Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Ogólnym celem niniejszego artykułu jest zilustrowanie procedury otrzymywania oligonukleotydów RNA w procesie syntezy w fazie stałej. Dodekamery RNA zostaną zsyntetyzowane jako modele, a także zademonstrowane zostanie ich oczyszczanie i charakterystyka. Poprzez swój komponent wizualny publikacja ta poszerzy zakres metodologii i udogodnień wykorzystywanych przez badaczy w różnych dziedzinach.

Zapewnienie pomocy wizualnej wraz z odrobiną protokołu umożliwi naukowcom zastosowanie tych technik. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość dostosowania jej do szerokiej gamy modyfikacji. Ponieważ dzisiejsze aplikacje stają się coraz bardziej wymagające, ważne jest, aby mieć standardowy protokół.

Chemia fosforoamidytów przeżywa odrodzenie ze względu na solidność metody i jej potencjał w zakresie otrzymywania oligonukleotydów do zastosowań terapeutycznych. O ile zakup oligonukleotydów jest atrakcyjny, o tyle cena i dostępność modyfikacji skłaniają zainteresowanie do przygotowywania tych oligomerów we własnym zakresie, co sprawia, że procedura ta ma ogromne znaczenie. Aby rozpocząć tę procedurę, zważ każdy fosforoamidyn do wysuszonych w piekarniku 10-mililitrowych bursztynowych butelek i zakręć każdą butelkę przegrodą uprzednio perforowaną igłą o rozmiarze 20.

Umieścić butelki natychmiast pod próżnią za pomocą eksykatora zawierającego środek suszący. Po napełnieniu eksykatora suchym argonem należy wyjąć każdą butelkę i natychmiast dodać bezwodny acetonitryl przed przymocowaniem do syntezatora peptydów w fazie stałej. Następnie wyjmij przegrody z każdej butelki i umieść je na syntezatorze za pomocą funkcji zmiany butelki.

Aby skonfigurować syntezę w fazie stałej, wybierz ikonę oprogramowania. Wybierz nazwę syntezatora i kliknij OK. Następnie utwórz nową syntezę, wybierając pozycję Plik i pozycję Nowa kolejność syntezy. Następnie użyj okna monitu, aby wprowadzić datę uruchomienia, klienta i identyfikator uruchomienia.Wybierz instrument, nazwę sekwencji i sekwencję.

Na karcie Cykl przypisz wcześniej utworzoną metodę. Następnie wybierz instrukcję End Procedure, która pozostawia oligonukleotyd związany z żywicą CPG. Wybierz opcję DMT Wyłączone.

Zapisz plik, wybierając pozycję Plik i Zapisz jako.Następnie podaj nazwę eksperymentu i kliknij przycisk Zapisz. Następnie wyślij plik, aby rozpocząć syntezę, wybierając Order i Send Order to Synthesizer. W oknie monitu wybierz pozycję kolumny i kliknij OK. W oknie Syntezator wybierz Trityl Monitor.

Kliknij Wybierz funkcję, a Trityl Monitor co kroku, wpisując 1. Rozpocznij syntezę, wybierając pozycję Syntezator i Przygotuj do rozpoczęcia. Umieść kolumny z żądanym trzema pierwszymi końcami w miejscach wskazanych na instrumencie.

Następnie kliknij Start i Nie na instrumencie. Po zakończeniu syntezy wyjmij kolumnę z instrumentu i umieść ją w kolbie okrągłodennej. Suszyć kolumnę pod zmniejszonym ciśnieniem przez około 0,5 godziny.

Przenieś białą żywicę z kolumny do 1,6-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj 0,5 mililitra wodnego roztworu metyloaminy i amoniaku. Zabezpiecz nakrętkę probówki wirówkowej parafilmem i podgrzewaj zawartość do 60 stopni Celsjusza przez półtorej godziny. Umieść ciężki przedmiot na probówkach, aby upewnić się, że stężenie jest utrzymywane na stałym poziomie.

Po schłodzeniu do temperatury pokojowej należy krótko odwirować próbkę w celu odwirowania zawartości. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej. Schłodzić probówkę do 70 stopni Celsjusza, umieszczając ją w kąpieli etanolowej z suchym lodem na pięć minut, a następnie zagęścić do wyschnięcia za pomocą koncentratora speed vac.

Teraz ponownie zawieś ciała stałe w 0,4 mililitra roztworu trihydrafluorku aminy, a następnie zabezpiecz nakrętkę folią laboratoryjną. Podgrzej roztwór do 60 stopni Celsjusza przez półtorej godziny. Umieść ciężki przedmiot na rurkach, aby zapewnić stałą koncentrację.

Po schłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej dodać 0,04 mililitra roztworu octanu sodu, a następnie delikatnie wymieszać końcówką pipety. Dodaj jeden mililitr etanolu i schłodzić roztwór do około 70 stopni Celsjusza w kąpieli etanolowej z suchym lodem przez 15 minut. Następnie odwiruj roztwór z prędkością 15 000 obr./min w czterech stopniach Celsjusza przez dziesięć minut.

Za pomocą pipety wyekstrahować supernatant i wysuszyć powstały osad pod zmniejszonym ciśnieniem. Po wysuszeniu ponownie zawiesić otrzymaną fazę stałą i bufor ładujący i mieszać do uzyskania jednorodnej konsystencji. Następnie zawiesinę należy załadować na wcześniej przygotowany żel poliakrylamidowy.

Przeciągnij prąd przez żel, aż niebieski marker brometymolowy znajdzie się między połową a dwiema trzecimi żelu. Po wyjęciu żelu ze stojaka przenieś zawartość żelu ze szkła na folię i umieść na cienkowarstwowej płytce chromatograficznej pokrytej krzemionką, aby uwidocznić pasma za pomocą lampy UV. Użyj markera, aby wyznaczyć pozycję, w której znajduje się górny pasek, i przetnij go za pomocą żyletki.

Umieść żel zawierający RNA w 50-mililitrowej stożkowej probówce i zmiażdż go na małe kawałki za pomocą szklanego pręta. Teraz zawiesić pozostałości żelu w wodnym roztworze chlorku sodu i wstrząsać zawiesiną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj z prędkością 3400 obr./min przez dziesięć minut.

Aby odsolić próbkę za pomocą wkładu C18 z odwróconą fazą, należy najpierw umyć wkład acetonitrylem, wodą, wodnym roztworem chlorku amonu i roztworem RNA, pozostawiając pozostałości żelu. Po umyciu wodą wymyj RNA z kolumny za pomocą trzech mililitrów 60% wodnego roztworu metanolu do trzech różnych probówek. Schłodzić probówki do 70 stopni Celsjusza w łaźni suchego lodu przez pięć minut, a następnie skoncentrować zawartość do sucha za pomocą koncentratora speed vac.

Po zagęszczeniu eluantu pod zmniejszonym ciśnieniem należy ponownie rozpuścić pozostałość w 0,3 mililitra wody wolnej od RNaz. Po rozcieńczeniu roztworu nałóż jeden mikrolitr na przyrząd UV/vis, aby zmierzyć widmo UVVIS od 200 do 450 nanometrów. W celu analizy MALDI-TOF należy najpierw umyć końcówkę pipety C18 50% acetonitrylem.

Wyrównać końcówkę pipety z 0,1% kwasem trifluorooctowym. Następnie napełnić końcówkę pipety roztworem zawierającym od 100 do 150 pikomoli próbki. Po umyciu końcówki pipety 0,1% TFA i wodą, eluować próbkę do roztworu zawierającego pożądaną matrycę.

Umieścić 0,9 mikrolitra roztworu na płytce MALDI i pozostawić próbkę do wyschnięcia. W celu analizy struktury RNA należy przenieść próbkę zawierającą RNA do mikrokuwety i umieścić w zmieniaczu próbek przyrządu do dichroizmu kołowego. Otwórz zbiornik azotu, aby zapewnić przepływ, który przesuwa pływak powietrza znajdujący się na instrumencie do około 40.

Następnie włącz chłodnicę. Teraz włącz instrument. Otwórz oprogramowanie, klikając ikonę Spectrum Manager, a następnie otwórz okno Akwizycja, klikając Pomiar widma.

Po oczyszczeniu instrumentu azotem uzyskaj kołowe widma dichroizmu, wybierając Pomiar i Parametry. Na karcie Ogólne wybierz 200-350 nanometrów dla skanowania, CD i HT dla kanałów, 0,1 nanometra dla wysokości danych, 100 nanometrów na minutę dla szybkości skanowania, jeden nanometr dla przepustowości i pięć dla liczby akumulacji. Na karcie Cell Unit (Jednostka komórki) wybierz 20 stopni Celsjusza.

Na karcie Sterowanie wybierz opcję Migawka jest otwierana i zamykana automatycznie. Na karcie Informacje wprowadź nazwę próbki, operatora, stężenie i rozpuszczalnik. Na karcie Dane przejdź do żądanego folderu i kliknij OK. Uzyskaj widma, klikając Pomiar i Pomiar próbki.

Na koniec określ pozycje kuwet w podajniku próbek od pierwszej do szóstej i kliknij przycisk OK. Cztery nici RNA uzyskano w drodze syntezy w fazie stałej, a po oczyszczeniu uzyskano od 300 do 700 nanomoli każdego oligonukleotydu. Chromatogramy oligonukleotydów MALDI-TOF są pokazane tutaj. Nie obserwuje się większej różnicy w znormalizowanych widmach UV vis z porównania pasma przy 260 nanometrach z kanonicznymi i zmodyfikowanymi oligonukleotydami, niezależnie od tego, czy porównuje się próbki jednoniciowe, czy struktury dupleksowe.

Jednak niewielkie zmiany obserwuje się po pomiarze ich kołowych widm dichroizmu. Ponadto, pomiary Tm trzech struktur dupleksowych wykazały wyraźną wartość, która wskazywała na destabilizację wywołaną przez włączenie dwóch głównych modyfikacji othyo fenylometylu na jednej z nici. Należy pamiętać, że wydajność syntezy w fazie stałej zależy od czystości odczynnika.

Wilgoć będzie miała negatywny wpływ na każdy krok, ponieważ ilość obecnej wody musi być odczynnikiem przez cały czas. Przedstawiona metodologia ma służyć jako ogólne źródło informacji dla naukowców. Technika może się różnić w zależności od pożądanej modyfikacji, dostępnego oprzyrządowania lub ograniczeń czasowych.

Rodzaj chemii zastosowany w tym artykule reprezentuje bardzo solidną metodologię, która jest stosowana od lat 80. XX wieku i nadal jest intensywnie stosowana zarówno w środowisku akademickim, jak i przemysłowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić syntezę, oczyszczanie i charakteryzację własnych zmodyfikowanych lub kanonicznych oligonukleotydów RNA lub DNA. Nie zapominaj, że praca z niezbędnymi odczynnikami może być niebezpieczna, a sprzęt ochronny, taki jak okulary ochronne, rękawice i fartuchy laboratoryjne, powinien być noszony przez cały czas.

Ze wszystkimi odczynnikami należy obchodzić się ostrożnie, a w razie potrzeby wewnątrz dygestorium.