Name: Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metody kwantyfikacji chemotaksji monocytów in vitro i migracji limfocytów in vivo. Protokoły te umożliwiają badanie zachowań komórek immunologicznych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Bernarda L. Schwartza dla Lekarzy Naukowców na Uniwersytecie Rockefellera, Robertson Therapeutic Development Fund na Uniwersytecie Rockefellera oraz Sackler Center for Biomedicine and Nutrition Research na Uniwersytecie Rockefellera.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rockefellera. Wszystkie zwierzęta były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów.
1. Chemotaksja in vitro
<ol>
	<li>Hodowla komórek THP-16 w Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES; 25 mM) (kompletna pożywka), utrzymując gęstość między 0,5-1,0 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>W naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm oznaczyć 3,5 x 105 komórek THP-1 na warunki acetoksymetylem kalceiny (kalceina AM; 2,5 μM) lub innym odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym w kompletnych pożywkach w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Barwniki muszą być przepuszczalne dla błony komórkowej i kompatybilne z etykietowaniem żywych komórek.</li>
	<li>Rozgrzej czytnik płytek do temperatury 37 °C. 
	UWAGA: Oprócz kontroli temperatury wymagana jest również funkcja odczytu od dołu. Zobacz krok 1.10.2, aby zapoznać się z alternatywą dla czytnika płytek do ilościowego oznaczania migrujących komórek.</li>
	<li>Podczas etykietowania komórek przygotuj płytkę testową i dolną komorę.
	<ol>
		<li>Użyj 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, z jednym warunkiem na studzienkę. Wykonaj każdy warunek w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Do płytki 24-dołkowej dodać 750 μl buforowanego roztworu soli Hanka (HBSS) buforowanego 25 mM HEPES i 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Służy to jako podstawowy warunek kontrolny.
		<ol>
			<li>Do warunków komparacyjnych należy używać innych studzienek, zawsze utrzymując całkowitą objętość w dolnej komorze na poziomie 750 μl. 
			UWAGA: W tym przykładzie ludzkie białko chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1) służy jako kontrola pozytywna dla chemotaksji7.
			<ol>
				<li>Zmontuj mieszaninę odczynników, łącząc HBSS z 25 mM HEPES, BSA (0,1%) i MCP-1 (75 ng/ml). Stosować surowicę dorosłego bydła (2,7 % v / v) z MCP-1 jako dodatkową kontrolę dodatnią. 
				UWAGA: Stężenie chemokin i chemokin będzie zależeć od badanej osi chemotaktycznej. Liofilizowany MCP-1 jest ponownie zawieszany w wodzie destylowanej z BSA (0,1%) w celu uzyskania roztworu podstawowego o końcowym stężeniu 50 μg/ml. Można go rozcieńczyć w wodzie do roztworu roboczego o stężeniu 10 μg/ml. Dodać 5,6 μl tego roztworu do dolnej komory.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po zakończeniu kompozycji dolnych komór umieść porowatą wkładkę w każdej studzience, upewniając się, że wypustki wkładki są wyrównane z nacięciami płytki. 
		UWAGA: Wybierz odpowiednią wielkość porów dla wkładek. W przypadku monocytów i limfocytów dobrze sprawdza się wielkość porów 3 μm. Niektóre typy komórek i/lub systemy chemokinowe mogą wymagać powierzchni pokrytej matrycą w celu optymalnej migracji. Na przykład do pomiaru chemotaksji monocytów THP-1 w kierunku MCP-1 zaleca się stosowanie wkładek pokrytych fibronektyną lub kolagenem. W przypadku czytnika płytek do oznaczania ilościowego, wkładka musi mieć powłokę nieprzepuszczalną dla światła, taką jak politereftalan etylenu, aby zapobiec wykryciu komórek niemigrujących w górnej komorze8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji komórek przez 30 minut z kalceiną-AM, przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 2 min. Obejrzyj wzrokowo komórki, aby potwierdzić wychwyt kalceiny-AM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego. Umyj znakowane komórki w bezsurowicy RPMI 1640 uzupełnionym o HEPES 25 mM. Odwirować komórki o masie 1 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawieś komórki w bezsurowicowym RPMI 1640 uzupełnionym o HEPES 25 mM. Policz komórki i dostosuj objętość tak, aby komórki miały końcowe stężenie 1,0-1,5 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Dozować 250 μl zawiesiny komórek do wkładu (górnej komory).</li>
	<li>Po napełnieniu wszystkich górnych komór delikatnie podnieś płytkę i sprawdź spód pod kątem obecności pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócać migrację i wykrywanie. Aby usunąć pęcherzyk, najpierw spróbuj wyjąć, a następnie ponownie ustawić wkładkę. Jeśli to się nie powiedzie, użyj igły 27 G, aby przebić pęcherzyk, a następnie ponownie umieść wkładkę.</li>
	<li>Umieścić płytkę w wstępnie podgrzanym czytniku płytek o temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Pobieraj odczyty fluorescencji od dołu w odstępach 1-3 minut. W przypadku stosowania kalceiny-AM należy ustawić długości fal wzbudzenia i emisji fluorescencji odpowiednio na 485 nm i 520 nm. W zależności od typu komórki i układu chemokin, chemotaksja zwykle występuje w ciągu 1-4 godzin (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
		<li>Jako alternatywę dla ciągłych pomiarów za pomocą czytnika płytek, zobrazuj studnie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B) zdolnego do wzbudzania i wykrywania światła odpowiednio przy 485 nm i 520 nm. Użyj małego powiększenia, aby uchwycić większość spodniej strony wkładki. Określ ilościowo komórki, przetwarzając obrazy za pomocą ImageJ lub podobnego oprogramowania9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Adoptywny transfer mysich limfocytów
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek dawcy
	<ol>
		<li>Znieczulić 8-12-tygodniowe myszy dawcy C57BL/6J znieczuleniem izofluranowym (1-3%) za pomocą waporyzatora. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi.</li>
		<li>Umieść mysz w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą skalpela i zlokalizuj śledzionę w lewej górnej przestrzeni otrzewnej. Wyciąć całą śledzionę i umieścić w kompletnych pożywkach (RPMI uzupełnionych o 10% FBS i 25 mM HEPES; 1 ml/śledzionę) na lodzie. Eutanazja znieczulonych zwierząt dawców przez dekapitację.</li>
		<li>Delikatnie zmielić tkankę śledziony przez siatkę nylonową 40 μm na kompletne podłoże (1 ml / śledziona) za pomocą końcówki tłoka strzykawki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 4 objętości buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy erytrocytów.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Jeśli erytrocyty pozostaną w osadzie, należy je ponownie zawiesić w buforze do lizy ACK, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odwirować komórki przy 1 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce w stężeniu 2-5x107 komórek/ml, a następnie przecedzić zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 40 μm, aby usunąć resztki komórek.</li>
		<li>Oznacz 1 x 107 komórek/biorcę mysz barwnikiem fluorescencyjnym kompatybilnym z żywymi komórkami, który zostanie zachowany po późniejszym utrwaleniu, takim jak dioctan 5-chlorometylofluoresceiny (stężenie końcowe 2 μM)10. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
		UWAGA: Aby śledzić więcej niż jedną populację komórek, użyj innych barwników fluorescencyjnych z dodatkowymi populacjami komórek. Na przykład część komórek dawcy może być oznaczona 5-(i-6)-((((4-chlorometylo)benzoilo)amino) tetrametylorodaminą (końcowe stężenie 2 μM)11.</li>
		<li>Dodać 4 objętości HBSS uzupełnione 25 mM HEPES, następnie odwirować przy 1 000 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w HBSS uzupełnionym HEPES 25 mM do końcowego stężenia 1 x 108 komórek/ml.
		<ol>
			<li>W przypadku stosowania więcej niż jednego barwnika fluorescencyjnego należy zachować populacje komórek oddzielnie aż do momentu bezpośrednio przed wstrzyknięciem.</li>
			<li>Przenieść małą podwielokrotność (10 μl) komórek każdego koloru do roztworu utrwalającego (1 ml) w celu późniejszej kompensacji cytometrii przepływowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfer limfocytów
	<ol>
		<li>Znieczulić 8-12-tygodniowe myszy płci męskiej C57BL/6J izofluranem (1-3%) za pomocą waporyzatora; potwierdzić głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi. Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
		<li>Krótko odwirować komórki dawcy (1 s) i przenieść do 1 ml strzykawki iniekcyjnej z igłą 27 G, 0,5 cala, łącząc różnicowo znakowane populacje komórek, jeśli ma to zastosowanie.
		<ol>
			<li>Przenieść małą podwielokrotność (10 μl) zmieszanych komórek do roztworu utrwalającego (1 ml) w celu przeprowadzenia kolejnych analiz cytometrii przepływowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść zwierzęta dawcy w pozycji leżącej. Zastosuj łagodny nacisk doogonowy na skórę, grzbietowo do oka, powodując lekkie wysunięcie gałki ocznej.</li>
		<li>Skierować igłę przyśrodkowo i wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórek dawcy zadoczoczopalnie każdej myszy biorcy. Komórki można również wstrzykiwać przez żyłę ogonową.</li>
		<li>Stopniowo wyjmować igłę do wstrzykiwań i umieszczać samą mysz w klatce ratunkowej. Monitorować zwierzę do momentu odzyskania przez nie przytomności; Po całkowitym wyzdrowieniu zwierzę należy zwrócić do mieszkania socjalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie i analiza
	<ol>
		<li>Po 1 godzinie znieczulić myszy biorcy znieczuleniem izofluranem (1-3%) za pomocą waporyzatora; potwierdzić głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca. Pobrać śledzionę (lub inną tkankę będącą przedmiotem zainteresowania) (krok 2.1.2.) od każdej myszy biorcy i umieścić w pełnej pożywce (1 ml/biorcę). Eutanazja znieczulonych zwierząt przez dekapitację. 
		UWAGA: Dłuższe odstępy czasu przed pobraniem tkanek zwiększą akumulację tkanek przez co najmniej 24 godziny.</li>
		<li>Delikatnie zmielić tkankę śledziony przez siatkę nylonową o grubości 40 μm na kompletne podłoże za pomocą końcówki tłoka strzykawki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 4 objętości buforu do lizy ACK i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym (sól fizjologiczna buforowana fosforanami uzupełniona 1% FBS). Policz komórki i dostosuj do końcowego stężenia 3 x 10 7 komórek/ml. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek na 96-dołkową okrągłą płytkę denną.</li>
		<li>Wybarwić komórki pod kątem pożądanych markerów (patrz tabela materiałów) do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Dodać przeciwciała sprzężone z fluoroforem (patrz Tabela Materiałów) przeciwko pożądanym markerom i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności. Dodać 100 μl buforu barwiącego, odwirować komórki o stężeniu 1 000 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 200 μl buforu barwiącego, odwirować komórki o stężeniu 1 000 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w buforze barwiącym o pojemności 125 μl i pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego zgodnie ze standardowymi procedurami. 
		UWAGA: Zielony barwnik jest wzbudzany przez laser o długości fali 488 nm, a emisja jest wykrywana za pomocą filtrów dichroicznych 505 i 530/30. Pomarańczowy barwnik jest wzbudzany przez 561 nm, a emisja jest wykrywana przez filtr dichroiczny 582/15.
		<ol>
			<li>Użyj zapisanych komórek z 2.1.8.2, aby skompensować każdy barwnik fluorescencyjny. 
			UWAGA: Zastosowanie kompensacji opartej na perełkach z fluoroforami dopasowanymi do widm wzbudzenia i emisji barwników etykietujących spowoduje nieoptymalną kompensację.</li>
			<li>Użyj zapisanych komórek wejściowych z kroku 2.2.2.1, aby dokładnie określić stosunek różnie oznaczonych komórek wejściowych w przypadku korzystania z więcej niż jednej oznaczonej populacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Oblicz migrację specyficzną dla tkanki na podstawie stosunku komórek znakowanych do nieznakowanych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/protocols/4464.pdf">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2186747">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li>
<li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li>
<li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li>
<li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking%3A+chemokines+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Kwantyfikacja migracji komórek odpornościowych może być przeprowadzona za pomocą prostych i szybkich testów zarówno in vitro , jak i in vivo. Pokazujemy chemotaksję ludzkich monocytów in vitro w odpowiedzi na gradient MCP-1 i augmentację przez surowicę. In vivo mysie splenocyty dawcy zostały zróżnicowane i po przeniesieniu adopcyjnym odzyskane od zwierząt biorców.
Korzystanie z czytnika płytek ma tę zaletę, że pobiera próbki z kilku punktów czasowych (nawet ...

Solidna odporność wymaga złożonej czasowej i przestrzennej koordynacji niezliczonych typów komórek, aby odpowiednio reagować na urazy, infekcje i generować samotolerancję. Odkryto i scharakteryzowano kilkadziesiąt receptorów chemokinowych i odpowiadających im ligandów, które zapewniają mechanizmy molekularne, dzięki którym określone komórki mogą być kierowane do określonej tkanki w określonym czasie. Tak więc badanie chemotaksji i migracji jest nieodzownym elementem badań immunologicznych. Rzeczywiście, opisany test in vitro został niedawno wykorzystany jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji kofaktora chemotaktycznego, który przyspiesza chemotaksję komórek T w kierunku chemokin C-C 19 i 213. Celem opisanych tu metod jest umożliwienie ilościowej oceny chemotaksji komórek odpornościowych in vitro i in vivo.
Test komorowy Boydena (migracja i inwazja komórek) jest niedrogą, powtarzalną i szybką metodą oceny migracji komórek4,5. W standardowym teście górna komora jest wysiewana komórkami i jest oddzielona porowatą wkładką od dolnej komory, do której migrują komórki. W pożądanym czasie komórki, które przeniosły się na spód wkładki, można utrwalić i wybarwić w celu ilościowego określenia za pomocą mikroskopii świetlnej. Jednak takie pomiary ograniczają gromadzenie danych do jednego punktu końcowego, co wyklucza dynamiczne gromadzenie danych i może wymagać rozległej optymalizacji w celu określenia optymalnego punktu czasowego do analizy. W tym miejscu opisano kilka adaptacji, które umożliwiają ilościowe i multipleksowane pomiary chemotaksji in vitro w czasie rzeczywistym.
Do badań in vivo stosuje się funkcjonalny punkt końcowy, a mianowicie specyficzne nagromadzenie komórek w danym przedziale tkankowym. Wstępnie oznakowane komórki dawcy są wprowadzane do zwierząt biorców w drodze transferu adopcyjnego. Te komórki dawcy można następnie zidentyfikować za pomocą cytometrii przepływowej po pobraniu tkanki biorcy. Przedstawiono również strategię wspólnego znakowania, która pozwala na określenie transportu różnych typów komórek w obrębie jednego zwierzęcia biorcy. Metoda ta eliminuje zmienność między zwierzętami wynikającą z wstrzyknięcia komórek i uwzględnia fizjologiczną zmienność między zwierzętami.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Wzbudzenie: 485nm, Emisja: 520nm</td></tr><tr><td>Komórka naczynie</td><td>hodowlane Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowa rurka</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dorosłego bydła</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS z wapniem i magnezem; bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek SpectraMax M2e</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwróconej fluorescencji Olympus IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein zdrowie zwierząt</td><td>11695-6776-2</td><td>Znieczulenie izofluoranowe</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK bufor lizujący</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Pomarańczowy CMTMR Barwnik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Wzbudzenie: 541nm, Emisja: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Wzbudzenie: 485nm, Emisja: 520nm</td></tr><tr><td>Strzykawka 5ml</td><td>Strzykawka BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml Strzykawka</td><td>TB Strzykawka BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>linii komórkowej THP-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 przeciwciało anty-mysie CD3</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Wzbudzenie: 405nm, Emisja: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anty-mysie przeciwciało CD19</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Wzbudzenie: 405nm, Emisja: 603nm</td></tr><tr><td>96-dołkowa okrągła płyta dolna</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td>Cytometr przepływowy</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaksja to migracja wzdłuż określonego gradientu chemicznego1. Chemokiny to cytokiny chemotaktyczne, które promują transport komórkowy ze specyficznością anatomiczną i czasową2. Chemotaksja jest krytyczną funkcją limfocytów i innych komórek odpornościowych, którą można ocenić ilościowo in vitro. W manuskrypcie opisano metody, które pozwalają na ocenę chemotaksji, zarówno in vitro, jak i in vivo, dla różnych typów komórek, w tym linii komórkowych i komórek natywnych. Format in vitro oparty na płytce pozwala na jednoczesne porównywanie kilku stanów w czasie rzeczywistym i może być zakończony w ciągu 1-4 godzin. Warunkami testu in vitro można manipulować w celu wprowadzenia agonistów i antagonistów, a także odróżnienia chemotaksji od chemokinezy, która jest ruchem losowym. W przypadku oceny transportu in vivo komórki odpornościowe można znakować wieloma barwnikami fluorescencyjnymi i wykorzystywać do transferu adoptywnego. Zróżnicowane znakowanie komórek pozwala na wprowadzenie mieszanych populacji komórek do tego samego zwierzęcia, zmniejszając w ten sposób wariancję i zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu o odpowiedniej mocy. Migracja do tkanki limfatycznej następuje w ciągu zaledwie 1 godziny i można pobrać próbki z wielu przedziałów tkankowych. Cytometria przepływowa po pobraniu tkanek pozwala na szybką i ilościową analizę wzorców migracji wielu typów komórek.

Przy użyciu barwnika calcein-AM kontrola wizualna komórek pozwoli potwierdzić pobranie znacznika (Rycina 1). Zautomatyzowane odczyty fluorescencji będą śledzić migrację komórek w miarę ich przemieszczania się na spodnią stronę wkładki w czasie. Dane te wyraźnie wykazują indukcję migracji komórek w kierunku MCP-1, a także nasilenie tej odpowiedzi przez surowicę (Rycina 2A). W zależności od siły bodźca migracyjnego występuje opóźni...

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Ogólnym celem tych analiz jest ilościowe określenie chemotaksji monocytów in vitro w czasie rzeczywistym oraz śledzenie migracji limfocytów in vivo. Metoda in vitro może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak wpływ czynników surowiczych na chemotaksję komórek odpornościowych. Główną zaletą techniki in vitro jest możliwość przeprowadzania ilościowych i multipleksowych pomiarów w czasie rzeczywistym.Metoda in vivo może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii dotyczące tego, w jaki sposób specyficzne typy komórek migrują w organizmie zwierzęcia biorcy. Technika in vivo jest szczególnie użyteczna do ilościowej oceny migracji wielu typów komórek w obrębie tego samego zwierzęcia. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy oznakować komórki THP-1 barwnikiem fluorescencyjnym w 35 mm szalce hodowlanej w pożywce kompletnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut.Podczas inkubacji komórek, do dołków kontrolnych ujemnych i dodatnich płytki 24-dołkowej należy dodać 750 µL HBSS buforowanego 25 mM HEPES i 0,1% BSA. Do dołków eksperymentalnych i dodatnich należy dodać odpowiednie stężenie MCP-1 w wodzie z dodatkiem BSA. Następnie do każdego dołka należy włożyć porowaty insert, dbając o to, aby wypustki insertów pokrywały się z wycięciami w płytce.Kluczowe jest usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza z dolnych studzienek po umieszczeniu wkładów, ponieważ pęcherzyki będą zakłócać pomiary fluorescencji. Po zakończeniu inkubacji przenieś znakowane komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów w celu ich zebrania poprzez wirowanie. Następnie sprawdź wizualnie otrzymany osad, aby potwierdzić pobranie barwnika.Następnie ostrożnie odessij supernatant za pomocą aspiratora próżniowego i przemyj komórki w pożywce RPMI-1640 bez surowicy z dodatkiem 25 mM HEPES, stosując te same warunki wirowania. Resuspenduj osad w świeżej pożywce bez surowicy z HEPES w celu policzenia komórek. Następnie dostosuj objętość do uzyskania końcowego stężenia od 1 do 1,5 × 10⁶ komórek na ml.Do górnej komory każdej studni dodaj 250 µL komórek, a następnie umieść płytkę w czytniku płytek w temperaturze 37 °C. Następnie wykonaj pomiary fluorescencji w dolnych komorach w odstępach od jednej do trzech minut, przy zastosowaniu odpowiednich długości fal wzbudzenia i emisji dla danego barwnika. Aby przygotować komórki donora do transferu adopcyjnego, najpierw pobierz całą śledzionę z znieczulonej samca myszy C57 black six w wieku od 8 do 12 tygodni do filtra z nylonowej siatki o oczkach 40 µm umieszczonego w naczyniu hodowlanym zawierającym pożywkę kompletną na lodzie.Używając końcówki tłoka strzykawki, delikatnie rozetrzyj śledzionę przez siatkę. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek, przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj cztery objętości buforu lizującego erytrocyty z chlorkiem amonu i potasem, aby usunąć krwinki czerwone. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej odwirowuj komórki i resuspenduj osad w pełnej pożywce do stężenia od 2 do 5 × 10⁷ komórek/ml.Przefiltruj komórki przez nową siatkę nylonową o oczkach 40 µm, aby usunąć resztki komórkowe. Następnie oznakuj 1×10⁷ komórek na mysz biorcę fluorescencyjnym barwnikiem kompatybilnym z żywymi komórkami, który zostanie zachowany po późniejszej fiksacji, inkubując przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu inkubacji przemyj komórki czterokrotną objętością HBSS uzupełnionego o HEPES.Następnie osad należy resuspendować w świeżym roztworze HBSS z dodatkiem HEPES do uzyskania stężenia 1 × 10⁸ komórek/ml. Dalej, krótko wymieszać komórki dawcy w wirówce vortex i nabić je do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 G i długości 0,5 cala. Zanarkotyzowane myszy biorcy szczepu C57 black six w wieku od 8 do 12 tygodni należy ułożyć w pozycji brzusznej i przyłożyć lekki nacisk ogonowy na skórę grzbietową nad okiem pierwszego zwierzęcia, aby gałka oczna lekko wystawała.Nakieruj igłę przyśrodkowo w celu wykonania iniekcji zakulicznej 100 µL komórek dawcy. Następnie powoli wycofaj igłę i umieść mysz w indywidualnej klatce regeneracyjnej, monitorując jej stan aż do pełnego wybudzenia. Kluczowe jest, aby zwierzęta były odpowiednio znieczulone, a procedura iniekcji była dobrze przećwiczona, co zapewni spójność podawania komórek pomiędzy zwierzętami oraz w obrębie poszczególnych eksperymentów.Do 24 godzin po transferze adopcyjnym pobierz śledziony do 1 ml kompletnej pożywki na każdego biorcę. Następnie przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek pozbawioną erytrocytów, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po policzeniu komórek dostosuj stężenie zawiesiny do poziomu 3 × 10⁷ komórek/ml w buforze barwiącym.Przenieś 100 µL komórek do poszczególnych studni 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem. Barw komórki na interesujące markery zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrycznej. Po 20 minutach w lodzie, z osłonięciem przed światłem, przemyj komórki 100 µL buforu do barwienia i resuspender osady w 200 µL świeżego buforu do barwienia przed drugą wirowką.Następnie osad resuspender w 125 µL świeżego buforu do barwienia i przeanalizować próbki komórek w cytometrze przepływowym zgodnie ze standardowymi protokołami. Zautomatyzowane odczyty fluorescencyjne służące do śledzenia migracji wyraźnie wykazują indukcję migracji komórek w kierunku MCP-1, która jest nasilona w obecności surowicy. W zależności od siły bodźca migracyjnego występuje opóźnienie wynoszące co najmniej 15 minut przed wzrostem sygnału fluorescencyjnego, który może osiągnąć szczyt i stopniowo spadać w miarę przedostawania się komórek z dolnej strony wkładu do roztworu w dolnej komorze z prędkością większą niż w przypadku komórek migrujących z górnej komory.Jeśli adoptywnie transferuje się więcej niż jedną populację komórek znakowanych fluorescencyjnie, ważne jest określenie ilościowe względnych proporcji populacji komórek w materiale wejściowym, aby uwzględnić wszelkie różnice w mieszaniu tych populacji. Na przykład w tym eksperymencie stosunek zielonych do pomarańczowych komórek fluorescencyjnych wynosił 0,97 do jednego. Migrację określono ilościowo jako liczbę odzyskanych komórek znakowanych podzieloną przez całkowitą liczbę odzyskanych komórek.Chociaż liczba odzyskanych komórek znacznie różni się między zwierzętami, w przypadku każdego z nich stosunek zielonych do pomarańczowych komórek fluorescencyjnych jest zazwyczaj w przybliżeniu taki sam. Po opanowaniu metody, technikę in vitro można przeprowadzić w cztery godziny, a technikę in vivo w sześć godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o unikaniu powstawania pęcherzyków powietrza w komorach eksperymentalnych oraz dbać o powtarzalność podczas wstrzyknięć okołogałkowych adoptywnie przeniesionych komórek.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny immunologii do badania chemotaksji in vitro oraz in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzać i monitorować w czasie rzeczywistym test chemotaksji in vitro oraz jak izolować rodzime limfocyty w celu ich transferu adopcyjnego i śledzenia ich migracji in vivo. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ten film przedstawia eksperymentalne badanie transmigracji limfocytów przez model śródbłonka bariery krew-mózg (BBB). Monowarstwa komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (HBMEC) jest generowana in vitro, a komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zawierające limfocyty są dodawane do monowarstwy. Komórki są następnie inkubowane, aby umożliwić transmigrację limfocytów, a migrowane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej.

Badanie migracji limfocytów przez monowarstwę komórek śródbłonka mikronaczyniowego

Opisujemy protokół pomiaru transmigracji monocytów przez monowarstwy ludzkiego śródbłonka i ich późniejszego dojrzewania do komórek piankowych. Zapewnia to wszechstronną metodę oceny właściwości miażdżycowych monocytów wyizolowanych od osób z różnymi stanami chorobowymi oraz oceny czynników we krwi, które mogą zwiększać tę skłonność.

Kwantyfikacja transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych u osób z przewlekłymi stanami zapalnymi

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia aktywności chemotaktycznej monocytów krwi w modelach mysich, do oceny wpływu interwencji żywieniowych, farmakologicznych i genetycznych na monocyty krwi oraz do scharakteryzowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi w modelach mysich przy użyciu zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej monocytów-chemoattraktantu-1 (MCP-1).

Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Poznaj metody kwantyfikacji chemotaksji monocytów in vitro i migracji limfocytów in vivo. Protokoły te umożliwiają badanie zachowań komórek immunologicznych w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Przeglądaj więcej filmów