Name: Ocena starzenia się wywołanego urazem i przeprogramowania in vivo w mięśniach szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę wykrywania komórek senescencyjnych i pluripotencjalnych w mięśniach szkieletowych po urazie. Ta technika umożliwia ocenę przeprogramowania in vivo i wspiera badania nad regeneracją tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Clemire Cimper za jej doskonałe wsparcie techniczne. Prace w laboratorium H.L. były finansowane przez Instytut Pasteura, Centre National pour la Recherche Scientific oraz Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) i Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. i A.C. są finansowane przez stypendia doktoranckie i podoktoranckie z Revive Consortium.

Zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej i zatwierdzonymi protokołami komisji etyki Instytutu Pasteura (CETEA).
1. Przygotowanie roztworów podstawowych
<ol>
	<li>Przygotuj materiały do utrwalenia próbki mięśniowej. Rozpuść 0,5 g gumy tragakantowej w 20 ml wody o temperaturze pokojowej, aby uzyskać pożywkę zamrażająco-zatapiającą do utrwalania mięśni.</li>
	<li>Przygotuj roztwory do barwienia SA-β-Gal.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe K3Fe(CN)6 (100 mM), K4Fe(CN)6 (100 mM), MgCl2 (1M) przez rozpuszczenie odpowiednich proszków w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 0,2% C20H6Br4Na2O5 (Eozyna), rozcieńczając go w wodzie.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy C14H15BrClNO6(X-gal) (50 mg/ml) przez rozpuszczenie proszku X-gal w C3H7NO (dimetyloformamid, DMF).</li>
		<li>Roztwory K3Fe(CN)6 i K4Fe(CN)6 przechowywać w temperaturze 4 °C, a MgCl2 w temperaturze RT. 
		UWAGA: X-gal może być przechowywany w podwielokrotności w temperaturze -20 °C, do 6 miesięcy. Roztwór eozyny może być przechowywany w temperaturze pokojowej i w razie potrzeby ponownie użyty po przefiltrowaniu. Roztwory K3Fe(CN)6 i K4Fe(CN)6 są chronione przed światłem. Roztwór X-gal nie jest stabilny w wodzie i musi być chroniony przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów do barwienia Nanog: roztwór przepuszczalny zawiera 0,1% Na3C6H5O7 (cytrynian trisodowy), 0,1% C14H22O(C2H4O)n(n = 9-10) (Triton X-100) w wodzie destylowanej, która powinna być przechowywana w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór blokujący zawierający 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), które powinny być przechowywane w RT.</li>
</ol>
2. Barwienie SA-β-Gal na zamrożonym odcinku mięśni TA
<ol>
	<li>Przygotuj materiał mocujący dla mięśnia TA, umieszczając niewielką ilość gumy tragakantowej na plasterku korka.</li>
	<li>Zranione myszy obojga płci (2 miesiące, C57/B6) zostały zranione 10 dni wcześniej kardiotoksyną (CDX), jak opisano wcześniej13. Należy użyć nieuszkodzonej (wstrzyknięcie PBS) TA od tej samej myszy, co kontrola ujemna. Jeśli pożądane jest przeprogramowanie in vivo, należy potraktować każdą mysz Dox (1 mg/ml) w wodzie pitnej tego samego dnia (chronionej przed światłem), zaraz po urazie CTX. 
	UWAGA: Roztwór Dox należy zmieniać co 3 dni, co daje łączny czas trwania leczenia wynoszący 7 dni.
	<ol>
		<li>Odizoluj oba mięśnie TA (uszkodzone i kontrolne) od myszy, jak opisano wcześniej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)13. Aby zapewnić przekroje poprzeczne, włóż dystalne ścięgno mięśnia TA do dziąsła tragakantowego i pozostaw około 3/4 części mięśnia na zewnątrz (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B) i zamroź bezpośrednio w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem przez <1 min. 
		UWAGA: Upewnij się, że mięsień TA znajduje się w pozycji prostopadłej i znajduje się pośrodku korka. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80°C lub bezpośrednio kriowycinane w sekcjach 10 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj mięśnie TA zgodnie z opisem w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B.
	<ol>
		<li>Rozłóż sekcje od 1do 10we właściwej kolejności na dziesięciu różnych szkiełkach w lewym górnym rogu każdego slajdu. Umieść 11. sekcję obok 1. sekcji na pierwszym slajdzie; 12. sekcja będzie miała tę samą kolejność, aby zostać umieszczona tuż obok 2. sekcji na drugim slajdzie. Powtarzaj ten proces, aż uzyskasz 10 sekcji/szkiełko dla dziesięciu szkiełek (łącznie 100 sekcji), aby zapewnić minimalną odległość 1 mm między pierwszą sekcją a ostatnią sekcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwal skrawki na 4 minuty w PBS zawierającym 1% paraformaldehydu i 0,2% aldehydu glutarowego. Mycie z PBS, 2x 10 min. Następnie inkubować skrawki w PBS (pH = 5,5) przez 30 minut. Wykonaj wszystkie kroki na stronie RT. 
	UWAGA: Utrwalenie musi być łagodne, aby utrzymać aktywność enzymatyczną. Wykonaj ten krok pod maską. pH PBS ma kluczowe znaczenie, a roztwór X-gal należy chronić przed światłem.</li>
	<li>Inkubować sekcje w roztworze X-gal zawierającym: 4 mM K3Fe(CN)6, 4 mM K4Fe(CN)6, 2 mM MgCl2 i 400 μg/ml X-Gal w PBS, pH = 5,5. Inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez co najmniej 24 godziny. Umyj szkiełka za pomocą PBS, 3x 10 min, w RT. 
	UWAGA: Inkubacja wymaga minimum 24 godzin i może trwać 48 godzin, aby zmaksymalizować sygnał SA-β-Gal. Roztwór należy zmienić po 24 godzinach inkubacji. Zjeżdżalnie należy chronić przed światłem. Jeśli pożądane jest tylko barwienie SA-β-Gal, przejdź do kroku 2.5. Jeśli pożądane jest współbarwienie za pomocą Nanog, przejdź do kroku 3.1.</li>
	<li>Utrwalić szkiełka w 1% paraformaldehydzie w PBS przez 30 min. Umyć szkiełka PBS, 3x 10 min. Przeciwbarwienie 0,2% eozyny. Zanurz szkiełka w roztworze eozyny na 1 minutę i krótko spłucz je wodą destylowaną. Na koniec zamontuj szkiełka za pomocą wodnego, niefluorescencyjnego medium montażowego (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Konieczne jest wykonanie post-fixation. Wykonaj ten krok pod maską. Wszystkie kroki są wykonywane w RT.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia z wykorzystaniem przeciwciała anty-Nanog
<ol>
	<li>Utrwalić szkiełka PBS zawierającym 4% paraformaldehydu przez 10 min. Przemyć PBS, 2x 10 min. Dodać 200 μl roztworu przepuszczalnego bezpośrednio na szkiełka i inkubować przez 5 min.
	<ol>
		<li>Umyj szkiełka PBS, 2x 5 min, a w ostatnim praniu użyj 200 μL PBS zawierających 0,25% BSA bezpośrednio na szkiełka. Wykonaj wszystkie te czynności na stronie RT. 
		Uwaga: Wykonaj krok mocowania pod maską.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować szkiełka z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-Nanog (końcowe stężenie: 1,25 μg/ml) przez noc w temperaturze 4 °C w PBS zawierającym 5% FBS. Szkiełka należy myć preparatami PBS, 2x 10 min, a w ostatnim praniu stosować 200 μL PBS zawierających 0,25% BSA przez 5 min. Wykonaj wszystkie kroki prania w RT. 
	UWAGA: Inkubuj szkiełka w pudełku z mokrym ręcznikiem papierowym, aby zapobiec parowaniu.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z 100 μl przeciwciała drugorzędowego rAb-HRP z gotowego do użycia zestawu (patrz tabela materiałów) przez 45 minut. Przemywać szkiełka PBS, 3 x 5 minut, w celu usunięcia przeciwciała drugorzędowego. Wykonaj wszystkie czynności w RT z ochroną przed światłem.</li>
	<li>wizualizacja
	<ol>
		<li>Najpierw rozcieńczyć 3,3'-diaminobenzydynę (C12H14N4C12H18Cl4N4 (4HCl), DAB) w buforze substratowym dostarczonym przez zestaw gotowy do użycia (20 μl DAB na 1 ml roztworu buforowego substratu). Dodać 100 μl roztworu DAB bezpośrednio na każde szkiełko podstawowe i inkubować maksymalnie przez 10 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Rozcieńczony roztwór DAB powinien być przygotowany na świeżo i może być przechowywany przez okres do jednego tygodnia w temperaturze 4 °C. Czas inkubacji można dostosować, aby zminimalizować sygnał tła, ale musi być taki sam dla wszystkich szkiełek.</li>
		<li>Usuń roztwór DAB, spłukując go wodą. Przeciwbarwić szkiełka szybkim czerwonym roztworem (gotowym do użycia, patrz Tabela Materiałów) przez 20 minut. Ponownie krótko umyj szkiełka wodą.</li>
		<li>Odwodnić je 95% etanolem przez 5 minut, a następnie 100% etanolem, 2x 5 min. Na koniec zamontuj prowadnice za pomocą szybkoutwardzalnego medium montażowego (patrz Tabela Materiałów).</li>
		<li>Obserwuj szkiełka pod mikroskopem w jasnym polu przy 20X, aby uniknąć tła. 
		UWAGA: Szybki czerwony roztwór może być przechowywany w temperaturze RT i ponownie użyty po przefiltrowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Kwantyfikacja SA-β-Gal
	<ol>
		<li>Zeskanuj slajdy i wybierz najlepsze sekcje na każdym slajdzie na podstawie uzyskanych obrazów. Do określenia ilościowego należy użyć co najmniej 2 sekcji/TA. Oceń jakość przekroju na podstawie integralności tkanki, jakości barwienia i barwienia przeciwstawnego. Do oceny ilościowej należy wybrać dwie sekcje najwyższej jakości z maksymalną możliwą odległością między próbkami, co pozwala na lepsze odwzorowanie kwantyfikacji SA-β-Gal w całym mięśniu TA.</li>
		<li>Kwantyfikacja komórek SA-β-Gal-dodatnich (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).
		<ol>
			<li>Określ rangę rozmiaru piksela, ręcznie wybierając najmniejsze i największe dodatnie komórki SA-β-Gal.
			<ol>
				<li>Otwórz cyfrowy obraz zeskanowanego slajdu za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
				<li>W interfejsie kliknij "Analizuj" > "Narzędzia" > "Menedżer ROI" > "Analizuj" > "ustaw pomiar" > "wybierz obszar". Użyj narzędzia do zaznaczania i otocz najmniejszą i największą dodatnią komórkę SA-β-Gal i dodaj ją do menedżera ROI, klikając "Dodaj". Zmierz rozmiary za pomocą przycisku "Zmierz" i zapisz wartości do późniejszego wykorzystania.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Dostosuj parametr progowy, aby upewnić się, że wszystkie widoczne komórki dodatnie są zaznaczone.
			<ol>
				<li>Przekonwertuj obraz na skalę szarości, klikając "Obraz" > "typ" > "8-bitowy" (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A). Następnie przejdź do "Obraz" > "Dostosuj" > "Próg", przesuń drugi kursor, aż wszystkie dodatnie komórki SA-β-Gal zostaną pokryte na czerwono (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B), a następnie kliknij "Zastosuj".</li>
				<li>Analizuj cząstki, klikając "Analizuj" > "Analizuj cząstki" > "Rozmiar (piksel^2)" i zastosuj wartość zdefiniowaną w kroku 4.1.2.1, wprowadź "Okrągłość": "0,00-1,00", kliknij "ok"; podsumowanie wszystkich zliczonych cząstek jest pokazane w menedżerze ROI (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D).</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przenieś wszystkie zaznaczone cząstki na oryginalny obraz. Dostosuj wybór ręcznie, aby zapewnić dokładną kwantyfikację. Dodaj komórki dodatnie (zielona strzałka, <silna klasa="xfig">Rysunek 2E) i/lub usuń komórki fałszywie dodatnie (czerwona strzałka, <silna klasa="xfig">Rysunek 2E). Na koniec zmierz obszar, obrysowując przekrój (Rysunek 2D) za pomocą "narzędzia do zaznaczania". Kliknij "Menedżer ROI" > "Dodaj" > "Zmierz".</li>
			<li>Co ważne, znormalizuj liczbę komórek dodatnich według obszaru sekcji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja nanog
	<ol>
		<li>Policz komórki dodatnie Nanog pod mikroskopem w jasnym polu ręcznie przy 20-krotnym powiększeniu. 
		UWAGA: Szybkie czerwone barwienie przeciwstawne pozwala na dobrą ocenę morfologii mięśnia TA. Jednak barwienie jest bardzo jasne i brakuje mu wyraźnego zarysu przekroju. Skaner często nie identyfikuje granic sekcji i nie może prawidłowo ustawić ostrości. Możliwe jest użycie markera do zakreślenia krawędzi sekcji przed skanowaniem lub użycie bardziej czułego skanera do wykrycia przekroju. W przypadku obecnego protokołu najbardziej efektywne jest ręczne liczenie dodatnich komórek Nanog.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li>
<li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li>
<li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li>
<li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li>
<li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li>
<li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528(2015).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li>
<li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li>
<li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SA+beta+Gal+staining%3A+biomarker+or+delusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiamy metodę wykrywania zarówno starczych, jak i pluripotencjalnych komórek macierzystych w mięśniach szkieletowych myszy reprogramowalnych. Metodę tę można wykorzystać do oceny i ilościowego określenia zarówno starzenia się, jak i indukowania plastyczności komórkowej in vivo, a także do zbadania roli starzenia się w naprawie i regeneracji tkanek.
W obecnym protokole test β-galaktozydazy związany ze starzeniem (SA-β-Gal) służy do wykrywania in vivo komór...

Starzenie się komórek jest formą reakcji na stres charakteryzującą się stabilnym zatrzymaniem cyklu komórkowego. W ciągu ostatniej dekady badania zdecydowanie wykazały, że starzenie się jest związane z różnymi procesami biologicznymi i patologicznymi, w tym rozwojem embrionalnym, zwłóknieniem i starzeniem się organizmu1,2. Starzenie się komórek zostało po raz pierwszy zidentyfikowane w ludzkich fibroblastach pod koniec ich replikacyjnej długości życia wywołanej skracaniem telomerów3. Oprócz stresu replikacyjnego istnieje wiele innych bodźców, które mogą indukować starzenie się, w tym uszkodzenia DNA, stres oksydacyjny, sygnały onkogenne i zmiany genomowe/epigenomiczne, z których każdy może ostatecznie aktywować szlaki p53/p21 i/lub pRB w celu ustanowienia i wzmocnienia trwałego zatrzymania wzrostu1. Jedną z ważnych cech komórek starczych jest to, że pozostają one metabolicznie aktywne i silnie wyrażają fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem się (SASP): wydzielanie wielu cytokin zapalnych, czynników wzrostu i czynników macierzy zewnątrzkomórkowej<klasa sup = "xref">4. Zaproponowano, że czynniki SASP odgrywają ważną rolę w pośredniczeniu i wzmacnianiu efektu starzenia, ze względu na ich silny wpływ na przyciąganie komórek odpornościowych i zmianę miejscowego i ogólnoustrojowego środowiska tkankowego1. Co ciekawe, ostatnio zaproponowano starzenie się jako ważne dla naprawy i regeneracji tkanek5,6. Ponadto dane z kilku laboratoriów, w tym z naszego, sugerują, że starzenie się wywołane uszkodzeniem tkanek może zwiększać plastyczność komórkową za pośrednictwem SASP, aby promować regenerację7-9. Dlatego wszystkie pojawiające się dane podkreślają znaczenie badania starzenia się in vivo.
W erze po indukcji pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), plastyczność komórkowa to zdolność komórki do uzyskania nowej tożsamości i przyjęcia alternatywnego losu po wystawieniu na działanie różnych bodźców, zarówno w hodowli, jak i in vivo10. Wiadomo, że pełne przeprogramowanie można osiągnąć in vivo11,12, gdzie ekspresja kasety zawierającej cztery czynniki Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc (OSKM) może być indukowana in vivo, aby promować powstawanie potworniaków w wielu narządach. W związku z tym reprogramowalny model myszy (i4F) może być używany jako potężny system do identyfikacji krytycznych regulatorów i ścieżek, które są ważne dla plastyczności komórkowej11.
Odpowiedni i czuły system in vivo jest niezbędny do zrozumienia, jak starzenie się komórek reguluje plastyczność komórkową w kontekście regeneracji tkanek. W tym miejscu przedstawiamy solidny system i szczegółowy protokół do oceny związku między starzeniem się a plastycznością komórkową w kontekście regeneracji tkanek. Połączenie indukowanego przez kardiotoksynę (CTX) uszkodzenia mięśni w grupie mięśni piszczelowej przedniej (TA), dobrze ugruntowanego systemu do badania regeneracji tkanek, oraz mysiego modelu i4F, pozwala na wykrycie zarówno starzenia się komórek, jak i przeprogramowania in vivo podczas regeneracji mięśni.
Aby ocenić związek między plastycznością komórkową a starzeniem się, myszy i4F są raniene za pomocą CTX w celu wywołania ostrego uszkodzenia mięśni i leczone doksycykliną (0,2 mg/ml) przez 7 dni w celu wywołania przeprogramowania in vivo. Chociaż protokół ostrego uszkodzenia i regeneracji mięśni wywołanego CTX został niedawno opublikowany13, ze względów etycznych procedura ta zostanie pominięta w obecnym protokole. Próbki mięśni TA zostaną pobrane po 10 dniach od urazu13, kiedy wcześniej zaobserwowano szczyt komórek starczych14. W tym przypadku ten szczegółowy protokół opisuje wszystkie kroki wymagane do oceny poziomu starzenia się (za pomocą SA-β-Gal) i przeprogramowania (poprzez barwienie IHC Nanog).
Test beta-galaktozydazy (SA-β-Gal) związany ze starzeniem jest najczęściej używanym testem do wykrywania komórek starczych zarówno w hodowli, jak i in vivo15. W porównaniu z innymi testami, test SA-β-Gal umożliwia identyfikację komórek starczych w ich naturalnym środowisku z nienaruszoną architekturą tkankową, co jest szczególnie ważne w badaniach in vivo. Ponadto możliwe jest sprzężenie testu SA-β-Gal z innymi markerami za pomocą IHC. Jednak test SA-β-Gal wymaga świeżych lub mrożonych próbek, co pozostaje głównym ograniczeniem. Gdy świeże lub zamrożone tkanki są rutynowo dostępne, takie jak zamrożone próbki mięśni TA, SA-β-Gal jest oczywiście najbardziej odpowiednim testem do wykrywania komórek starczych. Nanog jest markerem używanym do wykrywania przeprogramowanych komórek z dwóch powodów: 1) jest niezbędnym markerem pluripotencji; 2) co ważniejsze, jego ekspresja nie jest sterowana przez doksycyklinę (dox), dlatego wykrywa indukowaną pluripotencję, a nie wymuszoną ekspresję kasety Yamanaka.
Ważne jest, aby zauważyć, że protokoły barwienia przedstawione w tym badaniu mogą być przeprowadzane oddzielnie, aby uprościć procedurę kwantyfikacji, ale mogą być również wykonywane w procedurze jednoczesnego barwienia, aby uwidocznić zarówno starcze, jak i pluripotencjalne komórki macierzyste na tym samym obszarze.

<table><tbody><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>Dla SA-&beta; Roztwór do barwienia gal</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>Dla SA-&beta; Roztwór do barwienia galem</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>Dla SA-&beta; Roztwór do barwienia gal</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>Dla SA-&beta; Roztwór do barwienia gal</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>Do indukowania przeprogramowania in vivo</td></tr><tr><td>Kardiotoksyna</td><td>Lotaxan Valence, Francja</td><td>L8102</td><td>Do uszkodzenia mięśni</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>Do roztworu utrwalającego</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa nauka</td><td>50-980-487</td><td>Do roztworu</td></tr> <tr><td>utrwalającegoNaCitrate: Cytrynian sodu monobasic bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>Do roztworu do przepuszczalności</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Do roztworu przepuszczalnego</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Roztwór myjący</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Nanog</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>8822S Przeciwciało</td><td>monoklonalne królika</td></tr><tr><td>Zestawy EnVision+ (HRP. Królik. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>For Nanog revelation</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Przeciwbarwienie</td></tr><tr><td>Szybkie czerwone</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Przeciwbarwienie</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Rozwiązanie montażowe</td></tr><tr><td>Szybkoutwardzalne medium montażowe do mikroskopii: Eukitt&reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Rozwiązanie montażowe</td></tr><tr><td>Mikroskop Kontrast fazowy Jasne pole CKX41: Obiektywy 10X-20X-40X</td><td>Mikroskop Olympus</td><td>CKX41</td><td>do kwantyfikacji Nanog</td></tr><tr><td>Mysz: i4F-A</td><td>Abad i wsp., 2013</td><td>N/A</td><td>Reprogramowalny model myszy</td></tr><tr><td>Mięsień szkieletowy, piszczel Skaner slajdów przednich</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>Skanowanie slajdów</td></tr></tbody></table>

ocena starzenia się wywołanego urazem i przeprogramowania in vivo w mięśniach szkieletowych

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Starzenie się komórek to reakcja na stres, która charakteryzuje się stabilnym zatrzymaniem wzrostu komórek, co jest ważne dla wielu procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak rak i starzenie się. Ostatnio starzenie się jest również zaangażowane w naprawę i regenerację tkanek. Dlatego coraz ważniejsze staje się identyfikowanie komórek starczych in vivo. Test β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-Gal) jest najczęściej stosowanym testem do wykrywania komórek starczych zarówno w hodowli, jak i in vivo. Test ten opiera się na zwiększonej zawartości lizosomów w komórkach starczych, co pozwala na histochemiczne wykrycie aktywności lizosomalnej β-galaktozydazy przy nieoptymalnym pH (6 lub 5,5). W porównaniu z innymi testami, takimi jak cytometria przepływowa, pozwala to na identyfikację komórek starczych w ich środowisku rezydencyjnym, co dostarcza cennych informacji, takich jak lokalizacja związana z architekturą tkanki, morfologia i możliwość sprzężenia z innymi markerami za pomocą immunohistochemii (IHC). Głównym ograniczeniem testu SA-β-Gal jest wymóg świeżych lub mrożonych próbek.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół, aby zrozumieć, w jaki sposób starzenie się komórek sprzyja plastyczności komórkowej i regeneracji tkanek in vivo. Używamy SA-β-Gal do wykrywania komórek starczych w mięśniach szkieletowych po urazie, co jest dobrze ugruntowanym systemem do badania regeneracji tkanek. Co więcej, używamy IHC do wykrywania Nanog, markera pluripotencjalnych komórek macierzystych, w transgenicznym modelu myszy. Protokół ten umożliwia nam zbadanie i ilościowe określenie starzenia się komórek w kontekście indukowanej plastyczności komórkowej i przeprogramowania in vivo.

Wykrywanie starzenia się komórek indukowanego uszkodzeniem mięśni
Niedawno wykazano, że uraz mięśni indukuje przejściową starzenie się komórek14. W 10. dniu po urazie (DPI) większość uszkodzonych włókien mięśniowych ulega regeneracji, wykazując centralnie położone jądra, co jest charakterystyczne dla regenerujących się włókien mięśniowych, a architektura mięśnia zostaje przywrócona. Liczba naciekających komó...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wykrywania zarówno starczych, jak i pluripotencjalnych komórek macierzystych w mięśniach szkieletowych po urazie, podczas indukowania przeprogramowania in vivo. Metoda ta jest odpowiednia do oceny roli starzenia się komórek podczas regeneracji i przeprogramowania tkanek in vivo.

Ocena starzenia się wywołanego urazem i przeprogramowania in vivo w mięśniach szkieletowych

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ocena starzenia się komórek in vivo oraz reprogramowania w mięśniach szkieletowych po uszkodzeniu tkanki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak sposoby zwiększania plastyczności komórkowej w celu promowania regeneracji mięśni. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie niezawodnej metody wykrywania i kwantyfikacji komórek senescentnych w środowisku lokalnym.Starzenie się komórek zostało ostatnio powiązane z naprawą i regeneracją tkanek. Zrozumienie mechanizmów, poprzez które starzenie przyczynia się do naprawy i regeneracji tkanek, z pewnością wpłynie na medycynę regeneracyjną. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas badania potencjalnego wpływu uszkodzenia tkanek na reprogramowanie in vivo w mięśniach szkieletowych.Aby rozpocząć tę procedurę, utrwal preparaty z próbek mięśni w 1% paraformaldehydzie i 0,2% glutaraldehydzie w PBS przez cztery minuty. Następnie przemyj preparaty PBS-em dwukrotnie, za każdym razem przez 10 minut. Potem przemyj preparaty PBS-em o pH 5,5 przez 30 minut.Następnie inkubować skrawki z roztworem X-gal w ciemności w temperaturze 37 °C przez co najm

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do poruszania się i są głównym magazynem białka w organizmie. Pomiary zdrowia mięśni w obrębie C. Opisano elegans. Potencjalne zmiany w strukturze i funkcji mięśni ocenia się za pomocą zlokalizowanego GFP i barwników kationowych.

Metody oceny subkomórkowych kompartmentów mięśniowych u C. elegans

Ten protokół opisuje solidną, powtarzalną i prostą metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych mioblastów z mięśni szkieletowych osób dorosłych i starszych. Wykorzystywane tutaj mięśnie obejmują mięśnie stóp i nóg. Takie podejście umożliwia wyizolowanie wzbogaconej populacji pierwotnych mioblastów do badań funkcjonalnych.

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Opisujemy nowatorską technikę eksperymentalną, którą nazywamy Minimalnie Inwazyjnym Osadzaniem Mięśni (MIME), która opiera się na dowodach, że tkanka mięśni szkieletowych zawiera żywotne komórki miogenne, które mogą ułatwić miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy, gdy zostaną wszczepione do mięśnia gospodarza.

Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy

Pomiar funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych gryzoni jest użytecznym narzędziem, które może być używane do śledzenia postępu choroby, jak również skuteczności interwencji terapeutycznej. Opisujemy tutaj nieinwazyjną ocenę in vivo mięśni zginaczy grzbietowych, która może być powtarzana w czasie u tej samej myszy.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Mięśnie szkieletowe składają się z wielu typów komórek, w tym rezydentnych komórek macierzystych, z których każda ma szczególny wkład w homeostazę i regenerację mięśni. W tym miejscu opisano hodowlę 2D komórek macierzystych mięśni i niszy komórek mięśniowych w warunkach ex vivo, które zachowują wiele cech fizjologicznych, in vivo i środowiskowych.

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych. Porównanie histologii między żwaczem myszy a mięśniem piszczelowym przednim po urazie spowodowanym zamarznięciem potwierdziło zwłóknienie mięśni żwaczy. Model ten ułatwi dalsze badania nad mechanizmem leżącym u podstaw zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych.

Zamrożenie urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych

Poznaj metodę wykrywania komórek senescencyjnych i pluripotencjalnych w mięśniach szkieletowych po urazie. Ta technika umożliwia ocenę przeprogramowania in vivo i wspiera badania nad regeneracją tkanek.

Ocena starzenia się wywołanego urazem i przeprogramowania in vivo w mięśniach szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów