Name: Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do pomiaru reaktywności naczyń z wykorzystaniem mikroskopii wideo. Technika ta umożliwia badanie regulacji przepływu krwi w siatkówce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Ernst und Grimmke Stiftung i Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (DOG).

Procedury eksperymentalne tego badania zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Nadrenii-Palatynatu, Niemcy. Opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi i oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Zwierzęta były traktowane zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE w zakresie doświadczeń na zwierzętach. Do eksperymentów wykorzystano samce myszy C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, USA) w wieku 3-4 miesięcy. Zwierzęta trzymano w standardowych warunkach (temperatura 23 ± 2 °C, zakres wilgotności 55 ± 10% i 12 godzin cykli światło/ciemność) i miały dostęp do standardowej karmy dla myszy i wody ad libitum.
1. Izolacja siatkówki myszy
<ol>
	<li>Umieść narzędzia do preparowania na stole przygotowawczym i sprawdź, czy wszystkie narzędzia są kompletne, aby umożliwić szybkie przygotowanie.</li>
	<li>Poświęć mysz przez wdychanie CO2 .</li>
	<li>Odetnij głowę myszy stalowymi nożyczkami, przetnij czaszkę strzałkowo na dwie połówki za pomocą tej samej pary nożyczek i usuń skórę i mózg za pomocą nożyczek do oczu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Odetnij kość czaszki, aby pozostawić tylko kość oczodołu, używając nożyczek do oczu.</li>
	<li>Przenieść orbitę do naczynia preparacyjnego zawierającego lodowaty bufor Krebsa-Henseleita.</li>
	<li>Trzymaj naczynie preparacyjne na lodzie lub zmieniaj bufor co 10 minut.</li>
	<li>Przetnij kość oczodołu za pomocą nożyczek do oczu i delikatnie usuń gałkę oczną wraz z tkanką oczodołu za pomocą precyzyjnej pęsety typu 4 i nożyczek sprężynowych Student Vannas (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Delikatnie usuń gruczoł Harderian, tkankę łączną i mięśnie zewnątrzgałkowe za pomocą precyzyjnej pęsety typu 5 i nożyczek do kapsulotomii Vannas, uważając, aby nie uszkodzić głównej gałęzi tętnicy ocznej.</li>
	<li>Podwiązywać gałęzie oczodołowe tętnicy ocznej i ostatecznie bliższy koniec głównej gałęzi tętnicy ocznej za pomocą szwów nylonowych 10-0 (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).</li>
	<li>Przenieś gałkę oczną na szalkę Petriego zawierającą 70% etanolu na 10 s za pomocą precyzyjnej pęsety typu 4. Umieścić gałkę oczną z powrotem w naczyniu separacyjnym i zastąpić bufor świeżym roztworem Krebsa. Rogówka będzie wyglądać na białawą po ekspozycji na etanol .</li>
	<li>Nakłuć obwodową rogówkę igłą o rozmiarze 30 i wyciąć rogówkę za pomocą nożyczek do kapsulotomii Vannas. Delikatnie odetnij tkankę tęczówki, umieść jeden ostry czubek nożyczek kapsulotomijnych Vannas między naczyniówką a siatkówką i odetnij naczyniówkę i twardówkę. Pozostaw trochę tkanki twardówki wokół nerwu wzrokowego (<silna klasa="xfig">Ryc. 4).</li>
</ol>
2. Montaż siatkówki w komorze perfuzyjnej
UWAGA: Komora perfuzyjna używana do eksperymentów z tętniczkami siatkówki jest domowej roboty. Składa się z przezroczystego zbiornika z rurką wlotową i odpływową (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Jeden koniec silikonowej rurki jest przyklejony do dna komory za pomocą kleju histoakrylowego, a drugi koniec przymocowany do trójdrożnego kranu. Podłączyć strzykawkę zawierającą świeży bufor Krebsa do trójdrogowego kranu i napełnić probówkę buforem.
<ol>
	<li>Weź szklaną mikropipetę z uchwytem na igłę i wepchnij ją do końca rurki na dnie komory perfuzyjnej. Następnie rozbij końcówkę mikropipety nożyczkami typu 4, aby uzyskać końcówkę o średnicy 100 μm.</li>
	<li>Skoncentruj się na końcówce mikropipety i przepłucz ją przez strzykawkę podłączoną do probówki. Uważaj, aby naczynia włosowate nie były zasłonięte przez zanieczyszczenia. W przypadku niedrożności należy ją wyjąć, przepłukać rurkę i włożyć kolejną mikropipetę.</li>
	<li>Napełnij komorę perfuzyjną zimnym buforem Krebsa i umieść komorę pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Umieść przezroczystą plastikową platformę w komorze perfuzyjnej. Platforma ta ma wgłębienie o szerokości 1,8 mm na nerw wzrokowy i tętnicę oczną i jest umieszczona na dwóch stalowych drutach o średnicy 1,6 mm. Następnie umieść na platformie pierścień ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 2.8 mm i średnicy zewnętrznej 4.0 mm.</li>
	<li>Przenieś siatkówkę z nerwem wzrokowym i przyczepioną tętnicą oczną z komory rozwarstwiającej do komory perfuzyjnej z najwyższą ostrożnością za pomocą łyżki. Ten krok jest ważny, aby zapobiec potencjalnemu rozciąganiu tkanek, ponieważ może to być szkodliwe dla eksperymentu.</li>
	<li>Odetnij zszytą część bliższego końca tętnicy ocznej, umieść dwie wstępnie uformowane pętle nylonowego szwu 10-0 na mikropipecie i kaniuluj tętnicę oczną za pomocą mikropipety. Przymocuj tętnicę do mikropipety (<silna klasa="xfig">Rysunek 6) i umieść siatkówkę na przezroczystej platformie za pomocą cienkiej pęsety.</li>
	<li>Delikatnie rozerwij przednią torebkę soczewki za pomocą dwóch cienkich pęset, wyciągnij soczewkę i odetnij całą torebkę soczewki za pomocą mikronożyczek.</li>
	<li>Następnie wykonaj cztery promieniste nacięcia w siatkówce w połowie odległości od pars plana do nerwu wzrokowego i umieść pierścień ze stali nierdzewnej na siatkówce, aby przymocować go do dołu. Siatkówka jest teraz gotowa do eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 7).</li>
</ol>
3. Przygotowanie tętniczek siatkówki do eksperymentu
<ol>
	<li>Umieść komorę perfuzyjną pod mikroskopem świetlnym. Obiektyw jest soczewką obiektywową 100X zanurzoną w wodzie.</li>
	<li>Podłączyć dwa przewody do wlotu i odpływu do pompy perycyklicznej i wprowadzić cyrkulację w komorze z buforem Krebsa natlenionym 95%O2 i gazowanym 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Stosować natężenie przepływu od 100 do 120 ml/min.</li>
	<li>Podłącz silikonową rurkę, która jest podłączona do mikropipety, do silikonowego węża zbiornika za pomocą trójdrożnego kurka. Następnie należy napełnić zbiornik buforem Krebsa do wysokości odpowiadającej 50 mm Hg, ale nie otwierać jeszcze kranu trójdrogowego.</li>
	<li>Spójrz przez obiektywy mikroskopu i skup się na powierzchni siatkówki. Szukaj naczyń krwionośnych lub czerwonych krwinek. Możliwe, że naczynia krwionośne są całkowicie zapadnięte, więc czasami widoczne są tylko niektóre czerwone krwinki.</li>
	<li>Kiedy zostanie znalezione naczynie krwionośne, skup się na nim i otwórz trójdrożny kran odcinający. Średnica naczynia powinna natychmiast wzrosnąć, a czerwone krwinki poruszają się albo odśrodkowo, jeśli jest to tętniczka, albo dośrodkowo w przypadku żyłki. Tętniczki mają mniejszą średnicę w porównaniu z żyłkami tego samego rzędu.</li>
	<li>Po znalezieniu naczynia krwionośnego z dobrze widoczną ścianą, można je wykorzystać do eksperymentów po okresie równowagi wynoszącym 30 minut (<silna klasa="xfig">Ryc. 8). W okresie równowagi tętniczki rozwijają tylko słaby ton wewnętrzny, co skutkuje zmniejszeniem średnicy światła o mniej niż 10%.</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie eksperymentu
<ol>
	<li>Zbadać żywotność naczyń za pomocą mimetycznej tromboksanu 9,11-dideoksy-9α,11α-metanoepoksydowej prostaglandyny F2α (U46619), dodając ją do roztworu do kąpieli. Środek ten zwęża tętniczki siatkówki myszy o około 50% od średnicy spoczynkowej w stężeniach ≥ 10-6 M.</li>
	<li>Po potwierdzeniu, że naczynie jest zdolne do życia, wypłukać agonistę z kąpieli poprzez cyrkulację pompy i wprowadzić świeży bufor Krebsa do kąpieli.</li>
</ol>

<ol><li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%3A+ocular+blood+flow%2C+glaucoma%2C+and+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li>
<li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li>
<li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li>
<li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+%3A+smaller+vessels%2C+bigger+insight%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li>
<li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux%2C+velocity%2C+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li>
<li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li>
<li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li>
<li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li>
<li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24749494">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pomiar odpowiedzi naczyniowych w siatkówce myszy jest trudny ze względu na mały rozmiar naczyń krwionośnych siatkówki. Dzięki prezentowanej technice tętniczki siatkówki są uwidocznione za pomocą mikroskopii światła przechodzącego. Jest to możliwe, ponieważ izolowana siatkówka jest półprzezroczysta. Zaletą tej techniki jest wysoka rozdzielczość optyczna. Obliczona rozdzielczość przestrzenna wynosi 11 px/μm. Jednak rzeczywista rozdzielczość tego układu optycznego wykorzystującego światło białe wynosi od 200 do 300 nm, co t...

Zaburzenia w perfuzji siatkówki są związane z patogenezą różnych chorób oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa, retinopatia nadciśnieniowa i jaskra1,2,3. Dlatego badania mające na celu pomiar reaktywności naczyniowej w siatkówce są ważne dla zrozumienia patofizjologii tych chorób i opracowania nowych podejść do leczenia.
Ze względu na możliwość manipulacji genami w genomie myszy, mysz stała się powszechnie używanym modelem zwierzęcym do badań układu sercowo-naczyniowego4. Jednak ze względu na mały rozmiar naczyń krwionośnych siatkówki (≤ 30 μm) pomiar reaktywności naczyniowej w siatkówce myszy jest trudny. Na przykład, techniki stereomikroskopowe do pomiarów in vivo mają ograniczoną rozdzielczość optyczną i dlatego pozwalają na dokładne wykrycie zmian średnicy lub przepływu krwi w małej krwi o średnicy mniejszej niż ≤ 30 μm tylko wtedy, gdy są wyposażone w dodatkowe wyrafinowane urządzenia, takie jak mikroskop konfokalny wykorzystujący barwniki fluorescencyjne lub oftalmoskop skaningowy optyki adaptatywnej5, 6. Co więcej, interpretacja pomiarów in vivo mających na celu identyfikację lokalnych mechanizmów sygnalizacyjnych w naczyniach krwionośnych siatkówki może być zakłócona przez środki znieczulające, zmiany ogólnoustrojowego ciśnienia krwi i wpływ pozagałkowych naczyń krwionośnych.
Dlatego opracowaliśmy metodę pomiaru reakcji naczyń krwionośnych siatkówki myszy z wysoką rozdzielczością wzrokową ex vivo. Przedstawiona technika pozwala na wizualizację tętniczek siatkówki za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. Ta metoda, która może być również stosowana u szczurów, zapewnia dostęp do zalet technologii celowania genowego w badaniach naczyń ocznych.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki stalowe</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3576.1</td><td>1x 140 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki do oczu</td><td>Geuder</td><td>G-19390</td><td>1x proste, 10,5 cm</td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna, prosta z cienkimi końcówkami</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>LH68.1</td><td>2x typ 4</td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna, prosta z bardzo cienkimi końcówkami</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>LH53.1</td><td>2x typ 5</td></tr><tr><td>Nożyczki kapsulotomijne</td> <td>VannasGeuder</td><td>19760</td><td>1x proste, 77 mm</td></tr><tr><td>Student Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>91501-09</td><td>1x zakrzywione,</td></tr><tr><td>Barraquer Uchwyt igły</td><td>Geuder</td><td>G-17500</td><td>1x zakrzywiony, igła 120 mm</td></tr><tr><td></td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305128</td><td>1x 30 G</td></tr><tr><td>Kapilary szklane (do produkcji mikropipet)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-1211</td><td>1x (1,2 x 0,8 mm; średnica zewnętrzna/wewnętrzna)</td></tr><tr><td>Nylon Shature</td><td>Alcon</td><td>198001</td><td>1x 10-0</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórek nunclon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>1x</td></tr><tr><td>naczynie do hodowli komórek nunclon</td> o średnicy 35 mm <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172931</td><td>1x średnica 100 mm</td></tr><tr><td>Discofix C</td><td>Braun</td><td>16500C</td><td>10 cm</td></tr><tr><td>Histoacryl klej</td><td>B. Braun Surgical, S.A.</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perycykliczna&nbsp; (CYKLO II)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>EP76.1</td><td>1x</td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet Model 700C</td><td>David Kopf Instrumenty</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Mikroskop (Vanox-T AH-2)</td><td>Olympus</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Obiektyw do zanurzenia w wodzie LUMPlanFL, 1.0 NA</td><td>Olympus</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy (TK-C1381)</td><td>JVC</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna</td><td>własnej produkcji</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Drugs and Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K928.4</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek kalium (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan kalium (KH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>261.2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0965.3</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-(D)-(+)- Glukoza monohydrat</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>9,11-dideoksy-9&alfa;,11&alfa;-metanoepoksydowa prostaglandyna F2&alfa; (U-46619)</td><td>Cayman Chemical</td><td>16450</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek acetylocholiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Niewydolność naczyniowa i zmiany w prawidłowym ukrwieniu siatkówki są jednymi z głównych czynników patogenezy różnych zagrażających wzrokowi chorób oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa, retinopatia nadciśnieniowa i prawdopodobnie jaskra. Dlatego preparaty mikronaczyniowe siatkówki są kluczowymi narzędziami do badań fizjologicznych i farmakologicznych w celu określenia podstawowych mechanizmów patofizjologicznych i zaprojektowania terapii tych chorób. Pomimo szerokiego zastosowania modeli mysich w badaniach okulistycznych, badania nad reaktywnością naczyniową siatkówki są rzadkie u tego gatunku. Głównym powodem tej rozbieżności są trudne procedury izolacji ze względu na mały rozmiar tych naczyń krwionośnych siatkówki, który wynosi ~ ≤ 30 μm średnicy światła. Aby obejść problem bezpośredniej izolacji tych mikronaczyń siatkówki do badań funkcjonalnych, opracowaliśmy technikę izolacji i przygotowania, która umożliwia badania ex vivo wazoaktywności siatkówki myszy w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Chociaż obecne preparaty eksperymentalne będą odnosić się w szczególności do tętniczek siatkówki myszy, metodologia ta może być łatwo zastosowana do mikronaczyń krwionośnych szczurów.

U-46619 wywoływał zależne od stężenia reakcje skurczowe w tętniczkach siatkówki myszy typu dzikiego z linii C57Bl/6J. Przy stężeniu 10-6 M zmniejszenie średnicy światła naczynia wyniosło ≈50% w stosunku do średnicy spoczynkowej. Rysunek 9A przedstawia reprezentatywną krzywą zależność reakcji od stężenia dla jednej tętniczki siatkówki. W tętniczkach uprzednio skurczonych za pomocą U46619, kumulatywne podawanie acetylocholiny wywołało zależne od stęż...

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Ogólnym celem tej metody przygotowania siatkówki jest wykorzystanie mikroskopii wideo do pomiaru reaktywności tętnic siatkówki myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji przepływu krwi w siatkówce i może przyczynić się do pogłębienia wiedzy na temat patofizjologii różnych chorób oczu. Główną zaletą tej nowej techniki jest możliwość pomiaru reaktywności naczyń krwionośnych siatkówki przy bardzo wysokiej rozdzielczości optycznej.Jednocześnie metoda ta nie wymaga zaawansowanego sprzętu. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ odnalezienie tętnicy ocznej i jej odgałęzień może być wymagające. Przedstawię tę procedurę wspólnie z Jenią Kouchek Zadeh i Waelem Omranem, studentami studiów podyplomowych z mojego laboratorium.Przygotuj się do procedur eksperymentalnych, rozkładając wymagane instrumenty. Następnie za pomocą stalowych nożyczek przetnij czaszkę myszy strzałkowo na dwie połowy i użyj nożyczek okularnych, aby usunąć skórę oraz mózg. Za pomocą nożyczek okularnych usuń kości czaszki, aż pozostanie jedynie kość oczodołu, a następnie pod mikroskopem chirurgicznym przenieś oczodół do naczynia sekcyjnego zawierającego lodowaty bufor Krebsa-Henseleita w lodzie.Przeciąć kość oczodołową nożyczkami okulistycznymi, a następnie przy użyciu precyzyjnej pęsety typu cztery i studenckich nożyczek sprężynowych Vannasa delikatnie usunąć gałkę oczną oraz tkankę oczodołową. Za pomocą precyzyjnej pęsety typu pięć i nożyczek do kapsulotomii Vannasa ostrożnie usunąć gruczoł Hardera, tkankę łączną i mięśnie pozagałkowe, dbając o to, aby nie uszkodzić głównej gałęzi tętnicy ocznej. Użyć szwów nylonowych 10-0 do podwiązania gałęzi oczodołowych w proksymalnym odcinku głównej gałęzi tętnic ocznych, a następnie przy użyciu precyzyjnej pęsety typu cztery przenieść gałkę oczną do szalki Petriego zawierającej 70% ethanol.Bardzo ważne jest, aby podwiązać wszystkie gałęzie oczne tętnicy ocznej, aby zapobiec wyciekom podczas eksperymentu. Po 10 sekundach należy przenieść gałkę oczną z powrotem do naczynia sekcyjnego. Rogówka będzie miała białawy kolor w wyniku ekspozycji na etanol.Wymień bufor na świeży roztwór Krebsa, a następnie za pomocą mikroskopu i igły o rozmiarze 3 przebij obwodową część rogówki. Używając nożyczek do kapsulotomii Vannasa, przedziel rogówkę i ostrożnie wytnij tkankę tęczówki. Następnie wprowadź jeden ostry koniec nożyczek do kapsulotomii Vannasa pomiędzy naczyniówkę a siatkówkę i odetnij naczyniówkę oraz twardówkę.Aby zamontować siatkówkę w wykonanej na zamówienie komorze perfuzyjnej, należy najpierw za pomocą uchwytu do igieł wprowadzić koniec szklanej mikropipety z końcówką o średnicy 100 µm do silikonowej rurki komory. Następnie należy podłączyć strzykawkę do drugiego końca rurki, aby wypłukać z końcówki mikropipety wszelkie zanieczyszczenia. Komorę perfuzyjną należy wypełnić zimnym buforem Krebsa i umieścić ją pod stereomikroskopem.Umieść przezroczystą plastikową platformę z wcięciem o głębokości 1,8 milimetra na dwóch stalowych drutach o średnicy 1,6 milimetra wewnątrz komory perfuzyjnej, a następnie nałóż na platformę pierścień ze stali nierdzewnej. Za pomocą łyżeczki przenieś siatkówkę wraz z nerwem wzrokowym z wciąż przyłączoną tętnicą oczną na platformę i usuń zaszyty koniec tętnicy ocznej. Na mikropipetę nałóż dwie uformowane pętle nici Nylon 10-0 i zabezpiecz tętnicę do mikropipety za pomocą szwów.Za pomocą jednej pęsety precyzyjnej umieść siatkówkę na przezroczystej platformie, a drugą pęsetą precyzyjną delikatnie przerwij przednią torebkę soczewki. Wyjmij soczewkę i za pomocą mikronożyczek usuń całą torebkę soczewki oraz ciało szkliste. Następnie wykonaj cztery nacięcia radialne w siatkówce, w połowie odległości od pars plana do nerwu wzrokowego, i nałóż stalowy pierścień na siatkówkę, aby przymocować ją do platformy.Aby przygotować tętniczki siatkówki do analizy, przenieś komorę perfuzyjną pod mikroskop świetlny i wybierz obiektyw imersyjny 100X. Podłącz rurki do portów wlotowego i wylotowego pompy paracyklicznej i cyrkuluj w komorze bufor Krebsa o temperaturze 37 °C, natleniony 95% tlenem i nasycony 5% dwutlenkiem węgla. Podłącz silikonową rurkę wyposażoną w mikropipetę do silikonowego węża zbiornika za pomocą kurka trójdrożnego i napełnij zbiornik buforem Krebsa do wysokości odpowiadającej 50 mmHg.Używając obiektywów, należy ręcznie ustawić ostrość na powierzchnię siatkówki, aby odnaleźć naczynia krwionośne lub erytrocyty. Po zlokalizowaniu naczynia krwionośnego, należy ustawić na nim ostrość i otworzyć trójdrożny kurek. Średnica naczynia powinna natychmiast ulec zwiększeniu, a w jego świetle powinny pojawić się erytrocyty.Po 30-minutowym okresie equilibracji tętniczki wykażą słaby napięcie wewnątrzpochodne, z redukcją średnicy światła poniżej 10%. Do roztworu w kąpieli należy dodać odczyn ograniczający dla tętniczek siatkówki myszy i potwierdzić żywotność naczynia. Następnie należy uruchomić pompę, aby wypłukać agonistę z kąpieli, i dodać do komory świeży bufor Krebsa.W tym reprezentatywnym eksperymencie U46619, mimetyk tromboksanu, wywołał zależne od stężenia reakcje skurczowe w tętniczkach siatkówki myszy C57Bl/6J typu dzikiego, prowadząc do około 50% redukcji średnicy światła względem stanu spoczynkowego przy stężeniu 1×10⁻⁶ M. W tętniczkach uprzednio skurczonych agonistą, kumulatywna podaż acetylocholiny wywołała zależny od stężenia wzrost średnicy światła do około 25% średnicy przed skurczem przy stężeniu acetylocholiny 1×10⁻⁵ M, co wskazuje na nienaruszone śródbłonie naczyniowe. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu 90 do 120 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Podczas wykonywania tych procedur należy pamiętać o podwiązaniu wszystkich gałęzi tętnic zaoczodołowych przed zanurzeniem oka w etanolu, a następnie przed otwarciem gałki ocznej, aby uniknąć skręcenia tętnicy ocznej, oraz o końcowym sprawdzeniu końcówek szklanych mikropipet pod kątem niedrożności. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat przygotowania siatkówki myszy do pomiarów tętniczych z wykorzystaniem wideomikroskopii in vitro.

preparation-steps-for-measurement-reactivity-mouse-retinal-arterioles

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Tutaj opisano szczegółowy protokół do przeprowadzania testu stresu mitochondrialnego i testu szybkości glikolitycznej w próbkach tkanki siatkówki ex vivo przy użyciu komercyjnego bioanalizatora.

Oznaczanie oddychania mitochondrialnego i glikolizy w próbkach tkanki siatkówki ex vivo

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Poznaj metodę izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do pomiaru reaktywności naczyń z wykorzystaniem mikroskopii wideo. Technika ta umożliwia badanie regulacji przepływu krwi w siatkówce.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Przeglądaj więcej filmów