Name: Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj protokół ChIP i przygotowanie bibliotek ChIP-seq dla niskoliczbowych próbek embrionalnych kurczaka. Ta metoda umożliwia generowanie globalnych profili epigenomicznych i badanie modyfikacji histonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Janowi Appelowi za doskonałą pomoc techniczną podczas tworzenia tego protokołu. Prace w laboratorium Rada-Iglesias są wspierane przez fundusze CMMC, granty badawcze DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 i TE 1007/3-1), grant UoC Advanced Researcher Group oraz grant CECAD.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogłyby zostać ujawnione.

Profilowanie epigenomiczne modyfikacji histonów za pomocą ChIP-seq może być wykorzystane do poprawy funkcjonalnej adnotacji genomów kręgowców w różnych kontekstach komórkowych 4,5,18. Te profile epigenomiczne mogą być wykorzystywane między innymi do identyfikacji elementów wzmacniających, do definiowania stanu regulacyjnego wzmacniaczy (tj. aktywnych, zagruntowanych lub opanowanych) oraz do definiowania głównych regulat...

Modyfikacje potranslacyjne histonów są bezpośrednio zaangażowane w różne procesy zależne od chromatyny, w tym transkrypcję, replikację i naprawę DNA1,2,3. Co więcej, różne modyfikacje histonów wykazują dodatnie (np. H3K4me3 i H3K27ac) lub ujemne (np. H3K9me3 i H3K27me3) korelacje z ekspresją genów i mogą być szeroko zdefiniowane odpowiednio jako aktywujące lub represyjne znaczniki histonów2,3. W związku z tym globalne mapy modyfikacji histonów, zwane również mapami epigenomicznymi, stały się potężnymi i uniwersalnymi narzędziami do funkcjonalnego opisywania genomów kręgowców4,5. Na przykład dystalne sekwencje regulatorowe, takie jak wzmacniacze, można zidentyfikować na podstawie obecności specyficznych sygnatur chromatyny (np. aktywnych wzmacniaczy: H3K4me1 i H3K27ac), które odróżniają je od proksymalnych regionów promotorowych (np. aktywnych promotorów: H3K4me3)6,7,8. Z drugiej strony, geny z głównymi funkcjami regulacyjnymi tożsamości komórkowej są zwykle znajdowane z szerokimi domenami chromatyny oznaczonymi jako H3K4me3 lub H3K27me3, w zależności od transkrypcyjnie aktywnego lub nieaktywnego statusu podstawowych genów, odpowiednio9,10. Podobnie, ekspresja głównych genów tożsamości komórkowej wydaje się być często kontrolowana przez wielokrotne i przestrzennie zgrupowane wzmacniacze (tj. super-wzmacniacze), które można zidentyfikować jako szerokie domeny oznaczone H3K27ac11.
Obecnie, mapy modyfikacji histonów są generowane przy użyciu technologii ChIP-seq, która w porównaniu do poprzednich podejść, takich jak ChIP-chip (ChIP sprzężony z mikromacierzami) zapewnia wyższą rozdzielczość, mniej artefaktów, mniej szumów, większy zasięg i niższe koszty12. Niemniej jednak generowanie map epigenomicznych przy użyciu technologii ChIP-seq ma swoje nieodłączne ograniczenia, związane głównie ze zdolnością do skutecznego przeprowadzenia ChIP w próbkach będących przedmiotem zainteresowania. Tradycyjne protokoły ChIP zazwyczaj wymagały milionów komórek, co ogranicza możliwość zastosowania tej metody do linii komórkowych in vitro lub komórek, które można łatwo wyizolować in vivo (np. Komórki krwi). W ciągu ostatnich kilku lat opisano szereg zmodyfikowanych protokołów ChIP kompatybilnych z niską liczbą komórek13,14,15,16. Jednak protokoły te są specjalnie zaprojektowane do łączenia z sekwencjonowaniem nowej generacji (tj. ChIP-seq) i zazwyczaj używają metod przygotowania biblioteki ad hoc13,14,15,16.
Tutaj opisaliśmy protokół ChIP, który może być użyty do zbadania profili modyfikacji histonów przy użyciu niskiej i pośredniej liczby komórek (5 x 104 - 5 x 105 komórek) w wybranych loci (np. ChIP-qPCR) lub globalnie (tj. ChIP-seq) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W połączeniu z technologią ChIP-seq, nasz protokół ChIP może być używany razem ze standardowymi metodami przygotowania bibliotek, dzięki czemu jest szeroko dostępny dla wielu laboratoriów10. Protokół ten został wykorzystany do zbadania kilku znaczników histonowych (np. H3K4me3, H3K27me3 i H3K27ac) w różnych tkankach embrionalnych kurczaka (np. Rdzeniowej cewie nerwowej (SNT), protuberancjach czołowo-nosowych i epiblastach). Przewidujemy jednak, że powinno to mieć szerokie zastosowanie do innych organizmów, w których próbki istotne biologicznie i/lub klinicznie można uzyskać tylko w niewielkich ilościach.

<table><tbody><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA w proszku</td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowo-solny (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8,0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-deoksycholan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroilsarkozyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Białko G/kulki magnetyczne</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>RNaza glicyny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46,35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-maślan</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>Inhibitor proteinazy</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb drabinka</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Etoksylat oktylofenolu (Triton X 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute; s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do ładowania żelu Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Płytki</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 well</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &micro; L Końcówki filtracyjne</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &mikro; L Końcówki filtracyjne</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &mikro; L Końcówki filtracyjne</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0,5 - 10 &mikro; L Końcówki filtra</td><td>Przeciwciało Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Aktywny motyw</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K27ac</td><td>Aktywny motyw</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K4me3</td><td>Aktywny motyw</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K4me2</td><td>Aktywny motyw</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>End Repair Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki paramagnetyczne</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do zawieszania</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-Tailing Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Indeksy adaptera RNA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Stop bufor ligacyjny</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl starterowy do PCR</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Wzmocniona mieszanka do PCR</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka genomowego DNA</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw</td> <td>kwantyfikacyjny bibliotekiKapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>Płodne jaja z białka kurczaka</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>Igła (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Active</td><td>Motive EpiShear sonda Sonikator</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Zmienna głośność (5 &ndash; 1,000 &mu; L) pipety:</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt magnetyczny</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>Spinner stołowy</td><td>Heathrow Scientific</td><td>Sprout</td><td></td></tr><tr><td>Mixer</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Cycler</td><td></td> Roche <td>Light Cycler; Serial Nr.5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>System kontroli jakości DNA i RNA</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation System</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>Perforowana łyżka</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół immunoprecypitacji chromatyny (chip) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest powszechnie stosowaną techniką mapowania lokalizacji posttranslacyjnie zmodyfikowanych histonów, wariantów histonów, czynników transkrypcyjnych lub enzymów modyfikujących chromatynę w danym locus lub w skali całego genomu. Połączenie testów ChIP z sekwencjonowaniem nowej generacji (tj. ChIP-Seq) jest potężnym podejściem do globalnego odkrywania sieci regulacyjnych genów i poprawy funkcjonalnej adnotacji genomów, zwłaszcza niekodujących sekwencji regulatorowych. Protokoły ChIP zwykle wymagają dużych ilości materiału komórkowego, co wyklucza możliwość zastosowania tej metody do badania rzadkich typów komórek lub biopsji małych tkanek. Aby test ChIP był zgodny z ilością materiału biologicznego, którą zwykle można uzyskać in vivo podczas wczesnej embriogenezy kręgowców, opisujemy tutaj uproszczony protokół ChIP, w którym liczba kroków wymaganych do wykonania testu została zmniejszona w celu zminimalizowania utraty próbki. Ten protokół ChIP został z powodzeniem wykorzystany do zbadania różnych modyfikacji histonów w różnych embrionalnych tkankach kurczaków i dorosłych myszy przy użyciu niskiej i średniej liczby komórek (5 x 104 - 5 x 105 komórek). Co ważne, protokół ten jest kompatybilny z technologią ChIP-seq wykorzystującą standardowe metody przygotowania bibliotek, zapewniając w ten sposób globalne mapy epigenomiczne w bardzo istotnych tkankach embrionalnych.

Aby zaprezentować wydajność naszego protokołu ChIP, przeprowadzono eksperymenty ChIP-seq z wykorzystaniem połączonych sekcji SNT z embrionów kurzych w stadium HH19, wyrostków szczękowych embrionów kurzych w stadium HH22 oraz embrionów kurzych w stadium HH3, w celu zbadania profilu wiązania różnych modyfikacji histonowych (t.j. H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 i H3K27me3). Po uzyskaniu DNA z ChIP, wydajność sonikacji oceniono za pomocą elektroforezy żelowej na żelu agarozowym odpowiednic...

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie profili wiązania różnych modyfikacji histonów przy użyciu próbek embrionalnych o niskiej liczebności w celu poprawy funkcjonalnej adnotacji genomów kręgowców. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak kluczowe wzmacniacze i geny określające tożsamość danej tkanki embrionalnej. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wymaga ograniczonej ilości określonego materiału i może być również stosowana zarówno do analizy specyficznej lokalnie, jak i obejmującej cały genom.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji transkrypcji lub heterogeniczności komórkowej w tkankach embrionalnych, może być również stosowana do innych systemów, takich jak próbki patentowe. Aby uzyskać stadium HH19, zarodki kurze do tego eksperymentu wysiadują płodne białe jaja kurze Leghorn w orientacji poziomej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności 80% przez trzy dni. Aby rozpocząć izolowanie zarodków HH19, ułatw je poprzez ekstrakcję trzech mililitrów albuminy za pomocą 10-milimetrowej strzykawki, aby obniżyć blastodermę.Aby usunąć dodatkowe błony embrionalne, użyj cienkich nożyczek, aby zrobić mały otwór w oku. Dodaj jeden mililitr roztworu zamka. Za pomocą zgiętej igły dodaj 0,5 mililitra indyjskiego czarnego atramentu.Użyj cienkich nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby odciąć dodatkową błonę embrionalną otaczającą zarodek. Następnie przenieś zarodek za pomocą perforowanej łyżki na 4,5-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 20 mililitrów roztworu PBS. Pracując na lodzie pod mikroskopem stereoskopowym, użyj cienkich nożyczek i kleszczy, aby wypreparować i wyrzucić owodnię oraz pozostałe części dodatkowej błony zarodkowej.Następnie przeciąć poprzeczną rurkę nerwową rdzenia kręgowego lub segment SNT na poziomie ramiennym zarodka. Rozszerz sekcję doogonowo na obszar klatki piersiowej, aby wyizolować SNT. Na koniec użyj kleszczy, aby usunąć tkanki, które bocznie i brzusznie otaczają SNT.Po wyizolowaniu SNT zanurz każdy segment w 3,5-centymetrowej szalce Petriego zawierającej trypsynę o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy rozluźnienie tkanek nienerwowych wokół SNT jest widoczne pod mikroskopem stereoskopowym, przenieś próbki do zimnego 1x PBS. Aby zatrzymać trypsynizację, przenieś próbki do nowego naczynia z zimnym DMEM zawierającym 10% FBS.Użyj kleszczy, aby ręcznie usunąć pozostałe tkanki mezenchymalne i ektodermalne z SNT. Przenieś tę czystą sekcję SNT do 1,5-mililitrowej probówki i błyskawicznie zamroź ją w ciekłym azocie. Następnie homogenizuj tkankę zgodnie z protokołem tekstowym.Dodaj 13,5 mikrolitra 37% formaldehydu i inkubuj w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 15 minut. Aby ugasić formaldehyd, dodaj 25 mikrolitrów glicyny molowej o stężeniu 2,5 molowym do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 10 minut. Odwirować probówkę, a następnie umyć granulat zgodnie z protokołem tekstowym.Po usieciowaniu ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach lodowatego, pełnego buforu do lizy przez pipetowanie. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza na platformie kołyszącej przez 10 minut. Następnie poddaj próbki sonikacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po sonikacji odwirować próbki w temperaturze 16 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Przenieś supernatant lub lizat do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra i wyrzuć osad resztek komórkowych. Rozcieńczyć lizat zgodnie z protokołem tekstowym.Następnie zachowaj małą porcję każdej próbki jako kontrolę wejściową i zamroź w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Pozostałe próbki, które zostaną poddane wytrącaniu chromatyny, należy inkubować lub rozdrabniać odpowiednimi przeciwciałami zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodaj 300 mikrolitrów chromatyny związanej z przeciwciałami do wcześniej umytych kulek magnetycznych.Odwróć probówki, aby wymieszać próbki. Aby związać przeciwciała z kulkami, umieść probówki na rotatorze probówki i obracaj pionowo o cztery stopnie Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Aby umyć kulki związane z chromatyną, dodaj jeden mililitr lodowatego buforu płuczącego RIPA do probówki trzymanej na lodzie i wymieszaj, odwracając lub przesuwając probówkę.Po umieszczeniu rurki w uchwycie magnetycznym w temperaturze pokojowej poczekaj, aż koraliki osiądą na boku. Odlej klarowny płyn i powtórz to pranie jeszcze trzy razy. Po dodaniu jednego mililitra milimolowego chlorku sodu TE 50 do probówki, przenieś kulki związane z chromatyną w tym roztworze do świeżej 1,5 milimetrowej probówki mikrowirówkowej.Umieść rurkę w uchwycie magnetycznym, a gdy koraliki opadną, odlej płyn. Następnie odwiruj kulki w temperaturze 900 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty we wstępnie schłodzonej wirówce. Po osadzeniu koralików w uchwycie magnetycznym usuń wszystkie pozostałe TE za pomocą żelowej końcówki ładującej.Pracując w temperaturze pokojowej, dodaj 210 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek i ponownie zawiesij przez strzepnięcie. Inkubować probówkę we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut, wstrząsając. Po inkubacji odwirować probówki z kulkami o sile 16 000 x G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.Gdy kulki osiądą w uchwycie magnetycznym, przenieś supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki. Rozmrozić wcześniej zamrożoną wejściową próbkę kontrolną z 20 stopni Celsjusza do temperatury pokojowej. Dodać 90 mikrolitrów buforu elucyjnego do próbki i wymieszać przez krótkie wirowanie.Aby odwrócić usieciowania, należy inkubować chip i próbki kontrolne w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Pracując w temperaturze pokojowej, dodaj jedną objętość buforu TE na probówkę i odwróć do wymieszania. Aby roztrawić RNA, dodaj RNAzę A do próbki kontrolne i rozdrobnij je do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr i odwróć probówki do wymieszania.Inkubuj probówki we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Aby strawić białko w celu późniejszego oczyszczenia DNA, dodaj proteazę K do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr do probówek i odwróć probówki, aby wymieszać. Inkubuj probówki we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Ekstrahować i oczyszczać DNA zgodnie z materiałami uzupełniającymi. To DNA może być teraz wykorzystane do ilościowego PCR i przygotowania biblioteki chipów. Skuteczność sonikacji niezbędna dla udanego chipa jest potwierdzona przez elektroforezę w żelu agarozowym wejściowych próbek kontrolnych.W tym przykładzie, przy użyciu rdzeniowej cewy nerwowej kurczaka lub odcinków SNT, zastosowano 11 cykli sonikacji w celu uzyskania optymalnej wielkości fragmentu w zakresie od 200 do 500 par zasad. Rozdrobnione DNA analizowano za pomocą ilościowej reakcji PCR w celu zmierzenia poziomów wzbogacenia aktywujących i represyjnych znaczników histonowych wokół regionów promotorowych genów, które są aktywne i nieaktywne w SNT kurczaka. Pokazuje to, że możliwa jest ocena jakości rozdrobnionej części poprzez ilościowe określenie tylko kilku niskich stron bez utraty dużej ilości DNA do dalszej analizy.Po sekwencyjnym przygotowaniu bibliotek wyszukiwania chipów, pokazano reprezentatywną szarańczę dla danych dotyczących trimetylacji H3K27 i potrójnej metylacji H3K4 wygenerowanych w SNT kurczaka. Podobne profile wyszukiwania chipów udało się również z powodzeniem stworzyć w różnych tkankach embrionalnych kurcząt, takich jak protuberancje szczęki i zarodki w stadium HH3. Pokazuje to, że przedstawiony tutaj protokół chipowy może być wykorzystany do generowania profili epigenomicznych z ograniczonych ilości różnych tkanek embrionalnych.Wykorzystując ten protokół do generowania profili modyfikacji histonów w tkance embrionalnej, należy pamiętać, że sygnały będą pochodzić ze wszystkich różnych typów komórek obecnych w takiej tkance. Zgodnie z tym protokołem i przy użyciu większej ilości wyjściowego materiału biologicznego, powinno być możliwe zbadanie profili wiązania innych białek biorących udział w regulacji transkrypcji, takich jak czynniki transkrypcyjne, koaktywatory lub podjednostki polimerazy RNA 2. Po ustanowieniu, protokoły te umożliwią naukowcom zajmującym się biologią rozwojową lub genetyką medyczną poprawę funkcjonalnych zmian w genomach kręgowców oraz uzyskanie ważnych informacji na temat molekularnych podstaw miogenezy, ewolucji i chorób człowieka.

chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Precyzyjna regulacja transkrypcji genów leży u podstaw decyzji o losie komórki embrionalnej. W niniejszym artykule opisujemy testy immunoprecypitacji chromatyny stosowane do badania epigenetycznej regulacji zarówno różnicowania komórek macierzystych w sercu, jak i rozwoju serca zarodków myszy.

Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Poznaj protokół ChIP i przygotowanie bibliotek ChIP-seq dla niskoliczbowych próbek embrionalnych kurczaka. Ta metoda umożliwia generowanie globalnych profili epigenomicznych i badanie modyfikacji histonowych.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Przeglądaj więcej filmów