każdym kanale w taki sposób, aby na obrazach nie było nasyconych pikseli i zerowych wartości pikseli; Pozwala to uniknąć utraty informacji i zapewnia wykorzystanie pełnego zakresu dynamiki detektora. 
	UWAGA: Ponieważ obrazowanie 3D jest czasochłonne, pomiary można zautomatyzować, skanując wiele próbek równolegle w różnych lokalizacjach. Aby uniknąć parowania z obiektywem zanurzeniowym w wodzie, należy użyć specjalnego medium immersyjnego z olejem o współczynniku załamania światła n = 1,33.</li>
	<li>Przetwarzaj stosy konfokalne w celu uzyskania projekcji o maksymalnej gęstości, zmian odcienia kanału oraz regulacji jasności i kontrastu za pomocą dowolnego standardowego oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li>
<li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+in+neuroscience%3A+Architects+in+neural+circuit+design%3A+Glia+control+neuron+numbers+and+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity.</a> J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).</li>
<li>Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+neuron-glia+interactions+and+cell+number+adjustments+in+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly.</a> Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).</li>
<li>Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brain+development+and+homeostasis+by+local+and+systemic+insulin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes+Metab%22%5BJournal%5D)">Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling.</a> Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133 (3), 498-509 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-glia+interaction+in+the+insect+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuron-glia interaction in the insect nervous system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).</li>
<li>Oland, L. A., Tolbert, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+interactions+between+neurons+and+glial+cells+during+neural+development+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects.</a> Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).</li>
<li>Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-glia+interactions+through+the+Heartless+FGF+receptor+signaling+pathway+mediate+morphogenesis+of+Drosophila+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes.</a> Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).</li>
<li>Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A+Neuroethol+Sens+Neural+Behav+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glia in Drosophila behavior.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+site-specific+recombinases+for+use+in+manipulating+animal+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).</li>
<li>Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+probes+for+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance probes for light and electron microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Brainbow%3A+A+recombinase-based+fluorescence+labeling+technique+to+subdivide+neural+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.</a> Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).</li>
<li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flybow%3A+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li>
<li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych lub sprzecznych interesów.

Protokół ten opisuje łatwą i skuteczną metodę badania morfologii różnych typów komórek w tkance będącej przedmiotem zainteresowania w wysokiej rozdzielczości. W technice MCFO wiele reporterów z różnymi znacznikami epitopów jest używanych w połączeniu do wielokolorowego etykietowania stochastycznego (ryc. 2). Podobnie jak w przypadku innych metod, takich jak Brainbow/Flybow 15,16,17, MCFO zwiększa różnorodność etykiet poprzez koekspresję markerów, umożliwiając wizualizację granic komórkowych ...

Gleja, nieneuronalna populacja komórek układu nerwowego (NS), długo uważano, że stanowi statyczną strukturę dla neuronów i dlatego nie była szczegółowo badana. Jednak u ludzi glej stanowi zdecydowaną większość komórek w NS (~90%) i dzieli się na kilka różnych kategorii, w tym astrocyty, oligodendrocyty, mikroglej i komórki Schwanna. U Drosophila komórki glejowe stanowią około 10% komórek NS. Co ciekawe, ich morfologie i funkcje są niezwykle podobne do tych występujących u kręgowców1,2. Ich morfologia obejmuje barierę krew-mózg (BBB) tworzącą nabłonek, osłonę i komórki podobne do astrocytów.
Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) Drosophila składa się z następujących głównych struktur: regionów kory zawierających ciała komórek nerwowych; neuropils, które zawierają połączenia synaptyczne; małych i dużych aksonów, które łączą różne neuropile; nerwów obwodowych, które łączą narządy zmysłów i mięśnie z OUN (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Glej jest związany ze wszystkimi tymi strukturami anatomicznymi: glej kory mózgowej (CG) w regionach korowych, glej podobny do astrocytów (ALG) i glej pochewkowy (EG) w regionach neuropile, glej poszywający jest również związany z centralnymi drogami aksonowymi i nerwami obwodowymi (EGN), a na koniec dwa gleje przypominające arkusze, glej okołonerwowy (PG) i pachwinowy (SPG), które razem tworzą ciągłą warstwę pokrywającą cały NS (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).
Poprzednie badania wykazały, że glej odgrywa ważną rolę w rozwoju NS; monitorują liczbę komórek neuronalnych poprzez reakcję na krążące systemowo peptydy insulinopodobne, zapewniają troficzne wsparcie neuronom, takim jak astrocyta-neuron mleczan wahadłowy, i eliminują umierające neurony przez fagocytozę3,4,5,6. W dojrzałym NS glej utrzymuje barierę krew-mózg, pobiera neuroprzekaźniki i utrzymuje homeostazę jonową, działa jako główne komórki odpornościowe w NS, ponieważ makrofagi nie mogą naruszyć bariery krew-mózg i modulują aktywność synaptyczną, a także zachowanie zwierząt6,7,8,9,10,11.
Czy różne podtypy gleju pełnią wyspecjalizowane funkcje, pozostaje ważnym otwartym pytaniem. Jednak systematyczna analiza całego genomu gleju, zwłaszcza u osób dorosłych, jest utrudniona przez brak odpowiednich narzędzi genetycznych do manipulacji nimi. W tym artykule przedstawiono metodę, która pozwala na wydajną i łatwą charakterystykę kształtów komórek w celu badania złożonych interakcji komórka-komórka. Technika ta została zastosowana do scharakteryzowania morfologii różnych podtypów glejowych w mózgu dorosłego Drosophila, ale w zależności od konkretnego zastosowanego sterownika GAL4 można ją dostosować do badania neuronów12,13, dowolnego rodzaju mieszających się komórek i w zasadzie dowolnej tkanki w dowolnym stadium rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie preparacyjne 30 mm x 12 mmm</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70543-30</td><td>Szklana naczynie preparacyjne</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Szklana płyta punktowa z depresją</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Szklane płytki preparacyjne</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>domowej roboty z węgla drzewnego</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych ExpressFive S2</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20%</td><td>Mikroskopia elektronowa PFA Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Królik HA-tag</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>C29F4</td><td>Przeciwciało pierwotne, rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Flaga szczura - tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Mysz V5-tag: DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Sprzężony przeciwciało, rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>anty-królik AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>anty-szczur DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Skontaktuj się z firmą w celu zamówienia</td></tr><tr><td>Szkło nasadkowe mikroskopu 22 X 60 mm</td> Szkło osłonowe <td>mikroskopu Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr> Mikroskop stereoskopowy <tr><td>Roth</td><td>H874</td><td></td><td>22 x 22 mm</td></tr>, <tr><td>konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td> Leica MZ6 <td></td> LSM710 Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Immersol Zeiss 518 F <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Olejek immersyjny do mikroskopii fluorescencyjnej, bezhalogenowy</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Płyn zanurzeniowy do obiektywów zanurzeniowych w wodzie, bezhalogenowy</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>Sterownik GAL4</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Sterownik</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bloomington Stock Center 45914 GAL4hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAGA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>Reporter UAS (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fidżi (Zdjęcie J)</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Oprogramowanie do automatycznego skanowania</td></tr></tbody></table>

zastosowanie techniki multicolor flpout do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u drosophila

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Komórki wykazują różne morfologie i skomplikowane relacje anatomiczne. Jak komórki oddziałują ze swoimi sąsiadami? Czy interakcje różnią się między typami komórek, czy nawet w obrębie danego typu? Jakimi regułami przestrzennymi się kierują? Odpowiedzi na tak fundamentalne pytania in vivo były do tej pory utrudnione ze względu na brak narzędzi do znakowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości. Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół celowania w pojedyncze komórki za pomocą techniki MultiColor FlpOut (MCFO). Ta metoda opiera się na trzech różnie oznaczonych reporterach (HA, FLAG i V5) pod kontrolą UAS, które są milczące przez terminator transkrypcji otoczony przez dwa miejsca FRT (FRT-stop-FRT). Impuls szoku cieplnego indukuje ekspresję rekombinazy Flp wywołanej szokiem cieplnym, która losowo usuwa kasety FRT-stop-FRT w poszczególnych komórkach: ekspresja występuje tylko w komórkach, które również wyrażają sterownik GAL4. Prowadzi to do powstania tablicy różnokolorowych komórek danego typu komórki, która umożliwia wizualizację morfologii poszczególnych komórek w wysokiej rozdzielczości. Na przykład technikę MCFO można połączyć ze specyficznymi czynnikami glejowymi GAL4 w celu wizualizacji morfologii różnych podtypów glejowych w mózgu dorosłego Drosophila.

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać stosując technikę MCFO w mózgu dorosłej Drosophila. Rysunek 3 przedstawia schemat tej metody. Trzy różne reportery znakowane błonowo (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG oraz myr-smGFP-V5) pod kontrolą UAS są wyciszone przez terminator transkrypcyjny flankowany dwoma miejscami FRT (FRT-stop-FRT). Impuls szoku termicznego indukuje ekspresję rekombinazy Flp, która w sposób loso...

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Ogólnym celem tej techniki jest wizualizacja morfologii pojedynczych komórek w złożonych tkankach anatomicznych, co upraszcza badanie interakcji międzykomórkowych u Drosophila. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące złożonej morfologii i interakcji międzykomórkowych z wykorzystaniem muszki owocówki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej dostosowania do badania morfologii pojedynczych komórek w dowolnej tkance i na dowolnym etapie rozwoju.Procedurę zaprezentuje Anja Kieser, technik w naszym laboratorium. Technika MCFO modyfikuje standardową technikę FlpOut w następujący sposób. Rekombinaza FLP indukowana szokiem termicznym oraz różne reportery pozostają pod kontrolą UAS, jednak każdy reporter posiada wspólny szkielet myristylowanego superfolder GFP, w który wstawiono kopie znacznika epitopowego.Powstałe białka niefluorescencyjne nazywa się spaghetti monster GFP i są one identyfikowane za pomocą przeciwciał. W zależności od liczby wycięć ekspresjonowana jest inna kombinacja epitopów. Ponieważ promotor HSP wykazuje niewielką aktywność w temperaturze 25°C, należy przeprowadzić krzyżówki w temperaturze 18°C, w której jest on całkowicie nieakty

application-multicolor-flpout-technique-to-study-high-resolution

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne transgenicznego mózgu Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych. Mózg wykazuje ekspresję białek ukierunkowanych na błonę, połączonych z różnymi kombinacjami epitopów antygenowych pod kontrolą specyficznego dla gleju systemu rekombinazy. Wyizolowane i utrwalone mózgi są barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla epitopów antygenowych, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem.

Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Poznaj technikę MultiColor FlpOut do wizualizacji morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych w Drosophila. Metoda MCFO umożliwia badanie złożonych tkanek na różnych etapach rozwoju.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów