Name: Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji poziomów naładowania tRNA w Escherichia coli. Technika umożliwia porównawczą analizę RNA w różnych stanach wzrostu bakterii, co pozwala badać dynamikę komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Marit Warrer za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Duńską Radę ds. Niezależnych Badań Naukowych | Nauk Przyrodniczych [1323-00343B] oraz Duńskiej Narodowej Fundacji Badawczej [DNRF120].

<ol><li>Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li>
<li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%28%2B%29+and+Rel%28-%29+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Krüger, M. K., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li>
<li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li>
<li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li>
<li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li>
<li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global%2C+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).</li>
<li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li>
<li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+codon+bias%3A+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li>
<li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+%28Asn%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li>
<li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation%3A+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).</li>
<li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li>
<li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0926655062903456">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li>
<li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li>
<li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21460796">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li>
<li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje, jak jednocześnie mierzyć poziom naładowania określonych tRNA E. coli i porównywać względne poziomy tRNA w różnych próbkach. Krytycznymi punktami protokołu są: 1) obchodzenie się z próbkami w taki sposób, aby poziomy ładowania tRNA w komórkach zostały zachowane, 2) normalizacja ilości tRNA w taki sposób, aby można było wiarygodnie porównać względne poziomy tRNA w różnych próbkach, oraz 3) zapewnienie specyficzności wybranych sond dla interesujących nas tRNA. Kwestie te zostały omówione oddzi...

Poniżej przedstawiamy metodę ilościowego określania konkretnych tRNA i mierzenia ich poziomu naładowania za pomocą Northern blot. Metoda opiera się na technice opracowanej po raz pierwszy przez Varshneya i wsp.1. Poprzez pobieranie komórek do kwasu trichlorooctowego (TCA) i utrzymywanie próbek w temperaturze 0 °C przez cały czas oczyszczania RNA, wiązanie estrowe między tRNA a aminokwasem jest zachowane2,3,4. Aminoacylowane tRNA można odróżnić od ich nieacylowanych odpowiedników za pomocą elektroforezy żelowej i Northern blot, ze względu na zmniejszoną ruchliwość aminoacylowanego tRNA w żelu, spowodowaną kowalencyjnie związanym aminokwasem5. Dodatkowo przedstawiamy protokół normalizacji ilości tRNA poprzez dodanie komórek kolców powodujących nadekspresję rzadko używanegoselC tRNA 4.
tRNA są jednymi z najliczniejszych cząsteczek w komórce bakteryjnej i absolutnie istotną częścią maszynerii translacyjnej. tRNA wiążą aminokwasy i przenoszą je do translujących rybosomów. Wiązanie aminokwasów z tRNA (aminoacylacja lub ładowanie) jest ułatwione przez syntetazy aminoacylo-tRNA. Względna obfitość różnych naładowanych tRNA jest ważna dla zapewnienia wierności syntezy białek, ponieważ niedostateczna reprezentacja pokrewnego naładowanego tRNA dla danego kodonu informacyjnego RNA (mRNA) zwiększa prawdopodobieństwo, że prawie pokrewne tRNA błędnie dostarczy swój aminokwas do rosnącego łańcucha polipeptydowego na rybosomie6. Znaczenie naładowanego tRNA znajduje odzwierciedlenie w rozległej odpowiedzi komórki E. coli na poważny spadek poziomu ładunku tRNA; rygorystycznej reakcji. Podczas rygorystycznej odpowiedzi synteza tRNA, rybosomalnych RNA i większości mRNA jest obniżona na rzecz transkrypcji specyficznych mRNA związanych z biosyntezą aminokwasów i przetrwaniem stresu, a tempo wzrostu komórek jest dramatycznie obniżone7. Co więcej, ostatnie prace przeprowadzone przez nas i innych wykazały, że E. coli aktywnie degraduje większość swojego tRNA w odpowiedzi na stresy, które ograniczają translację4,8, co sugeruje, że dostosowanie poziomów tRNA może być ważne dla radzenia sobie z takimi stresami. W związku z tym wiarygodne pomiary obfitości tRNA i poziomów ładunku będą ważnym narzędziem do pełnego zrozumienia reakcji bakterii na stres.
E.coli jest powszechnie używana do ekspresji białka rekombinowanego, a ze względu na różnice w użyciu kodonów między gatunkami, często spotykanym problemem jest nieoptymalna ekspresja9. Można to obejść poprzez ekspresję dodatkowych tRNA potrzebnych do translacji rekombinowanego mRNA10. Pomiary poziomów ładowania tRNA w takich szczepach mogą pomóc w rozwiązywaniu problemów i pomóc w optymalizacji ekspresji białek.
Ta metoda umożliwia również wykrycie "nieprawidłowego ładowania"; cząsteczki tRNA aminoacylowanej przez niepokrewny aminokwas. Aminoacylacja przez różne aminokwasy może powodować migrację tRNA z nieco innymi prędkościami przez żele poliakrylamidowe1,11. W niektórych przypadkach metoda ta może być również wykorzystana do rozróżnienia różnych wzorców modyfikacji na identycznych tRNAs3.
Inną uznaną procedurą biochemiczną do badania poziomów ładowania tRNA jest okresowe utlenianie. Metoda opiera się na obserwacji, że aminoacylowane tRNA jest chronione przed utlenianiem periodycznym, a nienaładowane tRNA nie. Po okresowym utlenianiu dodaje się ponowne ładowanie tRNA w celu oszacowania poziomów naładowania zebranego RNA. Wykazano jednak, że leczenie ma wpływ na ładowanie kilku tRNA, co powoduje pewne niedokładności12. Przedstawiona tutaj metoda mierzy ładowanie bezpośrednio z oczyszczonego RNA, wykluczając w ten sposób wszelkie odchylenia wynikające z reakcji chemicznych lub enzymatycznych. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że w danym momencie wykrywany jest tylko jeden gatunek tRNA, więc chociaż ten sam Northern blot może być usunięty i ponownie zbadany pod kątem wielu tRNA, zbieranie danych na temat wielu tRNA jest czasochłonne i nieco pracochłonne.
Niezawodny sposób normalizacji próbek względem siebie jest niezbędny w badaniach, których celem jest porównanie względnych poziomów cząsteczki w różnych próbkach. Tutaj wprowadzamy procedurę normalizacji RNA, w której niewielka porcja komórek E. coli z nadekspresją rzadkiego tRNAselC jest dodawana jako impuls do wszystkich próbek eksperymentalnych przed oczyszczaniem RNA. Metoda ta jest przydatna nie tylko przy badaniu tRNA, ale także przy względnym oznaczaniu ilościowym dowolnego gatunku RNA, gdy konfiguracja doświadczalna jest taka, że nie można ufać, że żadne endogenne RNA nie jest obecne w tym samym stężeniu komórkowym we wszystkich próbkach. Na przykład, poziom rybosomalnego RNA podobnego do RNA jest często używany jako endogenne odniesienie do porównywania względnych ilości innego RNA między różnymi próbkami13. Jest to jednak mało przydatne, jeśli stężenie komórkowe referencyjnego RNA różni się między próbkami, jak może to mieć miejsce w przypadku rybosomalnego RNA, jeśli próbkowanie następuje podczas reakcji na stres15,16,17 lub podczas wejścia w fazę stacjonarną17. Dodanie komórek kolczastych do próbek eksperymentalnych przed oczyszczaniem RNA zapewnia solidny i dokładny sposób normalizacji niezależnie od konfiguracji próbkowania. Innym sposobem standaryzacji jest dodanie jednego lub więcej kolców RNA do próbek eksperymentalnych po oczyszczeniu RNA. Jednak metoda ta nie uwzględnia żadnych różnic w odzyskiwaniu RNA między próbkami.
Używanie komórek E. coli, które nadmiernie wyrażają referencyjne RNA jako komórki impulsowe (patrz Rysunek 1) w eksperymencie na E. coli ma tę wadę, że skutkuje dodatkiem niewielkiej ilości egzogennego całkowitego RNA E. coli do próbek. Korygujemy ten dodatek, analizując próbkę zawierającą tylko komórki kolczaste równolegle z próbkami eksperymentalnymi (patrz Northern blot w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2, pas oznaczony jako "selC"). Przedstawiony protokół został opracowany dla E. coli K-12, ale prawdopodobnie będzie miał zastosowanie do większości gatunków bakterii.

<table><tbody><tr><td>Mocznik</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>Czystość >99%</td></tr><tr><td>Poliakryloamid</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N,N'-metyleno-bis-akrylamid)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy (TCA)</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan</td><td></td><td></td><td></td>sodu</tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td><td></td><td></td><td></td>solny</tr><tr><td>Chlorek</td><td></td><td></td><td></td>sodu</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian</td><td></td><td></td><td></td>sodu</tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Śledź Plemniki DNA</td><td>Sigma</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 i gamma; ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonukleotydy (sondy)</td><td>TAG Kopenhaga</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond Membrana N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroblotter</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 GE</td><td>Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piec</td><td></td><td></td><td></td>do hydrydyzacji</tr><tr><td>Geiger-M&uuml; probówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ller Ekran do obrazowania luminoforowego</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka</td><td></td><td></td><td></td>hybrydyzacyjna</tr><tr><td>Kolby hodowlane Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>do mikrowirówek 1,5</td></tr><tr><td>ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td> wirówkowe 20 ml</tr> <tr><td><mocny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych rna w escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) jest istotną częścią maszynerii translacyjnej w każdym organizmie. tRNA wiążą i przenoszą aminokwasy do translującego rybosomu. Względne poziomy różnych tRNA oraz stosunek aminoacylowanego tRNA do całkowitego tRNA, znany jako poziom ładowania, są ważnymi czynnikami określającymi dokładność i szybkość translacji. Dlatego obfitość i poziomy naładowania tRNA są ważnymi zmiennymi do pomiaru podczas badania syntezy białek, na przykład w różnych warunkach stresowych. W tym miejscu opisujemy metodę zbierania tRNA i bezpośredniego pomiaru zarówno względnej obfitości, jak i bezwzględnego poziomu naładowania określonych gatunków tRNA w Escherichia coli. tRNA jest zbierane w taki sposób, aby zachować labilne wiązanie między tRNA a jego aminokwasem. RNA jest następnie poddawane elektroforezie żelowej i Northern blot, w wyniku czego dochodzi do oddzielenia naładowanych i nienaładowanych tRNA. Poziomy specyficznych tRNA w różnych próbkach można porównać dzięki dodaniu komórek kolców w celu normalizacji. Przed oczyszczeniem RNA do każdej próbki dodajemy 5% komórek E. coli, które nadprodukują rzadkie tRNAselC. Ilość interesujących gatunków tRNA w próbce jest następnie normalizowana do ilości tRNAselC w tej samej próbce. Dodanie komórek z kolcami przed oczyszczeniem RNA ma tę przewagę nad dodawaniem oczyszczonych kolców RNA, że uwzględnia również wszelkie różnice w wydajności lizy komórek między próbkami.

Stosując opisaną tutaj procedurę, zmierzono poziom obfitości oraz stopień naładowania trzech tRNAs w szczepie E. coli K-12 przed i w trakcie głodowania aminokwasowego.
Szczep NF915, aukstrotrof argininy4 (thr leu his argH thi mtl supE44) hodowano przez co najmniej dziesięć generacji w minimalnym medium MOPS uzupełnionym o 0,4% glicerolu, 50 &#181;g/mL treonina, leucyna, arginina i 5 &#18...

Tutaj prezentujemy metodę bezpośredniego pomiaru poziomów ładowania transferowego RNA z oczyszczonego RNA Escherichia coli, a także sposób porównywania względnych poziomów transferowego RNA, lub dowolnego innego krótkiego RNA, w różnych próbkach na podstawie dodania komórek impulsowych wyrażających gen odniesienia.

Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ilościowe określenie obfitości i poziomów ładunku transferowych RNA w Escherichia coli. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak, w jaki sposób zmienia się poziom naładowania tRNA w różnych stanach wzrostu. Główną zaletą tej metody jest to, że poziomy RNA można ilościowo porównywać nawet między stanami wzrostu, które drastycznie zmieniają skład RNA w komórkach.Rozpocznij ten eksperyment od wyhodowania eksperymentalnych i kolczastych kultur E. coli zgodnie z protokołem tekstowym. Hoduj kulturę kolców w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 160 obr./min. Gdy kultura z nagłym skokiem osiągnie OD436 około 0,1, indukuj ekspresję komórki C tRNA przez dodanie IPTG.Hoduj kulturę, aż osiągnie OD436 około 0,5. Następnie przenieś kulturę do lodu, aż wszystkie próbki zostaną zebrane. Następnie podgrzej jedną 100-mililitrową kolbę hodowlaną zawierającą cztery mililitry 10% TCA dla każdej próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Zmierzyć i zarejestrować OD436 w kulturach doświadczalnych bezpośrednio przed pobraniem komórek. Następnie przenieść cztery mililitry kultury do wstępnie podgrzanej kolby zawierającej TCA. Wymieszać próbkę ręcznie, obracając kolbę przez pięć sekund, co natychmiast wyłączy wszelkie działania enzymatyczne, zachowując poziomy naładowania tRNA.Po zebraniu wszystkich próbek dodaj 5% komórek kolczastych do każdej próbki. Należy również przygotować próbkę kontrolną składającą się wyłącznie z komórek typu spike-in, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, wlej osiem mililitrów każdej próbki, w tym kontrole, do chłodzonej lodem probówki wirówkowej.Odwirować próbki w temperaturze 9 500 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Po całkowitym usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 0,3 mililitra zimnego octanu sodu, zawierającego 10 milimolowych EDTA. Przenieś każdą próbkę do zimnej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i dodaj 0,3 mililitra fenolu zrównoważonego z buforem, używanym do ponownego zawieszenia osadu.Następnie wiruj każdą próbkę 10 razy przez 15 sekund za każdym razem. Z co najmniej jedną minutą w temperaturze zero stopni Celsjusza między każdym wirem, aby próbki były zimne. Następnie odwirować próbki w temperaturze 20 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.Przenieś górną lub wodną powierzchnię do nowej 1.5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 0,3 mililitra zimnego fenolu do powierzchni wodnej i wiruj próbki cztery razy po 15 sekund każda, jak opisano wcześniej. Następnie odwirować próbki w temperaturze 20 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Przenieś powierzchnię wodną do nowej zimnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i dodaj 2,5 objętości zimnego 96% etanolu. Następnie inkubuj probówki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wytrącić RNA. Odwirować próbki w temperaturze 20 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.Po usunięciu supernatantu ostrożnie dodaj jeden mililitr zimnego 70% etanolu do granulki RNA, uważając, aby go nie naruszyć. Delikatnie odwróć rurkę raz, aby umyć ją etanolem. Na koniec odwirować w temperaturze 20 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Całkowicie usunąć supernatant i wysuszyć granulki na powietrzu, aż etanol zostanie całkowicie usunięty. Przy 20 mikrolitrach zimnego octanu sodu zawierającego 1 milimolowy EDTA, energicznie wirować, aby ponownie zawiesić osad. Aby rozpocząć elektroforezę, wymieszaj cztery mikrolitry każdej próbki z sześcioma mikrolitrami buforu ładującego.Załadować próbki, wraz z kontrolami, na żel poliakrylamidowy o grubości 0,4 milimetra i zawartości 6,5 milimetra, zawierający osiem molowych urealów i 0,1-molowy bufor octanu sodu. Następnie oddziel RNA, uruchamiając elektroforezę przy napięciu 10 woltów na centymetr żelu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około 20 godzin, aż niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna żelu. Ostrożnie oddziel dwie szklane płytki, aby żel pozostał na jednej z nich.Użyj obszaru żelu od barwnika ksylenowo-cyjanolowego i 20 centymetrów w dół w kierunku barwnika bromofenolowego do osuszania. Przytnij cienki kawałek bibuły filtracyjnej do rozmiaru żądanego obszaru bibuły. Umieść bibułę filtracyjną na części żelu, która będzie używana do bibuły.Odetnij i wyrzuć części żelu, które nie są pokryte bibułą filtracyjną. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie podnieść żel ze szklanej płytki. Umieść dodatnio naładowaną nylonową membranę na wierzchu żelu i osuszaj ją elektrolitycznie w buforze transferowym o napięciu 20 woltów przez 90 minut.Zakończ sieciowaniem RNA z membraną za pomocą światła UV. Następnie umieść usieciowaną membranę w probówce hybrydyzacyjnej i dodaj sześć mililitrów roztworu hybrydyzacyjnego. Obracaj rurkę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wstępnie zhybrydyzować membranę.Następnie dodaj 30 molową radioaktywną sondę oligo DNA, pięć pierwszych i znakowaną P32. Obróć, aby inkubować membranę z sondą w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji użyj jednorazowej pipety o pojemności 10 mililitrów, aby wyjąć sondę.Następnie szybko umyj membranę dwukrotnie w probówce hybrydyzacyjnej, w 15 mililitrach roztworu myjącego o temperaturze pokojowej. Przenieś membranę do płaskiego plastikowego pojemnika, przykryj ją roztworem myjącym i zamknij pokrywkę. Inkubować membranę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Zmień roztwór i kontynuuj mycie, aż do uzyskania satysfakcjonującego stosunku sygnału do szumu. Użyj rurki Geigera Mullera, aby uzyskać stosunek sygnału do szumu, porównując promieniowanie z obszaru, w którym sonda zhybrydyzowała się z tRNA, z promieniowaniem z pustego obszaru. Następnie owiń membranę szczelnie folią spożywczą i szczelnie zamknij przez spawanie.Umieść tę membranę na ekranie do obrazowania fosforowego. Po odpowiednim czasie naświetlania zeskanuj ekran za pomocą skanera laserowego i zapisz plik w formacie żelowym. Następnie załaduj plik żelu do oprogramowania do obrazowania.Narysuj pionową linię wzdłuż każdego z pasów próbki, tak aby obejmowała większość szerokości pasa, wykluczając krawędzie pasm, w których sygnał może być nierówny. Aby zwizualizować zliczenia z każdego pasa, kliknij przycisk Analiza, a następnie utwórz wykres. Ręcznie zdefiniuj dwa piki, które reprezentują naładowane i nienaładowane tRNA z każdej linii.Następnie kliknij na analizę, a następnie raport obszaru, aby uzyskać zliczenia z każdego szczytu. Na koniec zapisz obszar pod każdym z dwóch szczytów. Oblicz poziomy tRNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Metoda ta została wykorzystana do zmierzenia obfitości różnych tRNA i E.Coli nf915 przed i podczas naszego głodu argininy. Na północnej powierzchni zhybrydyzowanej z różnymi sondami tRNA występuje wyraźna separacja między prążkami reprezentującymi naładowane tRNA a prążkami reprezentującymi nienaładowane tRNA. Profil promieniowania wzdłuż każdego pasa został uzyskany z północnych plam za pomocą oprogramowania do obrazowania.Sygnał promieniowania z każdego pasa został określony ilościowo poprzez odizolowanie każdego z nich od plamy. Wykres, który przedstawia kwantyfikację sygnału z jednego pasa, pokazuje dwa szczyty. Lewy pik pochodzi z aminoacylowanego tRNA, a prawy z deacylowanego tRNA.Obszar pod każdym szczytem jest eksportowany w celu dalszej analizy. Kwantyfikacja prążków z northern blot pokazuje, że względna liczebność wszystkich badanych gatunków tRNA gwałtownie i znacząco zmniejszyła się podczas głodu aminokwasów. Z drugiej strony, poziomy ładowania tRNA argininy akceptującej tRNA gwałtownie spadły po usunięciu argininy, a następnie nieznacznie wzrosły w okresie głodu.Jednak poziomy ładowania innych tRNA nieznacznie wzrosły po wygłodzeniu, a następnie spadły do poziomu prawie sprzed głodu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić RNA w taki sposób, aby można było określić ilościowo ładunek i obfitość tRNA oraz jak używać komórek kolczastych do normalizacji. Podczas tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby RNA było zimne i kwaśne, aby zapobiec hydrolizie RNA.

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę analizy mikromacierzy służącą do określenia względnych poziomów aminoacylacji wszystkich tRNA z S. cerivisiae.

Analiza poziomu aminacylacji (ładowania) tRNA w skali całego genomu z wykorzystaniem mikromacierzy

Źródło: Stenum, T. S. i in. Ilościowa ilościowa i ładująca poziomy transferowych RNA w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie elektroforezy żelowej i północnego blottingu do wykrywania i porównywania poziomów ładunku RNA transferowych w E. coli poprzez rozdzielenie form aminoacylowanych i deacylatowanych.

Elektroforeza żelowa i północne blotezowanie w celu wykrywania poziomów ładowania tRNA w E. coli

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Poznaj metodę kwantyfikacji poziomów naładowania tRNA w Escherichia coli. Technika umożliwia porównawczą analizę RNA w różnych stanach wzrostu bakterii, co pozwala badać dynamikę komórkową.

Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów