Name: Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę indukcji choroby autoimmunologicznej OUN poprzez transfer limfocytów T specyficznych dla AQP4 u myszy. Technika ta umożliwia badanie roli komórek T w neuromyelitis optica przy użyciu nieniszczącej tomografii optycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie zostało udzielone S.S.Z. przez National Institute of Health (RO1 AI073737 i RO1 NS092835-01), National Multiple Sclerosis Society (RG 4768, RG 5179 i RG 5180), Maisin Foundation i Guthy Jackson Charitable Foundation.

<ol><li>Hardy, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+inflammatory+demyelinating+syndromes+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS.</a> Lancet Neurol. 15 (9), 967-981 (2016).</li>
<li>Lennon, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+autoantibody+marker+of+neuromyelitis+optica%3A+distinction+from+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis.</a> Lancet. 364 (9451), 2106-2112 (2004).</li>
<li>Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+marker+of+optic-spinal+multiple+sclerosis+binds+to+the+aquaporin-4+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel.</a> J Exp Med. 202 (4), 473-477 (2005).</li>
<li>Zamvil, S. S., Slavin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+MOG+Ig-positive+AQP4-seronegative+opticospinal+inflammatory+disease+justify+a+diagnosis+of+NMO+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), 62(2015).</li>
<li>Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+pathogenic+anti-aquaporin-4+antibodies+in+early+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica.</a> Ann Neurol. 66 (5), 617-629 (2009).</li>
<li>Bradl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromyelitis+optica%3A+pathogenicity+of+patient+immunoglobulin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo.</a> Ann Neurol. 66 (5), 630-643 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., Chung, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+development+and+function+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Understanding the development and function of T follicular helper cells.</a> Cell Mol Immunol. 7 (3), 190-197 (2010).</li>
<li>Lucchinetti, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+an+autoimmune+astrocytopathy%3A+lessons+learned+from+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica.</a> Brain Pathol. 24 (1), 83-97 (2014).</li>
<li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4442096/">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Brum, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-DRB+association+in+neuromyelitis+optica+is+different+from+that+observed+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis.</a> Mult Scler. 16 (1), 21-29 (2010).</li>
<li>Varrin-Doyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+4-specific+T+cells+in+neuromyelitis+optica+exhibit+a+Th17+bias+and+recognize+Clostridium+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter.</a> Ann Neurol. 72 (1), 53-64 (2012).</li>
<li>Vaknin-Dembinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+responses+to+distinct+AQP4+peptides+in+patients+with+neuromyelitis+optica+%28NMO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO).</a> Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).</li>
<li>Nelson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T+cell+determinants+of+aquaporin-4%2C+the+autoantigen+associated+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica.</a> PLoS One. 5 (11), 15050(2010).</li>
<li>Kalluri, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+aquaporin-4+specific+T+cells%3A+towards+a+model+for+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica.</a> PLoS One. 6 (1), 16083(2011).</li>
<li>Pohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+T+cell+responses+against+aquaporin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenic T cell responses against aquaporin 4.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 21-34 (2011).</li>
<li>Zeka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+encephalitogenic+aquaporin+4-specific+T+cells+and+NMO-IgG+jointly+orchestrate+lesion+location+and+tissue+damage+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS.</a> Acta Neuropathol. 130 (6), 783-798 (2015).</li>
<li>Sagan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+checkpoint+bypass+permits+emergence+of+pathogenic+T+cells+to+neuromyelitis+optica+autoantigen+aquaporin-4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (51), 14781-14786 (2016).</li>
<li>Vita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+epitope+database+%28IEDB%29+3.0%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The immune epitope database (IEDB) 3.0.</a> Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175907003651">Lymph node mapping in the mouse.</a> J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+retinal+wholemount+preparation+for+imaging+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (82), e51018(2013).</li>
<li>Cruz-Herranz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+APOSTEL+recommendations+for+reporting+quantitative+optical+coherence+tomography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies.</a> Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur J Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Molnarfi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-dependent+B+cell+APC+function+is+required+for+induction+of+CNS+autoimmunity+independent+of+myelin-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies.</a> J Exp Med. 210 (13), 2921-2937 (2013).</li>
<li>Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+aquaporin-4+reactive+T+cells+are+sufficient+to+induce+mouse+model+of+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica.</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 28(2015).</li>
<li>Oertel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+visual+system+changes+in+AQP4-antiboby-seropositive+NMOSD%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Neuroimmunol.+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD.</a> Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72(2017).</li>
<li>Vogel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+prevents+AQP4+directed+autoimmunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice.</a> Eur J Immunol. , (2017).</li>
<li>Zhang, H., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinally+extensive+NMO+spinal+cord+pathology+produced+by+passive+transfer+of+NMO-IgG+in+mice+lacking+complement+inhibitor+CD59%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59.</a> J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).</li>
<li>Zeka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+4-specific+T+cells+and+NMO-IgG+cause+primary+retinal+damage+in+experimental+NMO%2FSD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 82(2016).</li>
<li>Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-independent+retinal+pathology+produced+by+intravitreal+injection+of+neuromyelitis+optica+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 275(2016).</li>
<li>Zamvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+clones+specific+for+myelin+basic+protein+induce+chronic+relapsing+paralysis+and+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination.</a> Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).</li>
<li>Zamvil, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitogenic+T+cell+clones+specific+for+myelin+basic+protein.+An+unusual+bias+in+antigen+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition.</a> J Exp Med. 162 (6), 2107-2124 (1985).</li>
<li>Kuchroo, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-1+and+B7-2+costimulatory+molecules+activate+differentially+the+Th1%2FTh2+developmental+pathways%3A+application+to+autoimmune+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy.</a> Cell. 80 (5), 707-718 (1995).</li>
<li>Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).</li>
</ol>

S.A. Sagan, A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green i R.A. Sobel nie informują o żadnych ujawnieniach. S.S. Zamvil jest zastępcą redaktora naczelnego czasopisma Neurology, Neuroimmunology and Neuroinflammation oraz członkiem rady doradczej Międzynarodowego Towarzystwa Neuroimmunologicznego. Zasiadał w radzie redakcyjnej czasopism Journal of Clinical Investigation, The Journal of Immunology i The Journal of Neurological Sciences, a także był członkiem komitetu ds. przeglądu grantów dla sekcji badawczej National Institutes of Health (NIH) Clinical Neuroimmunology and Brain Tumors (CNBT) oraz National Multiple Sclerosis Society (NMSS). Pełnił funkcję konsultanta i otrzymał honoraria od Biogen-Idec, EMD-Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech i Teva Pharmaceuticals, Inc., a także zasiadał lub zasiada w Radach Monitorujących Bezpieczeństwa Danych w firmach Lilly, BioMS, Teva i Opexa Therapeutics. Obecnie dr Zamvil otrzymuje granty badawcze od NIH, NMSS, The Maisin Foundation, Biogen i Celgene.

AQP4 został zidentyfikowany jako główny cel w NMO IgG w 2005 r.3. Następnie uznano, że ważne będzie ustanowienie ukierunkowanego na AQP4 zwierzęcego modelu autoimmunizacji OUN. Taki model może być przydatny do zbadania, w jaki sposób limfocyty T i B specyficzne dla AQP4 uczestniczą w rozwoju autoimmunizacji OUN oraz do przetestowania potencjalnych środków terapeutycznych dla NMO. Chociaż identyfikacja epitopów limfocytów T specyficznych dla AQP4 u myszy typu dzikiego została po raz pierwszy zgłoszona w 2010 roku13, limfocyty T reagujące na te epitopy nie powodowały choroby klinicznej ani histologicznej14,17. Niemożność wygenerowania modelu autoimmunizacji OUN opartego na reaktywności immunologicznej na AQP4 pozostawała zagadką do 2015 roku, kiedy Jones i wsp.25 odkryło, że limfocyty T AQP4 p135-153 od myszy AQP4-/- były zdolne do wywoływania klinicznych i histologicznych objawów autoimmunizacji OUN u myszy WT. Co ciekawe, przewiduje się, że AQP4 p135-153 wiąże MHC II (I-A b) z wysokim powinowactwem17. Przewiduje się, że tylko jedna inna sekwencja aminokwasów AQP4, 201-220, wiąże I-Ab z podobnie wysokim powinowactwem. Rzeczywiście, zaobserwowaliśmy, że AQP4 p135-153 i p201-220 wywołują silną proliferację u myszy AQP4-/-, ale nie WT. Tutaj pokazaliśmy, w jaki sposób można wyizolować i rozprężyć encefalitogenne limfocyty T reaktywne Th17 AQP4 p135-153- i p201-220 od myszy AQP4-/. Po przeniesieniu do myszy biorcy WT, komórki Th17 reagujące na AQP4 dawcy wywołały paraliż, któremu towarzyszyły nacieki komórek jednojądrzastych w rdzeniu kręgowym i nerwie wzrokowym. Uszkodzenie aferentnego układu wzrokowego jest dobrze znane u pacjentów z AQP4-serododatnim NMOSD26. Tutaj zaobserwowaliśmy, że zapalenie nerwu wzrokowego wywołane przez komórki Th17 reaktywne AQP4 i MOG było wyraźne. Podczas gdy komórki Th17 specyficzne dla AQP4 indukowały zapalenie krocza nerwu wzrokowego, komórki Th17 specyficzne dla MOG indukowały ciężkie zapalenie nerwu wzrokowego. Opisaliśmy również techniki stosowane do monitorowania zapalenia nerwu wzrokowego wywołanego przez limfocyty T specyficzne dla AQP4 i specyficzne dla MOG za pomocą szeregowego OCT. Inni badacze powinni teraz być w stanie zastosować opisane tutaj protokoły, aby posunąć naprzód własne badania skoncentrowane na patogennych mechanizmach ATCA.
W naszym protokole można łatwo uniknąć trzech potencjalnych pułapek. Po pierwsze, adoptywny transfer ATCA wymaga użycia limfocytów T specyficznych dla AQP4 od myszy dawców AQP4-/- . W szczególności limfocyty T specyficzne dla dawcy WT AQP4 p135-153 nie powodowały ATCA u myszy WT biorcy. Po drugie, ważne jest, aby wykonać "test wodny" z kroplą emulsji peptydowej / CFA przed immunizacją myszy AQP4-/- (krok protokołu 1.5). Emulsja nie powinna dyspergować w wodzie, gdy nadaje się do wstrzykiwań s.c. Jeśli emulsja się rozproszy, należy ją ponownie wymieszać, ponownie schłodzić i powtórzyć próbę wodną. Wreszcie, aktywowane limfocyty T specyficzne dla antygenu OUN dawcy indukują autoimmunizację OUN skuteczniej niż limfocyty T w stanie spoczynku. Należy dokonać oględzin tych kultur pod mikroskopem świetlnym przed pobraniem limfocytów T dawcy w celu transferu adoptywnego. Szybko dzielące się komórki mogą tworzyć klastry, które można łatwo zidentyfikować. Ponadto, gdy hodowle zawierają wiele aktywowanych limfocytów T, pożywka może zmienić kolor z różowego na pomarańczowy, a nawet żółty z powodu obniżenia pH. Można również ocenić aktywację limfocytów T węzłów chłonnych AQP4 dawcy do proliferacji przez inkorporację 3H-tymidyny, jak opisano w kroku 3 protokołu.
Nasze odkrycie, że dwa patogenne epitopy limfocytów T AQP4 są (1) przewidywane do wiązania MHC II z wysokim powinowactwem i (2) wywołują silne odpowiedzi proliferacyjne w AQP4 - / -, ale nie u myszy WT, sugeruje, że limfocyty T ukierunkowane na te determinanty są zwykle kontrolowane przez negatywną selekcję grasicy17. Repertuar TCR wykorzystywany do rozpoznawania AQP4 p135-153 i p201-220 u myszy AQP4-/- jest unikalny (Figura 2), co jest również zgodne z delecją klonalną, w której pośredniczą komórki nabłonka rdzeniowego grasicy. Inne mechanizmy tolerogenne mogą normalnie hamować odpowiedź immunologiczną na AQP4. Po naszym wstępnym raporcie17, inna grupa wykazała również, że AQP4 p201-220 zawiera encefalitogenny determinant limfocytów T27. Gdy myszy z niedoborem limfocytów T α/β (TCRα-/-) zostały odtworzone za pomocą limfocytów T AQP4-/- CD4 + , możliwe było wywołanie encefalitogennej odpowiedzi limfocytów T specyficznej dla AQP4, ale nie odpowiedzi humoralnej specyficznej dla AQP4, co oznacza, że u myszy WT odpowiedzi komórek B specyficzne dla AQP4, podobne do odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla AQP4, podlegają selekcji negatywnej. Rzeczywiście, utrata aksonów rdzenia kręgowego i RGC, której nie zaobserwowano u myszy WT z ATCA indukowanym przez same limfocyty T specyficzne dla AQP4, może wymagać udziału patogennych przeciwciał specyficznych dla AQP4. Oczywiste jest, że mysie modele autoimmunizacji OUN ukierunkowanej na AQP4 będą nadal ewoluować, gdy dowiemy się więcej o mechanizmach tolerogennych normalnie kontrolujących odporność limfocytów T i komórek B specyficznych dla AQP4.
Opracowywane są również inne modele autoimmunizacji OUN ukierunkowanej na AQP4 6,16,28,29,30. Każdy z nich może oferować korzyści w badaniu określonych aspektów, które są istotne dla patogenezy NMO. Limfocyty T specyficzne dla AQP4 zostały zidentyfikowane u szczurów WT 6,16,29. Te limfocyty T specyficzne dla AQP4 spowodowały zmiany histologiczne autoimmunizacji OUN, ale, podobnie jak w przypadku obserwacji u myszy, limfocyty T specyficzne dla AQP4 szczura WT nie powodują znaczących objawów klinicznych choroby. Dlatego mechanizmy tolerancji ograniczające odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla limfocytów T i limfocytów B AQP4 u myszy WT działają również u szczurów. Niezależnie od tego, nie należy lekceważyć mocy wykorzystania modeli mysich do badania mechanizmów związanych z patogenezą choroby. Bogactwo myszy nokautujących, transgenicznych i reporterowych może być korzystne. Należy również zauważyć, że kilka fundamentalnych odkryć w zakresie autoimmunizacji zostało dokonanych przy użyciu mysich modeli EAE. Na przykład wykazanie, że klony limfocytów T specyficzne dla własnego antygenu mogą pośredniczyć w chorobie autoimmunologicznej31,32, identyfikacja roli kostymulacji limfocytów T w autoimmunizacji33 i odkrycie szlaku rozwojowego różnicowania Th1734 zostały po raz pierwszy opisane przy użyciu mysich modeli EAE. Korzystając z opracowanego przez nas mysiego modelu ATCA, mamy teraz środki do badania rozwoju i regulacji patogennych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla AQP4 in vivo, co powinno dostarczyć ważnych informacji związanych z patogenezą NMO.

Neuromyelitis optica (NMO) to autoimmunologiczna choroba demielinizacyjna ośrodkowego układu nerwowego (OUN), która powoduje nawracające epizody paraliżu i utraty wzroku prowadzące do trwałej niepełnosprawności neurologicznej1. NMO jest obecnie uważane przede wszystkim za humoralną chorobę autoimmunologiczną2, ponieważ jest związane z przeciwciałami (Igs) skierowanymi przeciwko akwaporynie-4 (AQP4), kanale wodnemu ulegającemu obfitej ekspresji na astrocytach3,4. Jednak zapalenie OUN jest warunkiem wstępnym dla wejścia do OUN AQP4 Ig5,6. W związku z tym nie było możliwe ustalenie modelu NMO poprzez transfer samych Ig anty-AQP4. Odkrycie, że (1) patogenne Ig specyficzne dla AQP4 u pacjentów z NMO to IgG11,2, podklasa Ig zależna od limfocytów T7 (2) limfocyty T są identyfikowane w zmianach NMO8,9 (3) NMO jest związany z niektórymi genami MHC II (np. HLA-DR17 (DRB1*0301))10 i (4) prozapalne komórki Th17 z ograniczeniami DR reaktywnymi AQP4 są ekspandowane u pacjentów z NMO11,12 wskazują, że limfocyty T specyficzne dla AQP4 odgrywają kluczową rolę w patogenezie NMO. Dlatego ważne jest, aby opracować modele zwierzęce, aby określić, w jaki sposób limfocyty T specyficzne dla AQP4 mogą przyczyniać się do patogenezy NMO.
Kilka lat temu u myszy typu dzikiego (WT) zidentyfikowano wiele epitopów limfocytów T AQP413,14 i rats15. Chociaż zaobserwowano, że limfocyty T reagujące na AQP4 mogą indukować zapalenie nerwu wzrokowo-rdzeniowego u naiwnych szczurów biorców15,16, nie zaobserwowano istotnych objawów klinicznych choroby OUN. Podobnie, bezpośrednia immunizacja myszy WT peptydami zawierającymi epitopy limfocytów T AQP4 14,17, lub transfer prozapalnych limfocytów T ukierunkowanych na te determinanty17, nie spowodował objawów klinicznych ani histologicznych dowodów autoimmunizacji OUN.
Ostatnio zaobserwowano, że immunizacja myszy z niedoborem C57BL/6 AQP4 (AQP4-/-) peptydem AQP4 (p) 135-153 lub p201-220, dwoma determinantami, które zgodnie z przewidywaniami wiążą MHC II (I-Ab) o wysokim powinowactwie18, wywołała silne odpowiedzi limfocytów T CD4+17. W przeciwieństwie do tego, te dwa peptydy wywołały tylko umiarkowane odpowiedzi proliferacyjne u myszy WT. Co więcej, repertuar receptora limfocytów T (TCR) używany do rozpoznawania tych determinantów przez limfocyty T z myszy AQP4-/- był wyjątkowy. Podsumowując, odkrycia te wskazują, że rozpoznawanie AQP4 przez limfocyty T jest regulowane przez negatywną selekcję grasicy. Komórki Th17 specyficzne dla AQP4 p135-153 lub p201-220 z myszy dawcy AQP4 /- wywołały paraliż u prawie 100% naiwnych myszy WT biorców; było to związane z naciekami wzrokowo-rdzeniowymi limfocytów T, limfocytów B i monocytów. Seryjna koherentna tomografia wzrokowo-rdzeniowa (OCT) wykazała dynamiczne zajęcie układu wzrokowego. Myszy z autoimmunizacją OUN za pośrednictwem limfocytów T ukierunkowaną na AQP4 (ATCA) wyzdrowiały po paraliżu i urazie układu wzrokowego. W przeciwieństwie do EAE indukowanego przez limfocyty T specyficzne dla p35-55 oligodendrocytów mieliny (MOG), które prowadziło do uporczywej choroby klinicznej, ATCA indukowane przez same limfocyty T nie wiązało się z utratą aksonów lub zmniejszeniem liczby komórek zwojowych siatkówki (RGC). Nasze wyniki wyraźnie wykazały, że istnieje wiele patogennych determinantów limfocytów T AQP4. Ten nowy model ATCA jest przydatny do badania mechanizmów kontrolujących rozwój patogennych limfocytów T specyficznych dla AQP4, uczenia się, w jaki sposób komórki te indukują zapalenie OUN i jak mogą współpracować z komórkami B i przeciwciałami specyficznymi dla AQP4 w celu promowania patogenezy NMO.
W niniejszym raporcie opisujemy protokoły używane do indukowania i oceny ATCA indukowanego przez limfocyty T. Zaczynamy od technik stosowanych do immunizacji, hodowli limfocytów T i polaryzacji Th17 w celu wygenerowania patogennych limfocytów T specyficznych dla AQP4, analizy cytometrii przepływowej w celu potwierdzenia polaryzacji i adoptywnego transferu tych limfocytów T. Następnie opisujemy metody stosowane do oceny choroby klinicznej i histologicznej oraz zastosowanie seryjnego OCT do monitorowania uszkodzenia układu wzrokowego u myszy biorców.

<table><tbody><tr><td>M. tuberculosis H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Dessicated, killed M. tuberculosis</td></tr><tr><td>Incomplete Freund's Adjuwant</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 peptide p135-153</td><td>Genemed</td><td>Niestandardowa</td><td>sekwencja peptydowa syntezy: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>Peptyd AQP4 p201-220</td><td>Genemed</td><td>Niestandardowa</td><td>sekwencja peptydowa syntezy: HLFAINYTGASMNPARSFGP</td></tr><tr><td>Peptyd MOG p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>Niestandardowa</td><td>sekwencja peptydowa syntezy: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr><tr><td>3-kierunkowy kran</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Płodowa surowica bydlęca (scharakteryzowana)</td> <td>GE Opieka zdrowotna Nauki</td><td>biologiczne SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-23</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-6</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rekombinowana IL-12</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>Tymidyna [Metylo-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>Maty filtracyjne z włókna szklanego</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-mysie</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[różne]</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz TCR V&beta; Panel przesiewowy</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Możliwe do naprawienia barwienie martwych komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>[różne]</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16%)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw roztworu do utrwalania/przepuszczalności z GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian-octan 13-mirysianu Phorbol (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Jomomycyna (sól wapniowa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna krztuścowa z B. pertussis</td><td>List Laboratoria biologiczne</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>Piankowe podkładki do biopsji, prostokątne</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (izofluran, USP)</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td></td><td>050033 NDC: 11695-0500-2</td></tr><tr><td>Tropicamid Roztwór okulistyczny, USP (1%)</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC: 17478-102-12</td></tr><tr><td>Platforma obrazowania diagnostycznego Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty t specyficzne dla neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Chociaż uznaje się, że limfocyty T i przeciwciała specyficzne dla akwaporyny-4 (AQP4) uczestniczą w patogenezie zapalenia nerwu wzrokowego (NMO), autoimmunologicznej choroby demielinizacyjnej ludzkiego ośrodkowego układu nerwowego (OUN), stworzenie modelu ukierunkowanego na AQP4 z klinicznymi i histologicznymi objawami autoimmunizacji OUN okazało się wyzwaniem. Immunizacja myszy typu dzikiego (WT) peptydami AQP4 wywołała proliferację limfocytów T, chociaż te limfocyty T nie mogły przenosić choroby na myszy wcześniej biorcze. Niedawno zidentyfikowano dwa nowe epitopy limfocytów T AQP4, peptyd (p) 135-153 i p201-220, podczas badania odpowiedzi immunologicznej na AQP4 u myszy z niedoborem AQP4 (AQP4-/-), co sugeruje, że reaktywność limfocytów T na te epitopy jest zwykle kontrolowana przez selekcję grasiczo-ujemną. AQP4-/- Spolaryzowane limfocyty T Th17 przygotowane do paraliżu wywołanego p135-153 lub p201-220 u myszy WT biorcy, co było związane z głównie zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych rdzenia kręgowego i nerwów wzrokowych. Stan zapalny otaczający nerwy wzrokowe i zajęcie wewnętrznych warstw siatkówki (IRL) objawiały się zmianami w seryjnej optycznej koherentnej tomografii (OCT). W tym miejscu ilustrujemy podejścia zastosowane do stworzenia tego nowego modelu in vivo autoimmunizacji OUN ukierunkowanej na AQP4 (ATCA), który można teraz wykorzystać do badania mechanizmów umożliwiających rozwój patogennych limfocytów T specyficznych dla AQP4 i tego, jak mogą one współpracować z komórkami B w patogenezie NMO.

W niniejszym protokole wykorzystaliśmy limfocyty T od dawców będących myszami C57BL/6 AQP4-/-. Podskórna immunizacja tych myszy peptydami AQP4 p135-153 lub p201-20, które zawierają patogenne epitopy limfocytów T, wywoła silne odpowiedzi proliferacyjne limfocytów T w drenujących węzłach chłonnych (Rysunek 1), podczas gdy dwa te peptydy indukowały znacznie słabszą proliferację limfocytów T u myszy WT. W porównaniu z tym immunizacja peptydem AQP4 p91-10, zawierającym niepatogenny determinant limfocytów T AQP413, lub MOG p35-5, peptydem mieliny aktywującym limfocyty T wywołujące eksperymentalne autoimmunizacyjne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE)2,23,24, indukowała podobną skalę proliferacji limfocytów T u myszy AQP4-/- oraz WT. Analiza wykorzystania TCR za pomocą cytometrii przepływowej z barwieniem poszczególnych łańcuchów Vβ lub rodzin Vβ wykazała, że limfocyty T specyficzne dla p135-153 i p201-20 pochodzące od myszy AQP4-/- wykorzystywały unikalne repertuary TCR. Selektywna hiperproliferacja AQP4 p135-153 i p201-20 u myszy AQP4-/-, a także unikalne wykorzystanie TCR (Rysunek 2), wskazały, że patogenne odpowiedzi limfocytów T na te determinanty są normalnie regulowane przez negatywną selekcję grasicową, co podkreśla znaczenie zastosowania limfocytów T od dawców AQP4-/- w niniejszym protokole.
Przed transferem adoptywnym w celu indukcji ATCA, komórki węzłów chłonnych od myszy uwrażliwionych na peptyd AQP4 hodowano in vitro przez trzy dni w warunkach polaryzacji do Th17 lub Th1. Stopień polaryzacji dawczych limfocytów T CD4+ potwierdzono za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin (ICS) i zmierzono metodą cytometrii przepływowej (Rysunek 3). Naiwnym myszom biorcom wstrzyknięto dożylnie 2 x 107 dawczych limfocytów T specyficznych dla peptydu AQP4. Po około sześciu dniach u niemal 10% myszy biorców rozwinęły się kliniczne objawy autoimmunologicznej choroby OUN, w tym wiotki ogon i paraliż kończyn tylnych (Rysunek 4). Polaryzowane do Th17 limfocyty T specyficzne dla AQP4 indukowały cięższy przebieg kliniczny choroby niż limfocyty T specyficzne dla AQP4 polaryzowane do Th1. Reprezentatywna mysz, która otrzymała limfocyty T specyficzne dla peptydu AQP4 polaryzowane do Th17 i u której rozwinął się całkowity paraliż kończyn tylnych (paraplegia), jest przedstawiona w Filmie 1. W przeciwieństwie do myszy, u których rozwinęło się EAE po podaniu Th17 specyficznych dla MOG, myszy biorcy powróciły do zdrowia po chorobie klinicznej indukowanej przez Th17 specyficzne dla AQP4. Podobnie jak w przypadku EAE indukowanego przez komórki Th17 specyficzne dla MOG p35-5, choroba kliniczna indukowana przez komórki Th17 specyficzne dla AQP4 p135-153 lub p201-20 wiązała się z naciekaniem komórek jednojadrowych w miąższu OUN i oponach (Rysunek 5). W przypadku autoimmunizacji OUN indukowanej przez Th17 specyficzne dla AQP4 zmiany były liczniejsze w oponach niż w miąższu.
Zaangażowanie nerwu wzrokowego wykazano za pomocą oceny histologicznej oraz seryjnych badań OCT. Zarówno komórki Th17 specyficzne dla AQP4, jak i specyficzne dla MOG indukowały stan zapalny nerwu wzrokowego, który charakteryzował się obecnością komórek jednuklearnych. Podczas gdy komórki Th17 specyficzne dla AQP4 wywoływały okołozapalenie nerwu wzrokowego, komórki Th17 specyficzne dla MOG indukowały ciężkie zapalenie nerwu wzrokowego (Rysunek 5). W seryjnych badaniach OCT stan zapalny nerwu wzrokowego był widoczny poprzez obrzęk i zwiększenie grubości wewnętrznej warstwy siatkówki (IRL) w przebiegu choroby klinicznej indukowanej przez komórki Th17 specyficzne dla AQP4 lub MOG (Rysunek 6). W przypadku autoimmunizacji OUN indukowanej przez Th17 specyficzne dla AQP4, grubość IRL powróciła do wartości wyjściowej w miarę zdrowienia myszy z choroby klinicznej. Przeciwstawnie, utrzymywanie się EAE indukowanego przez komórki Th17 specyficzne dla MOG odpowiadało pocienczeniu IRL i, jak wykazaliśmy wcześniej17, wiązało się z utratą komórek zwojowych siatkówki.
<img alt="Wykresy odpowiedzi antygenowej AQP4; proliferacja a antygen; analiza porównawcza; wykres." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1AQP4 p135-153 oraz p201-20 wywołują silną proliferację limfocytów T w AQP4-/- myszy, ale nie myszy WT. Myszy immunizowano podskórnie wskazanymi peptydami w CFA. Po jedenastu dniach usunięto węzły chłonne, a następnie inkubowano je bez antygenu lub z peptydem użytym do immunizacji. Proliferację mierzono za pomocą 3Włączenie H-tymidyny (średnia ± SEM, reprezentatywne dla 5 eksperymentów). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający wykorzystanie Vβ w limfocytach T CD4+ w porównaniu odpowiedzi na peptydy AQP4 i MOG; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Limfocyty T specyficzne dla AQP4 z AQP4-/- myszy wykorzystują unikalne repertuary TCR. AQP4-/- myszy WT zaszczepiono wskazanymi peptydami. Po jedenastu dniach pobrano węzły chłonne i hodowano je z peptydem użytym do immunizacji. Zebrano komórki. Wykorzystanie TCR Vβ analizowano za pomocą cytometrii przepływowej (średnia ± SEM, n = 5). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej produkcji cytokin; IL-17A, IFN-γ przez komórki Th1, Th17 oraz komórki niepolaryzowane." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Prozapalna polaryzacja donorowych limfocytów T specyficznych dla AQP4. Jedenaście dni po immunizacji za pomocą peptydów AQP4 p135-153 lub p201-20 pobrano komórki węzłów chłonnych i hodowano je w obecności peptydów użytych do immunizacji w warunkach niepolaryzujących oraz w warunkach polaryzujących w kierunku Th1 lub Th17. Polaryzację Th17 lub Th1 badano za pomocą ICS i cytometrii przepływowej pod kątem obecności odpowiednio IL-17 lub IFN-γ. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykresy wyników klinicznych dla AQP4 p135-20 w porównaniu z MOG p35-5 po transferze; porównanie Th1 i Th17." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4T komórki specyficzne dla AQP4 spolaryzowane w kierunku Th17 indukują paraliż u myszy biorców typu WT. Myszy biorcy typu WT otrzymały 2 x 107 donorskie limfocyty T zpolaryzowane do fenotypu Th17, swoiste dla p135-153 lub p201-20 białka AQP4 z AQP4-/- myszy. Jako kontrolę dodatnią zastosowano limfocyty T swoiste dla MOG o polaryzacji Th17. Wyniki są reprezentatywne dla 8 eksperymentów (n = 5/grupa). * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0.001. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Histologia rdzenia kręgowego i nerwu wzrokowego; grupa naiwna, AQP4, MOG; porównanie odpowiedzi immunologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5Komórki Th17 specyficzne dla AQP4 indukują zapalenie wzrokowo-rdzeniowe u myszy typu WT. Myszy biorcze otrzymały 2 x 107 komórki Th17 od dawcy, aktywowane AQP4 p135-153 lub p201-20, z AQP4-/- myszy lub komórki specyficzne dla Th17 MOG p35-5 i uśpiono je po 10 dniach. Przygotowano tkanki rdzenia kręgowego i nerwu wzrokowego, a następnie zabarwiono je H&amp;E/LFB w celu oceny odpowiednio oznak stanu zapalnego i demielinizacji. Wyniki są reprezentatywne dla 5 myszy w grupie. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Grubość IRL w zależności od liczby dni po transferze, wykres dla AQP4, MOG, Naive; wyniki analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6Zapalenie nerwu wzrokowego indukowane swoistymi dla AQP4 komórkami Th17 może być monitorowane za pomocą podłużnego badania OCT siatkówki. Myszy biorcy typu WT otrzymały 2 x 107 donora spolaryzowane w kierunku Th17 limfocyty T swoiste dla AQP4 p201-20 lub MOG p35-5 w dniu 0. Badanie przeprowadzono za pomocą OCT w dniu 0 (przed podaniem limfocytów T), a następnie w dniach 4, 7, 8, 9, 10, 1, 14 i 21. Zmierzono grubość IRL (średnia ± SEM). Statystyki wskazują na porównanie z kontrolą naiwną. Wyniki są reprezentatywne dla 3 eksperymentów (5 myszy/grupa). * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0.001. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Tutaj prezentujemy protokół wywoływania paraliżu i zapalenia wzrokowo-rdzeniowego poprzez transfer limfocytów T specyficznych dla akwaporyny-4 (AQP4) z myszy AQP4-/- do myszy WT. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać seryjną optyczną tomografię koherentną do monitorowania dysfunkcji układu wzrokowego.

Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wywołanie autoimmunologicznej choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN) poprzez adoptywny transfer limfocytów T specyficznych dla akwaporyny 4 oraz monitorowanie wynikających z tego efektów w OUN i dynamicznym systemie wizualnym. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli limfocytów T specyficznych dla akwaporyny 4, powszechnie znanej jako AQP4, w neuromyelitis optica, a także w innych zapalnych schorzeniach wzroku. Główną zaletą optycznej koherentnej tomografii jest możliwość nienapastliwego, podłużnego monitorowania uszkodzeń siatkówki.Procedurę zaprezentują Sharon Sagan, pracownik naukowy w moim laboratorium, oraz Andreas Cruz Harans, stażysta w laboratorium RE Greens. W pierwszej kolejności należy przymocować trójdrożny nylonowy kranik z dwoma męskimi złączami Luer lock do szklanej strzykawki z złączem Luer lock, pozbawionej tłoka. Przełączyć dźwignię kranika w stronę strzykawki, aby go zamknąć, a następnie ustawić strzykawkę otwartym końcem do góry.Po wymieszaniu w wstrząsarce wirowej, do strzykawki należy dodać równe objętości peptydy oraz roztworu pełnego adiuwanta Freunda, a następnie ponownie włożyć szklany tłok do strzykawki. Przytrzymując tłok w miejscu, należy odwrócić strzykawkę tak, aby kurek znajdował się u góry, i przełączyć dźwignię na nieużywane przyłącze żeńskie. Należy ostrożnie nacisnąć tłok, aby usunąć nadmiar powietrza ze strzykawki.Roztwór wypełni drugie męskie przyłącze Luer lock kurka. Następnie należy podłączyć drugą szklaną strzykawkę z całkowicie wsuniętym tłokiem do drugiego męskiego przyłącza Luer lock. Aby stworzyć emulsję, należy naprzemiennie naciskać tłoki, przepuszczając roztwór między dwiema strzykawkami przez około dwie minuty, a następnie chłodzić roztwór przez około 10 minut, aż do momentu zauważalnej zmiany lepkości roztworu.Gdy powstanie bardzo gęsta biała emulsja, przenieść cały roztwór do jednej z strzykawek, a pustą strzykawkę zastąpić nową strzykawką 1 mm z końcówką Luer lock. Napełnić nową strzykawkę emulsją. Zdjąć strzykawkę z kurka i przymocować igłę 25G.Aby sprawdzić konsystencję emulsji w wodzie, należy wycisnąć kroplę emulsji do niewielkiego naczynia z wodą. Jeśli emulsja nie rozproszy się, nadaje się ona do wstrzyknięcia. Następnie każdego myszego donora z knockoutem AQP4 należy zaszczepić podskórnie jednorazowo po jednej stronie dolnej części brzucha oraz po jednej stronie klatki piersiowej, przyśrodkowo w obrębie pachy.Od 10 do 12 dni po immunizacji wykonaj nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej od pachwiny do szyi oraz wzdłuż każdej kończyny tylnej pierwszej myszy. Odciągnij skórę od otrzewnej i mocno przymocuj ją do podkładki. Następnie pobierz węzły chłonne pachwinowe i pachowe, a następnie umieść tkanki w sitku do komórek w szalce Petriego zawierającej pożywkę kompletną.Po zebraniu wszystkich węzłów chłonnych umieścić sitko do komórek na probówce stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej świeżą pożywkę kompletną w lodzie, a następnie za pomocą płaskiego końca tłoka sterylnej strzykawki 5-mililitrowej przecisnąć komórki z węzłów chłonnych przez siatkę filtra. Przepłukać siatkę od 20 do 30 ml pożywki kompletnej, aby ułatwić odzysk komórek, a następnie przeprowadzić dwa przemycia poprzez wirowanie. Po drugim wirowaniu zawiesić osad w pożywce dla limfocytów T w celu dokonania odliczenia komórek.Do komórek dodać odpowiednie stężenia antygenu, rekombinowanej mysiej interleukiny 23 oraz rekombinowanego mysiego IL-6, a następnie do każdej studzienki płytki 12-dołkowej nanieść po dwa mililitry komórek w tej mieszaninie polaryzującej Th17. Następnie płytkę umieścić w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na 72 godziny. Trzeciego dnia polaryzacji hodowle w każdej studni kilka razy triturować, aby oderwać spolaryzowane komórki, a następnie zebrać je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml w temperaturze 0 °C w celu ich przeliczenia.Po dwukrotnym przemyciu w PBS, rozcieńcz komórki w PBS do stężenia 1 × 10⁸ komórek/ml i delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, obracając naczynie. W ciągu godziny od ich zebrania przenieś komórki do strzykawki o pojemności 1 ml i podaj 200 µL komórek dożylnie przez żyłę ogonową każdemu zwierzęciu biorcy. Następnie wstrzyknij każdej myszy dootrzewnowo natychmiast oraz dwa dni później 200 ng toksyny B krztuśca rozcieńczonej w 200 µL PBS.W celu obrazowania siatkówki zwierząt biorców in vivo za pomocą optycznej koherentnej tomografii, na pięć minut przed badaniem należy rozszerzyć źrenice, podając jedną kroplę 1% tropikamidu do każdego oka, a następnie włączyć matę grzewczą. Umieść mysz na cylindrze do obrazowania i odpowiednio przekieruj przepływ anestetyka. Oczy należy zabezpieczyć 0,3% hydroksypropylometylocelulozą, aby zachować ich wilgotność oraz zapewnić ciągłość refrakcji, a następnie nałożyć specjalistyczną soczewkę kontaktową na badane oko.Kierując się obrazem dna oka w podczerwieni, skieruj laser na oko z nałożoną soczewką, dbając o to, aby wiązka była wycentrowana na tarczy nerwu wzrokowego. Wykonaj 25 skanów B w trybie wysokiej rozdzielczości, a obrazy zrasteryzuj z 30 uśrednionych skanów A. Po obrazowaniu obu oczu zastąp soczewkę kontaktową żelem oftalmicznym i umieść mysz w ogrzewanej klatce rekonwalescencyjnej.Aby przeanalizować pozyskane obrazy za pomocą modułowego oprogramowania do obrazowania w celu zautomatyzowanej segmentacji, należy najpierw ręcznie skorygować segmenty odpowiadające błonie ograniczającej wewnętrznej oraz warstwie splotowej wewnętrznej, aby reprezentowały one granice wewnętrznych warstw siatkówki. Następnie należy zweryfikować, czy warstwa włókien nerwowych siatkówki oraz warstwa komórek zwojowych znajdują się w granicach wewnętrznej warstwy siatkówki i czy nie nakładają się na siebie. Podskórna immunizacja peptydami AQP4 zawierającymi patogenne epitopy limfocytów T wywołuje silne odpowiedzi proliferacyjne limfocytów T w drenujących węzłach chłonnych myszy z knockoutem AQP4 w porównaniu do odpowiedzi limfocytów T typu dzikiego.Analizy cytometryczne przepływowe ekspresji poszczególnych łańcuchów V beta wykazują, że limfocyty T specyficzne dla peptydów AQP4 zawierających patogenne epitopy limfocytów T wykorzystują unikalne repertuary TCR oraz wykazują selektywną hiperproliferację, co wskazuje, że patogenne odpowiedzi limfocytów T na te determinanty są normalnie regulowane przez tymusową selekcję negatywną. Około sześciu do dziewięciu dni po wstrzyknięciu spolaryzowanych limfocytów T, prawie wszystkie myszy biorcze rozwinęły objawy kliniczne autoimmunizacyjnej choroby OUN, w tym wiotki ogon i paraliż kończyn tylnych. Przy czym limfocyty T specyficzne dla AQP4 spolaryzowane w kierunku Th17 wywoływały cięższy przebieg kliniczny choroby niż limfocyty T specyficzne dla AQP4 spolaryzowane w kierunku Th1.Na przykład u tej myszy rozwinął się całkowity paraliż kończyn tylnych po podaniu specyficznych dla peptydu AQP4 limfocytów T spolaryzowanych do fenotypu Th17. Choroba kliniczna wywołana przez specyficzne dla peptydu AQP4 komórki Th17 wiąże się również z naciekiem komórek jednowypukłych do miąższu OUN i opon mózgowo-rdzeniowych, a także z zapaleniem nerwu wzrokowego, co potwierdza obrzęk i zwiększona grubość wewnętrznej warstwy siatkówki, która powraca do wartości wyjściowych w miarę zdrowienia myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować i monitorować autoimmunizację skierowaną przeciwko AQP4, co umożliwi dalsze badania nad zrozumieniem roli limfocytów T w neuropielogniciu optycznym.

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do...

Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Ten film demonstruje procedurę wywoływania paraliżu poprzez transfer aktywowanych komórek Th17 ukierunkowanych na akwaporynę-4 do modelu mysiego. W ośrodkowym układzie nerwowym aktywowane komórki Th17 oddziałują z astrocytami wykazującymi ekspresję akwaporyny-4, wywołując odpowiedź immunologiczną, która prowadzi do paraliżu ogona i kończyn u myszy.

Wywoływanie paraliżu w modelu mysim poprzez transfer komórek Th17 specyficznych dla akwaporyny-4

Ten film pokazuje proces oceny dysfunkcji motorycznej w modelu mysim poprzez podanie toksyny krztuścowej i inokulum zawierającego peptydy naśladujące mielinę i adiuwanty, a następnie testy na bieżni w celu oceny funkcji motorycznych i oceny wynikłego uszkodzenia nerwów w wyniku aktywacji immunologicznej i demielinizacji.

Ocena funkcji motorycznych w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia nerwu

Opisujemy metodę wszczepiania i utrzymywania szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Okna te zapewniają przewlekły dostęp optyczny do rdzenia kręgowego w celu monitorowania dynamiki komórek na poziomie subkomórkowym u żywych zwierząt za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Ten raport przedstawia proste podejście do skutecznego wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu (EAN) przy użyciu peptydu białka mieliny zero (P0)180-199 w połączeniu z kompletnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuścową. Przedstawiamy wyrafinowany paradygmat zdolny do dokładnej oceny zakresu deficytów funkcjonalnych i neuropatologii, które występują w tym EAN.

Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

Test komórkowy jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w surowicy. Metoda ta może być stosowana w diagnostyce klinicznej i badaniach naukowych nad zaburzeniami spektrum optycznego zapalenia nerwu i szpiku.

Wykrywanie immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w ludzkiej surowicy za pomocą testu komórkowego

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Poznaj metodę indukcji choroby autoimmunologicznej OUN poprzez transfer limfocytów T specyficznych dla AQP4 u myszy. Technika ta umożliwia badanie roli komórek T w neuromyelitis optica przy użyciu nieniszczącej tomografii optycznej.

Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 (Wideo) | JoVE Journal

Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Przeglądaj więcej filmów