Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Ogólnym celem tych testów jest ilościowe określenie chemotaksji monocytów in vitro w czasie rzeczywistym oraz śledzenie migracji limfocytów in vivo. Metoda in vitro może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak wpływ czynników surowicy na chemotaksję komórek odpornościowych. Główną zaletą techniki in vitro jest to, że umożliwia ona pomiary ilościowe i multipleksowe w czasie rzeczywistym.

Metoda in vivo może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu immunologii dotyczące tego, w jaki sposób określone typy komórek migrują w obrębie zwierzęcia biorcy. Technika in vivo jest szczególnie przydatna do ilościowej oceny migracji wielu typów komórek w obrębie tego samego zwierzęcia. Przed rozpoczęciem eksperymentu oznacz komórki THP-1 barwnikiem fluorescencyjnym w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowej w kompletnym pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Podczas inkubacji komórek dodaj 750 mikrolitrów HBSS buforowanych 25 milimolowymi HEPES i 0,1% BSA do tła i dodatnich studzienek kontrolnych 24-dołkowej. Dodać odpowiednie stężenie MCP-1 w wodzie uzupełnionej BSA do studzienek doświadczalnych i kontrolnych dodatnich. I umieść porowate wkładki w każdej studzience, uważając, aby wypustki wkładek były wyrównane z nacięciami płytki.

Bardzo ważne jest, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z dołków dennych po umieszczeniu wkładek, ponieważ pęcherzyki będą zakłócać pomiary fluorescencji. Pod koniec inkubacji przenieś oznakowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów w celu ich zebrania przez odwirowanie. I sprawdź wzrokowo powstałą osadkę, aby potwierdzić wchłanianie barwnika.

Następnie ostrożnie odessać próżniowo supernatant i umyć komórki w bezsurowicowym podłożu RPMI-1640 uzupełnionym 25 milimolowymi HEPES w tych samych warunkach wirówki. Zawiesić osad w świeżym, wolnym od surowicy podłożu z HEPES do liczenia. I dostosuj objętość do końcowego stężenia od jednego do 1,5 razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

Dodaj 250 mikrolitrów komórek do górnej komory każdej studzienki i umieść płytkę w czytniku płytek o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uzyskaj odczyty fluorescencji dolnych komór w odstępach od jednej do trzech minut przy odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji fluorescencji dla barwnika. Aby przygotować komórki dawcy do ich adopcyjnego transferu, najpierw zbierz całą śledzionę od znieczulonego samca w wieku od 8 do 12 tygodni C57 Black Six Mouse do 40-mikrometrowego nylonowego filtra siatkowego w naczyniu do hodowli komórkowej zawierającym kompletną pożywkę na lodzie.

Za pomocą końcówki tłoka strzykawki delikatnie zmacerować śledzionę przez siatkę. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i dodaj cztery objętości buforu do lizy chlorku amonu potasu w celu wyczerpania czerwonych krwinek. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w kompletnym podłożu w stężeniu od dwóch do pięciu razy od 10 do siódmych komórek na mililitr

Przecedź komórki przez nową nylonową siatkę o grubości 40 mikrometrów, aby usunąć resztki komórek. I oznacz jeden razy 10 do siedmiu komórek na mysz biorcę barwnikiem fluorescencyjnym kompatybilnym z żywymi komórkami, który zostanie zachowany po późniejszym utrwaleniu przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć komórki w czterech objętościach HBSS uzupełnionych HEPES.

I ponownie zawieś osad w świeżym HBSS plus HEPES do stężenia od 10 do ośmiu komórek na mililitr. Następnie krótko zawiruj komórki dawcy i załaduj je do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 0,5 cala. Umieść znieczulone ośmio- do 12-tygodniowe czarne myszy z sześcioma biorcami C57 w pozycji leżącej i zastosuj łagodny nacisk ogonowy na skórę grzbietową do oka pierwszego zwierzęcia, powodując lekkie wysunięcie gałki ocznej.

Skieruj igłę przyśrodkowo do zaoczodołowego wstrzyknięcia 100 mikrolitrów komórek dawcy. Następnie stopniowo wyjmuj igłę i umieszczaj mysz w indywidualnej klatce odzyskiwania z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Bardzo ważne jest, aby zwierzęta były odpowiednio znieczulone i aby procedura wstrzykiwania została dobrze przećwiczona, aby zapewnić spójne dostarczanie komórek między zwierzętami i między eksperymentami.

Do 24 godzin po transferze adopcyjnym należy pobrać śledziony do jednego mililitra kompletnej pożywki na biorcę. I wygeneruj zawiesinę jednokomórkową wolną od czerwonych krwinek, jak właśnie pokazano. Po zliczeniu dostosuj zawiesinę komórek do stężenia trzy razy 10 do siedmiu komórek na mililitr w buforze barwiącym.

I przenieś 100 mikrolitrów komórek do pojedynczych dołków 96-dołkowej okrągłej płytki dennej. Wybarwić komórki pod kątem interesujących markerów zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej. Po 20 minutach na lodzie chronionym przed światłem, umyj komórki w 100 mikrolitrach buforu barwiącego i ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego do drugiego odwirowania.

Następnie ponownie zawieś osad w 125 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego i przeanalizuj próbki komórek na cytometrze przepływowym zgodnie ze standardowymi protokołami. Automatyczne odczyty fluorescencyjne w celu śledzenia migracji wyraźnie pokazują indukcję migracji komórek w kierunku MCP-1, która jest wzmacniana w obecności surowicy. W zależności od siły bodźca migracyjnego, występuje opóźnienie wynoszące co najmniej 15 minut przed wzrostem sygnału fluorescencyjnego, które może osiągnąć szczyt i stopniowo zanikać, gdy komórki przechodzą do roztworu do dolnej komory od spodu wkładki w szybszym tempie niż komórki migrujące z górnej komory.

Jeśli więcej niż jedna fluorescencyjnie znakowana populacja komórek jest przenoszona adoptywnie, ważne jest, aby określić ilościowo względną proporcję populacji komórek w materiale wejściowym, aby uwzględnić wszelkie różnice w mieszaniu populacji komórek. Na przykład w tym eksperymencie stosunek zielonych i pomarańczowych komórek fluorescencyjnych wynosił 0,97 do jednego. Handel określono ilościowo jako liczbę odzyskanych znakowanych komórek podzieloną przez całkowitą liczbę odzyskanych komórek.

Chociaż istnieje znaczna różnica w liczbie odzyskanych komórek między zwierzętami, dla każdego zwierzęcia stosunek zielonych do pomarańczowych komórek fluorescencyjnych jest zwykle w przybliżeniu równy. Po opanowaniu technikę in vitro można wykonać w ciągu czterech godzin, a technikę in vivo można wykonać w ciągu sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o unikaniu tworzenia pęcherzyków w komorach doświadczalnych i dążyć do zachowania spójności podczas retro-orbitalnego wstrzykiwania adoptywnie przeniesionych komórek.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do badania chemotaksji in vitro i in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać i monitorować test chemotaksji in vitro w czasie rzeczywistym oraz izolować natywne limfocyty w celu ich adoptywnego transferu i śledzenia ich migracji in vivo. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.