Name: Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK. Ta metoda umożliwia szybką i czułą analizę funkcji komórek NK bez użycia materiałów radioaktywnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Jill Narciso, Centrum Immunogenetyki UCLA, za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

Próbki zostały pobrane zgodnie z wytycznymi etycznymi ustanowionymi przez UCLA Human Research Protection Program i zatwierdzone przez IRB.
1. Przygotowanie odczynników
UWAGA: O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie odczynniki powinny mieć możliwość zrównoważenia w temperaturze pokojowej przed użyciem. Wszystkie odczynniki muszą pozostać sterylne.
<ol>
	<li>Przygotuj 2x roztwór roboczy Tween-20 (tj. 0,2%), dodając 10 μl roztworu Tween-20 do 5 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) bez wapnia i magnezu za pomocą pipety p20.
	<ol>
		<li>Biorąc pod uwagę wysoką lepkość Tween-20, należy podjąć następujące kroki, aby zapewnić dokładność: zbieraj powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, nie zanurzaj całej końcówki, aby uniknąć przenoszenia, i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół w PBS, aby wypłukać cały Tween-20 z końcówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 2 μl roztworu podstawowego IL-2 (2,1E6 j.m./ml) do 198 μl kompletnej pożywki (tj. rozcieńczenie 1:100), czyli RPMI z 1% penicyliną-streptomycyną i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), a następnie przystąpić do dodatkowego rozcieńczenia 1:100, dodając 2 μl roztworu pośredniego IL-2 do 198 μl kompletnej pożywki, aby przygotować 7x roztwór roboczy (210 j.m./ml).</li>
	<li>Dodać 2 μl roztworu podstawowego CFSE (5 mM) do 500 μl zwykłej pożywki (RPMI). Wirować, odwirować w dół, aby usunąć krople z nakrętki, a następnie przystąpić do dodatkowego rozcieńczenia 1:20, dodając 50 μl roztworu pośredniego CFSE do 950 μl zwykłego RPMI, aby uzyskać 2x roztwór roboczy 1 μM. Dobrze wirować i chronić przed światłem.</li>
</ol>
2. Izolacja PBMC jako komórek efektorowych
UWAGA: Ten test został zatwierdzony do skutecznego użycia z całkowitą liczbą PBMC od zdrowych osób z grupy kontrolnej. Zaleca się jednak, aby zawartość komórek NK była weryfikowana przy każdym preparacie PBMC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ponadto objętość krwi pełnej do pobrania zależy od częstości występowania komórek NK w obwodowej krwi pełnej i może się ona różnić w zależności od osoby, szczególnie między zdrowymi dawcami a pacjentami.
<ol>
	<li>Zebrać co najmniej 4 ml ludzkiej krwi pełnej w probówkach do pobierania krwi w heparynizacji sodu lub litu. Próbki krwi należy przechowywać w temperaturze pokojowej po pobraniu i zużyć w ciągu 30 godzin od pobrania.</li>
	<li>Rozcieńczyć krew pełną 4 ml PBS (tj. równą objętość PBS w stosunku do krwi pełnej).</li>
	<li>Dodać 4 ml roztworu gradientu gęstości (patrz tabela materiałów) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew pełną na roztwór gradientu gęstości, przechylając probówkę.</li>
	<li>Wirować przy 650 x g przez 24 minuty przy wyłączonym hamulcu.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać warstwę komórek jednojądrzastych, która jest cienką białą warstwą poniżej górnej warstwy osocza i płytek krwi, do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość do 15 ml za pomocą PBS.</li>
	<li>Wirować przy 450 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml kompletnego podłoża.</li>
	<li>Użyj automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, aby policzyć komórki i dostosuj stężenie PBMC do 5x106 komórek/ml z kompletną pożywką.</li>
	<li>Sprawdź zawartość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej (patrz krok 4).</li>
	<li>Test należy rozpocząć w ciągu 30 minut. Komórki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 10 minut lub umieścić w nawilżonym inkubatorze z 5% sprężonym stężeniemCO2 w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek NK jako komórek efektorowych
UWAGA: Ta część protokołu jest alternatywą dla używania całkowitych PBMC jako komórek efektorowych. Typowa wydajność z 4 ml pełnej krwi od zdrowej osoby wynosi około 4x105 komórek NK, czyli około 5-15% PBMC, chociaż częstotliwość ta różni się w zależności od dawcy 21. Zaleca się przeprowadzenie kontroli czystości po izolacji.
<ol>
	<li>Zebrać co najmniej 4 ml ludzkiej krwi pełnej w probówkach do pobierania krwi w heparynizacji sodu lub litu. Weź 50 μl krwi pełnej do barwienia jako próbkę wstępnego wzbogacania.</li>
	<li>Dodać koktajl wzbogacający do próbek krwi w stężeniu 50 μl/ml (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać równą objętość PBS + 2% FBS, aby rozcieńczyć próbkę i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dodać 4 ml roztworu gradientu gęstości do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ostrożnie nałożyć rozcieńczoną próbkę na podłoże o gradiencie gęstości.</li>
	<li>Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut przy wyłączonym hamulcu.</li>
	<li>Ostrożnie zbierz warstwę wzbogaconych komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj komórki, zwiększając objętość do 50 ml za pomocą PBS + 2% FBS.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant i powtórzyć mycie.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml kompletnego podłoża.</li>
	<li>Za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru policz komórki i dostosuj stężenie do 5x105 komórek/ml. Pobrać 50 μl oczyszczonej zawiesiny komórkowej do barwienia jako próbkę po wzbogaceniu.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej do 10 minut lub umieść w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia.</li>
</ol>
4. Immunofenotypowanie do oceny zawartości komórek NK
<ol>
	<li>Używając łącznie 50 μl wyizolowanych PBMC, wstępnie wzbogaconej krwi pełnej lub oczyszczonych komórek NK, wybarwić przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem anty-CD56 jako markerem komórek NK. Markery dla innych typów komórek i linii genetycznych (tj. limfocytów T CD3+, limfocytów B CD19+) mogą być również włączone w celu oceny pochodzenia zanieczyszczenia, jeśli takie istnieje.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przemyć, dodając 2 ml PBS + 2% FBS.</li>
	<li>Wirować przy 450 x g przez 5 min.</li>
	<li>W przypadku komórek PBMC lub komórek NK należy odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS + 2% FBS.</li>
	<li>W przypadku próbek krwi pełnej należy przeprowadzić lizę krwinek czerwonych (RBC):
	<ol>
		<li>Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (31,75 g chlorku amonu + 4,16 g zasady Tris + 6,65 g EDTA, rozpuszczone w 5000 ml wody dejonizowanej).</li>
		<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powtórzyć płukanie dwukrotnie, odessać supernatant i ponownie zawiesić zlizowaną próbkę w 100 μl PBS + 2% FBS. 
		UWAGA: Liza RBC może być również wykonana przed barwieniem.</li>
		<li>Kontynuuj analizę cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Rozmrażanie, hodowla i zbieranie komórek docelowych K562
<ol>
	<li>Porcję 10 ml kompletnej pożywki przelać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozostawić do ogrzania w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do rozmrażania i hodowli komórek K562 należy używać wyłącznie pożywki wstępnie podgrzanej do temperatury 37 °C na wszystkich etapach.</li>
	<li>Umieścić jedną fiolkę z zamrożonymi komórkami K562 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż większość z nich zostanie rozmrożona.</li>
	<li>Przenieść częściowo rozmrożone komórki K562 do kompletnej pożywki, wstępnie podgrzanej do 37 °C, w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umyj wnętrze fiolki kriogenicznej wstępnie podgrzanym podłożem i dodaj płyn do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 140 x g przez 7 minut z włączonym hamulcem. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Podwielokrotnić odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej w celu zliczenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.</li>
	<li>Dostosuj stężenie do 1x10 5-2x105 komórek/ml i hoduj w nawilżanym inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 dni przed użyciem. Utrzymuj kulturę w tym zakresie gęstości nie dłużej niż 3 miesiące, a następnie rozmrozić nową podwielokrotność. Nigdy nie przekraczaj stężenia komórek 1x106 komórek/ml w hodowli.</li>
	<li>Do użycia w teście należy dobrze wymieszać kulturę komórkową K562 z pipetą serologiczną o pojemności 10 ml i usunąć podwielokrotność w celu policzenia i oceny żywotności komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym.
	<ol>
		<li>Jeśli żywotność jest mniejsza niż 85%, wykonaj następujące kroki usuwania martwych komórek.
		<ol>
			<li>W razie potrzeby dodać 15 ml roztworu gradientu gęstości do 50-mililitrowych probówek stożkowych. Zbierz wszystkie komórki z hodowli i powoli nakładaj zawiesinę komórek na roztwór gradientu gęstości, przechylając probówkę.</li>
			<li>Wirować przy 650 x g przez 24 minuty z wyłączonym hamulcem. Ostrożnie zebrać warstwę żywych komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość do 50 ml za pomocą PBS.</li>
			<li>Wirować przy 450 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki. Policz komórki i sprawdź ich żywotność (jak w ppkt 5.7).</li>
			<li>Hodowla w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 dni przed użyciem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać 5x105 komórek docelowych K562 i odwirować przy 140 x g przez 7 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 500 μl w pożywce z 1% FBS.</li>
</ol>
6. Etykietowanie komórek docelowych K562
UWAGA: Upewnij się, że komórki K562 są dobrze zawieszone przed dodaniem roztworu roboczego CFSE.
<ol>
	<li>Odpipetować 500 μl roztworu roboczego CFSE do 500 μl komórek K562 w celu uzyskania końcowego stężenia 0,5 μM. Używając tej samej końcówki o pojemności 1000-1250 μl, natychmiast wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 3-5 razy.</li>
	<li>Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 minut w ciemności. 
	UWAGA: Ponieważ czas opóźnienia wyrównania temperatury w inkubatorze jest dłuższy w porównaniu z łaźnią wodną, może być konieczne dostosowanie czasu inkubacji szczególnie dla objętości > 1 ml.</li>
	<li>Ugasić reakcję etykietowania za pomocą 10 ml kompletnej pożywki przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować znakowane komórki K562 przy 140 x g przez 7 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i doprowadź stężenie do 1x105 komórek/ml w kompletnym pożywce.</li>
	<li>Umieść komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia. Komórki można przechowywać w temperaturze pokojowej do 10 minut lub w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia. Nie przechowywać w lodówce.</li>
</ol>
7. Poszycie
UWAGA: Jeśli komórki NK są ograniczone, stężenie komórek K562 i NK może być zmniejszone o połowę, tak aby połowa komórek była posiewana w teście. Test daje porównywalne wyniki przy połowie liczby komórek (o ile proporcje są utrzymywane na stałym poziomie).
<ol>
	<li>W przypadku stosowania całkowitych PBMC, należy oznaczyć 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U, poddaną kulturze tkankowej, dla następujących warunków na studzienkę: (1) Efektor (E): Cel (T) = 50 : 1 + IL-2 - kontrola pozytywna cytotoksyczności komórek NK; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12,5 : 1; (5) E : T = 6,25 : 1; (6) T - tylko komórki docelowe - kontrola ujemna dla śmierci K562; (7) E - tylko ogniwa efektorowe; (8) T + Tween - Kontrola pozytywna dla zgonu z powodu K562</li>
	<li>W przypadku stosowania oczyszczonych komórek NK należy oznaczyć 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U, poddaną działaniu kultury tkankowej, dla następujących warunków na basenik: (1) Efektor (E): Cel (T) = 5: 1 + IL-2 - kontrola pozytywna cytotoksyczności komórek NK; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2,5 : 1; (4) E : T = 1,25 : 1; (5) E : T = 0,625: 1; (6) T - tylko komórki docelowe - kontrola ujemna dla śmierci K562; (7) E - tylko ogniwa efektorowe; (8) T + Tween - kontrola pozytywna w przypadku zgonu z powodu K562</li>
	<li>Dodać 100 μl kompletnej pożywki do warunków 3, 4, 5, 6, 7. Do tego i wszystkich kolejnych kroków (zalecane) należy używać pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Dodać 100 μl komórek efektorowych (PBMC przy 5x106 komórek/ml lub oczyszczonych komórek NK przy 5x105 komórek/ml) do warunków 1, 2, 3. Dodać ogniwa efektorowe dla warunków 4-7 przez seryjne rozcieńczenie. Nie zmieniaj końcówek z warunku na warunek.
	<ol>
		<li>Wymieszaj warunek 3, weź 100 μl i przenieś do warunku 4.</li>
		<li>Wymieszać warunek 4, pobrać 100 μl i przenieść do warunku 5.</li>
		<li>Wymieszać warunek 5, pobrać 100 μl i przenieść do warunku 7; Warunek 6 nie ma komórek efektorowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100 μL przygotowanego roztworu roboczego 2x 0,2% Tween do warunku 8 (stężenie końcowe: 0,1% Tween-20); warunek 8 nie posiada komórek efektorowych.</li>
	<li>Dodać 30 μl roztworu roboczego IL-2 do warunku 1. IL-2 należy dodać do zawiesiny komórek efektorowych przed dodaniem zawiesiny komórek docelowych (stężenie końcowe: 27 j.m./ml).</li>
	<li>Dodaj 100 μl komórek docelowych (oznaczonych komórkami K562 o wymiarach 1x105 komórek/ml) do warunków 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. Warunek 7 nie ma komórek docelowych.</li>
	<li>Wymieszać wszystkie studzienki pipetą wielokanałową i odwirować płytkę o masie 120 x g przez 2 min.</li>
	<li>Inkubować w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Pod koniec inkubacji umieścić płytkę na lodzie i w ciągu 30 minut przystąpić do barwienia żywotności.</li>
</ol>
8. Barwienie dla rentowności i przejęcia
<ol>
	<li>Przygotować barwienie martwych komórek (patrz tabela materiałów), dodając 3 μl roztworu podstawowego 5 μM do 600 μl PBS.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego barwienia martwych komórek do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 250 μl i końcowe stężenie 0,005 μM. Dobrze wymieszać pipetą wielokanałową.</li>
	<li>Kontynuuj analizę cytometrii przepływowej. Korzystając z cytometru przepływowego, zbierz co najmniej 1000 zdarzeń w bramce komórki docelowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), aby uzyskać statystycznie znaczące wyniki.</li>
</ol>

<ol><li>Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+NK+cell+responses+in+HIV+infection%3A+I.+NK+cell+receptor+genes+as+determinants+of+HIV+resistance+and+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS.</a> J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).</li>
<li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li>
<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+cytotoxicity%3A+how+do+they+pull+the+trigger%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li>
<li>Warren, H. S., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NK cells and apoptosis.</a> Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).</li>
<li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li>
<li>Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+mechanism+of+natural+killer+%28NK%29+degranulation+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity.</a> J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+natural+killer+cell+function+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Determination of natural killer cell function by flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
<li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), e89357(2014).</li>
<li>Oppenheim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyco-engineered+anti-EGFR+mAb+elicits+ADCC+by+NK+cells+from+colorectal+cancer+patients+irrespective+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy.</a> Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).</li>
<li>West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cytotoxic+reactivity+of+human+lymphocytes+against+a+myeloid+cell+line%3A+characterization+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells.</a> J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).</li>
<li>Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+CFSE-based+assay+to+determine+susceptibility+to+lysis+by+cytotoxic+T+cells+of+leukemic+precursor+cells+within+a+heterogeneous+target+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population.</a> Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).</li>
<li>Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometric+assay+for+quantitation+and+multiparametric+characterization+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity.</a> J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).</li>
<li>Carotta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NK+Cells+for+Anticancer+Immunotherapy%3A+Clinical+and+Preclinical+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches.</a> Front Immunol. 7, 152(2016).</li>
<li>Mandal, A., Viswanathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells%3A+In+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol+Stem+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells: In health and disease.</a> Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Application+of+Natural+Killer+Cell+Immunotherapy+for+the+Treatment+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer.</a> Front Immunol. 6, 578(2015).</li>
<li>Angelo, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+NK+cell+phenotyping+and+variability+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults.</a> Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).</li>
<li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays%3A+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li>
<li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+sex%2C+menstrual+cycle%2C+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li>
<li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Obes%22%5BJournal%5D)">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1(2015).</li>
<li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda stanowi prostą i opłacalną alternatywę dla tradycyjnego testu uwalniania 51Cr w celu oceny aktywności cytotoksycznej komórek NK. Ta metoda jest czuła, powtarzalna i mniej czasochłonna niż poprzednie standardowe metody, takie jak CRA, i może być stosowana zarówno do zastosowań klinicznych, jak i badawczych.
Chociaż test działa zarówno z całkowitymi PBMC, jak i wzbogaconymi komórkami NK, opcja użycia PBMC bez konieczności oczyszczania populacji komórek jest wielką...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">
to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Komórki NK są wyrafinowanym podzbiorem ludzkich wrodzonych limfocytów, które są krytycznie zaangażowane w eliminację komórek zakażonych wirusem, komórek transformowanych i innych zagrożeń chorobotwórczych 1,2. Granulki lityczne komórek NK zawierają białka cytotoksyczne, takie jak perforyna i granzymy. Po aktywacji komórki NK tworzą złożoną interakcję ze swoimi celami, znaną jako synapsa immunologiczna, w wyniku której te cząsteczki cytolityczne są lokalnie uwalniane, co powoduje bezpośrednią lizę i apoptozę komórek docelowych, wraz z uwalnianiem cytokin i chemokin, a ostatecznie indukcją stanu zapalnego 1,3,4.
Aktywacja komórek NK obejmuje złożony ciąg aktywujących i hamujących interakcji między receptorami komórek NK a ligandami wyrażającymi się na powierzchni komórek docelowych, tworząc ściśle regulowany system. Jednym z najlepiej zbadanych mechanizmów aktywacji komórek NK jest "brakujące ja". Rzeczywiście, brak wykrycia głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I lub cząsteczek ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) na zakażonych lub transformowanych komórkach wyzwala cytotoksyczność komórek NK. Komórki zakażone nowotworem i wirusem na ogół obniżają poziom tych antygenów, aby uniknąć odporności za pośrednictwem limfocytów T, stając się w ten sposób głównymi celami komórek NK 1,3,4.
Ocena funkcji komórek NK jest przede wszystkim podzielona na testy degranulacji lub cytotoksyczności. Jednak testy degranulacji, takie jak cytometryczne wykrywanie markera CD107a związanego z degranulacją, wskazują jedynie na aktywację komórek NK, a nie na ich ostateczną funkcję, bezpośrednie zabijanie komórek docelowych 5,6,7,8. W związku z tym to ograniczenie skłoniło badaczy do testów cytotoksyczności jako bardziej wymownej i bardziej bezpośredniej alternatywy.
Długotrwałym "złotym standardem" do oceny cytotoksycznej aktywności komórek T i NK za pośrednictwem komórek jest test uwalniania chromu (CRA). CRA polega na radioaktywnym znakowaniu komórek docelowych za pomocą 51Cr i współinkubowaniu ich z komórkami efektorowymi. Test ten opiera się na zasadzie, że liza komórek powoduje uwolnienie związanego z białkiem 51Cr do supernatantu, co można zmierzyć za pomocą zliczania promieni gamma. Ten test, choć skuteczny, jest problematyczny z wielu powodów: wysokie koszty materiałów, obchodzenie się i usuwanie radioaktywnego 51Cr, spontaniczne uwalnianie 51Cr i trudna standaryzacja - co czyni go całkowicie niepraktycznym 9,10.
Od tego czasu opracowano szereg testów nieradioaktywnych, obejmujących znakowanie fluorescencyjne, uwalnianie enzymów, a nawet bioluminescencję, jako alternatywy dla CRA 11,12,13,14. Opisujemy tutaj opartą na cytometrii przepływowej metodę pomiaru aktywności cytotoksycznej komórek NK na komórkach docelowych K562, która jest prosta, czuła i powtarzalna. Komórki K562 to ludzka erytroreukemiczna linia komórkowa o zmniejszonej ekspresji HLA klasy I i podwyższonej ekspresji ligandów dla aktywujących receptorów NK, co czyni je szczególnie podatnymi na cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK <klasa sup = "xref">15. W tym teście komórki K562 są wstępnie znakowane estrem sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE) i współhodowane w różnych proporcjach z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) lub oczyszczonymi komórkami NK <klasa sup = "xref">1. CFSE jest stabilnym, wiążącym białka barwnikiem fluorescencyjnym, który umożliwia odróżnienie komórek docelowych od efektorowych komórek NK 16,17. Po koinkubacji do identyfikacji zabitych komórek docelowych stosuje się barwienie kwasem nukleinowym, specyficznie przenikającym przez błonę martwych komórek (patrz tabela materiałów). Próbki są następnie pobierane na cytometrze przepływowym w celu określenia procentu martwych (tj. barwiących +) komórek docelowych CFSE +.
Ten test może być używany jako rutynowe badanie diagnostyczne dla monogenowych defektów wpływających na przedział komórek NK, z których istnieje około 30 znanych defektów powodujących funkcjonalny lub klasyczny niedobór komórek NK, oraz dla pierwotnej lub wtórnej limfohistiocytozy hemofagocytarnej. Jest również przydatny do badania aktywności komórek NK u pacjentów z nawracającymi, ciężkimi infekcjami wirusowymi opryszczki, do oceny rekonstytucji immunologicznej po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych lub po terapii immunomodulującej 18,19,20 oraz do wielu podstawowych zastosowań badawczych.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x, bez Ca2+ i Mg2+)</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>Roztwór podstawowy o stężeniu 10 000 U/ml</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>Liofilizowany od 0,2 &mu; m przefiltrowany roztwór w acetonitrylu i TFA z BSA jako białkiem nośnikowym. Rozpuść w 500 ul przy 100 &mu; g/ml w sterylnym 100 mM kwasie octowym zawierającym co najmniej 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (2,1x10E6 IU/ml)</td></tr><tr><td>Komórki K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>Linia komórek rakowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych T-75</td><td>Zestaw do</td><td></td> proliferacji komórek Corning 431464 <td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies (CellTrace)</td><td>C34554</td><td>Rozpuścić fiolkę I za pomocą 18 ul DMSO, aby przygotować roztwór podstawowy 5 mM. Nie zamrażać/nie rozmrażać.</td></tr><tr><td>Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td><td>Roztwór podstawowy jest dostępny pod adresem 5 &mu; M w 1 ml DMSO. Roztwór DMSO może być poddawany wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania bez degradacji odczynnika.</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi z heparyną sodowo-litową</td><td>BD</td><td>02-687-95</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery U</td><td>Corning</td><td>CLS3897</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki okrągłodenne z polistyrenu (5 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl wzbogacający ludzkie komórki NK</td><td>StemCell Technologies (RosetteSep)</td><td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek nk

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

W obrębie wrodzonego układu odpornościowego, limfocyty efektorowe znane jako komórki NK odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza przed nieprawidłowymi komórkami, w szczególności eliminując komórki nowotworowe i wirusowo zakażone. Około 30 znanych defektów monogenowych, wraz z wieloma innymi stanami patologicznymi, powoduje funkcjonalny lub klasyczny niedobór komórek NK, objawiający się zmniejszoną aktywnością cytotoksyczną lub jej brakiem. Historycznie rzecz biorąc, cytotoksyczność była badana metodami radioaktywnymi, które są uciążliwe, drogie i potencjalnie niebezpieczne. W artykule opisano uproszczoną, mającą zastosowanie kliniczne metodę opartą na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej komórek NK. W tym teście komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) lub oczyszczone preparaty komórek NK są inkubowane w różnych proporcjach z docelową linią komórek nowotworowych, o której wiadomo, że jest wrażliwa na cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK (NKCC). Komórki docelowe są wstępnie znakowane barwnikiem fluorescencyjnym, aby umożliwić ich odróżnienie od komórek efektorowych (komórek NK). Po okresie inkubacji zabite komórki docelowe są identyfikowane za pomocą barwienia kwasem nukleinowym, który specyficznie przenika do martwych komórek. Metoda ta nadaje się zarówno do zastosowań diagnostycznych, jak i badawczych, a dzięki wieloparametrowym możliwościom cytometrii przepływowej ma dodatkową zaletę, jaką jest potencjalne umożliwienie głębszej analizy fenotypu i funkcji komórek NK.

Przed przystąpieniem do analizy wysoce zaleca się ocenę zawartości komórek NK w wybranej populacji efektorowej. Rycina 1 przedstawia typowe barwienie CD56 przed (jasnoniebieski) i po (czerwony) wzbogaceniu populacji komórek NK. Komórki NK stanowią do 15% PBMC i po wzbogaceniu powinny charakteryzować się czystością na poziomie co najmniej 80%.
Analiza cytometryczna w tym teście obejmuje detekcję dwóc...

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK. Metodę tę można stosować do monitorowania pacjentów z funkcjonalnym lub klasycznym niedoborem komórek NK. Głównymi zaletami tej techniki opartej na cytometrii przepływowej są jej czułość, powtarzalność oraz szybkość w porównaniu do standardowych metod oceny funkcji komórek NK, takich jak test uwalniania radioaktywnego chromu.Metoda ta może być wykorzystana do testowania nowych terapii celowanych w komórki NK, a także do prowadzenia wcześniej nieosiągalnych, pogłębionych, wieloparametrycznych analiz cytometrycznych biologii komórek NK. Należy rozpocząć od zastosowania separacji w gradiencie gęstości w celu wyizolowania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z próbek krwi pełnej zgodnie ze standardowymi protokołami. Wykorzystanie PBMC zamiast oczyszczonych komórek NK jest bardzo korzystne w przypadku pracy z materiałem klinicznym.Rozcieńczyć wyizolowane komórki w pożywce kompletnej do stężenia 5×10⁶ komórek/ml, a następnie niezwłocznie zebrać docelowe komórki K562 poprzez wirowanie. Ponownie zawiesić 5×10⁵ komórek K562 w 500 µl świeżej pożywki uzupełnionej o 1% FBS. Następnie oznakować komórki docelowe za pomocą 500 µl roztworu roboczego CFSE i delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując roztwór od trzech do pięciu razy.Po 10 minutach w temperaturze 37°C, w warunkach chronionych przed światłem, przerwać reakcję znakowania, dodając 10 ml pełnej pożywki i inkubując przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji przerywającej zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie zawiesić osad oznakowanych komórek docelowych w 1 ml pełnej pożywki w celu ich policzenia. Następnie rozcieńczyć komórki w świeżej pełnej pożywce do stężenia 1×10⁵ komórek/ml i umieścić komórki docelowe w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.Aby zapewnić pomyślny przebieg testu, należy zminimalizować stres komórek docelowych i przetestować komórki efektorowe jak najszybciej po ich zebraniu. W ciągu 30 minut od znakowania komórek docelowych należy opisać płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U, przeznaczoną do hodowli tkankowej, zgodnie z tabelą. Następnie należy dodać 100 µL pożywki kompletnej do dołków z proporcjami komórek efektorowych do docelowych 25:1, 12,5:1 oraz 6,25:1, do dołków zawierających wyłącznie komórki docelowe oraz do dołków zawierających wyłącznie komórki efektorowe.Dodaj 100 µL komórek efektorowych do studzienek kontroli cytotoksyczności oraz do studzienek o stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych 50:1 i 25:1. Następnie, zaczynając od studzienki o stosunku 25:1, przenieś 100 µL komórek do studzienki o kolejno niższym stosunku komórek w dwóch następnych studzienkach, pomijając studzienki zawierające wyłącznie komórki docelowe; dokładnie wymieszaj zawartość przed każdym przeniesieniem komórek, a ostatnie 100 µL komórek dodaj do studzienek zawierających wyłącznie komórki efektorowe. Dodaj 100 µL 2X 0,2% roztworu roboczego Tween do studzienek dodatniej kontroli śmierci komórek K562 z samym Tween.Do studzienek z kontrolą pozytywną cytotoksyczności komórek NK dodaj 30 µL roztworu roboczego z fiolki dwa. Następnie do wszystkich studzienek, z wyjątkiem tych zawierających wyłącznie komórki efektorowe, dodaj 10⁵ komórek docelowych K562 na ml w 100 µL pożywki kompletnej. Po wysianiu wszystkich komórek wymieszaj zawartość wszystkich studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.Osadź komórki poprzez krótkie wirowanie i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowej na cztery godziny. Po zakończeniu inkubacji umieść płytkę na lodzie lub na chłodzącej platformie, a następnie dodaj 50 µL świeżo przygotowanego barwnika do martwych komórek do każdego dołka. Następnie delikatnie wymieszaj zawartość wszystkich dołków i przeanalizuj komórki metodą cytometrii przepływowej.Analiza cytometryczna przepływowa barwienia CFSE i barwienia komórek martwych po czterech godzinach hodowli w niskiej temperaturze, zgodnie z przedstawioną demonstracją, wykazuje, że w studzienkach zawierających wyłącznie komórki docelowe śmierć komórek wynosi 15% lub mniej. W studzienkach zawierających wyłącznie komórki efektorowe nie wykryto sygnału CFSE, a obserwowana śmierć komórek w tych studzienkach wyniosła mniej niż pięć procent. W tymczasie śmierć komórek w studzienkach z zabijaniem komórek docelowych indukowanym przez Tween zazwyczaj przekracza 85%. U pacjentów z defektem funkcji komórek NK obserwuje się zmniejszoną aktywność zabijania w większości lub we wszystkich testowanych stosunkach w porównaniu z osobami zdrowymi, co dowodzi, że komórki NK tych pacjentów wykazują zróżnicowaną redukcję cytotoksyczności, która koreluje ze spadającym stosunkiem komórek efektorowych do komórek docelowych.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w sześć i pół godziny, wliczając w to dwie godziny przygotowania i wysiewania, cztery godziny inkubacji oraz 30 minut akwizycji danych. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o równoległym przygotowaniu komórek docelowych i efektorowych, aby zminimalizować czas oczekiwania między przygotowaniem komórek a rozpoczęciem wspólnej inkubacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK wobec znakowanych fluorescencyjnie komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.

a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Ten film demonstruje aktywność lityczną komórek NK w stosunku do komórek docelowych barwionych fluorescencyjnie. Metoda ta umożliwia pomiar cytotoksyczności indukowanej komórkami NK poprzez barwienie martwych komórek i użycie cytometru przepływowego do ilościowego określenia żywych i martwych komórek docelowych.

Test cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej przepływowej

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Ta praca opisuje zaawansowany proces dokładnego i szybkiego określania liczby komórek NK (Natural Killer) i cytotoksyczności komórek NK w próbkach ludzkiej krwi.

Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej

Unikanie eliminacji za pośrednictwem komórek NK przez komórki rakowe jest ważne dla inicjacji i progresji raka. Tutaj przedstawiamy dwa protokoły nieoparte na radioaktywności do oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych wątroby. Dodatkowo przedstawiono trzeci protokół do analizy migracji komórek NK.

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

Protokół do badania zdarzeń wywołanych przez FcγRIIIa przez przeciwciała terapeutyczne w ludzkich komórkach NK jest opisany tutaj. Ta platforma sztucznej stymulacji umożliwia badanie dalszych funkcji efektorowych, takich jak degranulacja, produkcja chemokin/cytokin i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą części FcγRIIIa i Fc przeciwciał zaangażowanych w wiązanie.

Ocena zdarzeń związanych z ludzkimi komórkami NK wywołanych zaangażowaniem FcγRIIIa w obecności przeciwciał terapeutycznych

Protokół ten opisuje bezznacznikową metodę szybkiej analizy liczby i aktywności komórek NK (Natural Cell ) bez użycia soczewek przy użyciu technologii obrazowania cieni bez soczewek. Metoda ta określa ilościowo zmiany morfologiczne w poszczególnych komórkach NK poprzez komputerową analizę ich wzorów dyfrakcyjnych.

Wdrażana w terenie platforma obrazowania bez soczewek do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Poznaj test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK. Ta metoda umożliwia szybką i czułą analizę funkcji komórek NK bez użycia materiałów radioaktywnych.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Przeglądaj więcej filmów