Name: Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Naucz się syntezy RNA w fazie stałej dodekamerów z modyfikacją 2'-O-tiofenylometylu oraz ich oczyszczania i charakteryzacji dichroizmem kołowym. Metoda umożliwia badanie struktury kwasów nukleinowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Przygotowanie tego manuskryptu było wspierane przez fundusze start-up z University of Colorado Denver (JMRE). AF pragnie podziękować za wsparcie ze strony nagrody za badania i działalność twórczą (RaCAS, CU Denver). Potwierdza się finansowanie z Biura Usług Badawczych Uniwersytetu Kolorado w Denver na pokrycie kosztów publikacji. Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium, pani Cassandrze Herbert i panu Yannickowi K. Dzowo, za ich wkład w część wideo.

1. Synteza oligonukleotydów RNA w fazie stałej
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów zawierających poszczególne fosforamidyty (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Obliczyć liczbę nukleotydów i podstawić do równania n+1 (gdzie n = liczba nukleotydów) odpowiadającego każdej zasadzie, a następnie uzupełnić tabelę brakującymi wartościami. Objętość = 0,15 mL na nukleotyd przy stężeniu 0,1 M, rozpuszczone w bezwodnym acetonitrylu.</li>
		<li>Odważyć każdy fosforamidyt do wysuszonych w piecu bursztynowych fiolek o pojemności 10 mL (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) i natychmiast umieścić pod próżnią w deskrykatorze zawierającym środek osuszający.</li>
		<li>Wypełnić deskrykator suchym argonem, wyjąć fiolkę i natychmiast rozcieńczyć odpowiednią ilością acetonitrylu (bezwodnego) przed zamocowaniem w urządzeniu. 
		UWAGA: Należy używać strzykawek szczelnych dla gazów i przez cały czas utrzymywać atmosferę bezwodną.</li>
		<li>Zdjąć septa z fiolek i umieścić je w urządzeniu za pomocą funkcji wymiany fiolek. 
		UWAGA: Proces ten wymaga dodatkowych 0,15 mL (stąd nadmiar objętości w powyższym równaniu n+1) każdego roztworu do zapowietrzenia linii przed syntezą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawienie sekwencji i synteza na fazie stałej przy użyciu oprogramowania (Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Kliknąć ikonę oprogramowania (np. OligoNet 1.0.1) i wybrać Nazwa urządzenia&#62;OK. Utworzyć nową syntezę poprzez Plik&#62;Nowa synteza&#62;Zamówienie.</li>
		<li>Wypełnić pola: Data; RunID; wybrać urządzenie; nazwa sekwencji; sekwencja (koniec 5'-do-3'). W sekcji |cykl przypisać wcześniej utworzoną metodę (Rysunek 3). Wybrać procedurę końcową, (pozostawia oligonukleotyd związany z żywicą CPG)&#62;manualna.</li>
		<li>Wybrać DMT Off &#62;(obałoga TCA w ostatnim kroku w celu uzyskania grupy 5'-OH na końcu syntezy); zapisać Plik&#62;Zapisz jako i podać nazwę eksperymentu.</li>
		<li>Wysłać plik, aby rozpocząć syntezę Zamówienie&#62;Wyślij zamówienie do syntezatora i wybrać kolumnę 1-4. Otworzyć okno syntezatora i wybrać trityl monitor|wybierz funkcję|trity&#62;monitoruj każdy krok.</li>
		<li>Powtarzać kroki w zależności od liczby oligonukleotydów, które mają zostać zsyntetyzowane jednocześnie (należy pamiętać, że wszystkie zamówienia muszą mieć tę samą metodę, tzn. takie same czasy sprzęgania i sekwencję zdarzeń).</li>
		<li>Rozpocząć syntezę Syntezator&#62;Przygotuj do startu. Umieścić kolumny z pożądanym końcem 3' w pozycjach wskazanych na urządzeniu. Na urządzeniu kliknąć Start&#62;Nie (dla przygotowania ABI).</li>
		<li>Po zakończeniu syntezy wyjąć kolumnę z urządzenia i umieścić w kolbie okrągłodennej, a następnie suszyć pod zmniejszonym ciśnieniem przez około 0,5 h. 
		UWAGA: Zaleca się sprawdzenie, czy w losowych sprzęganiach (kroki 1.2.4 - 1.2.7) obserwuje się ciemnopomarańczowy kolor, aby uniknąć potencjalnych błędów funkcji monitora tritylowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deprotekcja i oczyszczanie oligonukleotydów RNA.
	<ol>
		<li>Otworzyć kolumnę, przekręcając czarną zakrętkę, i przenieść całość (lub połowę, w zależności od potrzeb lub celu) białej żywicy do probówki wirówkowej o pojemności 1,6 mL. Dodać 0,5 mL mieszaniny metyloaminy (40% w wodzie)/amoniaku (40% w wodzie) w stosunku 1:1.</li>
		<li>Zabezpieczyć zakrętkę probówki wirówkowej parafilmem i, używając bloku grzewczego, podgrzać do 60 °C przez 1,5 h. 
		UWAGA: Na górze probówki można położyć ciężki przedmiot, aby zapewnić stałe stężenie amoniaku wewnątrz probówki reakcyjnej.</li>
		<li>Wyjąć z bloku grzewczego i powoli schłodzić do temperatury pokojowej. Krótko odwirować próbkę, aby osadzić zawartość, a następnie przenieść nadnadpłyn do nowej probówki wirówkowej.</li>
		<li>Zamrozić próbki, zanurzając probówki w ciekłym azocie (lub kąpieli z suchego lodu i etanolu) i odparować do suchości w wirówce pod zmniejszonym ciśnieniem.</li>
		<li>Resuspender ciało stałe w 0,4 mL roztworu trietyloaminy/N-metylopirolidonu/trifluorowodorku trietyloaminy (stosunek 2:2:3). Podgrzać do 60 °C przez 1,5 h, a następnie powoli schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Dodać 0,04 mL roztworu NaOAc (3M, pH 5,5 - skorygowane HCl), a następnie delikatnie wymieszać końcówką pipety. Dodać etanol (1 mL) i schłodzić do ok. -70 °C (kąpiel z suchego lodu i etanolu) przez 15 min.</li>
		<li>Wirować przy 15 000 rpm i 4 °C przez 10 min. Użyć pipety do pobrania alikwoty i wysuszyć otrzymany osad pod zmniejszonym ciśnieniem.</li>
		<li>Resuspender otrzymane ciało stałe w buforze do nakładania (0,2 mL, 90% wodna formamida, 1 mM EDTA) i mieszać do uzyskania homogenicznej mieszaniny.</li>
		<li>Nałożyć zawiesinę na wcześniej przygotowany żel poliakrylamidowy (20% denaturujący, wymiary otworu: 30 cm x 1 mm)22.</li>
		<li>Przyłożyć prąd do żelu, aż marker błękitu bromofenolowego znajdzie się w odległości 1/2-2/3 długości żelu (wymiary żelu: ~ 21,5 cm x 30 cm).</li>
		<li>Wyjąć żel ze statywu i przenieść zawartość żelu ze szkła na folię plastikową (pokrytą z obu stron), a następnie położyć na płytce do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) pokrytej krzemionką (zawierającą barwnik fluorescencyjny przy 254 nm), aby zwizualizować prążki za pomocą lampy UV (λmax = 254 nm).</li>
		<li>Użyć markera do zaznaczenia pozycji górnego prążka i wyciąć go nowym ostrzem żyletki. Umieścić żel zawierający RNA (bez folii plastikowej) w stożkowej probówce 50-mL i rozdrobić na małe kawałki za pomocą szklanej rurki.</li>
		<li>Zawiesić pozostałości żelu w wodnym roztworze NaCl (200 mM NaCl&#160;i 1 mM EDTA) i wstrząsać zawiesinę w temperaturze 37 °C przez 12 h. Wirować probówkę stożkową przez 10 min.</li>
		<li>Odsolić, używając kartridża C18 w odwróconej fazie.
		<ol>
			<li>Przygotować kartridż za pomocą strzykawki 10-mL, przemywając go za pomocą: 
			Acetonitrylu (10 mL) 
			H2O (dwukrotnie, 10 mL) 
			Wodnego roztworu 5 mM NH4OAc (3 mL) 
			Roztworu zawierającego RNA, dbając o to, aby nie przelać żadnych pozostałości żelu.</li>
			<li>Przemyć H2O (trzykrotnie, 10 mL).</li>
			<li>Eluować z kolumny, używając 60% wodnego roztworu metanolu (3 mL)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Skoncentrować pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuścić ponownie w wodzie wolnej od RNaz (0,3 mL)</li>
		<li>Przygotować roztwór rozcieńczony (10 µL) i nanieść 1 µL na urządzenie UV-vis (np. Nanodrop), aby zmierzyć widmo UV-vis (200-450 nm).</li>
		<li>Użyć prawa Beer-Lambert'a do wyznaczenia stężenia otrzymanego roztworu: 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> 
		gdzie A = otrzymana absorbancja; ε = obliczony molowy współczynnik ekstynkcji; c = stężenie, a l = 0,1 dla długości drogi 1 mm.</li>
		<li>Obliczyć molowe współczynniki ekstynkcji dla oligonukleotydów; obliczono je tutaj za pomocą kalkulatora online wykorzystującego oprogramowanie DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt)23</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczanie stężenia i charakterystyka za pomocą MALDI-TOF.
	<ol>
		<li>Nałożyć próbki na płytkę MALDI, używając końcówki pipety z końcówką C18 do odsalania, i nanieść każdy oligonukleotyd.
		<ol>
			<li>Przemyć końcówkę 50% acetonitrylem (10 µL x 2). Zrównoważyć końcówkę 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA; 10 µL x 2). Nanieść na końcówkę próbkę (zazwyczaj 100-150 pmol).</li>
			<li>Przemyć końcówkę 0,1% TFA (10 µL x 2), a następnie wodą (10 µL x 2).</li>
			<li>Eluować próbkę do roztworu zawierającego pożądaną matrycę; zastosowano roztwór: 10 µL 25 mM-2,4,6-trihydroksyacetofenonu monohydratu (THAP), 10 mM cytrynianu amonu i 300 mM fluorku amonu w 50% acetonitrylu.</li>
			<li>Nanieść bezpośrednio na płytkę MALDI, nakładając 0,9 µL (następnie susząc na powietrzu) i powtarzając procedurę w razie potrzeby. 
			UWAGA: Wszystkie widma uzyskano w trybie pozytywnym z reflektorem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza struktury RNA za pomocą CD
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów do CD.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,25 ml zawierające zmodyfikowane RNA [3 &#181;M], NaCl [10 mM], bufor fosforanowy sodu [10 mM, pH 7,2] oraz MgCl2 [5 mM]. Próbka w tej formie jest gotowa do analizy, szczególnie jeśli reprezentuje ona przejście jednocząsteczkowe.</li>
		<li>Jeśli celem jest analiza struktur duplexowych lub przejść bimolekularnych, należy w tym momencie dodać komplementarną sekwencję (1 ekwiwalent molowy, jeśli dotyczy) lub przejść do poniższego kroku.</li>
		<li>Umieść próbkę w bloku grzewczym, uprzednio podgrzanym do 90 &#176;Cnastępnie należy wyłączyć ogrzewanie, aby zapewnić powolne chłodzenie do temperatury pokojowej (zazwyczaj przez 2–4 h).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja widm
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór kontrolny (NaCl 10 mM, fosforan sodu 10 mM pH 7,3, MgCl2 5 mM), przenieść do mikrokuwety (długość drogi optycznej 1 cm, 250 &#181;L (minimalna objętość) i umieść w gnieździe próbek wewnątrz urządzenia.</li>
		<li>Przenieś próbkę zawierającą RNA do innej mikrokuwety i umieść ją w próbniku (sample changer). W przypadku pomiaru przejścia denaturacji termicznej ostrożnie dodaj warstwę oleju, nie naruszając warstwy wodnej, a następnie zabezpiecz zakrętkę kuwety za pomocą taśmy teflonowej.</li>
		<li>Otwórz zbiornik z azotem, aby zapewnić przepływ przemieszczający wskaźnik poziomu powietrza znajdujący się w urządzeniu do wartości ok. 40. Włącz chłodziarkę.</li>
		<li>Włącz urządzenie i uruchom oprogramowanie Menedżer Widm ikona, a następnie otwórz okno akwizycji Pomiar widma.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem akwizycji należy przepłukać instrument azotem przez 5 min.</li>
		<li>Należy pozyskać widma, stosując następujące parametry Pomiar&#62;Parametry i dostosować parametry w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Pod Ogólnewybierz: Skanowanie 200-350 nm; Kanały CD i HT: Interwał danych (data pitch) 0,1 nm; prędkość skanowania 100 nm/min; szerokość pasma 1 nm; liczba akumulacji 5.</li>
			<li>Pod jednostka komórkowawybierz 20 &#176;CPod kontrolawybierz opcję „Shutter is opened and closed automatically” (Migawka otwiera się i zamyka automatycznie). W sekcji informacjewybierz nazwę, stężenie, operatora.</li>
			<li>Pod Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.przejdź do wybranego folderu. Kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozyskaj widma Pomiar&#62;Pomiar próbki, zidentyfikuj pozycję (pozycje) kuwet w wymienniku próbek 1-6 odpowiednio kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku pomiaru przejścia denaturacji termicznej:
	<ol>
		<li>Zamknij oprogramowanie akwizycyjne Plik&#62;Wyjście i otwórz nowy program Pomiar zmiennej temperatury&#62;Pomiar&#62;Parametry.</li>
		<li>Zastosuj następujące parametry w celu zarejestrowania przejścia termicznego, które można dostosować według uznania:
		<ol>
			<li>Pod Temperatura, wybierz temperaturę początkową: 4 &#176;C; odstęp: 0,2; cel: 90 &#176;Cgradient: 1 &#176;C/min; odczekać 0 s. Pod Start/Koniecwybierz warunek startowy &amp;#38; warunek końcowy zgodnie z potrzebami.</li>
			<li>Pod Ogólnewybrać 3 kanały: CD/HT/Abs; szerokość pasma: 1 nm; długość fali: 270 nm (lub według uznania). W sekcji Kontrola, nie zaznaczono niczego. Pod Informacjewybierz nazwę, stężenie, operatora.</li>
			<li>Pod Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia., przejdź do wybranego folderu. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Schładzać próbki do 4 &#176;C należy odczekać 5 min w tej temperaturze przed wykonaniem pomiaru widma.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie danych dla widm.
	<ol>
		<li>Korzystając z funkcji w oprogramowaniu, należy odjąć widmo tła od widma próbki w celu skorygowania sygnałów tła pochodzących ze stosowanego systemu buforowego: Analiza widm&#62;Plik&#62;Otwórz.</li>
		<li>Po otwarciu pustego pliku oraz pliku ze widmem, należy przeciągnąć okno View 2 pod okno View 1 (po lewej stronie ekranu).</li>
		<li>Kliknij w Przetwarzanie&#62;odjęcie&#62;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. lub wymiana danych&#62;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..</li>
		<li>Wyeksportuj dane do pliku ASCII: Plik&#62;Eksport i wybierz ASCII.</li>
		<li>Należy użyć oprogramowania do wykreślenia odpowiadającego widma. W przypadkach, gdy stosunek sygnału do szumu jest niższy od oczekiwanego, dopuszczalne jest wygładzanie danych. Transformację tę można przeprowadzić, wybierając opcję wygładzania danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie danych dla przejść termicznej denaturacji.
	<ol>
		<li>Wyeksportuj dane z pliku JASCO do pliku ASCII.</li>
		<li>Nanieś punkty eliptyczności w funkcji temperatury. Zazwyczaj, w zależności od badanej długości fali, konieczne jest wygładzenie danych. W niektórych przypadkach zastosowanie długości fali 210 nm wykazało większe różnice między wykresami, co wymagało wygładzenia. Niemniej jednak, w zależności od próbki i stężeń, część obliczeń przeprowadzono z wykorzystaniem surowych danych.</li>
		<li>Aby obliczyć przejścia denaturacji termicznej (Tm) wartości, wyznaczono pierwszą pochodną krzywej. Maksima lub minima stanowiły wskazanie tego parametru. Podobnie jak w poprzednim kroku, w niektórych przypadkach wymagane było wygładzenie danych w celu uzyskania najdokładniejszej wartości. 
		UWAGA: Eksperymenty przeprowadzano zazwyczaj w trzech powtórzeniach, co pozwoliło na wyznaczenie odpowiedniej średniej oraz odchylenia standardowego dla danego pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229210603_The_synthesis_of_oligodeoxyprimidines_on_a_polymer_support">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li>
<li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403901904617">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+Chemistry+and+its+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses.</a> Science. 230 (4723), 281-285 (1985).</li>
<li>Nguyen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+Thermal+Stability%2C+Biophysical+Properties%2C+and+Molecular+Modeling+of+Oligonucleotides+of+RNA+Containing+2%27-O-2-Thiophenylmethyl+Groups%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups.</a> J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).</li>
<li>El-Sagheer, A. H., Brown, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Click chemistry with DNA.</a> Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).</li>
<li>Puffer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoro+pyrimidines%3A+labels+to+probe+DNA+and+RNA+secondary+structures+by+1D+19F+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).</li>
<li>Wan, W. B., Seth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medicinal+chemistry+of+therapeutic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.</a> J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).</li>
<li>Zhou, C., Greenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+by+histone+radicals+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles.</a> J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-Induced+proton-coupled+electron+transfer+in+cyclic+DNA+miniduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes.</a> J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).</li>
<li>Anosova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+diversity+of+artificial+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The structural diversity of artificial genetic polymers.</a> Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).</li>
<li>Riml, C., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+5-Hydroxymethylcytidine-+and+5-Hydroxymethyl-uridine-Modified+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Synthesis%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA.</a> Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).</li>
<li>Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+Two+Strategies+for+Mixed-Sequence+Recognition+of+Double-Stranded+DNA%3A+Pseudocomplementary+Invader+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes.</a> J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).</li>
<li>Beaucage, S. L., Iyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040402001879588">Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach.</a> Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).</li>
<li>Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+N-%28deoxyguanosin-8-yl%29-2-acetylaminofluorene+%28dG-AAF%29+into+oligonucleotides+using+modified+%27ultra-mild%27+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis.</a> Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+a+very+long+oligoribonucleotide+with+2-cyanoethoxymethyl+%28CEM%29+as+the+2%27-O.-protecting+group%3A+structural+identification+and+biological+activity+of+a+synthetic+110mer+precursor-microRNA+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate.</a> Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).</li>
<li>Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties%2C+thermal+stability+and+functional+impact+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+on+oligonucleotides+of+RNA+-+a+study+of+duplex%2C+hairpins+and+the+aptamer+for+preQ1+as+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).</li>
<li>Ranjbar, B., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+dichroism+techniques%3A+Biomolecular+and+nanostructural+analyses+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review.</a> Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).</li>
<li>Mergny, J. -L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thermal+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Oligonucleotides%22%5BJournal%5D)">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraplex+formation+of+a+guanine-containing+nonameric+DNA+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment.</a> Science. 250 (4980), 543-546 (1990).</li>
<li>Virgilio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethyl-2%27-deoxyuridine+residues+in+the+thrombin+binding+aptamer%3A+Investigating+anticoagulant+activity+by+making+a+tiny+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22CHEMBIOCHEM%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification.</a> CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).</li>
<li>Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+and+thermal+stability+of+oligonucleotides+of+RNA+containing+7%2C8-dihydro-8-hydroxyadenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.</a> Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAFold%3A+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li>
<li>Breslow, R., Huang, D. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+ions+including+Mg2%2B+and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li>
<li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li>
<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Intencją tego manuskryptu jest służenie jako przewodnik dla badaczy w tej dziedzinie, początkujących lub ekspertów, w celu pomyślnego osiągnięcia lub zwiększenia syntezy oligonukleotydów DNA lub RNA. Opisana metodologia koncentruje się na wykorzystaniu syntezy fazy stałej przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora DNA/RNA za pomocą standardowej chemii fosforoamidytu. Raport opisuje krok po kroku proces syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA. Ponadto zastosowanie CD jest wykorzystywane do identyfikacji dru...

Synteza fazy stałej w celu uzyskania oligonukleotydów DNA/RNA to potężne narzędzie, które od lat 70. XX wieku ma wiele zastosowań w różnych dziedzinach1,2,3 przy użyciu bloków budulcowych fosforamidytu4. Przykłady jego szerokiego wpływu obejmują: jego wpływ na etykietowanie (poprzez reakcje chemiczne kliknięć)5, sondowanie strukturalne6 i technologie antysensowne7, a także wyjaśnienie mechanizmów biologicznych8,9, źródło jako materiał genetyczny10, oraz badanie różnych naturalnych i/lub chemicznych modyfikacji11,12, wśród wielu innych. Modyfikacja, którą tutaj stosujemy, stanowi pierwszy krok w naszych wysiłkach na rzecz uzyskania oligonukleotydów RNA, które zawierają sondy fotoaktywne, aby umożliwić czasową kontrolę struktury i funkcji tego ważnego biopolimeru.
Synteza dodekamerów RNA z sekwencjami: 5'-[CUA CGG AAU CAU]-3'/5'-[AUG AUU CCG UAG]-3' (podkreślone pozycje reprezentują włączenie modyfikacji C2'-O-tiofenylometylu) stanowi główny cel tego badania. Sekwencje zostały dobrane tak, aby umożliwić kwantyfikację i pomiar nici RNA jako pojedynczych nici lub jako odpowiadających im struktur dupleksowych (nie przewidywano żadnych innych struktur drugorzędowych jako stabilnych termodynamicznie). CD wykorzystano do wyznaczenia parametrów strukturalnych, tj. powstawania dupleksu i termicznych przemian denaturacyjnych.
Synteza 
Ogólna procedura otrzymywania tych oligonukleotydów jest zilustrowana w <silnej klasie="xfig">Rysunek 1 i przedstawia proces krokowy: zautomatyzowana synteza w fazie stałej → deprotekcja → oczyszczanie → kwantyfikacja → charakteryzacja. Rysunek 2 przedstawia jednostki monomeryczne, które są niezbędne w tej procedurze. Synteza RNA w fazie stałej jest podobna do syntezy DNA, ponieważ opiera się na chemii fosforamidytu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, po lewej) i zastosowaniu labilnych grup ochronnych dla nukleofilowych amin egzocyklicznych na G, A i C, np. acetylu, benzoilu, fenoksyacetylu, t-butylu lub N,N-dimetyloformamidu (<klasa silna="xfig">Rysunek 2, po prawej). Jeszcze jednym aspektem do rozważenia w RNA, ze względu na obecność grupy C2'-OH (brak w biopolimerach deoksyoligonukleotydowych), jest dodatkowy krok, który należy włączyć w celu ochrony, a następnie deprotekcji tej pozycji nukleofilowej. Pod tym względem, grupy ochronne na bazie krzemu stały się atrakcyjną strategią ze względu na ich potencjał jako ugrupowań biortodolicznych (szczególnie odchronionych w obecności fluoru), z grupami tert-butylodimetylosililosililu (TBDMS) i triizopropylosilosililosmetylu (TOM) jako popularnymi wyborami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, na dole po lewej).
W tej pracy automatyczna synteza została przeprowadzona na syntezatorze DNA/RNA, który wykorzystuje standardową chemię fosforamidytu. Ustawienia producenta w urządzeniu obejmują automatyczny etap rozcieńczania w przypadku korzystania z komercyjnych wersji fosforoamidynów do DNA lub opcję rozcieńczania w objętościach ustawionych przez użytkownika. Zdecydowaliśmy się jednak zważyć fosforoamidyn RNA i rozcieńczyć go ręcznie, biorąc pod uwagę, że: 1) cena kanonicznych fosforamidynów RNA jest wyższa (w niektórych przypadkach nawet 50-krotnie droższa); 2) modyfikowane fosforamidyty są często otrzymywane w małych ilościach; oraz 3) ilość marnowanego materiału przy użyciu automatycznego etapu rozcieńczania (ustawionego przez producenta) jest duża. Ponadto zastosowaliśmy: 1) dostępne na rynku stałe nośniki (np. CPG) zawierające chronioną zasadę nukleotydową pełniącą funkcję końca 3'; oraz 2) komercyjne fosforamidyty (kanoniczne zasady nukleotydowe) zabezpieczone grupą TBDMS w pozycji C2'-O. Szczegółowa lista etapów syntezy znajduje się w Rysunek 3 i Tabela 1, wraz z dalszym opisem i komentarzami do etapów, które zostały dostosowane do syntezy RNA. Ponadto, Rysunek 4 ilustruje stopniowe plony, które są obserwowane dla każdego kroku po wybraniu opcji 'Trityl Monitor', która określa ilościowo kation trytylu uwalniany z każdego etapu detrytylacji.
Warto zauważyć, że zazwyczaj z naszego doświadczenia wynika, że czynnikiem ograniczającym było uzyskanie fosforamidytu zawierającego pożądaną modyfikację. Oznacza to opracowanie syntetycznej metodologii, która pozwala na wprowadzanie modyfikacji w wybranych lokalizacjach. W niniejszym raporcie skupiamy się na włączeniu zmodyfikowanego nukleotydu, dla którego ustaliliśmy odpowiednią metodologię syntezy, grupę C2'-O-tiofenylometylu. Grupa ta jest niewielkich rozmiarów i w żaden sposób nie wpływa na syntezę w fazie stałej. Ponieważ doniesiono o włączeniu tej grupy do oligonukleotydów RNA, wraz z parametrami strukturalnymi i termodynamicznymi4, żadne aspekty syntezy organicznej prowadzącej do zmodyfikowanych fosforoamidynów nie zostaną opisane w niniejszym dokumencie.
Deprotekcja, Oczyszczanie i Charakteryzacja 
Deprotekcja amin egzocyklicznych i grup ß-cyjanoetylowych zachodzi na tym samym etapie, co rozszczepienie z żywicy CPG. Zastosowaliśmy powszechnie stosowane warunki ogrzewania otrzymanej żywicy w obecności wodnego roztworu AMA, a następnie rozszczepienia grup C2'-O-sililowych w obecności jonów fluorkowych, a następnie oczyszczenia za pomocą elektroforezy żelowej. Chociaż w wielu przypadkach stały się one warunkami standardowymi, modyfikacje, które są odporne na warunki podstawowe lub jony fluorkowe, mogą wymagać łagodniejszych warunków13,14, np. metanol/węglan potasu (MeOH/K2CO3) lub butyloamina. W związku z tym konieczny jest inny zestaw grup ochronnych na odpowiadających im fosforamidytach. Ponadto wybraliśmy elektroforezę jako preferowaną alternatywę do oczyszczania odchronionych oligomerów, biorąc pod uwagę nasze wcześniejsze doświadczenia z tą metodą i brak innych oprzyrządowań. Jednak HPLC może być alternatywnie stosowany jako skuteczna metoda15. Charakterystykę oczyszczonych oligonukleotydów przeprowadzono za pomocą spektrometrii mas, matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej czasu lotu (MALDI-TOF), przy użyciu procedury zgłoszonej przez naszą grupę16.
Charakterystyka strukturalna i stabilność termiczna otrzymanych dupleksów została przeprowadzona za pomocą płyty CD. W szczególności wykorzystujemy CD do określania termicznych przejść denaturacyjnych zmodyfikowanych i niemodyfikowanych oligonukleotydów RNA, śledząc spadek eliptyczności pasma przy ok. 270 nm, a także zanik pasma (o ujemnej eliptyczności) przyλ max przy 210 nm. Przedstawiono porównanie widm przed i po hybrydyzacji w celu zilustrowania ich różnic i walidacji zastosowanej metodologii. Zastosowanie CD jest powszechnie akceptowane w określaniu motywów strukturalnych w kwasach nukleinowych i aminokwasach17, a zatem może być stosowane jako narzędzie do określania różnych parametrów strukturalnych i termodynamicznych18; Nie ma jednak wielu przykładów, w których technika ta jest stosowana do oceny przemian denaturacji termicznej. Niektóre przypadki obejmują określenie stabilności termicznej na DNA zawierającym G-kwadrupleksy19,20 lub w dupleksach i spinkach do włosów RNA21.
Ten raport ma na celu dostarczenie czytelnikowi lub widzowi niebędącemu ekspertem zestawu narzędzi, które umożliwiają płynne rozpoczęcie tego typu badań. Będzie on służył do ulepszenia i porównania z metodologiami i technikami w innych laboratoriach badawczych, które są zaangażowane w tę ekscytującą gałąź nauki. Treść tego raportu uzupełnia istniejące protokoły tej technologii z różnych źródeł oraz wzbogaca i ułatwia korzystanie z niej dzięki pomocy wizualnej dla każdego kroku.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl 99,9%, Klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl 99,9%, bezwodny do sekwencjonowania DNA</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid, 99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian amonu, dwuzasadowy 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek amonu&nbsp; 98,0%, klasa ACS</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu 28 - 30% w wodzie, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra wysoka czystość</td><td>&nbsp; Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akryloamid Ultra czysty</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu, 97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny, klasy histologicznej</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa odwodnienie 100,2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, 36,5 - 38,0%, Certyfikowany ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, 99,9%,&nbsp; HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Metyloamina 40% w wodzie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-metylo-2-pirolidynon, iwodny, 99,5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Wkład studzienkowy (123 x 81 mm)&nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu, bezwodny 99,2%, Certyfikowany ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 100,5%, Certyfikowany ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny 99,0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2',4' Trietyloamina, 99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Trihydrofluorek trietyloaminy, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6'-trihydroksyacetofenon monohydrat 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do syntezy RNA: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka deblokująca, 3% kwas trichlorooctowy w dichlorometanie</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix A, THF/pirydyna/bezwodnik octowy</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix B, 10% 1-metyloimidazol w THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Aktywator, 0,25 M 5-etylotio-1H-tetrazol w bezwodnym acetonitrylu</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór utleniający, 0,02 M jod w THF/pirydynie/wodzie</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Fosforoamidyt&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Fosforoamidyn</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Fosforoamidyn</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Fosforoamidyt&nbsp;</td><td>Badania Glena</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół syntezy w fazie stałej oligomerów rna zawierających modyfikację 2'-o-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Synteza fazy stałej została wykorzystana do uzyskania kanonicznych i zmodyfikowanych polimerów kwasów nukleinowych, w szczególności DNA lub RNA, co uczyniło ją popularną metodologią do zastosowań w różnych dziedzinach i do różnych celów badawczych. Opisana w niniejszym dokumencie procedura koncentruje się na syntezie, oczyszczaniu i charakterystyce dodekamerów RNA 5'-[CUA CGG AAU CAU]-3' zawierających zero, jedną lub dwie modyfikacje zlokalizowane w pozycji C2'-O. Sondy są oparte na grupach 2-tiofenylometylowych, włączonych do nukleotydów RNA poprzez standardową syntezę organiczną i wprowadzonych do odpowiednich oligonukleotydów za pośrednictwem odpowiednich fosforamiditów. W niniejszym raporcie wykorzystano chemię fosforamidytów za pośrednictwem czterech kanonicznych zasad nukleotydowych (urydyna (U), cytozyna (C), guanozyna (G), adenozyna (A)), a także nukleotydy funkcjonalizowane 2-tiofenylometylemetylu zmodyfikowane w pozycji 2'-O; Metodologia ta jest jednak podatna na wiele różnych modyfikacji, które zostały opracowane na przestrzeni lat. Oligonukleotydy zsyntetyzowano na nośniku ze szkła o kontrolowanych porach (CPG), a następnie rozszczepiono z żywicy i zdeprotekowano w standardowych warunkach, tj. mieszaninie amoniaku i metyloaminy (AMA), a następnie fluorowodoru/trietyloaminy/N-metylopirolidynonu. Odpowiednie oligonukleotydy oczyszczono za pomocą elektroforezy poliakrylamidowej (20% denaturacji), a następnie elucji, odsalania i izolacji za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami (Sep-pak,C 18-kolumnowy). Ocenę ilościową i parametry strukturalne oceniono odpowiednio za pomocą analizy fotometrycznej w ultrafiolecie widzialnym (UV-vis) i dichroizmu kołowego (CD). Niniejszy raport ma służyć jako źródło informacji i przewodnik dla początkujących i doświadczonych badaczy zainteresowanych rozpoczęciem pracy w tej dziedzinie. Oczekuje się, że będzie on służył jako praca w toku w miarę opracowywania nowych technologii i metodologii. Opis metodologii i technik zawartych w tym dokumencie odpowiada syntezatorowi DNA/RNA (odnowionemu i zakupionemu w 2013 r.), który wykorzystuje chemię fosforamidytu.

Opisano syntezę dodekamerów RNA zawierających zero, jedną lub dwie modyfikacje 2-tiofenylometylowe w pozycji C2'-O, wraz z odpowiadającym im oczyszczaniem i charakterystyką. Ponadto zamieszczono szczegółowy opis analizy strukturalnej przeprowadzonej za pomocą CD.
Cztery nici RNA (w tym nić o sekwencji komplementarnej) otrzymano za pomocą syntezy na fazie stałej, po której nastąpiło oczyszczanie, dając wydajność od 300 d...

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Ogólnym celem niniejszego raportu jest przedstawienie procedury otrzymywania oligonukleotydów RNA za pomocą syntezy na fazie stałej. W ramach modeli zsyntezyzowane zostaną dodekamery RNA, a następnie zaprezentowane zostanie ich oczyszczanie i charakterystyka. Dzięki komponentowi wizualnemu publikacja ta poszerzy zakres metodologii i zaplecza technicznego dostępnego dla badaczy z różnych dziedzin.Udostępnienie pomocy wizualnej wraz z krótkim protokołem umożliwi badaczom zastosowanie tych technik. Jedną z zalet tej metody jest jej podatność na szeroki zakres modyfikacji. W obliczu coraz bardziej wymagających współczesnych zastosowań, opracowanie standardowego protokołu jest niezwykle istotne.Chemia fosforamidytowa przeżywa obecnie renesans ze względu na niezawodność tej metody oraz potencjał w uzyskiwaniu oligonukleotydów do zastosowań terapeutycznych. Choć zakup gotowych oligonukleotydów jest atrakcyjny, cena i dostępność modyfikacji sprawiają, że wzrasta zainteresowanie samodzielnym przygotowywaniem tych oligomerów, co nadaje tej procedurze najwyższą wagę. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odważyć każdy fosforamidyt do wysuszonych w piecu 10-mililitrowych butelek z ciemnego szkła

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Fotostabilne barwniki cyjaninowe są dołączane do oligonukleotydów w celu monitorowania hybrydyzacji poprzez transfer energii.

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Tutaj prezentujemy protokół, aby zademonstrować skuteczną metodę syntezy spirocyklicznych heterocykli. Pięcioetapowy proces wykorzystuje syntezę w fazie stałej i regenerację strategii łącznika Michaela. Generalnie trudna do syntezy, przedstawiamy konfigurowalną metodę syntezy cząsteczek spirocyklicznych, która w inny sposób jest niedostępna dla innych nowoczesnych podejść.

Synteza oksymów spirocyklicznych w fazie stałej [4.4]

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Przedstawiamy protokół do pomiaru dynamiki mikro- do milisekundowej na 13C/15N-znakowanych i nieznakowanych RNA za pomocąspektroskopii 1 H R1ρ spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z dyspersją relaksacyjną. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu próbek o wysokiej czystości i konfiguracji eksperymentów NMR.

Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

Naucz się syntezy RNA w fazie stałej dodekamerów z modyfikacją 2'-O-tiofenylometylu oraz ich oczyszczania i charakteryzacji dichroizmem kołowym. Metoda umożliwia badanie struktury kwasów nukleinowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego (Wideo) | JoVE Journal

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Przeglądaj więcej filmów