Precyzyjna, wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest precyzyjna analiza wzrostu bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Dzięki zastosowaniu tej procedury można jednocześnie testować wiele rodzajów pożywek lub zróżnicowane szczepy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii systemów i mikrobiologii, takie jak określenie czynników determinujących wzrost komórek.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona badaczom na precyzyjne określenie globalnych parametrów maksymalnej szybkości wzrostu oraz maksymalnej gęstości populacji w krzywych wzrostu komórek bakteryjnych. Chociaż metoda ta pozwala uzyskać wgląd w wzrost e. Coli, może być ona również zastosowana do innych mikroorganizmów, na przykład w testach wzrostu i przesiewaniu bakterii środowiskowych.

Na początek należy umieścić na czystej ławce pięć wysterylizowanych probówek szklanych z silikonowymi korkami, pipety oraz docelowe szczepy. Przed otwarciem silikonowego korka należy wystawić wlot probówki na płomień palnika Bunsena. Po otwarciu probówki należy wystawić silikonowy korek na płomień, a następnie lekko założyć go z powrotem na probówkę szklaną.

Następnie, używając pipety elektronicznej i jednorazowej pipety serologicznej, należy dodać 5 ml M63 do jednej z probówek szklanych oraz 4,5 ml M63 do pozostałych czterech probówek. Za pomocą końcówki p200 należy pobrać kolonię i zaszczepić ją w probówce szklanej zawierającej 5 ml M63. Probówkę należy wymieszać na wstrząsarce typu Vortex w celu przygotowania zawiesiny.

Następnie rozcieńcz roztwór 10-krotnie, przenosząc 0,5 mililitra tego roztworu do jednej z czterech probówek zawierających 4,5 mililitra M63. Powtórz tę czynność dla pozostałych probówek. Po wysterylizowaniu wlotów probówek szklanych oraz silikonowych korków gumowych, zakorkuj probówki.

Następnie umieść pięć probówek w wstępnie ogrzanym inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 37 °C i wytrząsaj z prędkością 200 rpm. Inkubuj kulturę przez noc lub od 10 do 30 godzin. Po inkubacji dodaj 1 000 µL M63 do jednorazowej kuwety za pomocą pipety p1000.

Umieść jednorazową kuwetę w spektrofotometrze. Uruchom program przy stałej długości fali 600 nanometrów i zmierz próbę blank. Przenieś pięć szklanych probówek z inkubatora z wytrząsaniem na stół z laminarnym przepływem powietrza.

Usunąć M63 z jednorazowej kuwety i za pomocą pipety p1000 dodać do tej samej kuwety 1 000 µL hodowli. Następnie zmierzyć mętność optyczną hodowli komórkowej. Dalej, do probówki mikrocentryfygowej o pojemności 1,5 ml dodać 250 µL sterylnego 60% roztworu glicerolu oraz 750 µL wybranej hodowli komórkowej, a następnie wymieszać poprzez pipetowanie.

Umieść pozostałe dziewięć mikroprowetek w stojaku i do każdej z nich wlej 100 µL przygotowanej mieszaniny. Przechowuj zapasy w zamrażarce niskotemperaturowej w temperaturze 80 °C. Aby skonfigurować czytnik mikropłytek, najpierw uruchom oprogramowanie, otwórz sekcję protokołów w menedżerze zadań i wybierz opcję tworzenia nowego.

Następnie wybierz standardowy protokół. Otwórz procedurę i dostosuj ustawienia. Otwórz ustawienia temperatury i wybierz opcję włączenia inkubatora.

Następnie ustaw temperaturę na 37 °C oraz gradient na 0 °C. Przed przejściem do kolejnego kroku sprawdź wstępne podgrzewanie. Otwórz menu start kinetic i ustaw czas trwania pomiaru na 24 lub 48 minut, a następnie ustaw interwał na 30 minut lub jedną godzinę.

Otwórz ustawienia wstrząsania i ustaw tryb wstrząsania na liniowy. Zaznacz wstrząsanie ciągłe i ustaw częstotliwość na 567 cpm. Następnie otwórz ustawienia odczytu, zaznacz absorbancję, tryb punktowy/kinetyczny oraz monochromatory.

Ustaw długość fali na 600. Na koniec kliknij validate, aby potwierdzić poprawność procedury, a następnie kliknij save, aby zapisać ją jako nowy program do przyszłego użytku.

Aby rejestrować wzrost w czasie rzeczywistym, należy dodać około 25 ml M63 do sterylizowanego zbiornika na odczynniki. Następnie do probówek typu microtubes należy dodać 900 µl M63 w celu przygotowania do wykonania rozcieńczeń seryjnych. Kolejno, do rozmrożonego zapasu glicerolowego należy dodać 900 µl M63 i wymieszać na wortexie.

Przenieś 100 µL rozcieńczenia 10-krotnego do innej mikroprobówki zawierającej 900 µL M63 i wymieszaj na wortexie. Powtarzaj ten krok, aż do uzyskania pożądanej liczby rozcieńczeń. Następnie, za pomocą pipety ośmiokanałowej, napełnij dołki na krawędzi sterylizowanej 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem 200 µL M63.

Nanieś 200 µL każdego rozcieńczonego próbek do dołków mikropłytki zgodnie z tabelą odniesienia. Aby uniknąć powstania warstw wynikających z nagrzewania oraz różnic w wydajności wysiewania, nigdy nie używaj dołków na krawędzi mikropłytki do nanoszenia próbek oraz nanieś tę samą próbkę do kilku dołków w różnych miejscach na mikropłytce. Umieść mikropłytkę 96-dołkową w czytniku płytek.

Otwórz program Read Now oraz Menedżer zadań i wybierz odpowiedni program. Kliknij OK, aby rozpocząć pomiary. Na koniec zapisz nagranie jako nowy plik eksperymentalny do analizy danych.

Przedstawiono tutaj przykład tabeli referencyjnej sporządzonej przed przeprowadzeniem eksperymentu. Piktogram płytki 96-dołkowej został narysowany jako tabela o wymiarach 8x12, aby wskazać położenie zaszczepionych próbek kultur na płytce 96-dołkowej. Szybkość wzrostu oblicza się, stosując równanie dla wszystkich par kolejnych wartości OD600.

Obliczono średnią i odchylenie standardowe pięciu kolejnych szybkości wzrostu w celu oszacowania maksymalnej szybkości wzrostu. Szybkości wzrostu łącznie 60 kultur komórkowych przedstawiono na wyświetlonej mapie ciepła. Gradient od bieli do czerwieni wskazuje szybkości wzrostu od niskich do wysokich.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym i uporządkowanym wykonaniu, można ją zrealizować w ciągu kilku minut. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania i nakładania próbek na mikropłytkę w celu bardzo precyzyjnego pomiaru wzrostu bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed rozpoczęciem eksperymentu sporządzić tabelę referencyjną, co pozwoli uniknąć kultur komórkowych o niskiej gęstości i zapewni rozpoczęcie wzrostu komórek w ciągu 24 godzin.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak automatyzacja manipulacji eksperymentalnych oraz analiza obliczeniowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące czynników determinujących propagację i dynamikę populacji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii systemów i mikrobiologii do zgłębienia podstawowych zasad wzrostu komórek oraz optymalizacji składów pożywek hodowlanych.