Precyzyjna, wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii
19 września 2017
Ilościowa ocena wzrostu bakterii jest niezbędna do zrozumienia fizjologii drobnoustrojów jako zjawiska na poziomie systemu. Wprowadzono protokół manipulacji eksperymentalnej i podejście analityczne, pozwalające na precyzyjną, wysokoprzepustową analizę wzrostu bakterii, który jest kluczowym przedmiotem zainteresowania biologii systemów.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest precyzyjna analiza wzrostu bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Korzystając z tej procedury, można jednocześnie testować wiele pożywek lub różne szczepy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii systemów i mikrobiologii, takie jak: jakie są czynniki determinujące wzrost komórek.
Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom na precyzyjną ocenę globalnych parametrów maksymalnego tempa wzrostu i maksymalnej gęstości populacji w krzywych wzrostu komórek bakteryjnych. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w e. Wzrost Coli, może być również stosowany do innych mikroorganizmów, takich jak test wzrostu i badania przesiewowe bakterii środowiskowych.
Na początek umieść pięć wysterylizowanych szklanych probówek z korkami z gumy silikonowej, pipety i docelowe szczepy na czystej ławce. Wystawić wylot szklanej rurki na palnik Bunsena przed otwarciem korka z gumy silikonowej. Po otwarciu probówki wystawić korek z gumy silikonowej na działanie płomienia, a następnie delikatnie załóż nakrętkę z powrotem na szklaną rurkę.
Następnie użyj pipety elektronicznej i jednorazowej pipety serologicznej, aby dodać pięć mililitrów M63 do jednej ze szklanych probówek i 4,5 mililitra M63 do pozostałych czterech probówek. Użyj końcówki p200, aby wybrać kolonię i zaszczepić ją w szklanej probówce zawierającej pięć mililitrów M63. Zwiruj rurkę, aby uzyskać zawiesinę.
Następnie rozcieńczyć roztwór 10-krotnie, przenosząc 0,5 mililitra tego roztworu do jednej z czterech probówek zawierających 4,5 mililitra M63. Powtórz ten proces dla pozostałych probówek. Po wysterylizowaniu wylotów szklanych probówek i korków z gumy silikonowej, zakryj probówki korkami.
Następnie umieść pięć probówek we wstępnie podgrzanym inkubatorze do wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza i potrząśnij nim z prędkością 200 obr./min. Inkubuj kulturę przez noc lub przez 10 do 30 godzin. Po inkubacji dodaj 1 000 mikrolitrów M63 do jednorazowej kuwety z p1000.
Umieść jednorazową kuwetę w spektrofotometrze. Uruchom program na stałej długości fali 600 nanometrów i zmierz ślepą próbę. Przenieś pięć szklanych probówek z inkubatora do wytrząsania na czystą ławkę.
Wyrzuć M63 z jednorazowej kuwety i dodaj 1 000 mikrolitrów kultury do tej samej jednorazowej kuwety z p1000. Następnie zmierz zmętnienie optyczne hodowli komórkowej. Następnie dodaj 250 mikrolitrów wysterylizowanego 60% roztworu glicerolu i 750 mikrolitrów wybranej kultury komórkowej do 1,5 mililitrowej mikroprobówki i wymieszaj pipetując.
Umieść pozostałe dziewięć mikroprobówek w stojaku na mikroprobówki i dozuj 100 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny do każdej probówki. Przechowuj buliony w zamrażarce w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby skonfigurować czytnik mikropłytek, najpierw otwórz oprogramowanie, otwórz protokoły w menedżerze zadań i wybierz utwórz nowy.
Następnie wybierz protokół standardowy. Otwórz procedurę i dostosuj ustawienia. Otwórz ustawioną temperaturę i wybierz, inkubator włączony.
Następnie ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i gradient na zero stopni Celsjusza. Sprawdź rozgrzanie przed przejściem do następnego kroku. Otwórz start kinetyczny i ustaw czas pracy na 24 lub 48 minut, a następnie ustaw interwał 30 minut lub jedną godzinę.
Otwórz potrząsanie i ustaw tryb potrząsania jako liniowy. Sprawdź ciągłe potrząsanie i ustaw częstotliwość na 567 cpm. Następnie otwórz odczyt, sprawdź absorbancję, punkt końcowy/kinetyczny i monochromatory.
Ustaw długość fali na 600. Na koniec kliknij przycisk Zatwierdź, aby potwierdzić, że procedura jest poprawna. I kliknij Zapisz, aby zapisać go jako nowy program do wykorzystania w przyszłości.
Aby zarejestrować wzrost w czasie rzeczywistym, dodaj około 25 mililitrów M63 do wysterylizowanego zbiornika odczynnika. Następnie dodaj 900 mikrolitrów M63 do mikroprobówek, przygotowując się do wykonywania seryjnych rozcieńczeń. Następnie dodaj 900 mikrolitrów M63 do rozmrożonego bulionu glicerolowego i odwiruj.
Przenieść 100 mikrolitrów 10-krotnego rozcieńczenia do innej mikroprobówki zawierającej 900 mikrolitrów M63 i wiru. Powtarzaj ten krok, aż do uzyskania żądanej liczby rozcieńczeń. Teraz napełnij studzienki na krawędzi wysterylizowanej 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem 200 mikrolitrami M63 za pomocą ośmiokanałowej pipety.
Załadować 200 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do dołków mikropłytki zgodnie z tabelą referencyjną. Aby uniknąć warstw alokacyjnych spowodowanych ogrzewaniem i wydajnością wysiewu, nigdy nie używaj dołków na krawędzi mikropłytki do próbek i ładuj tę samą próbkę do wielu dołków w różnych miejscach na mikropłytce. Umieścić 96-dołkową mikropłytkę na czytniku płytek.
Otwórz przeczytaj teraz i menedżera zadań i wybierz program. Kliknij OK, aby rozpocząć pomiar. Na koniec zapisz nagranie jako nowy plik eksperymentalny do analizy danych.
Poniżej przedstawiono przykład tabeli referencyjnej, która została utworzona przed przeprowadzeniem eksperymentu. Piktogram 96-dołkowej płytki został narysowany jako tabela osiem na 12, aby wskazać pozycje zaszczepionych próbek kultur na 96-dołkowej płytce. Szybkość wzrostu oblicza się, stosując równanie dla wszystkich par kolejnych wartości OD600.
Średnia i odchylenie standardowe pięciu kolejnych wskaźników wzrostu zostały obliczone w celu oszacowania maksymalnej stopy wzrostu. Tempo wzrostu łącznie 60 kultur komórkowych jest wskazane na wyświetlonej mapie cieplnej. Degradacja od białego do czerwonego wskazuje tempo wzrostu od niskiego do wysokiego.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo i w kolejności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i załadować próbki do mikropłytki w celu bardzo precyzyjnych pomiarów rozwoju bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o sporządzeniu tabeli referencyjnej przed wykonaniem eksperymentu, aby uniknąć hodowli komórkowych o niskiej gęstości i upewnić się, że komórki zaczną rosnąć w ciągu 24 godzin.
Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak automatyzacja manipulacji eksperymentalnej i analiza obliczeniowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak czynniki determinujące rozmnażanie populacji i dynamika. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii systemowej i mikrobiologii. Zbadanie podstawowych zasad wzrostu komórek i optymalizacja składu pożywek hodowlanych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół precyzyjnej, wysokoprzepustowej analizy wzrostu bakterii, która jest kluczowa dla zrozumienia fizjologii mikroorganizmów. Metoda ta umożliwia jednoczesne testowanie wielu pożywek lub różnych szczepów, dostarczając informacji o kluczowych czynnikach wpływających na wzrost komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia mikroorganizmów
- Biologia systemowa
- Mikrobiologia
Wstęp
- Zrozumienie wzrostu bakterii jest kluczowe dla fizjologii drobnoustrojów.
- Analiza wysokoprzepustowa umożliwia ocenę parametrów wzrostu.
- Metodę tę można zastosować do różnych mikroorganizmów.
- Pomaga ona w udzieleniu odpowiedzi na fundamentalne pytania z zakresu mikrobiologii.
Cel badania
- Aby precyzyjnie analizować wzrost bakterii.
- Aby ocenić globalne parametry tempa wzrostu i gęstości populacji.
- Aby dostarczyć informacji na temat wzrostu E. coli oraz innych mikroorganizmów.
Zastosowane metody
- Experimentalna manipulacja warunkami wzrostu bakterii.
- Techniki analizy wysokoprzepustowej.
- Symultaniczne testowanie wielu szczepów i pożywek.
- Ocena krzywych wzrostu bakterii.
Główne wyniki
- Precyzyjna ocena osiągniętych maksymalnych tempa wzrostu.
- Ocena maksymalnej gęstości populacji na krzywych wzrostu.
- Pozyskanie informacji na temat czynników determinujących wzrost bakterii.
- Zastosowanie w przesiewaniu bakterii środowiskowych.
Wnioski
- Metoda ta zwiększa zrozumienie dynamiki wzrostu drobnoustrojów.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań w dziedzinie biologii systemów.
- Istnieje potencjał do szerszych zastosowań w badaniach mikrobiologicznych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii umożliwia szybką ocenę kondycji szczepów oraz optymalizację pożywek, wspierając wczesny etap walidacji celów w procesie odkrywania leków przeciwdrobnoustrojowych. Precyzyjna kwantyfikacja tempa wzrostu i gęstości populacji zapewnia pewność prognostyczną niezbędną do minimalizacji ryzyka związanego z kandydatami wiodącymi w potokach badawczych skoncentrowanych na mikrobiologii. Metoda ta odpowiada na zapotrzebowanie na skalowalne i powtarzalne przesiewanie fenotypowe w badaniach z zakresu biologii systemów oraz mikrobiologii translacyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar maksymalnej szybkości wzrostu jako wskaźnika kondycji komórkowej w różnych warunkach genetycznych lub środowiskowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez wysokoprzepustowe porównanie szczepów typu dzikiego i mutantów w wielu składach pożywek.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów z portfolio poprzez kwantyfikację koordynacji funkcji genów zależnej od wzrostu, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w wyborze celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane banki bakterii w celu odtwarzalnej standaryzacji testów, zapewniając spójne odczyty w oparciu o OD600 w ramach kampanii przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje format płytek 96-dołkowych, co umożliwia skalowalne, równoległe testowanie kilkudziesięciu szczepów lub warunków przy minimalnym zużyciu odczynników.
- Gotowość do analizy: Generuje szczegółowe krzywe wzrostu w czasie, które zwiększają niezawodność przesiewu poprzez uchwycenie fazy adaptacyjnej, wykładniczej i stacjonarnej w celu potwierdzenia wyników (hit confirmation).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy fenotypy wzrostu z fazy odkrywania z modelami przedklinicznymi poprzez zachowanie wierności systemu istotnej dla choroby w przypadku bakterii środowiskowych i patogennych.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie kinetyki wzrostu z reorganizacją transkryptomu i trendami sprawności w skali całego genomu.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Koncentruje się na pewności prognostycznej w odniesieniu do szlaków zależnych od wzrostu, a nie na wynikach klinicznych, co jest zgodne z wczesnymi celami redukcji ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego – od testowania hipotez w biologii podstawowej, po przygotowanie testów służących do identyfikacji związków wiodących, szczególnie w programach ukierunkowanych na działanie przeciwdrobnoustrojowe oraz badanie mikrobiomu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając precyzyjne porównanie dynamiki wzrostu w przypadku nokautów genów, wariantów promotorów lub warunków stresowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanym pomiarom OD600, powtarzalnemu przygotowaniu roztworów stokowych oraz wynikom danych kinetycznych do walidacji trafień.
- Analityka: Dostarcza ilościowych wyników – maksymalnego tempa wzrostu i gęstości populacji – które pozwalają na statystyczne porównanie warunków i wydajności szczepów.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez zastosowanie bakterii istotnych środowiskowo oraz mediów naśladujących warunki fizjologiczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do profilowania wzrostu w różnych projektach, co ogranicza redundantne opracowywanie protokołów i umożliwia uzgodnienie danych między zespołami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Większa pewność prognostyczna w walidacji celu, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach związanych ze wzrostem.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność pomiarów wzrostu w różnych szczepach i mediach.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa dzięki testowaniu równoległemu oraz zredukowane ryzyko biologiczne we wczesnych programach przeciwdrobnoustrojowych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o dane dotyczące sprawności wzrostu, umożliwiająca rozwój szczepów o silnych profilach fenotypowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikrobiologii w obszarze technik sterylnych, przygotowywania roztworów stokowych oraz kalibracji OD600.
- Metoda jest zależna od czytnika mikropłytek z kontrolą temperatury, funkcją wstrząsania oraz możliwością kinetycznego pomiaru absorbancji przy 600 nm.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja tabel referencyjnych, protokołów rozcieńczania oraz rozmieszczenia próbek w dołkach, aby uniknąć efektu brzegowego.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie gęstości inokulum i składu pożywki dla szczepów wolnorosnących lub wymagających.
- Ograniczenie praktyczne: bardziej rygorystyczny limit detekcji przy niskich gęstościach populacji w porównaniu do CFU, co wymaga zastosowania odpowiedniej ilości inokulum dla uzyskania wiarygodnego sygnału.
