Ocena starzenia się wywołanego urazem i przeprogramowania in vivo w mięśniach szkieletowych
26 października 2017
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wykrywania zarówno starczych, jak i pluripotencjalnych komórek macierzystych w mięśniach szkieletowych po urazie, podczas indukowania przeprogramowania in vivo. Metoda ta jest odpowiednia do oceny roli starzenia się komórek podczas regeneracji i przeprogramowania tkanek in vivo.
Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ocena starzenia się komórek in vivo oraz reprogramowania w mięśniach szkieletowych po uszkodzeniu tkanki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak sposoby zwiększania plastyczności komórkowej w celu promowania regeneracji mięśni. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie niezawodnej metody wykrywania i kwantyfikacji komórek senescentnych w środowisku lokalnym.
Starzenie się komórek zostało ostatnio powiązane z naprawą i regeneracją tkanek. Zrozumienie mechanizmów, poprzez które starzenie przyczynia się do naprawy i regeneracji tkanek, z pewnością wpłynie na medycynę regeneracyjną. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas badania potencjalnego wpływu uszkodzenia tkanek na reprogramowanie in vivo w mięśniach szkieletowych.
Aby rozpocząć tę procedurę, utrwal preparaty z próbek mięśni w 1% paraformaldehydzie i 0,2% glutaraldehydzie w PBS przez cztery minuty. Następnie przemyj preparaty PBS-em dwukrotnie, za każdym razem przez 10 minut. Potem przemyj preparaty PBS-em o pH 5,5 przez 30 minut.
Następnie inkubować skrawki z roztworem X-gal w ciemności w temperaturze 37 °C przez co najmniej 24 godziny. Po tym czasie przemyć preparaty trzy razy w PBS, za każdym razem przez 10 minut. Następnie przeprowadzić post-fiksację preparatów w PBS zawierającym 1% paraformaldehydu przez 30 minut.
Na koniec wypłucz preparaty trzy razy w PBS. Następnie przeprowadź kontrastowanie za pomocą 0,2% eozyny, zanurzając preparaty w roztworze eozyny na jedną minutę. Następnie krótko opłucz je wodą destylowaną.
Przygotuj preparaty na szkiełkach przedmiotowych, używając wodnego, niewyświetlającego medium montującego. Utrwal preparaty w PBS zawierającym 4%paraformaldehydu przez 10 minut. Przemyj je dwukrotnie w PBS, za każdym razem przez 10 minut.
Następnie należy dodać roztwór do permeabilizacji i inkubować przez pięć minut. Po tym czasie preparaty na szkiełkach należy przemyć dwukrotnie PBS, za każdym razem przez pięć minut. Podczas ostatniego płukania należy nanieść bezpośrednio na szkiełka 200 µL PBS zawierającego 0,25% BSA na pięć minut.
Inkubować preparaty na szkiełkach z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-Nanog w stężeniu 1,25 µg/mL przez noc w temperaturze 4°C w buforze PBS zawierającym 5% FBS. Przemyć szkiełka buforem PBS dwukrotnie, za każdym razem przez 10 minut. Podczas ostatniego płukania zastosować 200 µL buforu PBS zawierającego 0,25% BSA przez pięć minut.
Następnie inkubować preparaty na szkiełkach z 100 µL przeciwciała wtórnego RAB-HRP z gotowego zestawu przez 45 minut. Potem przemyć szkiełka buforem PBS trzykrotnie, za każdym razem przez pięć minut, aby usunąć przeciwciało wtórne. Po tym etapie rozcieńczyć DAB w buforze substratowym dostarczonym w gotowym zestawie.
Mocno wymieszać w wirówce typu vortex. Nanieść 100 µL roztworu DAB bezpośrednio na każdy preparas i inkubować przez maksymalnie 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć roztwór DAB, płucząc preparaty wodą.
Przymrocz preparaty na szkiełkach za pomocą roztworu fast red przez dwie minuty. Następnie krótko opłucz szkiełka wodą. Po tym etapie odwodnij je w 95% etanolu przez pięć minut, a następnie dwukrotnie w 100% etanolu, za każdym razem przez pięć minut.
Następnie preparaty należy zamontować, używając szybko twardniejącego medium montażowego. Preparaty należy obserwować pod mikroskopem w świetle przechodzącym przy powiększeniu 20x, aby uniknąć tła. W tej procedurze należy przeskanować preparaty i wybrać dwa przekroje najlepszej jakości na każdym z nich, zachowując maksymalnie możliwą odległość między nimi, w oparciu o integralność tkanki, jakość barwienia oraz barwienia kontrastowego.
Policz komórki wykazujące pozytywną reakcję na SA-Beta-Gal w tych dwóch przekrojach i oblicz wartość średnią. Następnie określ rangę wielkości pikseli, ręcznie wybierając najmniejszą i największą komórkę pozytywną pod kątem SA-Beta-Gal. W interfejsie programu ImageJ kliknij Analyze, Tools, ROI Manager, Analyze, Set Measurement.
Następnie wybierz opcję Area. Użyj narzędzia zaznaczania, aby obrysować najmniejszą i największą komórkę wykazującą aktywność SA-Beta-Gal, a następnie dodaj ją do ROI Managera, klikając Add. Po tym kroku zmierz ich rozmiary za pomocą przycisku Measure i zapisz uzyskane wartości do późniejszego wykorzystania.
Następnie należy dostosować parametr progu, aby upewnić się, że wszystkie widoczne komórki pozytywne zostały zaznaczone. Konwertuj obraz do skali szarości, klikając Image, Type, a następnie 8-bit. Po tym kroku przejdź do Image, Adjust, a następnie Threshold.
Przesuń drugi kursor tak, aby wszystkie komórki dodatnie pod kątem SA-Beta-Gal zostały pokryte kolorem czerwonym, a następnie kliknij Apply. Przeanalizuj cząsteczki, klikając Analyze, Analyze Particles, a następnie Size i wprowadź wartość zdefiniowaną wcześniej. W polu Circularity wprowadź 0,00-1,00 i kliknij OK. Podsumowanie wszystkich policzonych cząsteczek zostanie wyświetlone w ROI Manager.
Następnie przenieś wszystkie wybrane cząstki do oryginalnego obrazu. Ręcznie doprecyzuj zaznaczenie, aby zapewnić dokładną kwantyfikację. Dodaj komórki pozytywne lub usuń komórki fałszywie pozytywne.
Na koniec zmierz powierzchnię, obrysowując dany fragment za pomocą narzędzia zaznaczania. Kliknij ROI Manager, Add, a następnie Measure. Pod mikroskopem, przy powiększeniu 20x, ręcznie policz komórki dodatnie pod kątem ekspresji Nanog w obrazie w jasnym polu.
Przedstawiono tutaj schematyczną reprezentację służącą do oceny przeprogramowania in vivo oraz poziomu starzenia się komórek po urazie mięśni. Poniżej znajdują się reprezentatywne zdjęcia barwień SA-Beta-Gal i Nanog na zamrożonych skrawkach uszkodzonego mięśnia szkieletowego. Obrazy te ukazują barwienie SA-Beta-Gal z przeciwbarwieniem eozyną oraz barwienie Nanog z przeciwbarwieniem fast red.
Mięśnie nieuszkodzone przedstawiono na górze, natomiast mięśnie uszkodzone na dole. Wykres ten przedstawia kwantyfikację i korelację komórek dodatnich pod kątem SA-Beta-Gal oraz komórek dodatnich pod kątem Nanog w kolejnych przekrojach 10 dni po urazie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze uwzględnić kontrolę negatywną w celu zapewnienia swoistości barwienia.
Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić wszystkie metody, takie jak immunofluorescencja czy wybór różnych markerów starzenia, dla wszystkich typów komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tożsamości komórkowej komórek starzejących się. Wraz z rozwojem, technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny starzenia się komórek, a także naprawy i regeneracji tkanek, do zbadania, w jaki sposób starzenie komórkowe może promować plastyczność komórkową, aby ułatwić naprawę i regenerację tkanek u ssaków. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak identyfikować zarówno komórki starzejące się, jak i przeprogramowane in vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wykrywania komórek senescencyjnych i pluripotencjalnych komórek macierzystych w mięśniach szkieletowych po urazie, co ułatwia przeprogramowanie in vivo. Został on opracowany w celu zbadania roli starzenia się komórek w regeneracji tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Biologia komórki
- Naprawa tkanek
Wstęp
- Starzenie się komórek jest powiązane z naprawą i regeneracją tkanek.
- Zrozumienie mechanizmów starzenia się może usprawnić regenerację mięśni.
- Niniejsza metoda odpowiada na kluczowe pytania w medycynie regeneracyjnej.
- Zapewnia ona niezawodny sposób wykrywania i ilościowego oznaczania komórek senescentnych.
Cel badania
- Ocena starzenia się in vivo w mięśniach szkieletowych.
- Ocena wpływu uszkodzenia tkanki na przeprogramowanie komórkowe.
- Zwiększenie plastyczności komórkowej w celu regeneracji mięśni.
Zastosowane metody
- Wykrywanie komórek senescencyjnych w mięśniach szkieletowych.
- Ocena przeprogramowania in vivo.
- Kwantyfikacja senescencji komórkowej.
- Ocena procesów regeneracji tkankowej.
Główne wyniki
- Niezawodna detekcja komórek senescencyjnych i pluripotencjalnych komórek macierzystych.
- Wnioski dotyczące roli senescencji w regeneracji mięśni.
- Pogłębiona wiedza na temat mechanizmów plastyczności komórkowej.
- Potencjalne implikacje dla strategii medycyny regeneracyjnej.
Wnioski
- Ta metoda jest skuteczna w badaniu starzenia się tkanek mięśniowych.
- Zrozumienie procesów starzenia się może pomóc w opracowaniu terapii regeneracyjnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu usprawnienia regeneracji mięśni.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe wykrywanie komórek senescencyjnych i przeprogramowanych w uszkodzonej mięśni szkieletowej umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w programach medycyny regeneracyjnej. Niniejszy schemat postępowania wspiera pewność prognostyczną w modelach naprawy tkanek i dostarcza informacji niezbędnych do wczesnej walidacji celów dla interwencji mających na celu modulację plastyczności komórkowej. Integracja analizy starzenia i przeprogramowania in vivo wzmacnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do badań przedklinicznych w ramach portfolio chorób układu mięśniowo-szkieletowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów napędzanych przez starzenie się komórek, które leżą u podstaw regeneracji tkanek.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie populacji komórek starzejących się i pluripotencjalnych po urazie.
- Ułatwia biologiczną ocenę ryzyka dla strategii modulacji szlaków regeneracyjnych.
- Dostarcza danych do selekcji celów w oparciu o istotność in vivo oraz wyniki plastyczności.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane testy histochemiczne i immunohistochemiczne dla markerów starzenia się i pluripotencji.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do dalszego przesiewowego badania modulatorów.
- Umożliwia standaryzację testów opartych na tkankach w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do oceny związków w kontekście regeneracyjnym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami uszkodzeń i regeneracji mięśni istotnymi dla przebiegu chorób.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną walidację interwencji regeneracyjnych.
- Dostarcza ilościowych punktów końcowych dla decyzji o rozwoju projektów regeneracji tkanek przy uwzględnieniu analizy ryzyka.
- Umożliwia ocenę plastyczności komórkowej in vivo w oparciu o biomarkery.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając ilościowe określanie stopnia starzenia się i reprogramowania in vivo po uszkodzeniu tkanki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regeneracji tkanek indukowanej przez starzenie oraz plastyczności komórkowej.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe analizy obrazowe oraz generowanie wyników statystycznych do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki mechanistyczne z modelami przedklinicznymi naprawy i regeneracji mięśni.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do oceny starzenia i przeprogramowania w różnych typach tkanek i interwencjach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do mechanizmów regeneracyjnych i walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy tkankowe w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfelach regeneracyjnych.
- Wpływ na portfel: Umożliwia priorytetyzację zasobów medycyny regeneracyjnej w oparciu o skorygowane ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie histochemii, immunohistochemii oraz analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do mikroskopii, oprogramowania do kwantyfikacji obrazów oraz walidowanych przeciwciał.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności testu.
- Metoda jest dostosowywalna do innych modeli uszkodzeń tkanek przy odpowiednim doborze markerów.
- Ograniczeniem jest wymóg stosowania świeżych lub zamrożonych próbek tkanek do testu SA-β-Gal.
