Name: Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Naucz się syntezy RNA w fazie stałej dodekamerów z modyfikacją 2'-O-tiofenylometylu oraz ich oczyszczania i charakteryzacji dichroizmem kołowym. Metoda umożliwia badanie struktury kwasów nukleinowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przygotowanie tego manuskryptu było wspierane przez fundusze start-up z University of Colorado Denver (JMRE). AF pragnie podziękować za wsparcie ze strony nagrody za badania i działalność twórczą (RaCAS, CU Denver). Potwierdza się finansowanie z Biura Usług Badawczych Uniwersytetu Kolorado w Denver na pokrycie kosztów publikacji. Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium, pani Cassandrze Herbert i panu Yannickowi K. Dzowo, za ich wkład w część wideo.

1. Synteza oligonukleotydów RNA w fazie stałej
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów zawierających poszczególne fosforamidyty (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Obliczyć liczbę nukleotydów i podstawić do równania n+1 (gdzie n = liczba nukleotydów) odpowiadającego każdej zasadzie, a następnie uzupełnić tabelę brakującymi wartościami. Objętość = 0,15 mL na nukleotyd przy stężeniu 0,1 M, rozpuszczone w bezwodnym acetonitrylu.</li>
		<li>Odważyć każdy fosforamidyt do wysuszonych w piecu bursztynowych fiolek o pojemności 10 mL (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) i natychmiast umieścić pod próżnią w deskrykatorze zawierającym środek osuszający.</li>
		<li>Wypełnić deskrykator suchym argonem, wyjąć fiolkę i natychmiast rozcieńczyć odpowiednią ilością acetonitrylu (bezwodnego) przed zamocowaniem w urządzeniu. 
		UWAGA: Należy używać strzykawek szczelnych dla gazów i przez cały czas utrzymywać atmosferę bezwodną.</li>
		<li>Zdjąć septa z fiolek i umieścić je w urządzeniu za pomocą funkcji wymiany fiolek. 
		UWAGA: Proces ten wymaga dodatkowych 0,15 mL (stąd nadmiar objętości w powyższym równaniu n+1) każdego roztworu do zapowietrzenia linii przed syntezą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawienie sekwencji i synteza na fazie stałej przy użyciu oprogramowania (Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Kliknąć ikonę oprogramowania (np. OligoNet 1.0.1) i wybrać Nazwa urządzenia&#62;OK. Utworzyć nową syntezę poprzez Plik&#62;Nowa synteza&#62;Zamówienie.</li>
		<li>Wypełnić pola: Data; RunID; wybrać urządzenie; nazwa sekwencji; sekwencja (koniec 5'-do-3'). W sekcji |cykl przypisać wcześniej utworzoną metodę (Rysunek 3). Wybrać procedurę końcową, (pozostawia oligonukleotyd związany z żywicą CPG)&#62;manualna.</li>
		<li>Wybrać DMT Off &#62;(obałoga TCA w ostatnim kroku w celu uzyskania grupy 5'-OH na końcu syntezy); zapisać Plik&#62;Zapisz jako i podać nazwę eksperymentu.</li>
		<li>Wysłać plik, aby rozpocząć syntezę Zamówienie&#62;Wyślij zamówienie do syntezatora i wybrać kolumnę 1-4. Otworzyć okno syntezatora i wybrać trityl monitor|wybierz funkcję|trity&#62;monitoruj każdy krok.</li>
		<li>Powtarzać kroki w zależności od liczby oligonukleotydów, które mają zostać zsyntetyzowane jednocześnie (należy pamiętać, że wszystkie zamówienia muszą mieć tę samą metodę, tzn. takie same czasy sprzęgania i sekwencję zdarzeń).</li>
		<li>Rozpocząć syntezę Syntezator&#62;Przygotuj do startu. Umieścić kolumny z pożądanym końcem 3' w pozycjach wskazanych na urządzeniu. Na urządzeniu kliknąć Start&#62;Nie (dla przygotowania ABI).</li>
		<li>Po zakończeniu syntezy wyjąć kolumnę z urządzenia i umieścić w kolbie okrągłodennej, a następnie suszyć pod zmniejszonym ciśnieniem przez około 0,5 h. 
		UWAGA: Zaleca się sprawdzenie, czy w losowych sprzęganiach (kroki 1.2.4 - 1.2.7) obserwuje się ciemnopomarańczowy kolor, aby uniknąć potencjalnych błędów funkcji monitora tritylowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deprotekcja i oczyszczanie oligonukleotydów RNA.
	<ol>
		<li>Otworzyć kolumnę, przekręcając czarną zakrętkę, i przenieść całość (lub połowę, w zależności od potrzeb lub celu) białej żywicy do probówki wirówkowej o pojemności 1,6 mL. Dodać 0,5 mL mieszaniny metyloaminy (40% w wodzie)/amoniaku (40% w wodzie) w stosunku 1:1.</li>
		<li>Zabezpieczyć zakrętkę probówki wirówkowej parafilmem i, używając bloku grzewczego, podgrzać do 60 °C przez 1,5 h. 
		UWAGA: Na górze probówki można położyć ciężki przedmiot, aby zapewnić stałe stężenie amoniaku wewnątrz probówki reakcyjnej.</li>
		<li>Wyjąć z bloku grzewczego i powoli schłodzić do temperatury pokojowej. Krótko odwirować próbkę, aby osadzić zawartość, a następnie przenieść nadnadpłyn do nowej probówki wirówkowej.</li>
		<li>Zamrozić próbki, zanurzając probówki w ciekłym azocie (lub kąpieli z suchego lodu i etanolu) i odparować do suchości w wirówce pod zmniejszonym ciśnieniem.</li>
		<li>Resuspender ciało stałe w 0,4 mL roztworu trietyloaminy/N-metylopirolidonu/trifluorowodorku trietyloaminy (stosunek 2:2:3). Podgrzać do 60 °C przez 1,5 h, a następnie powoli schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Dodać 0,04 mL roztworu NaOAc (3M, pH 5,5 - skorygowane HCl), a następnie delikatnie wymieszać końcówką pipety. Dodać etanol (1 mL) i schłodzić do ok. -70 °C (kąpiel z suchego lodu i etanolu) przez 15 min.</li>
		<li>Wirować przy 15 000 rpm i 4 °C przez 10 min. Użyć pipety do pobrania alikwoty i wysuszyć otrzymany osad pod zmniejszonym ciśnieniem.</li>
		<li>Resuspender otrzymane ciało stałe w buforze do nakładania (0,2 mL, 90% wodna formamida, 1 mM EDTA) i mieszać do uzyskania homogenicznej mieszaniny.</li>
		<li>Nałożyć zawiesinę na wcześniej przygotowany żel poliakrylamidowy (20% denaturujący, wymiary otworu: 30 cm x 1 mm)22.</li>
		<li>Przyłożyć prąd do żelu, aż marker błękitu bromofenolowego znajdzie się w odległości 1/2-2/3 długości żelu (wymiary żelu: ~ 21,5 cm x 30 cm).</li>
		<li>Wyjąć żel ze statywu i przenieść zawartość żelu ze szkła na folię plastikową (pokrytą z obu stron), a następnie położyć na płytce do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) pokrytej krzemionką (zawierającą barwnik fluorescencyjny przy 254 nm), aby zwizualizować prążki za pomocą lampy UV (λmax = 254 nm).</li>
		<li>Użyć markera do zaznaczenia pozycji górnego prążka i wyciąć go nowym ostrzem żyletki. Umieścić żel zawierający RNA (bez folii plastikowej) w stożkowej probówce 50-mL i rozdrobić na małe kawałki za pomocą szklanej rurki.</li>
		<li>Zawiesić pozostałości żelu w wodnym roztworze NaCl (200 mM NaCl&#160;i 1 mM EDTA) i wstrząsać zawiesinę w temperaturze 37 °C przez 12 h. Wirować probówkę stożkową przez 10 min.</li>
		<li>Odsolić, używając kartridża C18 w odwróconej fazie.
		<ol>
			<li>Przygotować kartridż za pomocą strzykawki 10-mL, przemywając go za pomocą: 
			Acetonitrylu (10 mL) 
			H2O (dwukrotnie, 10 mL) 
			Wodnego roztworu 5 mM NH4OAc (3 mL) 
			Roztworu zawierającego RNA, dbając o to, aby nie przelać żadnych pozostałości żelu.</li>
			<li>Przemyć H2O (trzykrotnie, 10 mL).</li>
			<li>Eluować z kolumny, używając 60% wodnego roztworu metanolu (3 mL)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Skoncentrować pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuścić ponownie w wodzie wolnej od RNaz (0,3 mL)</li>
		<li>Przygotować roztwór rozcieńczony (10 µL) i nanieść 1 µL na urządzenie UV-vis (np. Nanodrop), aby zmierzyć widmo UV-vis (200-450 nm).</li>
		<li>Użyć prawa Beer-Lambert'a do wyznaczenia stężenia otrzymanego roztworu: 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> 
		gdzie A = otrzymana absorbancja; ε = obliczony molowy współczynnik ekstynkcji; c = stężenie, a l = 0,1 dla długości drogi 1 mm.</li>
		<li>Obliczyć molowe współczynniki ekstynkcji dla oligonukleotydów; obliczono je tutaj za pomocą kalkulatora online wykorzystującego oprogramowanie DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt)23</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczanie stężenia i charakterystyka za pomocą MALDI-TOF.
	<ol>
		<li>Nałożyć próbki na płytkę MALDI, używając końcówki pipety z końcówką C18 do odsalania, i nanieść każdy oligonukleotyd.
		<ol>
			<li>Przemyć końcówkę 50% acetonitrylem (10 µL x 2). Zrównoważyć końcówkę 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA; 10 µL x 2). Nanieść na końcówkę próbkę (zazwyczaj 100-150 pmol).</li>
			<li>Przemyć końcówkę 0,1% TFA (10 µL x 2), a następnie wodą (10 µL x 2).</li>
			<li>Eluować próbkę do roztworu zawierającego pożądaną matrycę; zastosowano roztwór: 10 µL 25 mM-2,4,6-trihydroksyacetofenonu monohydratu (THAP), 10 mM cytrynianu amonu i 300 mM fluorku amonu w 50% acetonitrylu.</li>
			<li>Nanieść bezpośrednio na płytkę MALDI, nakładając 0,9 µL (następnie susząc na powietrzu) i powtarzając procedurę w razie potrzeby. 
			UWAGA: Wszystkie widma uzyskano w trybie pozytywnym z reflektorem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza struktury RNA za pomocą CD
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów do CD.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,25 ml zawierające zmodyfikowane RNA [3 &#181;M], NaCl [10 mM], bufor fosforanowy sodu [10 mM, pH 7,2] oraz MgCl2 [5 mM]. Próbka w tej formie jest gotowa do analizy, szczególnie jeśli reprezentuje ona przejście jednocząsteczkowe.</li>
		<li>Jeśli celem jest analiza struktur duplexowych lub przejść bimolekularnych, należy w tym momencie dodać komplementarną sekwencję (1 ekwiwalent molowy, jeśli dotyczy) lub przejść do poniższego kroku.</li>
		<li>Umieść próbkę w bloku grzewczym, uprzednio podgrzanym do 90 &#176;Cnastępnie należy wyłączyć ogrzewanie, aby zapewnić powolne chłodzenie do temperatury pokojowej (zazwyczaj przez 2–4 h).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja widm
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór kontrolny (NaCl 10 mM, fosforan sodu 10 mM pH 7,3, MgCl2 5 mM), przenieść do mikrokuwety (długość drogi optycznej 1 cm, 250 &#181;L (minimalna objętość) i umieść w gnieździe próbek wewnątrz urządzenia.</li>
		<li>Przenieś próbkę zawierającą RNA do innej mikrokuwety i umieść ją w próbniku (sample changer). W przypadku pomiaru przejścia denaturacji termicznej ostrożnie dodaj warstwę oleju, nie naruszając warstwy wodnej, a następnie zabezpiecz zakrętkę kuwety za pomocą taśmy teflonowej.</li>
		<li>Otwórz zbiornik z azotem, aby zapewnić przepływ przemieszczający wskaźnik poziomu powietrza znajdujący się w urządzeniu do wartości ok. 40. Włącz chłodziarkę.</li>
		<li>Włącz urządzenie i uruchom oprogramowanie Menedżer Widm ikona, a następnie otwórz okno akwizycji Pomiar widma.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem akwizycji należy przepłukać instrument azotem przez 5 min.</li>
		<li>Należy pozyskać widma, stosując następujące parametry Pomiar&#62;Parametry i dostosować parametry w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Pod Ogólnewybierz: Skanowanie 200-350 nm; Kanały CD i HT: Interwał danych (data pitch) 0,1 nm; prędkość skanowania 100 nm/min; szerokość pasma 1 nm; liczba akumulacji 5.</li>
			<li>Pod jednostka komórkowawybierz 20 &#176;CPod kontrolawybierz opcję „Shutter is opened and closed automatically” (Migawka otwiera się i zamyka automatycznie). W sekcji informacjewybierz nazwę, stężenie, operatora.</li>
			<li>Pod Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.przejdź do wybranego folderu. Kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozyskaj widma Pomiar&#62;Pomiar próbki, zidentyfikuj pozycję (pozycje) kuwet w wymienniku próbek 1-6 odpowiednio kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku pomiaru przejścia denaturacji termicznej:
	<ol>
		<li>Zamknij oprogramowanie akwizycyjne Plik&#62;Wyjście i otwórz nowy program Pomiar zmiennej temperatury&#62;Pomiar&#62;Parametry.</li>
		<li>Zastosuj następujące parametry w celu zarejestrowania przejścia termicznego, które można dostosować według uznania:
		<ol>
			<li>Pod Temperatura, wybierz temperaturę początkową: 4 &#176;C; odstęp: 0,2; cel: 90 &#176;Cgradient: 1 &#176;C/min; odczekać 0 s. Pod Start/Koniecwybierz warunek startowy &amp;#38; warunek końcowy zgodnie z potrzebami.</li>
			<li>Pod Ogólnewybrać 3 kanały: CD/HT/Abs; szerokość pasma: 1 nm; długość fali: 270 nm (lub według uznania). W sekcji Kontrola, nie zaznaczono niczego. Pod Informacjewybierz nazwę, stężenie, operatora.</li>
			<li>Pod Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia., przejdź do wybranego folderu. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Schładzać próbki do 4 &#176;C należy odczekać 5 min w tej temperaturze przed wykonaniem pomiaru widma.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie danych dla widm.
	<ol>
		<li>Korzystając z funkcji w oprogramowaniu, należy odjąć widmo tła od widma próbki w celu skorygowania sygnałów tła pochodzących ze stosowanego systemu buforowego: Analiza widm&#62;Plik&#62;Otwórz.</li>
		<li>Po otwarciu pustego pliku oraz pliku ze widmem, należy przeciągnąć okno View 2 pod okno View 1 (po lewej stronie ekranu).</li>
		<li>Kliknij w Przetwarzanie&#62;odjęcie&#62;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. lub wymiana danych&#62;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..</li>
		<li>Wyeksportuj dane do pliku ASCII: Plik&#62;Eksport i wybierz ASCII.</li>
		<li>Należy użyć oprogramowania do wykreślenia odpowiadającego widma. W przypadkach, gdy stosunek sygnału do szumu jest niższy od oczekiwanego, dopuszczalne jest wygładzanie danych. Transformację tę można przeprowadzić, wybierając opcję wygładzania danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie danych dla przejść termicznej denaturacji.
	<ol>
		<li>Wyeksportuj dane z pliku JASCO do pliku ASCII.</li>
		<li>Nanieś punkty eliptyczności w funkcji temperatury. Zazwyczaj, w zależności od badanej długości fali, konieczne jest wygładzenie danych. W niektórych przypadkach zastosowanie długości fali 210 nm wykazało większe różnice między wykresami, co wymagało wygładzenia. Niemniej jednak, w zależności od próbki i stężeń, część obliczeń przeprowadzono z wykorzystaniem surowych danych.</li>
		<li>Aby obliczyć przejścia denaturacji termicznej (Tm) wartości, wyznaczono pierwszą pochodną krzywej. Maksima lub minima stanowiły wskazanie tego parametru. Podobnie jak w poprzednim kroku, w niektórych przypadkach wymagane było wygładzenie danych w celu uzyskania najdokładniejszej wartości. 
		UWAGA: Eksperymenty przeprowadzano zazwyczaj w trzech powtórzeniach, co pozwoliło na wyznaczenie odpowiedniej średniej oraz odchylenia standardowego dla danego pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229210603_The_synthesis_of_oligodeoxyprimidines_on_a_polymer_support">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li>
<li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403901904617">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+Chemistry+and+its+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses.</a> Science. 230 (4723), 281-285 (1985).</li>
<li>Nguyen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+Thermal+Stability%2C+Biophysical+Properties%2C+and+Molecular+Modeling+of+Oligonucleotides+of+RNA+Containing+2%27-O-2-Thiophenylmethyl+Groups%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups.</a> J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).</li>
<li>El-Sagheer, A. H., Brown, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Click chemistry with DNA.</a> Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).</li>
<li>Puffer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoro+pyrimidines%3A+labels+to+probe+DNA+and+RNA+secondary+structures+by+1D+19F+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).</li>
<li>Wan, W. B., Seth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medicinal+chemistry+of+therapeutic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.</a> J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).</li>
<li>Zhou, C., Greenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+by+histone+radicals+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles.</a> J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-Induced+proton-coupled+electron+transfer+in+cyclic+DNA+miniduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes.</a> J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).</li>
<li>Anosova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+diversity+of+artificial+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The structural diversity of artificial genetic polymers.</a> Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).</li>
<li>Riml, C., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+5-Hydroxymethylcytidine-+and+5-Hydroxymethyl-uridine-Modified+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Synthesis%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA.</a> Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).</li>
<li>Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+Two+Strategies+for+Mixed-Sequence+Recognition+of+Double-Stranded+DNA%3A+Pseudocomplementary+Invader+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes.</a> J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).</li>
<li>Beaucage, S. L., Iyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040402001879588">Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach.</a> Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).</li>
<li>Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+N-%28deoxyguanosin-8-yl%29-2-acetylaminofluorene+%28dG-AAF%29+into+oligonucleotides+using+modified+%27ultra-mild%27+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis.</a> Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+a+very+long+oligoribonucleotide+with+2-cyanoethoxymethyl+%28CEM%29+as+the+2%27-O.-protecting+group%3A+structural+identification+and+biological+activity+of+a+synthetic+110mer+precursor-microRNA+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate.</a> Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).</li>
<li>Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties%2C+thermal+stability+and+functional+impact+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+on+oligonucleotides+of+RNA+-+a+study+of+duplex%2C+hairpins+and+the+aptamer+for+preQ1+as+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).</li>
<li>Ranjbar, B., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+dichroism+techniques%3A+Biomolecular+and+nanostructural+analyses+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review.</a> Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).</li>
<li>Mergny, J. -L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thermal+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Oligonucleotides%22%5BJournal%5D)">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraplex+formation+of+a+guanine-containing+nonameric+DNA+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment.</a> Science. 250 (4980), 543-546 (1990).</li>
<li>Virgilio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethyl-2%27-deoxyuridine+residues+in+the+thrombin+binding+aptamer%3A+Investigating+anticoagulant+activity+by+making+a+tiny+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22CHEMBIOCHEM%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification.</a> CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).</li>
<li>Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+and+thermal+stability+of+oligonucleotides+of+RNA+containing+7%2C8-dihydro-8-hydroxyadenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.</a> Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAFold%3A+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li>
<li>Breslow, R., Huang, D. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+ions+including+Mg2%2B+and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li>
<li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li>
<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Intencją tego manuskryptu jest służenie jako przewodnik dla badaczy w tej dziedzinie, początkujących lub ekspertów, w celu pomyślnego osiągnięcia lub zwiększenia syntezy oligonukleotydów DNA lub RNA. Opisana metodologia koncentruje się na wykorzystaniu syntezy fazy stałej przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora DNA/RNA za pomocą standardowej chemii fosforoamidytu. Raport opisuje krok po kroku proces syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA. Ponadto zastosowanie CD jest wykorzystywane do identyfikacji dru...

Synteza fazy stałej w celu uzyskania oligonukleotydów DNA/RNA to potężne narzędzie, które od lat 70. XX wieku ma wiele zastosowań w różnych dziedzinach1,2,3 przy użyciu bloków budulcowych fosforamidytu4. Przykłady jego szerokiego wpływu obejmują: jego wpływ na etykietowanie (poprzez reakcje chemiczne kliknięć)5, sondowanie strukturalne6 i technologie antysensowne7, a także wyjaśnienie mechanizmów biologicznych8,9, źródło jako materiał genetyczny10, oraz badanie różnych naturalnych i/lub chemicznych modyfikacji11,12, wśród wielu innych. Modyfikacja, którą tutaj stosujemy, stanowi pierwszy krok w naszych wysiłkach na rzecz uzyskania oligonukleotydów RNA, które zawierają sondy fotoaktywne, aby umożliwić czasową kontrolę struktury i funkcji tego ważnego biopolimeru.
Synteza dodekamerów RNA z sekwencjami: 5'-[CUA CGG AAU CAU]-3'/5'-[AUG AUU CCG UAG]-3' (podkreślone pozycje reprezentują włączenie modyfikacji C2'-O-tiofenylometylu) stanowi główny cel tego badania. Sekwencje zostały dobrane tak, aby umożliwić kwantyfikację i pomiar nici RNA jako pojedynczych nici lub jako odpowiadających im struktur dupleksowych (nie przewidywano żadnych innych struktur drugorzędowych jako stabilnych termodynamicznie). CD wykorzystano do wyznaczenia parametrów strukturalnych, tj. powstawania dupleksu i termicznych przemian denaturacyjnych.
Synteza 
Ogólna procedura otrzymywania tych oligonukleotydów jest zilustrowana w <silnej klasie="xfig">Rysunek 1 i przedstawia proces krokowy: zautomatyzowana synteza w fazie stałej → deprotekcja → oczyszczanie → kwantyfikacja → charakteryzacja. Rysunek 2 przedstawia jednostki monomeryczne, które są niezbędne w tej procedurze. Synteza RNA w fazie stałej jest podobna do syntezy DNA, ponieważ opiera się na chemii fosforamidytu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, po lewej) i zastosowaniu labilnych grup ochronnych dla nukleofilowych amin egzocyklicznych na G, A i C, np. acetylu, benzoilu, fenoksyacetylu, t-butylu lub N,N-dimetyloformamidu (<klasa silna="xfig">Rysunek 2, po prawej). Jeszcze jednym aspektem do rozważenia w RNA, ze względu na obecność grupy C2'-OH (brak w biopolimerach deoksyoligonukleotydowych), jest dodatkowy krok, który należy włączyć w celu ochrony, a następnie deprotekcji tej pozycji nukleofilowej. Pod tym względem, grupy ochronne na bazie krzemu stały się atrakcyjną strategią ze względu na ich potencjał jako ugrupowań biortodolicznych (szczególnie odchronionych w obecności fluoru), z grupami tert-butylodimetylosililosililu (TBDMS) i triizopropylosilosililosmetylu (TOM) jako popularnymi wyborami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, na dole po lewej).
W tej pracy automatyczna synteza została przeprowadzona na syntezatorze DNA/RNA, który wykorzystuje standardową chemię fosforamidytu. Ustawienia producenta w urządzeniu obejmują automatyczny etap rozcieńczania w przypadku korzystania z komercyjnych wersji fosforoamidynów do DNA lub opcję rozcieńczania w objętościach ustawionych przez użytkownika. Zdecydowaliśmy się jednak zważyć fosforoamidyn RNA i rozcieńczyć go ręcznie, biorąc pod uwagę, że: 1) cena kanonicznych fosforamidynów RNA jest wyższa (w niektórych przypadkach nawet 50-krotnie droższa); 2) modyfikowane fosforamidyty są często otrzymywane w małych ilościach; oraz 3) ilość marnowanego materiału przy użyciu automatycznego etapu rozcieńczania (ustawionego przez producenta) jest duża. Ponadto zastosowaliśmy: 1) dostępne na rynku stałe nośniki (np. CPG) zawierające chronioną zasadę nukleotydową pełniącą funkcję końca 3'; oraz 2) komercyjne fosforamidyty (kanoniczne zasady nukleotydowe) zabezpieczone grupą TBDMS w pozycji C2'-O. Szczegółowa lista etapów syntezy znajduje się w Rysunek 3 i Tabela 1, wraz z dalszym opisem i komentarzami do etapów, które zostały dostosowane do syntezy RNA. Ponadto, Rysunek 4 ilustruje stopniowe plony, które są obserwowane dla każdego kroku po wybraniu opcji 'Trityl Monitor', która określa ilościowo kation trytylu uwalniany z każdego etapu detrytylacji.
Warto zauważyć, że zazwyczaj z naszego doświadczenia wynika, że czynnikiem ograniczającym było uzyskanie fosforamidytu zawierającego pożądaną modyfikację. Oznacza to opracowanie syntetycznej metodologii, która pozwala na wprowadzanie modyfikacji w wybranych lokalizacjach. W niniejszym raporcie skupiamy się na włączeniu zmodyfikowanego nukleotydu, dla którego ustaliliśmy odpowiednią metodologię syntezy, grupę C2'-O-tiofenylometylu. Grupa ta jest niewielkich rozmiarów i w żaden sposób nie wpływa na syntezę w fazie stałej. Ponieważ doniesiono o włączeniu tej grupy do oligonukleotydów RNA, wraz z parametrami strukturalnymi i termodynamicznymi4, żadne aspekty syntezy organicznej prowadzącej do zmodyfikowanych fosforoamidynów nie zostaną opisane w niniejszym dokumencie.
Deprotekcja, Oczyszczanie i Charakteryzacja 
Deprotekcja amin egzocyklicznych i grup ß-cyjanoetylowych zachodzi na tym samym etapie, co rozszczepienie z żywicy CPG. Zastosowaliśmy powszechnie stosowane warunki ogrzewania otrzymanej żywicy w obecności wodnego roztworu AMA, a następnie rozszczepienia grup C2'-O-sililowych w obecności jonów fluorkowych, a następnie oczyszczenia za pomocą elektroforezy żelowej. Chociaż w wielu przypadkach stały się one warunkami standardowymi, modyfikacje, które są odporne na warunki podstawowe lub jony fluorkowe, mogą wymagać łagodniejszych warunków13,14, np. metanol/węglan potasu (MeOH/K2CO3) lub butyloamina. W związku z tym konieczny jest inny zestaw grup ochronnych na odpowiadających im fosforamidytach. Ponadto wybraliśmy elektroforezę jako preferowaną alternatywę do oczyszczania odchronionych oligomerów, biorąc pod uwagę nasze wcześniejsze doświadczenia z tą metodą i brak innych oprzyrządowań. Jednak HPLC może być alternatywnie stosowany jako skuteczna metoda15. Charakterystykę oczyszczonych oligonukleotydów przeprowadzono za pomocą spektrometrii mas, matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej czasu lotu (MALDI-TOF), przy użyciu procedury zgłoszonej przez naszą grupę16.
Charakterystyka strukturalna i stabilność termiczna otrzymanych dupleksów została przeprowadzona za pomocą płyty CD. W szczególności wykorzystujemy CD do określania termicznych przejść denaturacyjnych zmodyfikowanych i niemodyfikowanych oligonukleotydów RNA, śledząc spadek eliptyczności pasma przy ok. 270 nm, a także zanik pasma (o ujemnej eliptyczności) przyλ max przy 210 nm. Przedstawiono porównanie widm przed i po hybrydyzacji w celu zilustrowania ich różnic i walidacji zastosowanej metodologii. Zastosowanie CD jest powszechnie akceptowane w określaniu motywów strukturalnych w kwasach nukleinowych i aminokwasach17, a zatem może być stosowane jako narzędzie do określania różnych parametrów strukturalnych i termodynamicznych18; Nie ma jednak wielu przykładów, w których technika ta jest stosowana do oceny przemian denaturacji termicznej. Niektóre przypadki obejmują określenie stabilności termicznej na DNA zawierającym G-kwadrupleksy19,20 lub w dupleksach i spinkach do włosów RNA21.
Ten raport ma na celu dostarczenie czytelnikowi lub widzowi niebędącemu ekspertem zestawu narzędzi, które umożliwiają płynne rozpoczęcie tego typu badań. Będzie on służył do ulepszenia i porównania z metodologiami i technikami w innych laboratoriach badawczych, które są zaangażowane w tę ekscytującą gałąź nauki. Treść tego raportu uzupełnia istniejące protokoły tej technologii z różnych źródeł oraz wzbogaca i ułatwia korzystanie z niej dzięki pomocy wizualnej dla każdego kroku.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl 99,9%, Klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl 99,9%, bezwodny do sekwencjonowania DNA</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid, 99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian amonu, dwuzasadowy 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek amonu&nbsp; 98,0%, klasa ACS</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu 28 - 30% w wodzie, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra wysoka czystość</td><td>&nbsp; Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akryloamid Ultra czysty</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu, 97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny, klasy histologicznej</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa odwodnienie 100,2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, 36,5 - 38,0%, Certyfikowany ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, 99,9%,&nbsp; HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Metyloamina 40% w wodzie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-metylo-2-pirolidynon, iwodny, 99,5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Wkład studzienkowy (123 x 81 mm)&nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu, bezwodny 99,2%, Certyfikowany ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 100,5%, Certyfikowany ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny 99,0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2',4' Trietyloamina, 99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Trihydrofluorek trietyloaminy, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6'-trihydroksyacetofenon monohydrat 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do syntezy RNA: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka deblokująca, 3% kwas trichlorooctowy w dichlorometanie</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix A, THF/pirydyna/bezwodnik octowy</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix B, 10% 1-metyloimidazol w THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Aktywator, 0,25 M 5-etylotio-1H-tetrazol w bezwodnym acetonitrylu</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór utleniający, 0,02 M jod w THF/pirydynie/wodzie</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Fosforoamidyt&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Fosforoamidyn</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Fosforoamidyn</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Fosforoamidyt&nbsp;</td><td>Badania Glena</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół syntezy w fazie stałej oligomerów rna zawierających modyfikację 2'-o-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Synteza fazy stałej została wykorzystana do uzyskania kanonicznych i zmodyfikowanych polimerów kwasów nukleinowych, w szczególności DNA lub RNA, co uczyniło ją popularną metodologią do zastosowań w różnych dziedzinach i do różnych celów badawczych. Opisana w niniejszym dokumencie procedura koncentruje się na syntezie, oczyszczaniu i charakterystyce dodekamerów RNA 5'-[CUA CGG AAU CAU]-3' zawierających zero, jedną lub dwie modyfikacje zlokalizowane w pozycji C2'-O. Sondy są oparte na grupach 2-tiofenylometylowych, włączonych do nukleotydów RNA poprzez standardową syntezę organiczną i wprowadzonych do odpowiednich oligonukleotydów za pośrednictwem odpowiednich fosforamiditów. W niniejszym raporcie wykorzystano chemię fosforamidytów za pośrednictwem czterech kanonicznych zasad nukleotydowych (urydyna (U), cytozyna (C), guanozyna (G), adenozyna (A)), a także nukleotydy funkcjonalizowane 2-tiofenylometylemetylu zmodyfikowane w pozycji 2'-O; Metodologia ta jest jednak podatna na wiele różnych modyfikacji, które zostały opracowane na przestrzeni lat. Oligonukleotydy zsyntetyzowano na nośniku ze szkła o kontrolowanych porach (CPG), a następnie rozszczepiono z żywicy i zdeprotekowano w standardowych warunkach, tj. mieszaninie amoniaku i metyloaminy (AMA), a następnie fluorowodoru/trietyloaminy/N-metylopirolidynonu. Odpowiednie oligonukleotydy oczyszczono za pomocą elektroforezy poliakrylamidowej (20% denaturacji), a następnie elucji, odsalania i izolacji za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami (Sep-pak,C 18-kolumnowy). Ocenę ilościową i parametry strukturalne oceniono odpowiednio za pomocą analizy fotometrycznej w ultrafiolecie widzialnym (UV-vis) i dichroizmu kołowego (CD). Niniejszy raport ma służyć jako źródło informacji i przewodnik dla początkujących i doświadczonych badaczy zainteresowanych rozpoczęciem pracy w tej dziedzinie. Oczekuje się, że będzie on służył jako praca w toku w miarę opracowywania nowych technologii i metodologii. Opis metodologii i technik zawartych w tym dokumencie odpowiada syntezatorowi DNA/RNA (odnowionemu i zakupionemu w 2013 r.), który wykorzystuje chemię fosforamidytu.

Opisano syntezę dodekamerów RNA zawierających zero, jedną lub dwie modyfikacje 2-tiofenylometylowe w pozycji C2'-O, wraz z odpowiadającym im oczyszczaniem i charakterystyką. Ponadto zamieszczono szczegółowy opis analizy strukturalnej przeprowadzonej za pomocą CD.
Cztery nici RNA (w tym nić o sekwencji komplementarnej) otrzymano za pomocą syntezy na fazie stałej, po której nastąpiło oczyszczanie, dając wydajność od 300 d...

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Ogólnym celem niniejszego raportu jest przedstawienie procedury otrzymywania oligonukleotydów RNA za pomocą syntezy na fazie stałej. W ramach modeli zsyntezyzowane zostaną dodekamery RNA, a następnie zaprezentowane zostanie ich oczyszczanie i charakterystyka. Dzięki komponentowi wizualnemu publikacja ta poszerzy zakres metodologii i zaplecza technicznego dostępnego dla badaczy z różnych dziedzin.Udostępnienie pomocy wizualnej wraz z krótkim protokołem umożliwi badaczom zastosowanie tych technik. Jedną z zalet tej metody jest jej podatność na szeroki zakres modyfikacji. W obliczu coraz bardziej wymagających współczesnych zastosowań, opracowanie standardowego protokołu jest niezwykle istotne.Chemia fosforamidytowa przeżywa obecnie renesans ze względu na niezawodność tej metody oraz potencjał w uzyskiwaniu oligonukleotydów do zastosowań terapeutycznych. Choć zakup gotowych oligonukleotydów jest atrakcyjny, cena i dostępność modyfikacji sprawiają, że wzrasta zainteresowanie samodzielnym przygotowywaniem tych oligomerów, co nadaje tej procedurze najwyższą wagę. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odważyć każdy fosforamidyt do wysuszonych w piecu 10-mililitrowych butelek z ciemnego szkła i zamknąć każdą butelkę septem uprzednio perforowanym igłą 20G.Butelki należy niezwłocznie umieścić w próżni, korzystając z eksykatora zawierającego środek osuszający. Po napełnieniu eksykatora suchym argonem, należy wyjąć każdą butelkę i niezwłocznie dodać bezwodny acetonitryl, a następnie zamocować je na syntezatorze peptydów w fazie stałej. Następnie należy usunąć septa z każdej butelki i ustawić je na syntezatorze za pomocą funkcji wymiany butelek.Aby skonfigurować syntezę w fazie stałej, wybierz ikonę oprogramowania. Wybierz nazwę syntezatora i kliknij OK. Następnie utwórz nową syntezę, wybierając Plik, a potem Nowe zamówienie na syntezę. W kolejnym kroku w oknie polecenia wprowadź datę uruchomienia, klienta oraz identyfikator uruchomienia. Wybierz instrument, nazwę sekwencji oraz sekwencję.W karcie Cycle przypisz wcześniej utworzoną metodę. Następnie wybierz procedurę końcową End Procedure, która pozostawia oligonukleotyd związany z żywicą CPG. Wybierz opcję DMT Off.Zapisz plik, wybierając Plik, a następnie Zapisz jako. Następnie nadaj eksperymentowi nazwę i kliknij Zapisz. W kolejnym kroku prześlij plik, aby rozpocząć syntezę, wybierając Zamówienie, a następnie Prześlij zamówienie do syntezatora. W oknie komunikatu wybierz pozycję kolumny i kliknij OK. W oknie Syntezator wybierz Monitor tritylu.Kliknij „Choose Function”, a następnie wybierz „Trityl Monitor” dla każdego etapu, wpisując 1. Rozpocznij syntezę, wybierając „Synthesizer” oraz „Prepare to Start”. Umieść kolumny z pożądanym końcem 3' w pozycjach wskazanych na urządzeniu.Następnie kliknij Start oraz No na urządzeniu. Po zakończeniu syntezy wyjmij kolumnę z urządzenia i umieść ją w kolbie okrągłodnej. Susz kolumnę pod zmniejszonym ciśnieniem przez około 0,5 godziny.Przenieś białą żywicę z kolumny do probówki wirówkowej o pojemności 1,6 ml i dodaj 0,5 ml wodnego roztworu metyloaminy i amoniaku. Zabezpiecz zakrętkę probówki parafilmem i podgrzewaj zawartość w temperaturze 60 °C przez półtorej godziny. Na wierzchu probówek umieść ciężki przedmiot, aby zapewnić stałe stężenie.Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, krótko odwiruj próbkę, aby osadzić zawartość na dnie. Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki wirówkowej. Ochłodź probówkę do 70 stopni Celsjusza, umieszczając ją w kąpieli z etanolu i suchego lodu na pięć minut, a następnie odparuj do sucha przy użyciu koncentratora próżniowego typu speed vac.Następnie zawiesinę w postaci ciał stałych resuspenderować w 0,4 ml roztworu triwodorku fluorku aminy, a następnie zabezpieczyć zakrętkę folią laboratoryjną. Podgrzewać roztwór w temperaturze 60 °C przez półtorej godziny. Na wierzchu probówek umieścić ciężki przedmiot, aby zapewnić stałe stężenie.Po ochłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej należy dodać 0,04 ml roztworu octanu sodu, a następnie delikatnie wymieszać go końcówką pipety. Należy dodać 1 ml etanolu i schłodzić roztwór do temperatury około -70 °C w kąpieli z suchego lodu i etanolu przez 15 minut. Następnie roztwór należy odwirować z prędkością 15 000 RPM w temperaturze 4 °C przez dziesięć minut.Za pomocą pipety należy odessać nadsącz, a otrzymany osad wysuszyć pod zmniejszonym ciśnieniem. Po wysuszeniu otrzymany ciało stałe należy zawiesić w buforze do nakładania i mieszać do uzyskania jednorodnego roztworu. Następnie zawiesinę należy nanieść na wcześniej przygotowany żel poliakrylamidowy.Przeprowadzaj prąd przez żel, aż marker błękitny bromotymolowy znajdzie się na wysokości od połowy do dwóch trzecich długości żelu. Po wyjęciu żelu ze stojaka przenieś jego zawartość ze szkła na folię spożywczą i połóż ją na płytce do cienkowarstwowej chromatografii pokrytej krzemionką, aby zwizualizować prążki za pomocą lampy UV. Za pomocą markera zaznacz pozycję górnego prążka, a następnie wytnij go za pomocą żyletki.Umieść żel zawierający RNA w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i rozdrobnij go na małe kawałki za pomocą szklanej rurki. Następnie zawieś pozostałości żelu w wodnym roztworze chlorku sodu i inkubuj zawiesinę wstrząsając w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml, a następnie wiruj przy 3400 RPM przez dziesięć minut.Aby odsolić próbkę za pomocą kartridża C18 w odwróconej fazie, najpierw należy przemyć kartridż acetonitrylem, wodą, wodnym roztworem chlorku amonu oraz roztworem RNA, pozostawiając pozostałości żelu wewnątrz. Po przemyciu wodą, eluj RNA z kolumny, używając trzech mililitrów 60% wodnego roztworu metanolu, zbierając frakcje do trzech różnych probówek. Schłódź probówki do -70 °C w kąpieli z suchego lodu przez pięć minut, a następnie odparuj zawartość do suchości za pomocą koncentratora próżniowego (speed vac).Po odparowaniu eluantu pod zmniejszonym ciśnieniem, ponownie rozpuść osad w 0,3 ml wody wolnej od RNaz. Po rozcieńczeniu roztworu, nanieś jeden µL na urządzenie do spektroskopii UV-vis, aby zmierzyć widmo UV-vis w zakresie od 200 do 450 nm. Do analizy MALDI-TOF najpierw przemyj końcówkę pipety C18 50% acetonitrylem.Równoważ napięciowo końcówkę pipety za pomocą 0,1% kwasu trifluorooctowego. Następnie nabierz do końcówki pipety roztwór zawierający od 100 do 150 pikomoli próbki. Po przemyciu końcówki pipety 0,1% TFA i wodą, eluuj próbkę do roztworu zawierającego odpowiednią macierz.Nanieś 0,9 µL roztworu na płytkę MALDI i pozostaw próbkę do wyschnięcia. W celu analizy struktury RNA przenieś próbkę zawierającą RNA do mikrokuwety i umieść ją w automatycznym podajniku próbek spektropolarymetru do dichroizmu kołowego. Otwórz butlę z azotem, aby uzyskać przepływ, który przesunie pływak powietrza w urządzeniu do wartości około 40.Następnie włącz chłodziarkę. Teraz włącz urządzenie. Uruchom oprogramowanie, klikając ikonę Spectrum Manager, a następnie otwórz okno akwizycji, klikając Spectrum Measurement.Po przedmuchaniu instrumentu azotem, zarejestruj widma dichroizmu kołowego, wybierając opcje Measure oraz Parameters. W zakładce General wybierz zakres skanowania 200-350 nanometrów, kanały CD i HT, krok pomiarowy 0.1 nanometra, prędkość skanowania 100 nanometrów na minutę, szerokość pasma jeden nanometr oraz pięć powtórzeń w celu uśrednienia sygnału. W zakładce Cell Unit wybierz temperaturę 20 stopni Celsjusza.W karcie Control zaznacz opcję Shutter is opened and closed automatically. W karcie Information wprowadź nazwę próbki, operatora, stężenie oraz rozpuszczalnik. W karcie Data przejdź do wybranego folderu i kliknij OK. Pozyskaj widma, klikając Measure, a następnie Sample Measurement.Na koniec należy określić pozycje kuwet w próbniku od pierwszej do szóstej i kliknąć OK. Cztery nici RNA otrzymano metodą syntezy w fazie stałej, a oczyszczanie pozwoliło na uzyskanie od 300 do 700 nanomoli każdego oligonukleotydu. Tutaj przedstawiono chromatogramy MALDI-TOF otrzymanych oligonukleotydów. Porównanie pasma przy 260 nanometrach dla oligonukleotydów kanonicznych i zmodyfikowanych nie wykazuje istotnych różnic w znormalizowanych widmach UV-vis, niezależnie od tego, czy porównuje się próbki jednoniciowe, czy struktury dupleksowe.Zaobserwowano jednak niewielkie zmiany podczas pomiaru ich widm dichroizmu kołowego. Ponadto pomiary Tm dla trzech struktur dupleksowych wykazały wyraźną wartość, która wskazywała na destabilizację wywołaną wprowadzeniem modyfikacji orto-fenylometylowej przy pozycji 2' w jednej z nici. Należy pamiętać, że wydajność syntezy na fazie stałej zależy od czystości odczynników.Wilgoć będzie miała negatywny wpływ na każdy etap, ponieważ ilość obecnej wody musi być w każdej chwili kontrolowana. Przedstawiona metodologia ma służyć jako ogólny zasób dla naukowców. Technika może się różnić w zależności od pożądanej modyfikacji, dostępnej aparatury lub ograniczeń czasowych.Rodzaj chemii zastosowany w niniejszej pracy reprezentuje bardzo solidną metodologię, która jest wykorzystywana od lat 80. i wciąż znajduje szerokie zastosowanie zarówno w środowisku akademickim, jak i przemysłowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić syntezę, oczyszczanie i charakteryzację własnych zmodyfikowanych lub kanonicznych oligonukleotydów RNA lub DNA. Pamiętaj, że praca z niezbędnymi odczynnikami może być niebezpieczna, dlatego przez cały czas należy nosić odzież ochronną, taką jak okulary ochronne, rękawiczki i fartuchy laboratoryjne.Wszystkie odczynniki należy traktować z ostrożnością, a w razie potrzeby używać ich w dygestorium.

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Fotostabilne barwniki cyjaninowe są dołączane do oligonukleotydów w celu monitorowania hybrydyzacji poprzez transfer energii.

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Tutaj prezentujemy protokół, aby zademonstrować skuteczną metodę syntezy spirocyklicznych heterocykli. Pięcioetapowy proces wykorzystuje syntezę w fazie stałej i regenerację strategii łącznika Michaela. Generalnie trudna do syntezy, przedstawiamy konfigurowalną metodę syntezy cząsteczek spirocyklicznych, która w inny sposób jest niedostępna dla innych nowoczesnych podejść.

Synteza oksymów spirocyklicznych w fazie stałej [4.4]

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Przedstawiamy protokół do pomiaru dynamiki mikro- do milisekundowej na 13C/15N-znakowanych i nieznakowanych RNA za pomocąspektroskopii 1 H R1ρ spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z dyspersją relaksacyjną. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu próbek o wysokiej czystości i konfiguracji eksperymentów NMR.

Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

Naucz się syntezy RNA w fazie stałej dodekamerów z modyfikacją 2'-O-tiofenylometylu oraz ich oczyszczania i charakteryzacji dichroizmem kołowym. Metoda umożliwia badanie struktury kwasów nukleinowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego (Wideo) | JoVE Journal

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Przeglądaj więcej filmów