Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie profili wiązania różnych modyfikacji histonów przy użyciu próbek embrionalnych o niskiej liczebności w celu poprawy funkcjonalnej adnotacji genomów kręgowców. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak kluczowe wzmacniacze i geny określające tożsamość danej tkanki embrionalnej. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wymaga ograniczonej ilości określonego materiału i może być również stosowana zarówno do analizy specyficznej lokalnie, jak i obejmującej cały genom.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji transkrypcji lub heterogeniczności komórkowej w tkankach embrionalnych, może być również stosowana do innych systemów, takich jak próbki patentowe. Aby uzyskać stadium HH19, zarodki kurze do tego eksperymentu wysiadują płodne białe jaja kurze Leghorn w orientacji poziomej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności 80% przez trzy dni. Aby rozpocząć izolowanie zarodków HH19, ułatw je poprzez ekstrakcję trzech mililitrów albuminy za pomocą 10-milimetrowej strzykawki, aby obniżyć blastodermę.

Aby usunąć dodatkowe błony embrionalne, użyj cienkich nożyczek, aby zrobić mały otwór w oku. Dodaj jeden mililitr roztworu zamka. Za pomocą zgiętej igły dodaj 0,5 mililitra indyjskiego czarnego atramentu.

Użyj cienkich nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby odciąć dodatkową błonę embrionalną otaczającą zarodek. Następnie przenieś zarodek za pomocą perforowanej łyżki na 4,5-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 20 mililitrów roztworu PBS. Pracując na lodzie pod mikroskopem stereoskopowym, użyj cienkich nożyczek i kleszczy, aby wypreparować i wyrzucić owodnię oraz pozostałe części dodatkowej błony zarodkowej.

Następnie przeciąć poprzeczną rurkę nerwową rdzenia kręgowego lub segment SNT na poziomie ramiennym zarodka. Rozszerz sekcję doogonowo na obszar klatki piersiowej, aby wyizolować SNT. Na koniec użyj kleszczy, aby usunąć tkanki, które bocznie i brzusznie otaczają SNT.

Po wyizolowaniu SNT zanurz każdy segment w 3,5-centymetrowej szalce Petriego zawierającej trypsynę o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy rozluźnienie tkanek nienerwowych wokół SNT jest widoczne pod mikroskopem stereoskopowym, przenieś próbki do zimnego 1x PBS. Aby zatrzymać trypsynizację, przenieś próbki do nowego naczynia z zimnym DMEM zawierającym 10% FBS.

Użyj kleszczy, aby ręcznie usunąć pozostałe tkanki mezenchymalne i ektodermalne z SNT. Przenieś tę czystą sekcję SNT do 1,5-mililitrowej probówki i błyskawicznie zamroź ją w ciekłym azocie. Następnie homogenizuj tkankę zgodnie z protokołem tekstowym.

Dodaj 13,5 mikrolitra 37% formaldehydu i inkubuj w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 15 minut. Aby ugasić formaldehyd, dodaj 25 mikrolitrów glicyny molowej o stężeniu 2,5 molowym do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 10 minut. Odwirować probówkę, a następnie umyć granulat zgodnie z protokołem tekstowym.

Po usieciowaniu ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach lodowatego, pełnego buforu do lizy przez pipetowanie. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza na platformie kołyszącej przez 10 minut. Następnie poddaj próbki sonikacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po sonikacji odwirować próbki w temperaturze 16 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Przenieś supernatant lub lizat do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra i wyrzuć osad resztek komórkowych. Rozcieńczyć lizat zgodnie z protokołem tekstowym.

Następnie zachowaj małą porcję każdej próbki jako kontrolę wejściową i zamroź w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Pozostałe próbki, które zostaną poddane wytrącaniu chromatyny, należy inkubować lub rozdrabniać odpowiednimi przeciwciałami zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodaj 300 mikrolitrów chromatyny związanej z przeciwciałami do wcześniej umytych kulek magnetycznych.

Odwróć probówki, aby wymieszać próbki. Aby związać przeciwciała z kulkami, umieść probówki na rotatorze probówki i obracaj pionowo o cztery stopnie Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Aby umyć kulki związane z chromatyną, dodaj jeden mililitr lodowatego buforu płuczącego RIPA do probówki trzymanej na lodzie i wymieszaj, odwracając lub przesuwając probówkę.

Po umieszczeniu rurki w uchwycie magnetycznym w temperaturze pokojowej poczekaj, aż koraliki osiądą na boku. Odlej klarowny płyn i powtórz to pranie jeszcze trzy razy. Po dodaniu jednego mililitra milimolowego chlorku sodu TE 50 do probówki, przenieś kulki związane z chromatyną w tym roztworze do świeżej 1,5 milimetrowej probówki mikrowirówkowej.

Umieść rurkę w uchwycie magnetycznym, a gdy koraliki opadną, odlej płyn. Następnie odwiruj kulki w temperaturze 900 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty we wstępnie schłodzonej wirówce. Po osadzeniu koralików w uchwycie magnetycznym usuń wszystkie pozostałe TE za pomocą żelowej końcówki ładującej.

Pracując w temperaturze pokojowej, dodaj 210 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek i ponownie zawiesij przez strzepnięcie. Inkubować probówkę we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut, wstrząsając. Po inkubacji odwirować probówki z kulkami o sile 16 000 x G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Gdy kulki osiądą w uchwycie magnetycznym, przenieś supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki. Rozmrozić wcześniej zamrożoną wejściową próbkę kontrolną z 20 stopni Celsjusza do temperatury pokojowej. Dodać 90 mikrolitrów buforu elucyjnego do próbki i wymieszać przez krótkie wirowanie.

Aby odwrócić usieciowania, należy inkubować chip i próbki kontrolne w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Pracując w temperaturze pokojowej, dodaj jedną objętość buforu TE na probówkę i odwróć do wymieszania. Aby roztrawić RNA, dodaj RNAzę A do próbki kontrolne i rozdrobnij je do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr i odwróć probówki do wymieszania.

Inkubuj probówki we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Aby strawić białko w celu późniejszego oczyszczenia DNA, dodaj proteazę K do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr do probówek i odwróć probówki, aby wymieszać. Inkubuj probówki we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Ekstrahować i oczyszczać DNA zgodnie z materiałami uzupełniającymi. To DNA może być teraz wykorzystane do ilościowego PCR i przygotowania biblioteki chipów. Skuteczność sonikacji niezbędna dla udanego chipa jest potwierdzona przez elektroforezę w żelu agarozowym wejściowych próbek kontrolnych.

W tym przykładzie, przy użyciu rdzeniowej cewy nerwowej kurczaka lub odcinków SNT, zastosowano 11 cykli sonikacji w celu uzyskania optymalnej wielkości fragmentu w zakresie od 200 do 500 par zasad. Rozdrobnione DNA analizowano za pomocą ilościowej reakcji PCR w celu zmierzenia poziomów wzbogacenia aktywujących i represyjnych znaczników histonowych wokół regionów promotorowych genów, które są aktywne i nieaktywne w SNT kurczaka. Pokazuje to, że możliwa jest ocena jakości rozdrobnionej części poprzez ilościowe określenie tylko kilku niskich stron bez utraty dużej ilości DNA do dalszej analizy.

Po sekwencyjnym przygotowaniu bibliotek wyszukiwania chipów, pokazano reprezentatywną szarańczę dla danych dotyczących trimetylacji H3K27 i potrójnej metylacji H3K4 wygenerowanych w SNT kurczaka. Podobne profile wyszukiwania chipów udało się również z powodzeniem stworzyć w różnych tkankach embrionalnych kurcząt, takich jak protuberancje szczęki i zarodki w stadium HH3. Pokazuje to, że przedstawiony tutaj protokół chipowy może być wykorzystany do generowania profili epigenomicznych z ograniczonych ilości różnych tkanek embrionalnych.

Wykorzystując ten protokół do generowania profili modyfikacji histonów w tkance embrionalnej, należy pamiętać, że sygnały będą pochodzić ze wszystkich różnych typów komórek obecnych w takiej tkance. Zgodnie z tym protokołem i przy użyciu większej ilości wyjściowego materiału biologicznego, powinno być możliwe zbadanie profili wiązania innych białek biorących udział w regulacji transkrypcji, takich jak czynniki transkrypcyjne, koaktywatory lub podjednostki polimerazy RNA 2. Po ustanowieniu, protokoły te umożliwią naukowcom zajmującym się biologią rozwojową lub genetyką medyczną poprawę funkcjonalnych zmian w genomach kręgowców oraz uzyskanie ważnych informacji na temat molekularnych podstaw miogenezy, ewolucji i chorób człowieka.