Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania mikroirradiacji laserowej do indukowania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym prostych pęknięć nici oraz uszkodzeń złożonych, w celu badania sygnalizacji uszkodzeń DNA oraz montażu czynników naprawczych in vivo. W latach 60. i 70. skupialiśmy wiązkę lasera za pomocą mikroskopu, który widać za mną, co pozwalało na uszkodzenie niewielkiego obszaru chromosomu. Komórka dzieliła się i przeżywała, a my nie potrafiliśmy zrozumieć dlaczego.

Wielu badaczy, 40 lat później, wykorzystuje obecnie tę metodę do selektywnego badania naprawy DNA i właśnie to zaprezentujemy dzisiaj. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA, takie jak sposób rozpoznawania i przetwarzania uszkodzeń DNA oraz mechanizm propagacji sygnału o uszkodzeniu w komórce. Mikroirradiation laserowa umożliwia analizę dynamiki makromolekularnej w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością, na poziomie pojedynczej komórki, w odpowiedzi na uszkodzenia DNA ograniczone do obszaru o wielkości kilku mikrometrów w jądrze komórkowym.

Stosowano jednak różne warunki laserowe bez uwzględnienia różnic w indukowanych typach uszkodzeń, co prowadziło do niespójności w odpowiedziach komórkowych, rekrutacji czynników oraz modyfikacjach. Aby wyexpronować białka znakowane fluorescencyjnie w komórkach HeLa, pierwszego dnia należy wysiać od 6 do 8 × 10⁴ komórek w 0,5 ml pożywki hodowlanej w jednym dołku płytki 24-dołkowej. Następnie płytkę należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek.

Drugiego dnia przeprowadź transfekcję DNA za pomocą liposomów, rozcieńczając 0,3 µg plazmidowego DNA ekspresyjnego dla ssaków, kodującego znakowany fluorescencyjnie czynnik naprawy DNA, w 25 µL bezserwatkowego medium hodowlanego. W tym przypadku zastosowano domenę celującą w miejsce uszkodzenia białka 53BP1 połączoną z GFP dla pęknięć dwuniciowych lub glikozylazę DNA NTH1 połączoną z GFP dla uszkodzeń zasad. W oddzielnej probówce 1,5 ml rozcieńcz 1 µL odczynnika do transfekcji DNA opartego na liposomach w 25 µL bezserwatkowego medium hodowlanego, następnie połącz zawartość obu probówek (rozcieńczone DNA oraz odczynnik do transfekcji) i inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu utworzenia kompleksów DNA-lipid.

Przepłucz komórki raz 0,5 ml pożywki hodowlanej, następnie usuń pożywkę i dodaj do komórek 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej. Dodaj kompleksy DNA-lipid do komórek i delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie kołysząc płytką. Następnie przenieś komórki z powrotem do inkubatora.

Po czterech do sześciu godzinach usunąć pożywkę hodowlaną z komórek i dodać 300 µL 0,5% Trypsyny-EDTA. Usunąć roztwór, a następnie dodać 200 µL Trypsyny-EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez trzy do czterech minut. Po potwierdzeniu, że komórki się odłączyły, dodać 800 µL pożywki hodowlanej i resuspenderć komórki, delikatnie pipetując w celu rozbicia skupisk komórkowych.

Przenieś zawiesinę komórkową do 35-milimetrowejy szalki hodowlanej z siatkowanym szkiełkiem nakrywkowym i dodaj medium hodowlane do uzyskania objętości końcowej 2 ml. Po 48 godzinach komórki osiągną od 30 do 60% konfluencji z ekspresją białka fluorescencyjnego i będą gotowe do indukcji uszkodzeń laserowych. Włącz laser NIR i pozwól systemowi laserowemu rozgrzać się przez jedną godzinę przed użyciem.

Umieść naczynie z komórkami na podgrzewanym do 37 °C stoliku w komorze umożliwiającej kontrolę poziomu dwutlenku węgla i wilgotności. Do analizy żywych komórek z białkami znakowanymi fluorescencyjnie należy użyć obiektywu imersyjnego o dużym powiększeniu oraz odpowiedniej kombinacji filtrów fluorescencyjnych, zależnie od rodzaju znacznika. Znajdź komórki o porównywalnej ekspresji białka fluorescencyjnego.

Należy unikać komórek o zbyt słabej lub zbyt silnej ekspresji, aby zmniejszyć zmienność międzykomórkową w pomiarach fluorescencji. W przypadku mikroskopii konfokalnej należy użyć obiektywu olejowego 100x z aperturą numeryczną 1,3 oraz funkcji wygaszania (bleach) w oprogramowaniu do wyznaczania liniowych ścieżek wewnątrz jądra komórkowego. Należy ustawić procent transmisji lasera na 5%, nie zmieniając pozostałych ustawień.

Następnie umieść komórkę w centrum pola widzenia. Kliknij obszar zainteresowania i za pomocą myszy narysuj w jądrze linii lub prostokąt o wymiarach około 50 na 4 piksele. Unikaj dotykania błony jądrowej lub jąderek.

Następnie kliknij przycisk wybielania (bleach), aby wywołać uszkodzenia DNA. W tym momencie widoczna jest różnica między szczytową rekrutacją GFP-53BP1 a GFP-NTH1. Aby przeprowadzić ilościową analizę fluorescencji żywych komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego, należy użyć powiększenia 1x oraz lasera argonowego dla GFP FITC.

Ustaw rozdzielczość 512 x 512 pikseli, prędkość skanowania na pięć oraz wartość jeden dla szybkiego skanowania lub dwa i więcej w celu uśrednienia wielu skanów dla poprawy stosunku sygnału do szumu. Następnie wykonaj akwizycję obrazów. Wyznacz obszar bleach ROY w celu indukcji uszkodzeń, następnie wybierz podmenu Time Series, ustaw liczbę na 20 oraz opóźnienie cyklu na 30 sekund.

Wybierz opcję bleach raz po pierwszym skanie, a następnie kliknij start B. W tym przypadku pierwszy obraz jest pozyskiwany bezpośrednio przed indukcją uszkodzeń, a następnie wykonuje się akwizycję 19 dodatkowych obrazów w odstępach 30 sekund. Tutaj można zauważyć, że GFP-NTH1 jest szybko i przejściowo rekrutowany do miejsc uszkodzeń, podczas gdy GFP-53BP1 gromadzi się powoli i utrzymuje się w miejscach uszkodzeń. Niektóre czynniki naprawcze mogą być rekrutowane do miejsc uszkodzeń w sposób zależny od fazy cyklu komórkowego.

Aby zidentyfikować komórki w fazie G1 do indukcji uszkodzeń, należy pod mikroskopem odwróconym, używając obiektywu 10x i okularów 10x, zidentyfikować komórki w metafazie, które są lekko uniesione i mają zaokrąglony kształt. Należy wykonać zdjęcia, aby zarejestrować pozycję komórek w metafazie na szkiełku zakrywowym z siatką. Po trzech do czterech godzinach należy potwierdzić, że podział komórkowy doprowadził do powstania dwóch komórek potomnych, które w zarejestrowanej pozycji są gotowe do indukcji uszkodzeń.

W celu przygotowania komórek w fazie SG2 należy zastosować protokół podwójnej blokady tymidyną. Efektywność synchronizacji należy potwierdzić za pomocą profilowania DNA i/lub detekcji Rad51 w miejscach uszkodzeń. Przy wysokiej mocy wejściowej lasera uszkodzenia CPD indukowane przez UV oraz skupiska glikozylazy DNA GFP-NTH1, która specyficznie rozpoznaje uszkodzenia zasad, były obserwowane wyraźniej w porównaniu do niskiej mocy wejściowej.

Dodatkowo zaobserwowano wyższe poziomy XRCC1 i CtIP, co odzwierciedla zwiększoną liczbę pęknięć pojedynczych i podwójnych nici, a tym samym wskazuje na indukcję złożonych uszkodzeń DNA. Jak wykazano w niniejszej pracy, zmiana mocy wejściowej lasera prowadzi do zmian w sygnalizacji uszkodzeń. PARP1 pośredniczy w poli-ADP-rybozylacji (PAR) białek docelowych w miejscach uszkodzeń, co jest znacząco indukowane przez laser o wysokiej mocy wejściowej, a jedynie w niewielkim stopniu przez laser o niskiej mocy.

Białko 53BP1 jest rekrutowane do miejsc uszkodzeń powstałych przy niskiej, ale nie przy wysokiej mocy wejściowej. Co ciekawe, rekrutacja do uszkodzeń o niskiej mocy wejściowej była hamowana przez obecność drugiego miejsca uszkodzenia o wysokiej mocy wejściowej w tym samym jądrze komórkowym. Hamowanie to zostało zniesione po zastosowaniu inhibitora PARP.

Z kolei inhibitor PARP, który hamuje rozkład PAR, nasilił sygnał PAR i skutecznie zahamował rekrutację 53BP1 nawet w miejscach uszkodzeń przy niskiej mocy wejściowej. Wskazuje to, że to sygnalizacja PARP, a nie sam charakter uszkodzenia, determinuje rekrutację 53BP1. Jest to przykład, w którym miareczkowanie laserowe ujawniło różnicową aktywację PARP1, oceniającą ilość i złożoność uszkodzeń DNA oraz kontrolującą dostępność miejsca uszkodzenia.

Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu około pięciu dni, wliczając w to przygotowanie komórek, konfigurację systemu laserowego, indukcję uszkodzeń DNA, obrazowanie żywych lub unieruchomionych immunologicznie komórek oraz analizę danych. Proces może potrwać dłużej w przypadku synchronizacji komórek lub analizy kosztów czasowych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że miareczkowanie mocy wejściowej lasera może ulegać zmianom w czasie, nawet w tym samym systemie laserowym, szczególnie po ponownym ustawieniu systemu, dlatego ważne jest okresowe sprawdzanie wzorca rekrutacji czynników naprawczych.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić i porównać wyniki uzyskane z innych metod uszkadzania DNA, takich jak analiza napromieniowania, działanie czynników chemicznych lub ekspresja endonukleaz, aby potwierdzić, że wyniki nie wynikają z artefaktów specyficznych dla laseru. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu naprawy DNA do zgłębiania odpowiedzi na uszkodzenia DNA w odniesieniu do chromatyny jądrowej oraz do identyfikowania nowych czynników i szlaków rozpoznawania, przetwarzania i sygnalizacji uszkodzeń DNA.