Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Ogólnym celem tego protokołu jest wywołanie choroby autoimmunologicznej ośrodkowego układu nerwowego lub OUN poprzez adoptywny transfer limfocytów T specyficznych dla akwaporyny 4 oraz monitorowanie wynikającego z tego wpływu na OUN i dynamiczny układ wzrokowy. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli akwaporyny 4, powszechnie znanej jako AQP4, specyficznych limfocytów T w zapaleniu nerwu wzrokowego, a także innych zapalnych zaburzeniach widzenia. Główną zaletą optycznej koherentnej tomografii jest możliwość wykonywania podłużnego monitorowania uszkodzeń siatkówki w sposób nieinwazyjny.

Procedurę zademonstruje Sharon Sagan, pracownik naukowy w moim laboratorium, a także Andreas Cruz Harans, pracownik naukowy w RE Greens Laboratory. Zacznij od zamocowania trójdrożnego nylonowego kranu z dwoma męskimi złączami Luer lock do szklanej strzykawki Luer lock bez tłoka. Przestaw dźwignię kranu w kierunku strzykawki, aby zamknąć kran i ustawić strzykawkę otwartym końcem skierowanym do góry.

Po wirowaniu dodać do strzykawki objętość peptydu jeden do jednego i roztwór adiuwantowy Complete Freund's Adjuwant, a następnie ponownie włożyć szklany tłok do strzykawki. Trzymając tłok na miejscu, odwrócić strzykawkę tak, aby kran był skierowany do góry, a następnie przełączyć dźwignię na nieużywane złącze żeńskie. Ostrożnie wcisnąć tłok, aby usunąć nadmiar powietrza ze strzykawki.

Roztwór wypełni drugie męskie połączenie Luer lock kurka. Następnie podłączyć drugą szklaną strzykawkę z tłokiem całkowicie włożonym do drugiego męskiego złącza Luer lock. Aby utworzyć emulsję, naprzemiennie naciskać tłoki, aby przepuścić roztwór między dwiema strzykawkami przez około dwie minuty, a następnie schładzać roztwór przez około 10 minut, aż do widocznej zmiany lepkości roztworu.

Gdy utworzy się bardzo sztywna biała emulsja, przenieś cały roztwór do jednej ze strzykawek i zastąp pustą strzykawkę nową jednomilimetrową strzykawką Luer lock. Napełnić nową strzykawkę emulsją. Wyjąć strzykawkę z zaworu odcinającego i założyć igłę o rozmiarze 25G.

Aby przetestować emulsję pod kątem konsystencji, wylej kroplę emulsji do małego naczynia z wodą. Jeśli emulsja nie dyspersjonuje się, nadaje się do wstrzykiwania. Następnie wstrzyknij każdemu dawcy mysz z nokautem AQP4 podskórnie jeden raz w każdą stronę podbrzusza i po każdej stronie ściany klatki piersiowej przyśrodkowo do pachy.

10 do 12 dni po szczepieniu wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry od pachwiny do szyi i w dół każdej nogi pierwszej myszy. Odciągnij skórę od otrzewnej i przymocuj ją mocno do deski. Następnie należy pobrać pachwinowe i pachowe węzły chłonne i umieścić tkanki w sitku do komórek na szalce Petriego zawierającej kompletne podłoże.

Po zebraniu wszystkich węzłów chłonnych umieść sitko do komórek na 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej świeże kompletne podłoże na lodzie i użyj płaskiego końca sterylnego tłoka strzykawki o pojemności pięciu mililitrów, aby przecisnąć komórki węzłów chłonnych przez siatkę filtracyjną. Przepłucz siatkę 20 do 30 mililitrami kompletnego podłoża, aby ułatwić regenerację komórek, a następnie wykonaj dwa płukania wirujące. Po drugim odwirowaniu ponownie zawieś osad w pożywce z komórek T w celu zliczenia.

Dodaj odpowiednie stężenia antygenu, rekombinowanej myszy interleukiny myszy 23 i rekombinowanej myszy IL-6 do komórek i dodaj dwa mililitry komórek na studzienkę w tej mieszaninie polaryzującej Th17 do każdego dołka 12-dołkowej płytki. Następnie umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 na 72 godziny. Trzeciego dnia polaryzacji kilkakrotnie rozcieraj kultury w każdej studzience, aby usunąć spolaryzowane komórki, i zbierz je w 50-mililitrowej stożkowej probówce na lodzie w celu zliczenia.

Po dwóch płukaniach w PBS rozcieńczyć komórki do stężenia jeden razy 10 do ósmych komórek na mililitr w PBS i delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową przez wirowanie. W ciągu godziny od ich pobrania przenieś komórki do jednomililitrowej strzykawki i dostarcz 200 mikrolitrów komórek każdemu zwierzęciu biorcy dożylnie przez żyłę ogonową. Następnie wstrzyknij każdej myszy dootrzewnowo natychmiast, a dwa dni później 200 nanogramów toksyny krztuścowej B rozcieńczonej w 200 mikrolitrach PBS.

W przypadku obrazowania siatkówki in vivo zwierząt biorców za pomocą optycznej koherentnej tomografii, pięć minut przed obrazowaniem rozszerz źrenice jedną kroplą 1% tropikamidu na oko i włącz matę grzewczą. Umieść mysz na cylindrze obrazującym i odpowiednio przekieruj przepływ znieczulenia. Chroń oczy 0,3% hydroksypropylometylocelulozą, aby utrzymać je wilgotne i zapewnić ciągłość refrakcji, a następnie umieść niestandardową soczewkę kontaktową na badanym oku.

Kierując się obrazem dna oka w podczerwieni, skieruj laser na oko pokryte soczewką, uważając, aby wiązka była wyśrodkowana na głowie nerwu wzrokowego. Wykonaj 25 skanów B w trybie wysokiej rozdzielczości i rasteryzuj obrazy z 30 uśrednionych skanów A. Po zobrazowaniu obu oczu wymień soczewkę kontaktową na żel okulistyczny i umieść mysz w ciepłej klatce regeneracyjnej.

Aby przeanalizować uzyskane obrazy za pomocą modułowego oprogramowania do obrazowania do automatycznej segmentacji, najpierw ręcznie skoryguj segmenty odpowiadające wewnętrznej błonie ograniczającej i wewnętrznej warstwie splotowatej, aby reprezentowały granice wewnętrznych warstw siatkówki. Następnie sprawdź, czy warstwy włókien nerwowych siatkówki i komórek zwojowych znajdują się w granicach wewnętrznej warstwy siatkówki i czy nie zachodzą na siebie. Immunizacja podskórna peptydami AQP4, które zawierają patogenne epitopy limfocytów T, wywołuje silne odpowiedzi proliferacyjnych limfocytów T w drenujących węzłach chłonnych myszy z nokautem AQP4 w porównaniu z odpowiedziami dzikich komórek T.

Analizy cytometryczne poszczególnych ekspresji V beta wykazują, że limfocyty T specyficzne dla peptydów AQP4, które zawierają patogenne epitopy komórek T, wykorzystują unikalne repertuary TCR i wykazują selektywną hiperproliferację wskazującą, że odpowiedzi patogennych komórek T na te determinanty są zwykle regulowane przez selekcję grasiczo-ujemną. Około sześć do dziewięciu dni po wstrzyknięciu spolaryzowanych limfocytów T prawie wszystkie myszy biorcy rozwinęły kliniczne objawy choroby autoimmunologicznej OUN, w tym bezwładny ogon i paraliż kończyn tylnych. Z limfocytami T specyficznymi dla AQP4 spolaryzowanymi Th17 wywołującymi cięższą chorobę kliniczną niż limfocyty T specyficzne dla AQP4 spolaryzowane Th1.

Na przykład u tej myszy rozwinął się całkowity paraliż kończyn tylnych po podaniu limfocytów T specyficznych dla peptydu Th17 AQP4. Choroba kliniczna wywołana przez komórki Th17 specyficzne dla peptydu AQP4 jest również związana z infiltracją komórek jednojądrzastych do miąższu OUN i opon mózgowych, a także zapaleniem nerwu wzrokowego, o czym dodatkowo świadczy obrzęk i zwiększona grubość wewnętrznej warstwy siatkówki, która powraca do stanu wyjściowego, gdy myszy wracają do zdrowia po chorobie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować i monitorować autoimmunizację ukierunkowaną na AQP4, co pozwoli na dalsze badania, aby zrozumieć, w jaki sposób limfocyty T uczestniczą w zapaleniu nerwu wzrokowego.