Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Ogólnym celem tej metody przygotowania siatkówki jest wykorzystanie mikroskopii wideo do pomiaru reaktywności tętnic siatkówki myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji przepływu krwi w siatkówce i może przyczynić się do pogłębienia wiedzy na temat patofizjologii różnych chorób oczu. Główną zaletą tej nowej techniki jest możliwość pomiaru reaktywności naczyń krwionośnych siatkówki przy bardzo wysokiej rozdzielczości optycznej.

Jednocześnie metoda ta nie wymaga zaawansowanego sprzętu. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ odnalezienie tętnicy ocznej i jej odgałęzień może być wymagające. Przedstawię tę procedurę wspólnie z Jenią Kouchek Zadeh i Waelem Omranem, studentami studiów podyplomowych z mojego laboratorium.

Przygotuj się do procedur eksperymentalnych, rozkładając wymagane instrumenty. Następnie za pomocą stalowych nożyczek przetnij czaszkę myszy strzałkowo na dwie połowy i użyj nożyczek okularnych, aby usunąć skórę oraz mózg. Za pomocą nożyczek okularnych usuń kości czaszki, aż pozostanie jedynie kość oczodołu, a następnie pod mikroskopem chirurgicznym przenieś oczodół do naczynia sekcyjnego zawierającego lodowaty bufor Krebsa-Henseleita w lodzie.

Przeciąć kość oczodołową nożyczkami okulistycznymi, a następnie przy użyciu precyzyjnej pęsety typu cztery i studenckich nożyczek sprężynowych Vannasa delikatnie usunąć gałkę oczną oraz tkankę oczodołową. Za pomocą precyzyjnej pęsety typu pięć i nożyczek do kapsulotomii Vannasa ostrożnie usunąć gruczoł Hardera, tkankę łączną i mięśnie pozagałkowe, dbając o to, aby nie uszkodzić głównej gałęzi tętnicy ocznej. Użyć szwów nylonowych 10-0 do podwiązania gałęzi oczodołowych w proksymalnym odcinku głównej gałęzi tętnic ocznych, a następnie przy użyciu precyzyjnej pęsety typu cztery przenieść gałkę oczną do szalki Petriego zawierającej 70% ethanol.

Bardzo ważne jest, aby podwiązać wszystkie gałęzie oczne tętnicy ocznej, aby zapobiec wyciekom podczas eksperymentu. Po 10 sekundach należy przenieść gałkę oczną z powrotem do naczynia sekcyjnego. Rogówka będzie miała białawy kolor w wyniku ekspozycji na etanol.

Wymień bufor na świeży roztwór Krebsa, a następnie za pomocą mikroskopu i igły o rozmiarze 3 przebij obwodową część rogówki. Używając nożyczek do kapsulotomii Vannasa, przedziel rogówkę i ostrożnie wytnij tkankę tęczówki. Następnie wprowadź jeden ostry koniec nożyczek do kapsulotomii Vannasa pomiędzy naczyniówkę a siatkówkę i odetnij naczyniówkę oraz twardówkę.

Aby zamontować siatkówkę w wykonanej na zamówienie komorze perfuzyjnej, należy najpierw za pomocą uchwytu do igieł wprowadzić koniec szklanej mikropipety z końcówką o średnicy 100 µm do silikonowej rurki komory. Następnie należy podłączyć strzykawkę do drugiego końca rurki, aby wypłukać z końcówki mikropipety wszelkie zanieczyszczenia. Komorę perfuzyjną należy wypełnić zimnym buforem Krebsa i umieścić ją pod stereomikroskopem.

Umieść przezroczystą plastikową platformę z wcięciem o głębokości 1,8 milimetra na dwóch stalowych drutach o średnicy 1,6 milimetra wewnątrz komory perfuzyjnej, a następnie nałóż na platformę pierścień ze stali nierdzewnej. Za pomocą łyżeczki przenieś siatkówkę wraz z nerwem wzrokowym z wciąż przyłączoną tętnicą oczną na platformę i usuń zaszyty koniec tętnicy ocznej. Na mikropipetę nałóż dwie uformowane pętle nici Nylon 10-0 i zabezpiecz tętnicę do mikropipety za pomocą szwów.

Za pomocą jednej pęsety precyzyjnej umieść siatkówkę na przezroczystej platformie, a drugą pęsetą precyzyjną delikatnie przerwij przednią torebkę soczewki. Wyjmij soczewkę i za pomocą mikronożyczek usuń całą torebkę soczewki oraz ciało szkliste. Następnie wykonaj cztery nacięcia radialne w siatkówce, w połowie odległości od pars plana do nerwu wzrokowego, i nałóż stalowy pierścień na siatkówkę, aby przymocować ją do platformy.

Aby przygotować tętniczki siatkówki do analizy, przenieś komorę perfuzyjną pod mikroskop świetlny i wybierz obiektyw imersyjny 100X. Podłącz rurki do portów wlotowego i wylotowego pompy paracyklicznej i cyrkuluj w komorze bufor Krebsa o temperaturze 37 °C, natleniony 95% tlenem i nasycony 5% dwutlenkiem węgla. Podłącz silikonową rurkę wyposażoną w mikropipetę do silikonowego węża zbiornika za pomocą kurka trójdrożnego i napełnij zbiornik buforem Krebsa do wysokości odpowiadającej 50 mmHg.

Używając obiektywów, należy ręcznie ustawić ostrość na powierzchnię siatkówki, aby odnaleźć naczynia krwionośne lub erytrocyty. Po zlokalizowaniu naczynia krwionośnego, należy ustawić na nim ostrość i otworzyć trójdrożny kurek. Średnica naczynia powinna natychmiast ulec zwiększeniu, a w jego świetle powinny pojawić się erytrocyty.

Po 30-minutowym okresie equilibracji tętniczki wykażą słaby napięcie wewnątrzpochodne, z redukcją średnicy światła poniżej 10%. Do roztworu w kąpieli należy dodać odczyn ograniczający dla tętniczek siatkówki myszy i potwierdzić żywotność naczynia. Następnie należy uruchomić pompę, aby wypłukać agonistę z kąpieli, i dodać do komory świeży bufor Krebsa.

W tym reprezentatywnym eksperymencie U46619, mimetyk tromboksanu, wywołał zależne od stężenia reakcje skurczowe w tętniczkach siatkówki myszy C57Bl/6J typu dzikiego, prowadząc do około 50% redukcji średnicy światła względem stanu spoczynkowego przy stężeniu 1×10⁻⁶ M. W tętniczkach uprzednio skurczonych agonistą, kumulatywna podaż acetylocholiny wywołała zależny od stężenia wzrost średnicy światła do około 25% średnicy przed skurczem przy stężeniu acetylocholiny 1×10⁻⁵ M, co wskazuje na nienaruszone śródbłonie naczyniowe. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu 90 do 120 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.

Podczas wykonywania tych procedur należy pamiętać o podwiązaniu wszystkich gałęzi tętnic zaoczodołowych przed zanurzeniem oka w etanolu, a następnie przed otwarciem gałki ocznej, aby uniknąć skręcenia tętnicy ocznej, oraz o końcowym sprawdzeniu końcówek szklanych mikropipet pod kątem niedrożności. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat przygotowania siatkówki myszy do pomiarów tętniczych z wykorzystaniem wideomikroskopii in vitro.