Name: Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj technologię snap chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej. Ta metoda umożliwia jednoczesne oznaczanie wielu białek bez złożonego spottera mikromacierzowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Robowi Sladkowi za korzystanie z skanera atramentowego. Doceniamy ostateczne wsparcie ze strony Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR), Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC), Instytutu Badawczego Kanadyjskiego Towarzystwa Onkologicznego oraz Kanadyjskiej Fundacji Innowacji (CFI). D.J. dziękuje za wsparcie ze strony Kanadyjskiego Przewodniczącego ds. Badań.

1. Wytwarzanie i przechowywanie chipów snap
<ol>
	<li>Metoda pojedynczego transferu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a)
	<ol>
		<li>Punktowe roztwory cAb zawierające 400 μg/ml przeciwciał i 20% glicerolu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) na szkiełku testowym nitrocelulozowym (lub funkcjonalizowanym szkłem) za pomocą atramentowego skanera mikromacierzy 13 przy wilgotności względnej 60% (1,2 nl na każdą plamkę) w odstępach 800 μm od środka do środka. Upewnij się, że zjeżdżalnia jest zamocowana na pokładzie obserwatora zgodnie z jednym rogiem (tutaj użyto lewego dolnego rogu).</li>
		<li>Inkubować szkiełko testowe plamkowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy wilgotności względnej 60%.</li>
		<li>Zaciśnij uszczelkę modułu suwaka z 16 komorami na szkiełku testowym, aby podzielić ją na 16 dołków. Przepłukać szkiełko trzykrotnie, dodając 80 μl PBS zawierającego 0,1% Tween-20 (PBST) do każdego dołka i wstrząsając z prędkością 450 obr./min na wytrząsarce, za każdym razem 5 minut.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 80 μl roztworów blokujących i wstrząsać przez 1 godzinę z prędkością 450 obr./min.</li>
		<li>Zdejmij uszczelkę i osusz szkiełko testowe strumieniem azotu.</li>
		<li>Zamocuj suwak transferowy na pokładzie obserwatora i dociśnij lewy dolny róg zjeżdżalni do lewego dolnego rogu pokładu obserwatora. Drukarka atramentowa wykrywa szereg znaczników wyrównania (roztwór mikrokulek polistyrenu) o takim samym układzie, jak w przypadku cAbs.</li>
		<li>Pozostaw znaczniki wyrównania do wyschnięcia. Odwróć suwak transferowy i umieść go z powrotem na pokładzie obserwatora, przymocowując do lewego dolnego rogu.</li>
		<li>Przygotuj roztwory do plamienia dAb zawierające 20 μg/ml przeciwciał, 20% glicerolu i 1% BSA.</li>
		<li>Korzystając z kamery obserwatora, zrób zdjęcie znaku wyrównania. Zaimplementuj ten obraz w programie do wykrywania jako powiernik i uzyskaj system rozpoznawania obrazu skanera atramentowego, aby zidentyfikować najbardziej górny lewy znak. Użyj jego współrzędnych jako pierwszego miejsca tablicy dAb. Punktowo 8 nL na kroplę w odstępach od środka do środka 800 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda podwójnego transferu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b)
	<ol>
		<li>Umieść suwak transferowy 1 na pokładzie skanera atramentowego w lewym dolnym rogu. Punktowe roztwory cAbs zawierające 400 μg/ml przeciwciał, 20% glicerolu i 1% BSA w PBS na szkiełku za pomocą skanera do mikromacierzy atramentowej o wilgotności względnej 60% (0,4 nL dla każdej plamki i średnicy ~ 200 μm). Odstęp między środkami wynosi 400 μm.</li>
		<li>Zatrzaśnij szkiełko transferowe za pomocą szkiełka testowego pokrytego nitrocelulozą (lub funkcjonalizowanego szkła) za pomocą aparatu zatrzaskowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2), aby przenieść kropelki cAb na szkiełko testowe.
		<ol>
			<li>Obróć wszystkie sześć przycisków z boku aparatu zatrzaskowego o 90 stopni, aby pociągnąć i zablokować wszystkie tłoki w pozycji otwartej. Włóż suwak transferowy do uchwytu suwaka w jego gnieździe z zaciśniętym rogiem skierowanym w stronę stałego kołka pogo. Obróć pierwszy zestaw trzech przycisków, aby zwolnić tłoki za pomocą złotego kołka pogo i upewnij się, że suwaki są dociśnięte do kołków wyrównujących.</li>
			<li>Włóż szkiełko pokryte nitrocelulozą do aparatu zatrzaskowego do góry nogami, siedząc na 4 kołkach pogo. Obróć drugi zestaw trzech przycisków, aby zwolnić tłoki za pomocą srebrnego kołka i upewnij się, że suwaki są dociśnięte do kołków wyrównujących.</li>
			<li>Zamknij aparat zatrzaskowy, umieszczając górną powłokę na uchwycie szkiełka za pomocą słupków wyrównujących i otworów w celu precyzyjnego pozycjonowania.</li>
			<li>Włóż zamknięty aparat zatrzaskowy do klatki i całkowicie dociśnij klapkę zamykającą w dół, aby ustawić mikromatryce twarzą w twarz, wywierając odpowiedni nacisk. Trzymaj zamknięte przez 1 minutę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oddziel slajdy. Inkubować szkiełko testowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy wilgotności względnej 60%. Umyć, zablokować i wysuszyć szkiełko testowe zgodnie z opisem w krokach 1.1.3 - 1.1.5.</li>
		<li>Umieść kolejny suwak transferowy na pokładzie skanera atramentowego i dociśnij do lewego dolnego rogu. Punktowe roztwory dAb zawierające 50 lub 100 μg/ml przeciwciał (patrz Tabela 1), 20% glicerolu i 1% BSA w PBS. Upewnij się, że każda plamka ma 0.8 nl, a odstęp między punktami od środka do środka wynosi 400 μm.</li>
		<li>Przechowywać test i szkiełko transferowe. Zamknąć zarówno szkiełka testowe, jak i transferowe w hermetycznej torbie zawierającej środek osuszający i umieścić w zamrażarce o temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Multipleksowane testy immunologiczne z chipami snap
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełko testowe z zamrażarki. Pozostaw worek szczelnie zamknięty na 30 minut, aż szkiełko osiągnie temperaturę pokojową.</li>
	<li>Przygotować 7-punktowe, seryjnie rozcieńczane roztwory próbek, dodając białka do PBS zawierającego 0,05% Tween-20, 
	UWAGA: W tym przypadku stosuje się 5-krotny współczynnik rozcieńczenia. Stężenia wyjściowe dla każdego białka są wymienione w tabeli 1.</li>
	<li>W razie potrzeby przygotować roztwory próbek. Na przykład rozcieńczyć ludzką surowicę 4 razy w buforze PBST.</li>
	<li>Zacisnąć 16-komorową uszczelkę na szkiełku testowym.</li>
	<li>Napełnij jedną kolumnę z 8 studzienkami 7 roztworami rozcieńczającymi białka i bezbiałkowym roztworem buforowym PBST przez pipetowanie. Odpipetować roztwory próbek w pozostałych 8 dołkach na tym samym szkiełku. 
	UWAGA: W każdym dołku można zmieścić 80 μl roztworów. W razie potrzeby można użyć większej liczby szkiełek do pomiaru dodatkowych próbek.</li>
	<li>Próbki inkubować na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć szkiełko trzykrotnie PBST na wytrząsarce przy 450 obr./min, za każdym razem 5 min. Zdejmij uszczelkę i osusz szkiełko pod strumieniem gazowego azotu.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko transferowe z dAbs z zamrażarki. Przechowywać worek szczelnie zamknięty przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj szkiełko w zamkniętej komorze (np. pustym pudełku z końcówkami) zawierającej 60% kulki stabilizujące wilgotność przez 20 minut w celu ponownego nawodnienia.</li>
	<li>Zatrzaśnij szkiełko transferowe ze szkiełkiem testowym za pomocą aparatu zatrzaskowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2), aby przenieść kropelki dAb. Patrz sekcja 1.2.2 w celu zapoznania się z działaniem urządzenia zatrzaskowego.</li>
	<li>Oddziel slajdy. Szkiełko testowe inkubować w zamkniętej komorze zawierającej 60% kulki stabilizujące wilgotność przez 1 godzinę. Zacisnąć szkiełko testowe z uszczelką 16-komorową i przepłukać szkiełko 4 razy za pomocą PBST na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min, za każdym razem po 5 minut.</li>
	<li>Do każdej studzienki należy pobrać pipetą 80 μl roztworów zawierających 2,5 μg/ml fluoroforu streptawidyny w PBS. Inkubować przez 20 minut na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min.</li>
	<li>Przepłukać szkiełko 3 razy PBST i raz wodą destylowaną na wytrząsarce przy 450 obr./min. Zdejmij uszczelkę i osusz szkiełko za pomocą azotu.</li>
</ol>
3. Skanowanie slajdów i analiza danych
<ol>
	<li>Zeskanuj szkiełko testowe za pomocą fluorescencyjnego skanera mikromatrycowego przy użyciu lasera 635 nm.</li>
	<li>Wyodrębnij intensywność netto każdego punktu za pomocą oprogramowania analitycznego (np. array-pro analyzer)16.</li>
	<li>Obliczyć granicę wykrywalności (LOD) każdego białka za pomocą oprogramowania statystycznego i określić stężenia białka w próbkach. 
	UWAGA: LOD definiuje się jako punkt przecięcia z osią Y krzywej wzorcowej zwiększony o trzykrotność odchylenia standardowego trzech niezależnych testów.</li>
</ol>

<ol><li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li>
<li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers%3A+CEA%2C+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+improve+protein+detection+by+indirect+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).</li>
<li>Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multiplexed+MRM-based+protein+biomarker+quantitation+toward+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility.</a> Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).</li>
<li>Ekins, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-analyte+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Multi-analyte immunoassay.</a> J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).</li>
<li>Mahlknecht, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+microarray+analysis+of+serum+cytokines+in+neurodegenerative+Parkinsonian+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes.</a> Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera%3A+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li>
<li>Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+droplet+microarrays+with+trapped+antibody-functionalized+beads+for+multiplexed+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis.</a> Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).</li>
<li>Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+in+antibody+microarrays+and+multiplexed+sandwich+assays%3A+shedding+light+on+the+dark+side+of+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).</li>
<li>Blank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-chip+protein+arrays%3A+force-based+multiplex+sandwich+immunoassays+with+increased+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).</li>
<li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%3A+A+Programmable+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA: A Programmable Force Sensor.</a> Science. 301 (5631), 367-370 (2003).</li>
<li>Pla-Roca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Colocalization+Microarray%3A+A+Scalable+Technology+for+Multiplex+Protein+Analysis+in+Complex+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples.</a> Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-to-Microarray+Transfer+of+Reagents+by+Snapping+of+Two+Chips+for+Cross-Reactivity-Free+Multiplex+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).</li>
<li>Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+snap+chip+for+high-density+sub-nanoliter+chip-to-chip+reagent+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11688(2015).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+38+proteins+during+the+progression+of+human+breast+tumor+in+mice+using+an+antibody+colocalization+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).</li>
<li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li>
<li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li>
<li>Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+%28MetaChip%29+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li>
<li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li>
<li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li>
</ol>

Uniwersytet McGill złożył wniosek patentowy na niektóre aspekty tej pracy, a wynalazcami byli Huiyan Li i David Juncker.

W tej pracy przedstawiliśmy technologię snap chip, która sprawia, że multipleksowe testy immunologiczne wolne od reaktywności krzyżowej są szeroko dostępne dla badaczy z podstawową konfiguracją eksperymentalną. W odróżnieniu od istniejących mikromacierzy przeciwciał, użytkownicy końcowi nie potrzebują obserwatora mikromacierzy. Zademonstrowano zarówno metodę pojedynczego, jak i podwójnego transferu, przy czym podwójny transfer zapewnia doskonałą dokładność wyrównania do ~ 40 μm dla 98% miejsc, z największą niewspółosiowo...

Panel biomarkerów składający się z wielu białek może zapewnić wyższą czułość i swoistość niż pojedynczy biomarker w diagnostyce złożonych chorób, takich jak nowotwory1,2. Test immunoenzymatyczny (ELISA) jest złotym standardem technologicznym stosowanym w laboratoriach klinicznych, który osiąga granicę wykrywalności przy niskim pg/ml w osoczu, ale ogranicza się do jednego celu na test3,4,5. Mikromacierze przeciwciał zostały opracowane z myślą o tysiącach zminiaturyzowanych testów przeprowadzanych równolegle na jednym szkiełku mikroskopowym6,7,8. Jednak zdolność tej metody do multipleksowania jest ograniczona przez reaktywność krzyżową sterowaną odczynnikami, wynikającą z zastosowania mieszaniny dAbs, i staje się bardziej problematyczna wraz ze wzrostem liczby celów9,10,11. Pla i wsp. stwierdzili, że wynikająca z tego podatność testu kanapkowego multipleksowego skaluje się jako 4N(N-1), gdzie N to liczba celów12.
Aby złagodzić reaktywność krzyżową w mikromacierzach przeciwciał, w naszym laboratorium opracowano mikromacierz kolokalizacji przeciwciał (ACM) do multipleksowego testu kanapkowego12. Przeciwciała wychwytujące (cAb) są wykrywane na podłożu za pomocą obserwatora mikromacierzy. Po zablokowaniu próbki są nakładane na powierzchnię, a następnie poszczególne dAb są nakrapiane w tych samych miejscach z kompleksem cAb-antygen. Wszystkie scenariusze reaktywności krzyżowej między przeciwciałami i antygenami można złagodzić za pomocą ACM, a granice wykrywalności na pg/ml zostały osiągnięte. Protokół testu wymaga jednak przygotowania i wykrycia dAb podczas eksperymentów przy użyciu lokalnego obserwatora mikromacierzy o wysokiej precyzji w celu wyrównania, co jest kosztowne i czasochłonne, co ogranicza szerokie zastosowanie tej technologii w innych laboratoriach. Ręczny ACM, nazwany chipem snap, został opracowany do wielowarstwowych testów immunologicznych bez reaktywności krzyżowej i bez obserwatorów13,14,15. cAb i dAb są wstępnie nanoszone odpowiednio na szkiełko testowe i szkiełko transferowe w formacie mikromacierzy i przechowywane. Podczas testu szkiełka są pobierane, a mikromacierz dAb jest przenoszona zbiorczo na szkiełko testowe, po prostu łącząc ze sobą dwa chipy. Do niezawodnego przenoszenia odczynników służy aparat zatrzaskowy. Szkiełka pokryte nitrocelulozą o stosunkowo dużej zdolności wiązania przeciwciał zostały wykorzystane jako szkiełka testowe do absorpcji kropelek cieczy, a tym samym ułatwienia transferu odczynników, jednak szkiełka są droższe niż zwykłe szkiełka szklane, a do akwizycji sygnału potrzebne są skanery mikromatrycowe kompatybilne z szkiełkami nieprzezroczystymi.
W tej pracy demonstrujemy protokół wykonywania multipleksowego testu immunologicznego typu kanapkowego za pomocą chipa snap. Opracowano nowatorski aparat zatrzaskowy do wygodniejszego i bardziej niezawodnego transferu odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Co ważne, tutaj ustaliliśmy metodę przenoszenia odczynnika na zwykłe szkiełka podstawowe za pomocą chipa zatrzaskowego. 1024 plamki udało się przenieść i wyrównać na szklanym szkiełku, co znacznie rozszerzyło zastosowanie tej technologii w większości laboratoriów.

<table><tbody><tr><td>Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 sprzężony z paciorkowcem</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie blokujące: Stabilizator mikromatrycowy StabilGuard Choice bez BSA</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka powlekane nitrocelulozą</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka pokryte aminozylanem</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Device</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>Skaner mikromacierzy atramentowej</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka modułu suwaka</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki stabilizacji wilgotności</td><td>Testy biologiczne Parallex Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Array-Pro Analyzer</td> Media <td>Cybernetyka</td><td>Wersja 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Skaner mikromacierzy fluorescencyjnych</td><td>Skaner</td><td>mikromacierzy Agilent SureScan Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>biostatystyczne</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wychwytujące endoglin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>Białko Endoglin</td><td>R& D Systems</td><td>1097-PL</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wykrywające endoglin</td><td>R& Systemy D</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6a (patrz tabela 1)</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6b (patrz Tabela 1)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

snap chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i spotterów

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Analiza białek multipleksowanych wykazała wyższą czułość i dokładność diagnostyczną w porównaniu z pojedynczymi białkami. Mikromacierze przeciwciał pozwalają na wykonywanie tysięcy testów immunologicznych w mikroskali jednocześnie na jednym chipie. Format testu warstwowego poprawia swoistość testu poprzez wykrywanie każdego celu z dwoma przeciwciałami, ale cierpi z powodu reaktywności krzyżowej między odczynnikami, co ogranicza ich możliwości multipleksowania. Mikromacierz kolokalizacyjna przeciwciał (ACM) została opracowana do wykrywania białek multipleksowanych bez reaktywności krzyżowej, ale wymaga drogiego obserwatora na miejscu do wytwarzania mikromacierzy podczas testów. W tej pracy demonstrujemy technologię chipów zatrzaskowych, która przenosi odczynnik z mikromacierzy do mikromacierzy, po prostu łącząc ze sobą dwa chipy, dzięki czemu nie jest potrzebny obserwator podczas inkubacji próbki, a następnie aplikacji przeciwciał detekcyjnych (dAbs) po przechowywaniu wstępnie wykrytych szkiełek, oddzielając przygotowanie szkiełka od wykonania testu. Przedstawiono zarówno pojedyncze, jak i podwójne metody transferu w celu uzyskania dokładnego wyrównania między dwiema mikromatrycami oraz opisano wytwarzanie szkiełek dla obu metod. Wyniki pokazują, że wyrównanie <40 μm osiągnięto przy podwójnym transferze, osiągając gęstość matrycy 625 plamek/cm2. Przeprowadzono test immunologiczny z 50 pleksami, aby wykazać przydatność chipa snap w multipleksowanej analizie białek. Granice wykrywalności 35 białek mieszczą się w zakresie pg/ml.

Procedura analizy dla obu metod transferu — pojedynczego i podwójnego — przedstawiona jest na Rysunku 1. W transferze pojedynczym przeciwciała uchwytujące (cAbs) są naniesione bezpośrednio na slajd analityczny, a przeciwciała detekcyjne (dAbs) są przenoszone na slajd w momencie użycia w układzie lustrzanym względem cAbs (Rysunek 1a). Wymagana jest tylko jedna procedura transferu, jednak metoda ta jest obarczona błędem niedopasowa...

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne ilościowe oznaczenie wielu białek na płytce przy użyciu immunotestów kanapkowych w sposób niewymagający nanoszenia próbek (spotter-free), bez reaktywności krzyżowej między odczynnikami. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie proteomiki ilościowej, takie jak odkrywanie i walidacja kandydatów na białkowe biomarkery w nowotworach. Głównymi zaletami tej techniki są brak reaktywności krzyżowej między przeciwciałami a antygenem w multipleksowych testach kanapkowych oraz brak konieczności stosowania złożonego urządzenia do nanoszenia mikromacierzy.Procedurę zaprezentuje Heidi Larkin, dyrektor naukowa w Parallex BioAssays. Aby rozpocząć przygotowanie szkiełek do metody pojedynczego przeniesienia, zamocuj nowe szkiełko transferowe na platformie inkubatora do mikrotablic typu ink-jet. Używając roztworu polistyrenowych mikrokulek lub 30% glicerolu, nanieś macierz znaczników wyrównawczych na krawędź szkiełka.Używając oprogramowania urządzenia i kamery spottera, wykonaj zdjęcie znaczników wyrównawczych w celu kontroli jakości. Następnie przymocuj slajd testowy z nitrocelulozy lub funkcjonalizowanego szkła po lewej stronie slajdu transferowego na platformie ink-jetowego spottera do mikroarrayów. Korzystając ze znaczników wyrównawczych, nanieś 24 matryce roztworów przeciwciał wychwytujących z odstępem 400 µm od środka do środka.Inkubować slajd testowy w temperaturze pokojowej w atmosferze o wilgotności względnej 60% przez jedną godzinę. Następnie przypiąć do slajdu 24-dołkową uszczelkę silikonową, dopasowując ją do matryc. Do każdego dołka pipetować 80 µL 0,1% roztworu polysorbate 20 w PBS.Wstrząsaj preparatem przy 450 rpm przez pięć minut, a następnie wylej roztwór. Powtórz ten proces płukania preparatu trzykrotnie. Następnie nanieś 80 µL roztworu blokującego wolnego od BSA do każdej wypłukanej studni.Wstrząsać preparatem przy 450 rpm przez jedną godzinę. Następnie usunąć roztwór, zdjąć uszczelkę silikonową i wysuszyć slajd testowy za pomocą strumienia azotu lub w wirówce. Zamknąć slajd testowy w szczelnym worku z żelem krzemionkowym lub innym środkiem osuszającym i przechowywać w temperaturze -20 °C.Korzystając z tych samych znaczników wyrównania, nanieś 24 macierze roztworów przeciwciał detekcyjnych, stosując 3,2 nanolitra na plamkę w odstępach 400 mikrometrów od środka do środka. Przechowuj szkiełko transferowe w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w szczelnej torebce z osuszaczem. Aby rozpocząć przygotowywanie szkiełek do metody podwójnego transferu, zamocuj szkiełko transferowe na platformie inkjetowego spottera do mikromacierzy.Nanieś 24 macierze roztworów przeciwciał wychwytujących z rozstawem środka od środka wynoszącym 400 micrometers. Następnie obróć przełączniki tłoków urządzenia snap o 90 stopni, aby zablokować tłoki w pozycji otwartej. Wsuń szkiełko transferowe do przechwytywania do urządzenia tak, aby ścięty róg opierał się o stały pin pogo.Zwolnij piny pogo, obracając odpowiadające im przełączniki tłokowe o 90 stopni z powrotem. Upewnij się, że piny pogo mocno trzymają slajd transferowy i że jest on zlicowany z ustalonymi pinami pozycjonującymi. Następnie umieść nowy slajd nitrocelulozowy lub funkcjonalizowane szkiełko na pinach pogo stroną powleczoną do dołu.Przełącz pozostałe trzy przełączniki, aby zwolnić proste piny. Upewnij się, że oba suwaki są unieruchomione przy stałych pinach wyrównawczych. Następnie nałóż górną obudowę na uchwyt suwaka, osadzając filar w otworach wyrównawczych.Włóż zamknięte urządzenie do zatrzaskowej klatki i całkowicie dociśnij zakładkę zamykającą. Pozostaw urządzenie zamknięte przez jedną minutę. Następnie podnieś zakładkę zamykającą, aby zwolnić urządzenie z klatki.Zdejmij górną obudowę i oddziel slajd analityczny od slajdu transferowego. Inkubuj slajd analityczny przez jedną godzinę. Następnie przymocuj do slajdu silikonową uszczelkę 24-dołkową i przemyj slajd trzykrotnie.Następnie wstrząsaj preparatem w roztworze blokującym bez BSA przez jedną godzinę. Usuń uszczelkę i wysusz slajd testowy strumieniem gazu azotowego lub w wirówce. Następnie zamocuj kolejny slajd transferowy na platformie urządzenia do nanoszenia kropel (ink jet spotter).Nanieś na slajd 24 macierze roztworów przeciwciał detekcyjnych, stosując 3,2 nanolitrów na punkt w odstępach 400 mikrometrów od środka do środka, aby przygotować slajd transferowy. Przechowuj slajd transferowy do detekcji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć analizę immunoenzymatyczną, wyjmij przygotowany slajd analityczny z zamrażarki i pozostaw go w szczelnej torebce na 30 minut, aby osiągnął temperaturę pokojową.Przygotować siedem roztworów białek w PBS z 0,05% polysorbate 20, rozcieńczonych seryjnie. Przygotować odpowiednio rozcieńczone roztwory próbek w tym samym buforze. Zamocować 24-dołkową uszczelkę silikonową do preparatu analitycznego w temperaturze pokojowej.Nanieś siedem rozcieńczeń białek do siedmiu z ośmiu studzienek w kolumnie. Do ostatniej studzienki w tej kolumnie nanieś PBS bez białka z dodatkiem 0,05% polisorbatu 20. Do pozostałych studzienek nanieś roztwory próbek.Wstrząsać slajdy z prędkością 450 rpm przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub w 4 stopniach Celsjusza przez noc. Następnie przemyć slajd trzykrotnie. Usunąć uszczelkę i wysuszyć slajd strumieniem gazu azotowego.Następnie należy pozwolić, aby szkiełko z przeciwciałem detekcyjnym ogrzało się do temperatury pokojowej przez 30 minut w zamkniętej torebce. Następnie inkubować szkiełka przez 20 minut w zamkniętej komorze przy wilgotności względnej 60%, aby nawodnić macierze. Użyć pinów pogo, aby przymocować szkiełko z przeciwciałem detekcyjnym stroną górną do urządzenia snap.Umieść slajd testowy stroną roboczą do dołu na pinach pogo i wyrównaj go z pinami prostymi. Zamknij urządzenie i wykonaj szybki transfer przeciwciał detekcyjnych na slajd testowy. Wyjmij slajdy z urządzenia i inkubuj slajd testowy przez jedną godzinę.Przymocuj silikonową uszczelkę 24-dołkową do szkiełka i przemyj szkiełko trzy razy. Następnie wprowadź do każdego dołka 80 µL roztworu streptawidyny fluoro-4 w PBS o stężeniu 2,5 µg/mL. Wstrząśnij szkiełkiem z prędkością 450 rpm przez 20 minut.Przemyj slajd trzykrotnie 0,1% roztworem polisorbatasu 20 w PBS oraz raz wodą destylowaną. Następnie usuń uszczelkę i wysusz slajd. Przeskanuj slajd za pomocą skanera fluorescencyjnego i zmierz intensywność plamek.Wyznaczenie granic wykrywalności w stężeniach białek. Dwa białka fluorescencyjne zostały sekwencyjnie naniesione na slajd powlekany nitrocelulozą przy użyciu metody podwójnego transferu z matrycą 16-dołkową. Podczas transferu drugiego białka fluorescencyjnego nie zaobserwowano kontaminacji krzyżowej.Mniejsze plamki z mniejszym odstępem między nimi można przenieść na szkiełko przedmiotowe o silnie hydrofobowej powierzchni. Metoda podwójnego przeniesienia pozwoliła na zminimalizowanie błędu kątowego wyrównania macierzy. Metodę podwójnego przeniesienia zastosowano do przeprowadzenia 50-pleksowego testu immunoologicznego białek związanych z rakiem piersi w formacie testu kanapkowego.Nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej, co umożliwiło niezależną optymalizację każdej pary przeciwciał. Krzywe wzorcowe obliczone na podstawie analiz wykazały, że 35 z 50 białek posiadało granice wykrywalności na poziomie pikogramów na mililitr. Po opanowaniu techniki, czas jej wykonania wynosi około trzech godzin.Technika ta pozwala naukowcom na przeprowadzanie analiz opartych na mikroarrays oraz dostarczanie odczynników w postaci nanokropli. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym zamocowaniu szkiełek na platformie do nanoszenia próbek oraz w aparacie snap. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania aparatu snap w celu przeprowadzania multipleksowych testów immunoenzymatycznych typu kanapkowego bez reakcji krzyżowych.

snap-chip-for-cross-reactivity-free-spotter-free-multiplexed-sandwich

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Test ELISA można łatwo przekształcić w analizę Luminex xMAP, a dzięki zaletom multipleksowania można jednocześnie przesiewowo badać kilka przeciwciał w celu zidentyfikowania optymalnej pary przeciwciał, co prowadzi do zwiększenia czułości i zakresu dynamicznego przy jednoczesnym obniżeniu kosztów analizy.

Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Film prezentuje implementację technologii chipów snap do wielowarstwowych testów immunologicznych bez reaktywności krzyżowej. Prosta czynność polegająca na zatrzaśnięciu dwóch szkiełek mikromacierzy, z których każdy zawiera inne odczynniki, zapewnia transfer odczynnika bez zanieczyszczenia krzyżowego i pomaga w wykrywaniu wielu białek za pomocą testu immunologicznego typu sandwich.

Technologia Snap Chip do wielowarstwowego testu immunologicznego bez reaktywności krzyżowej

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

W obecnym klimacie ograniczonych zasobów, pojawiają się nowe technologie, które pozwalają badaczom prowadzić badania taniej, szybciej i z większą precyzją. W tym miejscu opisujemy rozwój multipleksowego testu immunologicznego na bazie przeciwciał ślinowych na bazie kulek do pomiaru narażenia ludzi na wiele patogenów środowiskowych jednocześnie.

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

Obecność toksyn cyjanobakteryjnych w zbiornikach słodkiej wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi jest głównym problemem dla organów zarządzających gospodarką wodną. Aby ocenić ryzyko zanieczyszczenia wody, w artykule opisano protokół wykrywania w terenie szczepów sinic w próbkach ciekłych i stałych przy użyciu chipa mikromacierzy przeciwciał.

Eksperymentalny protokół wykrywania sinic w próbkach ciekłych i stałych za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Poznaj technologię snap chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej. Ta metoda umożliwia jednoczesne oznaczanie wielu białek bez złożonego spottera mikromacierzowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Przeglądaj więcej filmów