Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ilościowe określenie obfitości i poziomów ładunku transferowych RNA w Escherichia coli. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak, w jaki sposób zmienia się poziom naładowania tRNA w różnych stanach wzrostu. Główną zaletą tej metody jest to, że poziomy RNA można ilościowo porównywać nawet między stanami wzrostu, które drastycznie zmieniają skład RNA w komórkach.

Rozpocznij ten eksperyment od wyhodowania eksperymentalnych i kolczastych kultur E. coli zgodnie z protokołem tekstowym. Hoduj kulturę kolców w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 160 obr./min. Gdy kultura z nagłym skokiem osiągnie OD436 około 0,1, indukuj ekspresję komórki C tRNA przez dodanie IPTG.

Hoduj kulturę, aż osiągnie OD436 około 0,5. Następnie przenieś kulturę do lodu, aż wszystkie próbki zostaną zebrane. Następnie podgrzej jedną 100-mililitrową kolbę hodowlaną zawierającą cztery mililitry 10% TCA dla każdej próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zmierzyć i zarejestrować OD436 w kulturach doświadczalnych bezpośrednio przed pobraniem komórek. Następnie przenieść cztery mililitry kultury do wstępnie podgrzanej kolby zawierającej TCA. Wymieszać próbkę ręcznie, obracając kolbę przez pięć sekund, co natychmiast wyłączy wszelkie działania enzymatyczne, zachowując poziomy naładowania tRNA.

Po zebraniu wszystkich próbek dodaj 5% komórek kolczastych do każdej próbki. Należy również przygotować próbkę kontrolną składającą się wyłącznie z komórek typu spike-in, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, wlej osiem mililitrów każdej próbki, w tym kontrole, do chłodzonej lodem probówki wirówkowej.

Odwirować próbki w temperaturze 9 500 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Po całkowitym usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 0,3 mililitra zimnego octanu sodu, zawierającego 10 milimolowych EDTA. Przenieś każdą próbkę do zimnej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i dodaj 0,3 mililitra fenolu zrównoważonego z buforem, używanym do ponownego zawieszenia osadu.

Następnie wiruj każdą próbkę 10 razy przez 15 sekund za każdym razem. Z co najmniej jedną minutą w temperaturze zero stopni Celsjusza między każdym wirem, aby próbki były zimne. Następnie odwirować próbki w temperaturze 20 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Przenieś górną lub wodną powierzchnię do nowej 1.5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 0,3 mililitra zimnego fenolu do powierzchni wodnej i wiruj próbki cztery razy po 15 sekund każda, jak opisano wcześniej. Następnie odwirować próbki w temperaturze 20 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Przenieś powierzchnię wodną do nowej zimnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i dodaj 2,5 objętości zimnego 96% etanolu. Następnie inkubuj probówki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wytrącić RNA. Odwirować próbki w temperaturze 20 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po usunięciu supernatantu ostrożnie dodaj jeden mililitr zimnego 70% etanolu do granulki RNA, uważając, aby go nie naruszyć. Delikatnie odwróć rurkę raz, aby umyć ją etanolem. Na koniec odwirować w temperaturze 20 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Całkowicie usunąć supernatant i wysuszyć granulki na powietrzu, aż etanol zostanie całkowicie usunięty. Przy 20 mikrolitrach zimnego octanu sodu zawierającego 1 milimolowy EDTA, energicznie wirować, aby ponownie zawiesić osad. Aby rozpocząć elektroforezę, wymieszaj cztery mikrolitry każdej próbki z sześcioma mikrolitrami buforu ładującego.

Załadować próbki, wraz z kontrolami, na żel poliakrylamidowy o grubości 0,4 milimetra i zawartości 6,5 milimetra, zawierający osiem molowych urealów i 0,1-molowy bufor octanu sodu. Następnie oddziel RNA, uruchamiając elektroforezę przy napięciu 10 woltów na centymetr żelu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około 20 godzin, aż niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna żelu. Ostrożnie oddziel dwie szklane płytki, aby żel pozostał na jednej z nich.

Użyj obszaru żelu od barwnika ksylenowo-cyjanolowego i 20 centymetrów w dół w kierunku barwnika bromofenolowego do osuszania. Przytnij cienki kawałek bibuły filtracyjnej do rozmiaru żądanego obszaru bibuły. Umieść bibułę filtracyjną na części żelu, która będzie używana do bibuły.

Odetnij i wyrzuć części żelu, które nie są pokryte bibułą filtracyjną. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie podnieść żel ze szklanej płytki. Umieść dodatnio naładowaną nylonową membranę na wierzchu żelu i osuszaj ją elektrolitycznie w buforze transferowym o napięciu 20 woltów przez 90 minut.

Zakończ sieciowaniem RNA z membraną za pomocą światła UV. Następnie umieść usieciowaną membranę w probówce hybrydyzacyjnej i dodaj sześć mililitrów roztworu hybrydyzacyjnego. Obracaj rurkę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wstępnie zhybrydyzować membranę.

Następnie dodaj 30 molową radioaktywną sondę oligo DNA, pięć pierwszych i znakowaną P32. Obróć, aby inkubować membranę z sondą w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji użyj jednorazowej pipety o pojemności 10 mililitrów, aby wyjąć sondę.

Następnie szybko umyj membranę dwukrotnie w probówce hybrydyzacyjnej, w 15 mililitrach roztworu myjącego o temperaturze pokojowej. Przenieś membranę do płaskiego plastikowego pojemnika, przykryj ją roztworem myjącym i zamknij pokrywkę. Inkubować membranę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Zmień roztwór i kontynuuj mycie, aż do uzyskania satysfakcjonującego stosunku sygnału do szumu. Użyj rurki Geigera Mullera, aby uzyskać stosunek sygnału do szumu, porównując promieniowanie z obszaru, w którym sonda zhybrydyzowała się z tRNA, z promieniowaniem z pustego obszaru. Następnie owiń membranę szczelnie folią spożywczą i szczelnie zamknij przez spawanie.

Umieść tę membranę na ekranie do obrazowania fosforowego. Po odpowiednim czasie naświetlania zeskanuj ekran za pomocą skanera laserowego i zapisz plik w formacie żelowym. Następnie załaduj plik żelu do oprogramowania do obrazowania.

Narysuj pionową linię wzdłuż każdego z pasów próbki, tak aby obejmowała większość szerokości pasa, wykluczając krawędzie pasm, w których sygnał może być nierówny. Aby zwizualizować zliczenia z każdego pasa, kliknij przycisk Analiza, a następnie utwórz wykres. Ręcznie zdefiniuj dwa piki, które reprezentują naładowane i nienaładowane tRNA z każdej linii.

Następnie kliknij na analizę, a następnie raport obszaru, aby uzyskać zliczenia z każdego szczytu. Na koniec zapisz obszar pod każdym z dwóch szczytów. Oblicz poziomy tRNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Metoda ta została wykorzystana do zmierzenia obfitości różnych tRNA i E.Coli nf915 przed i podczas naszego głodu argininy. Na północnej powierzchni zhybrydyzowanej z różnymi sondami tRNA występuje wyraźna separacja między prążkami reprezentującymi naładowane tRNA a prążkami reprezentującymi nienaładowane tRNA. Profil promieniowania wzdłuż każdego pasa został uzyskany z północnych plam za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Sygnał promieniowania z każdego pasa został określony ilościowo poprzez odizolowanie każdego z nich od plamy. Wykres, który przedstawia kwantyfikację sygnału z jednego pasa, pokazuje dwa szczyty. Lewy pik pochodzi z aminoacylowanego tRNA, a prawy z deacylowanego tRNA.

Obszar pod każdym szczytem jest eksportowany w celu dalszej analizy. Kwantyfikacja prążków z northern blot pokazuje, że względna liczebność wszystkich badanych gatunków tRNA gwałtownie i znacząco zmniejszyła się podczas głodu aminokwasów. Z drugiej strony, poziomy ładowania tRNA argininy akceptującej tRNA gwałtownie spadły po usunięciu argininy, a następnie nieznacznie wzrosły w okresie głodu.

Jednak poziomy ładowania innych tRNA nieznacznie wzrosły po wygłodzeniu, a następnie spadły do poziomu prawie sprzed głodu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić RNA w taki sposób, aby można było określić ilościowo ładunek i obfitość tRNA oraz jak używać komórek kolczastych do normalizacji. Podczas tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby RNA było zimne i kwaśne, aby zapobiec hydrolizie RNA.