Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK. Metodę tę można stosować do monitorowania pacjentów z funkcjonalnym lub klasycznym niedoborem komórek NK. Głównymi zaletami tej techniki opartej na cytometrii przepływowej są jej czułość, powtarzalność oraz szybkość w porównaniu do standardowych metod oceny funkcji komórek NK, takich jak test uwalniania radioaktywnego chromu.

Metoda ta może być wykorzystana do testowania nowych terapii celowanych w komórki NK, a także do prowadzenia wcześniej nieosiągalnych, pogłębionych, wieloparametrycznych analiz cytometrycznych biologii komórek NK. Należy rozpocząć od zastosowania separacji w gradiencie gęstości w celu wyizolowania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z próbek krwi pełnej zgodnie ze standardowymi protokołami. Wykorzystanie PBMC zamiast oczyszczonych komórek NK jest bardzo korzystne w przypadku pracy z materiałem klinicznym.

Rozcieńczyć wyizolowane komórki w pożywce kompletnej do stężenia 5×10⁶ komórek/ml, a następnie niezwłocznie zebrać docelowe komórki K562 poprzez wirowanie. Ponownie zawiesić 5×10⁵ komórek K562 w 500 µl świeżej pożywki uzupełnionej o 1% FBS. Następnie oznakować komórki docelowe za pomocą 500 µl roztworu roboczego CFSE i delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując roztwór od trzech do pięciu razy.

Po 10 minutach w temperaturze 37°C, w warunkach chronionych przed światłem, przerwać reakcję znakowania, dodając 10 ml pełnej pożywki i inkubując przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji przerywającej zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie zawiesić osad oznakowanych komórek docelowych w 1 ml pełnej pożywki w celu ich policzenia. Następnie rozcieńczyć komórki w świeżej pełnej pożywce do stężenia 1×10⁵ komórek/ml i umieścić komórki docelowe w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.

Aby zapewnić pomyślny przebieg testu, należy zminimalizować stres komórek docelowych i przetestować komórki efektorowe jak najszybciej po ich zebraniu. W ciągu 30 minut od znakowania komórek docelowych należy opisać płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U, przeznaczoną do hodowli tkankowej, zgodnie z tabelą. Następnie należy dodać 100 µL pożywki kompletnej do dołków z proporcjami komórek efektorowych do docelowych 25:1, 12,5:1 oraz 6,25:1, do dołków zawierających wyłącznie komórki docelowe oraz do dołków zawierających wyłącznie komórki efektorowe.

Dodaj 100 µL komórek efektorowych do studzienek kontroli cytotoksyczności oraz do studzienek o stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych 50:1 i 25:1. Następnie, zaczynając od studzienki o stosunku 25:1, przenieś 100 µL komórek do studzienki o kolejno niższym stosunku komórek w dwóch następnych studzienkach, pomijając studzienki zawierające wyłącznie komórki docelowe; dokładnie wymieszaj zawartość przed każdym przeniesieniem komórek, a ostatnie 100 µL komórek dodaj do studzienek zawierających wyłącznie komórki efektorowe. Dodaj 100 µL 2X 0,2% roztworu roboczego Tween do studzienek dodatniej kontroli śmierci komórek K562 z samym Tween.

Do studzienek z kontrolą pozytywną cytotoksyczności komórek NK dodaj 30 µL roztworu roboczego z fiolki dwa. Następnie do wszystkich studzienek, z wyjątkiem tych zawierających wyłącznie komórki efektorowe, dodaj 10⁵ komórek docelowych K562 na ml w 100 µL pożywki kompletnej. Po wysianiu wszystkich komórek wymieszaj zawartość wszystkich studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.

Osadź komórki poprzez krótkie wirowanie i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowej na cztery godziny. Po zakończeniu inkubacji umieść płytkę na lodzie lub na chłodzącej platformie, a następnie dodaj 50 µL świeżo przygotowanego barwnika do martwych komórek do każdego dołka. Następnie delikatnie wymieszaj zawartość wszystkich dołków i przeanalizuj komórki metodą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa barwienia CFSE i barwienia komórek martwych po czterech godzinach hodowli w niskiej temperaturze, zgodnie z przedstawioną demonstracją, wykazuje, że w studzienkach zawierających wyłącznie komórki docelowe śmierć komórek wynosi 15% lub mniej. W studzienkach zawierających wyłącznie komórki efektorowe nie wykryto sygnału CFSE, a obserwowana śmierć komórek w tych studzienkach wyniosła mniej niż pięć procent. W tymczasie śmierć komórek w studzienkach z zabijaniem komórek docelowych indukowanym przez Tween zazwyczaj przekracza 85%. U pacjentów z defektem funkcji komórek NK obserwuje się zmniejszoną aktywność zabijania w większości lub we wszystkich testowanych stosunkach w porównaniu z osobami zdrowymi, co dowodzi, że komórki NK tych pacjentów wykazują zróżnicowaną redukcję cytotoksyczności, która koreluje ze spadającym stosunkiem komórek efektorowych do komórek docelowych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w sześć i pół godziny, wliczając w to dwie godziny przygotowania i wysiewania, cztery godziny inkubacji oraz 30 minut akwizycji danych. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o równoległym przygotowaniu komórek docelowych i efektorowych, aby zminimalizować czas oczekiwania między przygotowaniem komórek a rozpoczęciem wspólnej inkubacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK wobec znakowanych fluorescencyjnie komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.