Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila
October 20th, 2017
Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.
Ogólnym celem tej techniki jest wizualizacja morfologii pojedynczych komórek w złożonych tkankach anatomicznych, upraszczając w ten sposób badanie interakcji komórek u Drosophila. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące złożonych morfologii i interakcji komórek komórkowych z wykorzystaniem muszki owocowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować do badania morfologii pojedynczych komórek w dowolnej tkance i na dowolnym etapie rozwoju.
Procedurę zademonstruje Anja Kieser, technik z naszego laboratorium. Technika MCFO modyfikuje standardową technikę FlpOut w następujący sposób. Rekombinaza FLP szoku cieplnego i różne reportery pozostają pod kontrolą UAS, jednak każdy reporter ma wspólny szkielet w postaci mirystoylowanego superfolderu GFP, do którego wstawiono kopie znacznika epitopu.
Powstałe w ten sposób niefluorescencyjne białka nazywane są GFP spaghetti monster i są identyfikowane z przeciwciałami. W zależności od liczby wycięć ulega ekspresji różna kombinacja epitopów. Ponieważ promotor HSP jest lekko aktywny w temperaturze 25 stopni Celsjusza, ustaw krzyżówki w temperaturze 18 stopni Celsjusza, gdzie jest naprawdę nieaktywny.
Następnie poczekaj około 20 dni, aby uzyskać generację F1. Posortuj samice i samce F1 do oddzielnych fiolek. Aby je zszokować termicznie, najpierw przenieś je do fiolek ze świeżą żywnością, gdy mają od trzech do czterech dni.
Młodsze muchy mogą być zbyt delikatne na szok cieplny. Następnie przenieść fiolki do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zanurz je głęboko, aby zapewnić jednorodny szok cieplny.
W przypadku rzadkiego znakowania komórek glejowych zacznij od pięciu do ośmiu minut szoku cieplnego, a następnie zoptymalizuj. Optymalny czas szoku cieplnego będzie słabo oznaczał komórki docelowe, a jego zależność zależy od konkretnego używanego sterownika GAL4. Po szoku cieplnym połóż fiolki poziomo na ławce na kilka minut, aby je schłodzić.
Teraz zacznij utrzymywać muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza w tych samych fiolkach. Po dwóch dniach wyraz twarzy reportera będzie optymalny, a muchy będzie można wypreparować. W ramach przygotowań umieść na lodzie trzy studnie głębinowe.
Napełnij jedną studzienkę 70% etanolem, jedną PBS, a trzecią pożywką do hodowli komórkowych S2. Następnie załaduj trzycentymetrową miskę preparacyjną wyłożoną czarnym silikonem zimnym S2. Przeprowadź całe rozbiory w S2, aby utrzymać zdrowe tkanki. Teraz znieczul muchy dwutlenkiem węgla.
Następnie za pomocą kleszczy lub pióra umieść muchy w zimnym 70% etanolu na około 30 sekund, a następnie w zimnym PBS na około 30 sekund, a następnie przenieś je do zimnego S2. W ten sposób umyj wszystkie muchy, które mają zostać wycięte. Zwykle wystarczy do 10 much jednego genotypu. Teraz, w ciągu 30 minut, wypreparuj wszystkie mózgi.
Najpierw odłącz głowę od reszty ciała i wyrzuć ciało. Trzymaj głowę wolną ręką przez cały okres sekcji, w przeciwnym razie bardzo trudno będzie ją odzyskać. Następnie wyciągnij jedno oko, chwytając tkankę tylko tuż pod siatkówką.
Następnie odciągnij drugie oko i w ten sposób odsłoń mózg i otaczające tkanki. Następnie usuń całą tkankę tchawicy i pozostały naskórek wokół mózgu, aż tkanka mózgowa będzie wyglądać na czystą. Cała tkanka tchawicy musi zostać usunięta, aby uzyskać optymalne wyniki barwienia.
To wszystko, co jest potrzebne, aby przygotować mózg do fiksacji. Kontynuuj sekcję wszystkich mózgów, trzymając wypreparowane mózgi w zimnym S2. Postaraj się przygotować do 10 mózgów na probówkę mikrowirówki, aby uzyskać optymalne barwienie. Przenieś izolowane mózgi za pomocą końcówki pipety P10 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów z roztworem utrwalającym.
Nigdy nie dotykaj mózgu za pomocą kleszczy. Inkubować tkanki chronione przed światłem. Unikaj zasysania mózgu podczas przenoszenia roztworu.
Aby usunąć utrwalacz, użyj trzech lub więcej 15-minutowych myć roztworem myjącym. Następnie zablokuj tkanki roztworem blokującym na 30 minut lub dłużej. Następnie zastąp roztwór blokujący pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze płuczącym i inkubuj mózgi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aby usunąć przeciwciała pierwszorzędowe, należy użyć trzech godzinnych płukań w roztworze do mycia. Następnie dodaj wtórne przeciwciała sprzężone z fluoroforem w roztworze do płukania i inkubuj mózgi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Aby całkowicie zmyć niezwiązane przeciwciała, należy użyć trzech godzinnych płukań w roztworze do mycia, a następnie dłuższego płukania PBS.
Następnie zamontuj mózgi. Przygotuj dwa szkiełka nakrywkowe z przekładką do wyobraźni. W przekładce i na dodatkowe szkiełko nakrywkowe nanieść 10 mikrolitrów podłoża montażowego ze środkiem zapobiegającym blaknięciu.
Następnie, za pomocą pipety P10, przenieś mózgi na szkiełko nakrywkowe, umieszczając je obok pożywki wraz z odrobiną PBS. Nie pozwól, aby chusteczka wyschła. Teraz ostrożnie przenieś mózgi do podłoża montażowego za pomocą pipety, a na koniec przenieś je do podłoża w przekładce i ułóż je za pomocą kleszczy.
Następnie usuń samoprzylepną wkładkę z przekładek i przymocuj szkiełko nakrywkowe. Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe, lekko dociskując za pomocą kleszczy i natychmiast przystąp do obrazowania lub przechowuj szkiełka w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszej analizy. Korzystając z opisanych metod, trzy różne reportery znakowane błoną są utrzymywane w milczeniu przez terminatory transkrypcji otoczone miejscami FRT.
Kiedy zwierzęta zostały poddane szokowi cieplnemu, rekombinaza FLP uległa ekspresji i losowo usunięto terminatory, co doprowadziło do ekspresji różnych kombinacji reporterów. Ogólnie rzecz biorąc, różne kombinacje reporterów zapewniają siedem różnych kolorów, dzięki czemu wiele morfologii pojedynczych komórek może być wizualizowanych i badanych indywidualnie. Za pomocą EG-GAL4 i ALG-GAL4 przetestowano różne czasy szoku cieplnego.
Znakowanie pojedynczych komórek analizowano w obszarze płata antenowego mózgu. Sterownik EG-GAL4 ulega ekspresji w otaczających komórkach glejowych, które wszystkie są osłonięte na powierzchni płata antenowego. Dla porównania, glej podobny do astrocytów, na który celował ALG-GAL4, obejmował głównie nienakładające się na siebie obszary płata czułkowego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać pojedyncze komórki w roztworze. W celu zrozumienia ich złożonych i anatomicznych relacji z wykorzystaniem Drosophila i w zasadzie oraz w organizmie modelowym, w którym można zastosować system binarny GAL4 UIS. Próbując tej procedury po raz pierwszy, ważne jest, aby pamiętać najpierw o optymalizacji czasu szoku cieplnego i przestrzeganiu w jak największym stopniu poszczególnych kroków protokołu barwienia w celu uzyskania najlepszych rezultatów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wizualizacji morfologii pojedynczych komórek i badania interakcji międzykomórkowych u Drosophila z wykorzystaniem systemu ekspresji Gal4/UAS. Technika ta upraszcza badania złożonych tkanek anatomicznych i może być dostosowana do różnych tkanek i stadiów rozwojowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Tło
- Komórki wykazują różnorodne morfologie i interakcje.
- Rozumienie tych interakcji jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- System Gal4/UAS jest wszechstronnym narzędziem do badań ekspresji genów.
- Drosophila służy jako efektywny organizm modelowy do takich badań.
Cel badania
- Wizualizacja morfologii pojedynczych komórek w złożonych tkankach.
- Badanie interakcji międzykomórkowych w kontekście rozwojowym.
- Dostosowanie metody do różnych tkanek i stadiów.
Stosowane metody
- Technika MCFO modyfikuje technikę FlpOut.
- Wykorzystuje szok cieplny FLP rekombinazę i reportery kontrolowane przez UAS.
- Zastosowanie myrystoylowanego superfolder GFP z epitopem tagów.
- Demonstrowane przez technika laboratoryjnego.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja morfologii pojedynczych komórek.
- Zlepszone zrozumienie interakcji międzykomórkowych.
- Możliwość zastosowania techniki w różnych tkankach.
- Potencjał dla zastosowania w różnych stadiach rozwoju.
Wnioski
- Metoda zapewnia wgląd w złożone interakcje komórkowe.
- Może być szeroko stosowana w badaniach nad biologią rozwoju.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę dla głębszego zrozumienia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding glial cell morphology and interaction patterns in vivo is critical for de-risking neurobiological target hypotheses and informing preclinical model selection. The MultiColor FlpOut (MCFO) technique enables high-resolution single-cell labeling in complex tissues, supporting mechanistic de-risking by clarifying cellular architecture and spatial relationships. This capability enhances predictive confidence in target validation efforts within discovery neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial subtype morphology and spatial organization to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible method for visualizing single-cell architectures in intact neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively distinguishable single-cell labels for morphological screening and interaction mapping.
- Operational Value: Produces standardized, sparse labeling compatible with imaging-based assay readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling detailed glial phenotyping in Drosophila models of neural function.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery morphology assessment to preclinical validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The MCFO technique integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven assessment of glial cell structure and interaction, informing target selection and model relevance prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking through high-resolution visualization of glial morphologies and spatial patterning in vivo.
- Screening: Enables standardized, sparse single-cell labeling for imaging-based phenotypic screening of glial architecture.
- Analytics: Generates multi-color readouts that allow quantitative comparison of cell shape, territory, and interaction patterns across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage morphology data to preclinical models by establishing glial phenotypic benchmarks.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable labeling platform applicable across neural tissues and developmental stages in Drosophila.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in glial target validation through direct visualization of single-cell morphology and interaction.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via controlled heat-shock induction and sparse labeling optimization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing morphological confidence in target relevance and model fidelity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial targets based on validated structural and spatial phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, GAL4/UAS systems, and heat-shock inducible Flp recombinase protocols.
- Dependent on access to fluorescence microscopy and antibody-based detection for epitope-tagged reporters (HA, FLAG, V5).
- Necessitates optimization of heat-shock duration to achieve sparse labeling for specific GAL4 drivers.
- Involves standardized dissection, fixation, and immunostaining workflows to preserve tissue integrity and signal quality.
- Limited to epitope-tag detection rather than live fluorescence, requiring fixed-tissue processing and immunostaining steps.
