Name: Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj mikronapromienianie laserowe do badania odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA in vivo. Ta metoda umożliwia analizę sygnalizacji uszkodzeń i rekrutacji czynników naprawczych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Akirze Yasui z Uniwersytetu Tohoku, Japonia za plazmid ekspresji GFP-NTH1, oraz dr Eros Lazzerini Denchi z Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornia za plazmidy ekspresji TRF2-YFP i EGFP-53BP11220-1711. Prace te były wspierane przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych (FA9550-04-1-0101) i Fundację Beckman Laser Institute Inc. (do M.W.B.), stypendium Fundacji Forda z Narodowej Akademii Nauk (do B.A.S) oraz NSF MCB-1615701 i CRCC CRR-17-426665 (do KL).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zalety stosowania mikronapromieniowania laserowego do badań DDR to:
1. Możliwe jest wywołanie różnych typów i ilości uszkodzeń DNA od prostych pęknięć nici do złożonych uszkodzeń DNA oraz wykrycie różnych czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia DNA poprzez dostosowanie parametrów napromieniania laserowego. Możliwe jest również wielokrotne uszkodzenie tego samego jądra komórkowego w celu oceny efektów trans (jak na rycinie 3).
<p class="jove_cont...

Sygnalizacja uszkodzeń DNA in vivo nie jest dobrze poznana 
In vivo DNA jest skompleksowane z histonami i innymi czynnikami, tworząc włókna chromatyny. Regulacja struktury chromatyny ma ogromne znaczenie dla metabolizmu DNA. Na przykład wariant histonu H2AX jest fosforylowany przez mutację ataksji-teleangiektazji (ATM) i inne kinazy po indukcji pęknięć dwuniciowych (DSB) i jest ważny dla wzmocnienia sygnału uszkodzenia DSB, a także zapewnia miejsce dokowania dla innych czynników. Wydaje się, że na rozprzestrzenianie się sygnalizacji uszkodzeń i wybór ścieżki naprawy krytyczny wpływ ma lokalna struktura chromatyny w miejscach uszkodzenia1. Wiele czynników przebudowujących chromatynę, opiekuńczych histonów i enzymów modyfikujących histony jest rzeczywiście rekrutowanych do uszkadzania miejsc i jest ważnych dla skutecznej naprawy DNA, podkreślając znaczenie regulacji chromatyny w DDR i naprawie2,3,4. Ponadto u drożdży i drosophila5,6,7,8, co przypomina relokalizację loci genów w przedziale subjądrowym związanym z regulacją genów9,10. Ostatnie badania na komórkach mysich i ludzkich wykazały również mobilizację miejsc DSB, co wpływa na wierność naprawy i wybór ścieżki11,12. Stwarza to możliwość, że DDR/naprawa może być również ściśle związana z architekturą jądrową, organizacją chromatyny wyższego rzędu i dynamiką chromosomów w jądrze komórkowym. W związku z tym tak ważne jest opracowanie metod o wysokiej rozdzielczości do badania DDR i procesów naprawczych w kontekście endogennego środowiska jądrowego w żywej komórce, aby zrozumieć krótko- i długoterminowe konsekwencje uszkodzenia DNA.
Krytyczna rola polimerazy PAR (PARP) w ocenie zakresu i rodzaju uszkodzenia oraz regulacji składania białek w miejscu uszkodzenia 
PARP1 to czujnik nacięć DNA szybko aktywowany przez uszkodzenie DNA, który odgrywa kluczową rolę w naprawie DNA13. Pierwotnie sądzono, że PARP1 działa razem z X-Ray Repair Cross Complementing 1 (XRCC1) w celu ułatwienia naprawy przez wycinanie zasady (BER), ale ostatnie badania ujawniają jego rolę w innych szlakach naprawy DNA, w tym DSB repair14. Aktywowany PARP1 wykorzystuje dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+) jako substrat do ADP-rybozylanu wielu białek docelowych, w tym siebie. Ten enzym i inni członkowie rodziny przyciągnęli wiele uwagi w ostatnich latach, ponieważ inhibitory PARP okazały się obiecującymi lekami terapeutycznymi na nowotwory. Chociaż początkowo stwierdzono, że inhibitory PARP są skuteczne w komórkach raka piersi z mutacją genu raka piersi (BRCA), obecnie istnieje mnóstwo dowodów na ich działanie w terapiach mono- i skojarzonych wraz z czynnikami uszkadzającymi/napromienianiem DNA przeciwko szerokiemu spektrum nowotworów z mutacjami nie ograniczającymi się do BRCA15,16,17,18,19,20.
Na poziomie molekularnym wykazano, że aktywacja PARP odgrywa kluczową rolę w organizowaniu lokalnej struktury chromatyny w miejscach uszkodzenia. Zależna od PAR rekrutacja enzymów modyfikujących chromatynę ułatwia naprawę DSB i dyktuje wybór szlaku naprawy, co sugeruje ważną rolę modyfikacji PAR w miejscach uszkodzenia. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 Niedawno wykazaliśmy wykluczenie białka wiążącego p53 1 (53BP1) z miejsc uszkodzenia przez PAR 32, dostarczając alternatywnego wyjaśnienia zależnej od 53BP1 hiperaktywacji niehomologicznego łączenia końcówek (NHEJ) przez inhibitor PARP i podkreślając znaczenie PARP w wyborze ścieżki naprawy DSB33,34. PARP1 również bezpośrednio PARyluje i wpływa na aktywność wielu czynników naprawy DNA14.
Wykorzystanie mikronapromieniowania laserowego jako narzędzia do badania DDR/naprawy In Vivo 
Mikronapromienianie laserowe w celu wywołania submikronowych zmian na poszczególnych chromosomach zostało po raz pierwszy opisane w 1969 roku35 i szczegółowo omówione w 1981 roku36. Kilkadziesiąt lat później wykazano, że mikronapromienianie laserowe indukuje uszkodzenia DNA w określonym regionie submikrometrowym w jądrze komórkowym i udowodniono, że jest cenną techniką badania rekrutacji lub modyfikacji różnych czynników do zmian w DNA in vivo13,37,38,39,40,41. Metoda ta pozwala na wykrycie tych czynników, które nie tworzą wyraźnych ognisk wywołanych promieniowaniem (IRIF) w miejscach uszkodzenia39,42. Możliwe jest również zbadanie czasoprzestrzennej dynamiki zmian strukturalnych chromatyny zarówno w miejscach uszkodzenia, jak i w pozostałej części jądra. Dokładnie porównaliśmy DDR indukowane przez różne systemy laserowe i moce wejściowe, aby ocenić związek między rodzajem uszkodzenia DNA a warunkami mikronapromieniowania32,43,44,45. Nieprawidłowe wzorce rekrutacji 53BP1 i telomerowego czynnika wiązania powtórzeń 2 (TRF2) zaobserwowano w poprzednich badaniach uszkodzeń laserowych, które stanowiły podstawę do powtarzających się obaw o "niefizjologiczny" charakter uszkodzeń wywołanych laserem46,47,48,49. Odkryliśmy, że te pozorne rozbieżności można teraz wyjaśnić za pomocą różnicowej sygnalizacji PARP, która mierzy ilość i złożoność wywołanych uszkodzeń32. Potwierdziliśmy, że: 1) ogniwa napromieniowane laserowo (nawet po napromieniowaniu o dużej mocy wejściowej) są zatrzymywane w interfazie w sposób zależny od kontroli punktu kontroli uszkodzenia i zachowują żywotność (co najmniej do 48 godzin)32,50; oraz 2) rekrutacja/modyfikacje czynników naprawczych wiernie odwzorowują te zaobserwowane podczas leczenia konwencjonalnymi czynnikami uszkadzającymi DNA i indukcji DSB przez endonukleazy32,39,42,44,50,51,52. Wyniki te silnie potwierdzają fizjologiczne znaczenie badania odpowiedzi komórkowych wywołanych uszkodzeniem laserowym.

<table><tbody><tr><td>Ti:Szafirowy impulsowy laser femtosekundowy NIR Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td><td>Mikroskop odwrócony Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Obiektyw Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy stolik obrotowy&nbsp;</td><td>Regulator temperatury Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>System</td> grzewczy <td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi&nbsp;</td><td></td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>System inkubacji gazów</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy miernik mocy i energii (RoHS)</td><td>Pole koherentne</td><td>MaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CCD ORCA-R2</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Laserowe mikroskopy skaningowe</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Naczynia z kratką&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 komórki nabłonka nerek</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Medium niezależne od CO2&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>uzupełniony o L-glutaminę, 4% penicyliny</td></tr><tr><td>/streptomycyny</td><td>FBS Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Tymidyna&nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>pożywka bez surowicy&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Cyklobutancyjny dimer pirymidyny (CPD) (mysz)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (mysz)</td> <td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (królik)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Polimery anty-PAR (mysz)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (królik)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (mysz)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (mysz)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (Królik)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (do wykrywania kohezyny)</td>wygenerowane w laboratorium <td></td><td></td><td>Yokomori (KY)</td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (Królik)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (mysz)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-oksyguanina&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anty-PARP1&nbsp; (Królik)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>wygenerowane w KY lab</td><td></td><td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp; Anty-hCAPG (Królik)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (do wykrywania kondensyny)</td><td>wytworzony w laboratorium</td><td></td> KY <td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji HiPerFect siRNA</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Stabilna linia komórkowa GFP-SMC1&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>wygenerowane w laboratorium KY</td><td></td><td>ref 49&nbsp;</td></tr><tr><td>Stabilna linia komórkowa GFP-NEIL2</td><td>wytworzona w laboratorium KY</td><td></td><td>nr ref. 54</td></tr><tr><td>Stabilna linia komórkowa GFP-NTH1</td><td>wytworzona w laboratorium</td><td></td> KY <td>nr ref. 32</td></tr><tr><td>Plazmid GFP-SMC1</td><td>wytworzony w laboratorium</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Plazmid GFP-Ku</td><td>wytworzony w laboratorium</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Anty-MDC1 (królik)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100&ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anty-gH2AX (królik)</td><td>&nbsp; Milipor</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) Stabilna linia komórkowa PtK2</td><td>wytworzona w laboratorium</td><td></td> Berns <td>nr ref. 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP PtK2 stabilna linia komórkowa</td><td>wytworzona w laboratorium</td><td></td> Berns <td>nr ref. 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor PARG</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash; Inhibitor PKcs&nbsp; NU7026&nbsp;</td>Inhibitor ATM <td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>KU55933</td><td>&nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Ilość Jedno oprogramowanie do analizy 1-D Wersja 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>Program do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>arkusz kalkulacyjny</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco 10X bez wapnia i magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>rozcieńczyć do 1X&nbsp;</td></tr></tbody></table>

mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia dna

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Uszkodzenie DNA indukuje specyficzne reakcje sygnalizacyjne i naprawcze w komórce, co jest kluczowe dla ochrony integralności genomu. Mikronapromienianie laserowe stało się cennym narzędziem eksperymentalnym do badania odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) in vivo. Umożliwia analizę dynamiki makromolekularnej pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości w odpowiedzi na uszkodzenia wywołane laserem ograniczone do submikrometrowego obszaru w jądrze komórkowym. Stosowano jednak różne warunki laserowe bez uwzględniania różnic w rodzajach wywoływanych uszkodzeń. W rezultacie, charakter szkody często nie jest dobrze scharakteryzowany lub kontrolowany, co powoduje pozorne niespójności w profilach rekrutacji lub modyfikacji. Wykazaliśmy, że różne warunki napromieniowania (tj. różne długości fal, a także różne moce wejściowe (napromieniowanie) lasera femtosekundowego (fs) bliskiej podczerwieni (NIR)) indukowały różne zespoły białek DDR i naprawczych. Odzwierciedla to rodzaj powstałych uszkodzeń DNA. Protokół ten opisuje, w jaki sposób miareczkowanie mocy wejściowej lasera umożliwia indukcję różnych ilości i złożoności uszkodzeń DNA, które można łatwo monitorować poprzez wykrywanie uszkodzeń zasad i sieciowania, różnicowej sygnalizacji poli (ADP-rybozy) (PAR) oraz specyficznych dla szlaku zespołów czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia. Po określeniu warunków uszkodzenia możliwe jest zbadanie wpływu różnej złożoności uszkodzeń i zróżnicowanej sygnalizacji uszkodzeń, a także wyczerpania czynników poprzedzających na dowolny czynnik będący przedmiotem zainteresowania.

Przy użyciu komórek PtK2 stabilnie ekspresujących EGFP-53BP1120-171 lub TRF2-YFP przeprowadzono miareczkowanie mocy wejściowej lasera w celu ustalenia optymalnych warunków dla ich rekrutacji (Rysunek 1)32.
W miejscach uszkodzeń wywołanych laserem o wysokiej mocy wejściowej zaobserwowano znaczne skupianie się CPD (uszkodzeń sieciujących typowo generowanych przez promieniowanie ultrafioletowe (UV)) oraz glikozylazy DNA GFP-NTH1, kt...

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania mikroirradiacji laserowej do indukowania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym prostych pęknięć nici oraz uszkodzeń złożonych, w celu badania sygnalizacji uszkodzeń DNA oraz montażu czynników naprawczych in vivo. W latach 60. i 70. skupialiśmy wiązkę lasera za pomocą mikroskopu, który widać za mną, co pozwalało na uszkodzenie niewielkiego obszaru chromosomu. Komórka dzieliła się i przeżywała, a my nie potrafiliśmy zrozumieć dlaczego.Wielu badaczy, 40 lat później, wykorzystuje obecnie tę metodę do selektywnego badania naprawy DNA i właśnie to zaprezentujemy dzisiaj. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA, takie jak sposób rozpoznawania i przetwarzania uszkodzeń DNA oraz mechanizm propagacji sygnału o uszkodzeniu w komórce. Mikroirradiation laserowa umożliwia analizę dynamiki makromolekularnej w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością, na poziomie pojedynczej komórki, w odpowiedzi na uszkodzenia DNA ograniczone do obszaru o wielkości kilku mikrometrów w jądrze komórkowym.Stosowano jednak różne warunki laserowe bez uwzględnienia różnic w indukowanych typach uszkodzeń, co prowadziło do niespójności w odpowiedziach komórkowych, rekrutacji czynników oraz modyfikacjach. Aby wyexpronować białka znakowane fluorescencyjnie w komórkach HeLa, pierwszego dnia należy wysiać od 6 do 8 × 10⁴ komórek w 0,5 ml pożywki hodowlanej w jednym dołku płytki 24-dołkowej. Następnie płytkę należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek.Drugiego dnia przeprowadź transfekcję DNA za pomocą liposomów, rozcieńczając 0,3 µg plazmidowego DNA ekspresyjnego dla ssaków, kodującego znakowany fluorescencyjnie czynnik naprawy DNA, w 25 µL bezserwatkowego medium hodowlanego. W tym przypadku zastosowano domenę celującą w miejsce uszkodzenia białka 53BP1 połączoną z GFP dla pęknięć dwuniciowych lub glikozylazę DNA NTH1 połączoną z GFP dla uszkodzeń zasad. W oddzielnej probówce 1,5 ml rozcieńcz 1 µL odczynnika do transfekcji DNA opartego na liposomach w 25 µL bezserwatkowego medium hodowlanego, następnie połącz zawartość obu probówek (rozcieńczone DNA oraz odczynnik do transfekcji) i inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu utworzenia kompleksów DNA-lipid.Przepłucz komórki raz 0,5 ml pożywki hodowlanej, następnie usuń pożywkę i dodaj do komórek 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej. Dodaj kompleksy DNA-lipid do komórek i delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie kołysząc płytką. Następnie przenieś komórki z powrotem do inkubatora.Po czterech do sześciu godzinach usunąć pożywkę hodowlaną z komórek i dodać 300 µL 0,5% Trypsyny-EDTA. Usunąć roztwór, a następnie dodać 200 µL Trypsyny-EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez trzy do czterech minut. Po potwierdzeniu, że komórki się odłączyły, dodać 800 µL pożywki hodowlanej i resuspenderć komórki, delikatnie pipetując w celu rozbicia skupisk komórkowych.Przenieś zawiesinę komórkową do 35-milimetrowejy szalki hodowlanej z siatkowanym szkiełkiem nakrywkowym i dodaj medium hodowlane do uzyskania objętości końcowej 2 ml. Po 48 godzinach komórki osiągną od 30 do 60% konfluencji z ekspresją białka fluorescencyjnego i będą gotowe do indukcji uszkodzeń laserowych. Włącz laser NIR i pozwól systemowi laserowemu rozgrzać się przez jedną godzinę przed użyciem.Umieść naczynie z komórkami na podgrzewanym do 37 °C stoliku w komorze umożliwiającej kontrolę poziomu dwutlenku węgla i wilgotności. Do analizy żywych komórek z białkami znakowanymi fluorescencyjnie należy użyć obiektywu imersyjnego o dużym powiększeniu oraz odpowiedniej kombinacji filtrów fluorescencyjnych, zależnie od rodzaju znacznika. Znajdź komórki o porównywalnej ekspresji białka fluorescencyjnego.Należy unikać komórek o zbyt słabej lub zbyt silnej ekspresji, aby zmniejszyć zmienność międzykomórkową w pomiarach fluorescencji. W przypadku mikroskopii konfokalnej należy użyć obiektywu olejowego 100x z aperturą numeryczną 1,3 oraz funkcji wygaszania (bleach) w oprogramowaniu do wyznaczania liniowych ścieżek wewnątrz jądra komórkowego. Należy ustawić procent transmisji lasera na 5%, nie zmieniając pozostałych ustawień.Następnie umieść komórkę w centrum pola widzenia. Kliknij obszar zainteresowania i za pomocą myszy narysuj w jądrze linii lub prostokąt o wymiarach około 50 na 4 piksele. Unikaj dotykania błony jądrowej lub jąderek.Następnie kliknij przycisk wybielania (bleach), aby wywołać uszkodzenia DNA. W tym momencie widoczna jest różnica między szczytową rekrutacją GFP-53BP1 a GFP-NTH1. Aby przeprowadzić ilościową analizę fluorescencji żywych komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego, należy użyć powiększenia 1x oraz lasera argonowego dla GFP FITC.Ustaw rozdzielczość 512 x 512 pikseli, prędkość skanowania na pięć oraz wartość jeden dla szybkiego skanowania lub dwa i więcej w celu uśrednienia wielu skanów dla poprawy stosunku sygnału do szumu. Następnie wykonaj akwizycję obrazów. Wyznacz obszar bleach ROY w celu indukcji uszkodzeń, następnie wybierz podmenu Time Series, ustaw liczbę na 20 oraz opóźnienie cyklu na 30 sekund.Wybierz opcję bleach raz po pierwszym skanie, a następnie kliknij start B. W tym przypadku pierwszy obraz jest pozyskiwany bezpośrednio przed indukcją uszkodzeń, a następnie wykonuje się akwizycję 19 dodatkowych obrazów w odstępach 30 sekund. Tutaj można zauważyć, że GFP-NTH1 jest szybko i przejściowo rekrutowany do miejsc uszkodzeń, podczas gdy GFP-53BP1 gromadzi się powoli i utrzymuje się w miejscach uszkodzeń. Niektóre czynniki naprawcze mogą być rekrutowane do miejsc uszkodzeń w sposób zależny od fazy cyklu komórkowego.Aby zidentyfikować komórki w fazie G1 do indukcji uszkodzeń, należy pod mikroskopem odwróconym, używając obiektywu 10x i okularów 10x, zidentyfikować komórki w metafazie, które są lekko uniesione i mają zaokrąglony kształt. Należy wykonać zdjęcia, aby zarejestrować pozycję komórek w metafazie na szkiełku zakrywowym z siatką. Po trzech do czterech godzinach należy potwierdzić, że podział komórkowy doprowadził do powstania dwóch komórek potomnych, które w zarejestrowanej pozycji są gotowe do indukcji uszkodzeń.W celu przygotowania komórek w fazie SG2 należy zastosować protokół podwójnej blokady tymidyną. Efektywność synchronizacji należy potwierdzić za pomocą profilowania DNA i/lub detekcji Rad51 w miejscach uszkodzeń. Przy wysokiej mocy wejściowej lasera uszkodzenia CPD indukowane przez UV oraz skupiska glikozylazy DNA GFP-NTH1, która specyficznie rozpoznaje uszkodzenia zasad, były obserwowane wyraźniej w porównaniu do niskiej mocy wejściowej.Dodatkowo zaobserwowano wyższe poziomy XRCC1 i CtIP, co odzwierciedla zwiększoną liczbę pęknięć pojedynczych i podwójnych nici, a tym samym wskazuje na indukcję złożonych uszkodzeń DNA. Jak wykazano w niniejszej pracy, zmiana mocy wejściowej lasera prowadzi do zmian w sygnalizacji uszkodzeń. PARP1 pośredniczy w poli-ADP-rybozylacji (PAR) białek docelowych w miejscach uszkodzeń, co jest znacząco indukowane przez laser o wysokiej mocy wejściowej, a jedynie w niewielkim stopniu przez laser o niskiej mocy.Białko 53BP1 jest rekrutowane do miejsc uszkodzeń powstałych przy niskiej, ale nie przy wysokiej mocy wejściowej. Co ciekawe, rekrutacja do uszkodzeń o niskiej mocy wejściowej była hamowana przez obecność drugiego miejsca uszkodzenia o wysokiej mocy wejściowej w tym samym jądrze komórkowym. Hamowanie to zostało zniesione po zastosowaniu inhibitora PARP.Z kolei inhibitor PARP, który hamuje rozkład PAR, nasilił sygnał PAR i skutecznie zahamował rekrutację 53BP1 nawet w miejscach uszkodzeń przy niskiej mocy wejściowej. Wskazuje to, że to sygnalizacja PARP, a nie sam charakter uszkodzenia, determinuje rekrutację 53BP1. Jest to przykład, w którym miareczkowanie laserowe ujawniło różnicową aktywację PARP1, oceniającą ilość i złożoność uszkodzeń DNA oraz kontrolującą dostępność miejsca uszkodzenia.Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu około pięciu dni, wliczając w to przygotowanie komórek, konfigurację systemu laserowego, indukcję uszkodzeń DNA, obrazowanie żywych lub unieruchomionych immunologicznie komórek oraz analizę danych. Proces może potrwać dłużej w przypadku synchronizacji komórek lub analizy kosztów czasowych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że miareczkowanie mocy wejściowej lasera może ulegać zmianom w czasie, nawet w tym samym systemie laserowym, szczególnie po ponownym ustawieniu systemu, dlatego ważne jest okresowe sprawdzanie wzorca rekrutacji czynników naprawczych.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić i porównać wyniki uzyskane z innych metod uszkadzania DNA, takich jak analiza napromieniowania, działanie czynników chemicznych lub ekspresja endonukleaz, aby potwierdzić, że wyniki nie wynikają z artefaktów specyficznych dla laseru. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu naprawy DNA do zgłębiania odpowiedzi na uszkodzenia DNA w odniesieniu do chromatyny jądrowej oraz do identyfikowania nowych czynników i szlaków rozpoznawania, przetwarzania i sygnalizacji uszkodzeń DNA.

laser-microirradiation-to-study-vivo-cellular-responses-to-simple

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Ten protokół opisuje nieinwazyjną metodę efektywnej identyfikacji komórek fazy S do dalszych badań mikroskopowych, takich jak pomiar rekrutacji białka naprawczego DNA za pomocą mikronapromieniowania laserowego.

Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Ukierunkowane uszkodzenie DNA można osiągnąć poprzez przywiązanie czynnika uszkadzającego DNA do oligonukleotydu tworzącego triplex (TFO). Za pomocą zmodyfikowanych TFO, asocjacji białek specyficznych dla uszkodzenia DNA i modyfikacji topologii DNA można badać w komórkach ludzkich poprzez wykorzystanie zmodyfikowanych testów immunoprecypitacji chromatyny i testów superzwijania DNA opisanych w niniejszym dokumencie.

Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA

Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.

Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli komórek ludzkich do analizy czynników inicjacji translacji, które wiążą 5' czapeczkę mRNA podczas fizjologicznych warunków tlenowych. Metoda ta wykorzystuje analog kapu m7GTP sprzężonego z agarozą i jest odpowiednia do badania czynników wiążących kap i ich oddziałujących partnerów.

Analiza białek wiążących czapeczki w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Poznaj mikronapromienianie laserowe do badania odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA in vivo. Ta metoda umożliwia analizę sygnalizacji uszkodzeń i rekrutacji czynników naprawczych w czasie rzeczywistym.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Przeglądaj więcej filmów