Name: Technika minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu indukcji przerostu lewej komory (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną technikę poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu indukcji przerostu lewej komory. Ta metoda eliminuje potrzebę intubacji i wentylacji, upraszczając procedurę chirurgiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem (nr 32016) Szwajcarskiej Fundacji Sercowo-Naczyniowej dla RT.

Męskie myszy C57BL/6J (10 tygodni, 25 - 30g, n=60) są używane w tym protokole. Zwierzęta otrzymują humanitarną opiekę zgodnie z wytycznymi sformułowanymi przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa oraz Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych, a wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG) oraz prawem francuskim. Protokół został zatwierdzony przez "Regionalną Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach CREMEAS" (#2016092816207606).
1. Przygotowanie do zabiegu
<ol>
	<li>Utrzymuj myszy przez tydzień po przybyciu do obiektu dla zwierząt w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności, w standardowych klatkach, z jedzeniem (szczegóły patrz Tabela materiałów) i wodą dostępną ad libitum.</li>
	<li>W dniu operacji umieść myszy w oddzielnych klatkach na kilka minut przed indukcją znieczulenia, aby uniknąć dodatkowego stresu dla zwierzęcia. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne dzień przed zabiegiem.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo pojedynczą dawkę mieszaniny ketaminy (51,4 mg/kg) i ksylazyny (3,3 mg/kg) rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl).</li>
	<li>Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest spowodowana brakiem odruchu wycofania się u nogi.</li>
	<li>Ogol szyję i klatkę piersiową zwierzęcia dostępną w handlu maszynką do golenia i zdezynfekuj ogolony obszar 70% alkoholem.</li>
	<li>Umieść zwierzę na wznak na czystej korkowej podkładce roboczej i przymocuj łapy taśmą klejącą.</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Podczas zabiegów stosowana jest sterylna technika chirurgiczna. U zwierzęcia oddychającego spontanicznie wykonaj podłużne nacięcie szyjki macicy w linii środkowej na długości ponad 10 mm nożem z 11 ostrzami od wcięcia nadmostkowego do połowy klatki piersiowej w celu odsłonięcia mostka (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Cofnij tarczycę, przesuwając szew polipropylenowy 4/0 z monofilamentu za pomocą uchwytu na igłę Crile-Wood i przyklej go do podkładki roboczej.</li>
	<li>Oddziel tępo mięśnie przedtchawicze za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych, aby odsłonić tchawicę.</li>
	<li>Delikatnie przesuń zakrzywione kleszczyki mikrochirurgiczne z zamkniętymi szczękami po tchawicy i za mostek.</li>
	<li>Ostrożnie otwierając i zamykając szczęki gładko zakończonych, zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych, przeprowadź rozwarstwienie pod mięśniami przedtchawicowymi i za mostkiem, aby odsunąć opłucną.</li>
	<li>Chwyć prawe mięśnie nadobojczykowe prostymi kleszczami mikrochirurgicznymi z gładką końcówką i delikatnie pociągnij klatkę piersiową zwierzęcia.</li>
	<li>Wsuń dolną szczękę szczypiec kostnych pod mostek i wykonaj górną częściową sternotomię 3-4 mm (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2). Skieruj dolną część mini-sternnotomii lekko w lewo.</li>
	<li>Przełóż szew polipropylenowy z monofilamentu 7/0 od wewnątrz na zewnątrz przez drugą przestrzeń międzyżebrową po każdej stronie mini-sternotomii za pomocą mikrochirurgicznego uchwytu na igłę. Trzymaj się blisko kąta żebrowo-mostkowego, aby uniknąć uszkodzenia naczyń międzyżebrowych i wewnętrznych klatki piersiowej lub opłucnej.</li>
	<li>Rozłóż krawędzie mostka za pomocą monofilamentowych szwów polipropylenowych 7/0 z każdej strony i przymocuj je do podkładki roboczej za pomocą taśmy klejącej.</li>
	<li>Delikatnie odsuń na bok mięśnie przedtchawicze, tłuszcz śródpiersia i grasicę za pomocą zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych o gładkiej końcówce, aby uwidocznić łuk aorty w powiększeniu o niskiej mocy (2 - 3X) (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie dotykać ani nie uszkadzać opłucnej ciemieniowej, aby zapobiec rozwojowi odmy opłucnowej.</li>
	<li>Odsłoń tkankę miękką pod łukiem aorty, wiążąc kleszcze (<silna klasa="xfig">Ryc. 4A) i delikatnie rozłóż jej szczęki. Przygotuj tunel w tkance miękkiej pod łukiem aorty za pomocą drugich kleszczy wiążących, delikatnie otwierając i zamykając szczęki w tkance miękkiej.</li>
	<li>Przełóż odcinek jedwabnej ligatury 6/0 przewleczony przez oczko pomocy do podwiązywania (<silna klasa="xfig">Ryc. 4B) trzymanego w lewej ręce pod łukiem aorty i odzyskaj go, zawiązując kleszcze trzymane w prawej ręce między początkiem prawej tętnicy szyjnej nienazwanej a lewą wspólną (<silna klasa="xfig">Ryc. 5).</li>
	<li>Przytnij igłę o rozmiarze 27 na długość 5 mm i stęp oba końce, dociskając je uchwytem na igłę Crile. Umieść igłę o rozmiarze 27 obok łuku aorty (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 6) za pomocą prostych kleszczy mikrochirurgicznych o gładkiej końcówce i zawiąż szew ciasno wokół igły i aorty między prawą tętnicą szyjną bezimienną a lewą wspólną za pomocą dwóch kleszczy wiążących (<klasa silna = "xfig">Rycina 7). Aby ściśle zawiązać szew, wykonaj początkowy podwójny węzeł, a następnie cztery dodatkowe węzły. Upewnij się, że wszystkie węzły są płaskie.</li>
	<li>Po podwiązaniu należy szybko, ale delikatnie usunąć igłę, aby uzyskać zwężenie o średnicy 0,4 mm i powtarzalne poprzeczne zwężenie aorty na poziomie 65-70%.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma hemostazy tkanki miękkiej wokół łuku aorty, krawędzi mostka i mięśni przedtchawiczych. Umieść wchłanialną gazę hemostatyczną wszędzie tam, gdzie obserwuje się sączenie krwi. Usuń monofilamentowe szwy polipropylenowe 7/0 używane do rozkładania krawędzi mostka.</li>
	<li>Przeprowadź prosty szew polipropylenowy 6/0 z monofilamentu za pomocą mikrochirurgicznego uchwytu na igłę od zewnątrz do wewnątrz lewej drugiej przestrzeni międzyżebrowej, a następnie od wewnątrz na zewnątrz prawej drugiej przestrzeni międzyżebrowej. Trzymaj się blisko kąta żebrowo-mostkowego, aby uniknąć uszkodzenia naczyń międzyżebrowych i wewnętrznych klatki piersiowej lub opłucnej.</li>
	<li>Zbliż krawędzie mostka, wiążąc szew polipropylenowy 6/0 z monofilamentu za pomocą uchwytu na igłę Crile-Wood.</li>
	<li>Zamknij skórę monofilamentowym polipropylenowym szwem ciągłym 5/0 w jednej warstwie za pomocą uchwytu na igłę Crile-Wood.</li>
	<li>Wykonaj procedurę pozorowaną identyczną z operacją zwężenia, ale bez wiązania szwu wokół aorty.</li>
</ol>
3. Rekonwalescencja pooperacyjna
<ol>
	<li>Monitoruj zwierzęta bardzo uważnie. Przenieś mysz do indywidualnej klatki i umieść ją w pozycji leżącej.</li>
	<li>Pozwól myszy dojść do siebie w ciepłym świetle, aż do całkowitego wybudzenia (mniej niż 1 godzinę po wywołaniu znieczulenia).</li>
	<li>W przypadku analgezji pooperacyjnej należy wstrzyknąć dootrzewnowo 0,1 mg/kg buprenorfiny. Powtarzać wstrzyknięcia podskórne w dawce 0,1 mg/kg buprenorfiny co 8 godzin przez pierwsze trzy dni, zgodnie ze wskazaniami.</li>
	<li>Umieść operowane myszy w standardowych klatkach (maksymalnie 3 myszy na klatkę i minimum 2 myszy na klatkę).</li>
</ol>
4. Żniwa serca
<ol>
	<li>W dniu analizy należy poddać mysz eutanazji roztworem ketaminy 300 mg/kg i ksylazyny 20 mg/kg w soli fizjologicznej we wstrzyknięciu dootrzewnowym.</li>
	<li>Najpierw zbierz krew z żyły głównej dolnej, a następnie tą samą linią wstrzyknij 5 ml roztworu 2,6 mM EDTA w soli fizjologicznej.</li>
	<li>Zbierz serce, usuń przedsionki i obważ serce (lewa i prawa komora bez przedsionków).</li>
	<li>Oddziel lewą komorę od prawej, pozostawiając przegrodę do lewej części komory. Zważyć obie próbki tkanek i zamrozić je w ciekłym azocie.</li>
</ol>

<ol><li>Molinari, F., Malara, N., Mollace, V., Rosano, G., Ferraro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cardiac+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cardiac cachexia.</a> Int. J. Cardiol. 219 (15), 105-110 (2016).</li>
<li>Tarnavski, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+surgical+models+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse surgical models in cardiovascular research.</a> Methods. Mol. Biol. 573, 115-137 (2009).</li>
<li>Verma, S. K., Krishnamurthy, P., Kishore, R., et al. Transverse aortic constriction: a model to study heart failure in small animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerma%2C+SK+%22Manual+of+Research+Techniques+in+Cardiovascular+Medicine%22">Manual of Research Techniques in Cardiovascular Medicine</a>. Ardehali, H. , Wiley, J., & Sons. 164-169 (2014).</li>
<li>Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+models+of+heart+failure.+Development+of+novel+therapies%2C+past+and+present%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Small animal models of heart failure. Development of novel therapies, past and present.</a> Circ. Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).</li>
<li>Rockman, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (18), Erratum in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Page 9907 8277-8281 (1991).</li>
<li>Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S., Threadgill, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+response+to+pressure+overload+in+129S1%2FSvImJ+and+C57BL%2F6J+mice%3A+temporal-+and+background-dependent+development+of+concentric+left+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292 (5), 2119-2130 (2007).</li>
<li>Deschepper, C. F., Olson, J. L., Otis, M., Gallo-Payet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+blood+pressure+and+morphological+traits+in+cardiovascular-related+organs+in+13+different+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of blood pressure and morphological traits in cardiovascular-related organs in 13 different inbred mouse strains.</a> J. Appl. Physiol. 97 (1), 369-376 (2004).</li>
<li>Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3164086/">Transverse aortic constriction in mice.</a> J. Vis. Exp. (38), April 21 (2010).</li>
<li>Hu, P., Zhang, D., Swenson, L., Chakrabarti, G., Abel, E. D., Litwin, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+invasive+aortic+banding+in+mice%3A+effects+of+altered+cardiomyocyte+insulin+signaling+during+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285 (3), 1261-1269 (2003).</li>
<li>Faerber, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20447656">Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: Reduced peroxisome proliferator-activated receptor ϒ coactivator levels and mitochondrial dysfunction.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (2), 492-500 (2011).</li>
<li>Andersen, N. M., Tang, R., Li, L., Javan, H., Zhang, X. Q., Selzman, C. H. <a target="_blank" href="http://pubmedcentralcanada.ca/pmcc/articles/PMC3402700/">IKK-β inhibition prevents adaptive left ventricular hypertrophy.</a> J. Surg. Res. 178 (1), 105-109 (2012).</li>
<li>Nemska, S., Monassier, L., Gassmann, M., Frossard, N., Tavakoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+mRNA+profiling+in+a+rat+model+of+left+ventricular+hypertrophy+reveals+early+expression+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Kinetic mRNA profiling in a rat model of left ventricular hypertrophy reveals early expression of chemokines and their receptors.</a> PLoS ONE. 11 (8), 0161273(2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiographic+assessment+of+LV+hypertrophy+and+function+in+aortic-banded+mice%3A+necropsy+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Echocardiographic assessment of LV hypertrophy and function in aortic-banded mice: necropsy validation.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (5), 1703-1708 (2002).</li>
<li>Stansfield, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+model+to+independently+study+regression+of+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a model to independently study regression of ventricular hypertrophy.</a> J. Surg. Res. 142 (2), 387-393 (2007).</li>
<li>Beetz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+biglycan+attenuates+cardiac+hypertrophy+and+fibrosis+after+left+ventricular+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Ablation of biglycan attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis after left ventricular pressure overload.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 101, December 145-155 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Celem tego protokołu jest przedstawienie krok po kroku ilustracji techniki chirurgicznej minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy. Szczegółowy opis techniczny poprzecznego zwężenia aorty u myszy został opisany przez innych autorów 2,8. Jednak ci badacze wykonują operację po intubacji i wentylacji zwierząt. Zastosowanie dodatkowego etapu intubacji-wentylacji zwiększa złożoność i czas trwania całej procedury oraz globalny stres, na jaki narażone j...

W ciągu ostatnich lat badania nad niewydolnością serca były prowadzone na realnych modelach zwierzęcych1. W porównaniu z dużymi modelami zwierzęcymi niewydolności serca, małe modele zwierzęce mają wiele potencjalnych zalet. Oprócz niższych kosztów utrzymania i utrzymania, modele małych zwierząt są dostępne dla większej liczby badaczy ze względu na mniej skomplikowane potrzebne udogodnienia2.
Modele niewydolności serca myszy oferują wiele takich samych zalet jak modele szczurze. Oprócz obniżonych kosztów utrzymania3, modele myszy korzystają z dostępności odpowiednich szczepów transgenicznych i nokautujących (KO). Możliwość specyficznych dla typu komórki, indukowalnych KO lub strategii transgenicznych sprawia, że mysz jest nieocenionym narzędziem do badania patogenezy niewydolności serca i prób zidentyfikowania nowych schematów terapeutycznych3.
Wśród obecnie używanych mysich modeli niewydolności serca4, poprzeczne zwężenie aorty (TAC), które po raz pierwszy zostało opisane przez Rockmana5 jest preferowanym modelem do generowania przerostu lewej komory (LVH) wywołanego przeciążeniem ciśnieniowym1,3. Największą zaletą tego modelu jest możliwość umożliwienia stratyfikacji LVH2, chociaż przebudowa lewej komory w odpowiedzi na TAC jest zmienna wśród różnych szczepów myszy. W szczególności myszy C57BL/6 rozwijają szybką dylatację LV po TAC, która może nie wystąpić w przypadku innych szczepów4,6,7.
Nagłe pojawienie się nadciśnienia osiągnięte za pomocą TAC powoduje około 50% wzrost masy LV w ciągu 2 tygodni, co pozwala na szybkie zbadanie aktywności interwencji farmakologicznych lub molekularnych mających na celu modulację rozwoju LVH4. Ostra indukcja ciężkiego nadciśnienia tętniczego przez TAC nie odtwarza dokładnie postępującego przerostu i przebudowy lewej komory obserwowanego w warunkach klinicznych zwężenia zastawki aortalnej lub nadciśnienia tętniczego. Niemniej jednak model ten jest używany przez wielu badaczy do identyfikacji i modyfikacji nowych celów terapeutycznych w niewydolności serca4.
Wykonywanie TAC u myszy wymaga większej wiedzy chirurgicznej niż ta wymagana dla innych technik stosowanych do wywoływania LVH i późniejszej niewydolności serca2. Większość autorów przeprowadza tę procedurę poprzez intubację i wentylację zwierzęcia2,8, co sprawia, że procedura ta jest bardziej wymagająca i czasochłonna oraz zwiększa obciążenie chirurgiczne dla zwierzęcia. Tylko nieliczni badacze zastosowali minimalnie inwazyjny TAC w swoich badaniach z krótkim odniesieniem do procedury chirurgicznej9,10,11.
Celem tego protokołu jest opisanie krok po kroku uproszczonej i przyjaznej dla użytkownika techniki minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy, podkreślając krytyczne etapy procedury. Postępując zgodnie z tymi kluczowymi krokami, można łatwo wykonać tę technikę.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Olympus</td><td>SZX2-TR30</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do golenia</td><td>Rowenta</td><td>Nomad TN3650FO</td><td></td></tr><tr><td><mocne>szwy:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropylen 7/0</td><td>Ethicon</td><td>BV-1X</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylen 6/0</td><td>BBraun</td><td>C0862061</td><td></td></tr><tr><td>Jedwab 6/0 ligatura&nbsp;</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylen 4/0</td><td>Ethicon</td><td>8683</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylen 5/0</td><td>Ethicon</td><td>Z303</td><td></td></tr><tr><td>Drugs:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td></td><td>Merial Imalg&egrave; ne 1000, LBM154AD</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Rompun 2%, KP09PPC</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Ceva</td><td>Vetergesic, 072013</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty:&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do kości</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>16101-10</td><td></td></tr><tr><td>Pomoce do podwiązania</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>18062-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do wiązania</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>18026-10</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły Precyzyjne</td><td>narzędzia chirurgiczne</td> Crile-Wood <td>12003-15</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze mikrochirurgiczne&nbsp;</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do mikrochirurgii&nbsp;</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły do mikrochirurgii</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki mikrochirurgiczne</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>91501-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>14511-15</td><td></td></tr><tr><td>Nóż z 11 ostrzami</td><td>Fine Surgical Narzędzia</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstrakcja i qPCR: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Euromedex</td><td>TR-118-200</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>74704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorymetryczny test RNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034622</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Nano</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw cDNA o dużej pojemności</td><td>Fisher Scientific</td><td>10400745</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Master Mix</td><td>Fisher Scientific</td><td>10157154</td><td></td></tr><tr><td>Startery Taqman BNP Fisher</td><td>Scientific</td><td>Mm01255770_g1</td><td></td></tr><tr><td>Startery ANP Taqman</td><td>Fisher Scientific</td><td>Mm01255747_g1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady Taqman ACE</td><td>Fisher Scientific</td><td>Mm00802048_m1</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady Taqman Col1a1&nbsp;</td><td>Podkłady Fisher Scientific</td><td>Mm00801666_g1</td><td></td></tr><tr><td>Taqman TGFb</td><td>Podkłady Fisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gapdh Fisher</td><td>Scientific</td><td>Mm99999915_g1</td><td></td></tr><tr><td>ABIPrism&nbsp; Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>7000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td></td></tr><tr><td>karma dla zwierząt</td>Kompletna dieta dla dorosłych szczurów/<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>myszy</td><td>Bezpieczny</td><td>UB220610R</td><td></td></tr></tbody></table>

technika minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu indukcji przerostu lewej komory

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest jedną z najczęściej stosowanych technik chirurgicznych do eksperymentalnego badania przerostu lewej komory (LVH) wywołanego przeciążeniem ciśnieniowym i jego progresji do niewydolności serca. W większości zgłoszonych badań procedura ta jest wykonywana z intubacją i wentylacją zwierzęcia, co czyni ją wymagającą i czasochłonną oraz zwiększa obciążenie chirurgiczne zwierzęcia. Celem tego protokołu jest opisanie uproszczonej techniki minimalnie inwazyjnego TAC bez intubacji i wentylacji myszy. Nacisk kładziony jest na krytyczne etapy techniki w celu osiągnięcia niskiej śmiertelności i wysokiej skuteczności w indukowaniu LVH.
Samce myszy C57BL/6 (10-tygodniowe, 25-30 g, n=60) zostały znieczulone pojedynczym dootrzewnowym wstrzyknięciem mieszaniny ketaminy i ksylazyny. U spontanicznie oddychającego zwierzęcia po częściowej sternotomii 3-4 mm górnej, odcinek jedwabnego szwu 6/0 przewleczonego przez oczko pomocy do podwiązania został przeprowadzony pod łukiem aorty i zawiązany na igle o rozmiarze 27. Zwierzęta operowane pozorowo przechodziły ten sam preparat chirurgiczny, ale bez zwężenia aorty. O skuteczności zabiegu w indukcji LVH świadczy znaczny wzrost stosunku masy serca do masy ciała. Stosunek ten uzyskuje się w 3, 7, 14 i 28 dniu po operacji (n = 6 - 10 w każdej grupie i każdym punkcie czasowym). Korzystając z naszej techniki, LVH obserwuje się w TAC w porównaniu ze zwierzętami pozorowanymi od 7 do 28 dnia. Śmiertelność operacyjna i śmiertelność pod koniec (powyżej 28 dni) jest bardzo niska i wynosi 1,7%.
Podsumowując, nasza opłacalna technika minimalnie inwazyjnego TAC u myszy zapewnia bardzo niską śmiertelność operacyjną i pooperacyjną oraz jest wysoce skuteczna w indukowaniu LVH. Upraszcza to procedurę operacyjną i zmniejsza obciążenie zwierzęcia. Można to łatwo wykonać, wykonując krytyczne kroki opisane w tym protokole.

Przeżywalność śródoperacyjna i późna 
Przeżywalność śródoperacyjna była bardzo wysoka i wyniosła 98,3% (59 z 60) dla całej serii (zwierzęta poddane TAC oraz operacjom pozorowanym). Jedyny zgon śródoperacyjny był wynikiem powikłań krwotocznych u myszy przeznaczonej do operacji pozorowanej. Przeżywalność pooperacyjna w okresie obserwacji trwającym 28 dni była również doskonała i wyniosła 98,3% (58 z 59). Jedyny późny zgon pooperacyjny wystąpił u myszy po TAC w dniu (D) 1...

Celem tego protokołu jest opisanie krok po kroku techniki minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty (TAC) u myszy. Poprzez wyeliminowanie intubacji i wentylacji, które są obowiązkowe w powszechnie stosowanej procedurze standardowej, minimalnie inwazyjny TAC upraszcza procedurę operacyjną i zmniejsza obciążenie zwierzęcia.

Technika minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu indukcji przerostu lewej komory

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przeprowadzenie małoinwazyjnego zabiegu poprzecznego zwężenia aorty u myszy. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące implementacji poprzecznego zwężenia aorty u myszy, na przykład w kwestii tworzenia przejścia pod łukiem aorty. Głównymi zaletami tej techniki są jej prostota, łatwość wykonania oraz brak konieczności intubacji i wentylacji myszy.Procedurę zaprezentuję wraz z doktorantką Simoną Nemską, która przeprowadzi etapy przedoperacyjnego przygotowania zwierzęcia oraz pooperacyjnej obserwacji. W dniu zabiegu należy ogolić szyję i klatkę piersiową znieczulonej myszy, a następnie zdezynfekować odsłoniętą skórę 70% etanolem. Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez test uszczupnięcia palca, należy unieruchomić zwierzę w pozycji grzbietowej na czystej podkładce korkowej.Następnie, używając ostrza skalpela nr 11, wykonaj 10-milimetrowe podłużne nacięcie w linii środkowej szyi, od wcięcia nadmostkowego do środka klatki piersiowej, aby odsłonić mostek. Za pomocą igłotrzymacza Crile-Wooda przeprowadź monofilamentowy szew stabilizujący z polipropylenu 4-0, aby odsunąć tarczycę. Następnie przymocuj szew taśmą do podkładki roboczej.Następnie przesuń podkładkę roboczą pod mikroskop chirurgiczny i za pomocą pęsety mikrosurgicalnej tępo rozdziel mięśnie przedtchawicze, aby odsłonić tchawicę. Ostrożnie wsuń zamknięte końcówki zakrzywionej pęsety mikrosurgicalnej nad tchawicę i za mostkiem, a następnie ostrożnie otwieraj i zamykaj zakrzywioną pęsetę, aby tępo rozdzielić opłucną. Użyj prostej pęsety mikrosurgicalnej, aby chwycić prawe mięśnie nadobojczykowe i delikatnie unieść klatkę piersiową.Wsuwając dolną końcówkę kleszczy do kości pod mostek, należy wykonać górną częściową sternotomię o szerokości od trzech do czterech milimetrów, kierując dolną część mini-sternotomii lekko w lewo. Za pomocą mikrosurgicalnego holderów do igieł należy przeprowadzić monofilamentową nić polipropylenową 7-0 jako szew stabilizujący od wewnątrz na zewnątrz drugiej przestrzeni międzyżebrowej po każdej stronie mini-sternotomii. Do rozszerzenia brzegów mostka po obu stronach należy użyć monofilamentowych nici polipropylenowych 7-0 jako szwów stabilizujących.Następnie za pomocą zakrzywionej pęsety ostrożnie odsuń mięśnie przedkrtaniowe, tłuszcz śródpiersia oraz grasicę, aby uwidocznić łuk aorty przy małym powiększeniu. Aby odsłonić tkankę miękką pod łukiem aorty, wprowadź pod łuk pęsetę do wiązania z zamkniętymi końcami, a następnie delikatnie je rozchyl. Użyj drugiej pęsety do wiązania, aby utworzyć tunel w tkance miękkiej pod łukiem aorty, delikatnie otwierając i zamykając pęsetę w obrębie tkanki.Następnie przećwić kawałek jedwabnej nici chirurgicznej 6-0 przez oczko przyrządu do ligacji pod łuk aorty, używając pęsety chirurgicznej, aby wyciągnąć szew z przestrzeni między odejściem prawej tętnicy szyjnej wspólnej a lewej tętnicy szyjnej wspólnej. Najtrudniejszym etapem procedury jest wsunięcie szwu pod łuk aorty. Zachowanie należytej staranności podczas tworzenia tunelu pod łukiem ułatwi późniejsze umieszczenie szwu.Następnie za pomocą pęsety prostej należy umieścić tęponą igłę 27G obok łuku aorty, a następnie za pomocą dwóch pęset wiążących ciasno zawiązać szew wokół igły i aorty pomiędzy prawą tętnicą bezimienną a lewą tętnicą szyjną wspólną. Po zabezpieczeniu szwu należy szybko, lecz delikatnie usunąć igłę, aby uzyskać zwężenie o średnicy 0,4 milimetra i powtarzalną poprzeczną konstrikcję aorty o stopniu 65 do 70%. Po potwierdzeniu hemostazy należy usunąć monofilamentowe szwy stabilizujące z polipropylenu 7-0, które służyły do rozszerzenia krawędzi mostka.Za pomocą mikrosurgicalnego uchwytu do igieł przeprowadź prosty szew monofilamentowy z polipropylenu 6-0 od strony zewnętrznej do wewnętrznej lewej drugiej przestrzeni międzyżebrowej oraz od strony wewnętrznej do zewnętrznej prawej drugiej przestrzeni międzyżebrowej. Użyj uchwytu do igieł Crile-Wood, aby zbliżyć brzegi mostka za pomocą monofilamentowego szwu polipropylenowego 6-0. Następnie zamknij skórę jednym szwem ciągłym z monofilamentowego polipropylenu 5-0, używając uchwytu do igieł Crile-Wood.Następnie umieść zwierzę z powrotem w klatce w pozycji brzusznej, zapewniając ogrzewanie i monitorowanie aż do pełnego wybudzenia. Skuteczność indukcji przerostu lewej komory można potwierdzić, porównując stosunki masy serca do masy ciała zwierząt z grupy kontrolnej (sham) oraz zwierząt doświadczalnych w trzeciej, siódmej, czternastej i dwudziestej ósmym dobie po operacji. Stosunek ten ulega znacznemu zwiększeniu u zwierząt z opaską w porównaniu z grupami kontrolnymi od siódmej doby po operacji i pozostaje znacząco wyższy u zwierząt z przyciasną opaską aż do 28. doby po zabiegu.Obserwowany wzrost stosunku masy serca do masy ciała wynika wyłącznie ze wzrostu stosunku masy lewej komory do masy ciała, podczas gdy stosunek masy prawej komory do masy ciała pozostaje porównywalny pomiędzy zwierzętami z wykonaną poprzeczną konstrikcją aorty a zwierzętami z grupy operacji pozorowanej (sham) przez cały okres obserwacji. Ponadto ekspresja mRNA peptydu natriuretycznego mózgu, będącego kontrolą pozytywną przerostu mięśnia sercowego w lewych komorach, jest znacznie wyższa u zwierząt z podwiązaną aortą w porównaniu z kontrolnymi zwierzętami z grupy operacji pozorowanej w 14. dniu, co dodatkowo potwierdza skuteczność tej techniki. Po opanowaniu metoda ta może zostać wykonana w 20 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest użycie pomocniczego narzędzia do ligacji oraz kleszczyków wiążących podobnych do tych zastosowanych w naszym protokole. Po opracowaniu technika ta zapewniła wiarygodny i uproszczony model do badania mechanizmów zaangażowanych w powstawanie przerostu lewej komory indukowanego przeciążeniem ciśnieniowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić małoinwazyjną poprzeczną konstrikcję aorty u myszy, ze szczególnym uwzględnieniem przejścia pod łukiem aorty.Należy pamiętać, że utworzenie przejścia pod łukiem aorty jest najkrytyczniejszym etapem procedury, a zastosowanie pomocy do ligacji oraz kleszczyków do wiązania znacznie zmniejsza ryzyko uszkodzenia łuku.

technique-minimally-invasive-transverse-aortic-constriction-mice-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw przerostu mięśnia sercowego i rozwoju niewydolności serca. W niniejszym materiale opisujemy procedury zwężania aorty w celu wywołania powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

W tym filmie demonstrujemy eksperymentalny protokół minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu zbadania niewydolności serca wywołanej przeciążeniem ciśnieniem.

Pasaż poprzecznego łuku aorty w modelu mysim: minimalnie inwazyjna technika u myszy do indukcji wysokiego ciśnienia w lewej komorze

Opisujemy stopniową procedurę tworzenia przeciążenia ciśnieniowego i przerostu lewej komory u szczurów Wistar poprzez zwężenie aorty wstępującej za pomocą małego metalowego klipsa. Model ten jest szeroko stosowany do badania zmian przebudowy podczas przerostu mięśnia sercowego oraz do identyfikacji i oceny strategii regresji takich zmian.

Zwężenie aorty wstępującej u szczurów w celu stworzenia modelu przerostu mięśnia sercowego spowodowanego przeciążeniem ciśnieniem

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Celem tego protokołu jest nieinwazyjna ocena zmian strukturalnych i funkcjonalnych w mysim modelu choroby serca powstałych w wyniku poprzecznego zwężenia aorty, przy użyciu echokardiografii w trybie B i M oraz obrazowania dopplerowskiego kolorem/falą tętna.

Ocena zmian morfologicznych i czynnościowych serca w mysim modelu poprzecznego zwężenia aorty za pomocą obrazowania echokardiograficznego

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty (MTAC) zachowuje podstawowe cechy regularnego poprzecznego zwężenia aorty (TAC), eliminując jednocześnie użycie respiratora z intubacją tchawiczą. Okazuje się, że jest to wysoce pożądana metoda w wysokoprzepustowych badaniach przeciążenia lewej komory, szczególnie w badaniach translacyjnych.

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Tutaj prezentujemy protokół poprzecznego zwężenia aorty (TAC) za pomocą torakotomii bocznej. Technika ta jest minimalnie inwazyjnym, zamkniętym zabiegiem chirurgicznym klatki piersiowej, mającym na celu symulację przeciążenia ciśnieniem i niewydolności serca u myszy wykorzystujących standardowe warunki laboratoryjne TAC.

Model z zamkniętą klatką piersiową do wywoływania poprzecznego zwężenia aorty u myszy

Tutaj oferujemy użyteczne podejście do badania mechanizmu niewydolności prawej komory. Wygodniejsze i skuteczniejsze podejście do zwężenia tętnicy płucnej ustala się za pomocą narzędzi chirurgicznych wykonanych we własnym zakresie. Ponadto przedstawiono metody oceny jakości tego podejścia za pomocą echokardiografii i cewnikowania.

Indukcja niewydolności prawej komory przez zwężenie tętnicy płucnej i ocena funkcji prawej komory u myszy

Tutaj opisujemy krok po kroku protokół chirurgicznego usuwania aorty w dobrze znanym mysim modelu zwężenia aorty. Procedura ta pozwala nie tylko na zbadanie mechanizmów leżących u podstaw odwrotnej przebudowy lewej komory i regresji przerostu, ale także na przetestowanie nowych opcji terapeutycznych, które mogą przyspieszyć powrót do zdrowia mięśnia sercowego.

Badanie odwrotnej przebudowy lewej komory przez odpasowanie aorty u gryzoni

Ten protokół przedstawia ulepszoną metodę uzyskiwania przejściowego przerostu mięśnia sercowego za pomocą wchłanialnego szwu, symulując zmniejszenie przerostu lewej komory po usunięciu przeciążenia ciśnieniowego. Może to być cenne dla badań nad wstępnym kondycjonowaniem przerostu mięśnia sercowego.

Operacyjne poprzeczne zwężenie aorty z wchłanialnym szwem w celu uzyskania przejściowego przerostu mięśnia sercowego

Obecny protokół opisuje zmodyfikowaną i uproszczoną technikę z minimalnie inwazyjną procedurą poprzecznego zwężenia aorty (TAC) przy użyciu samodzielnie wykonanego retraktora. Procedura ta może być przeprowadzona bez respiratora lub mikroskopu i wprowadza przeciążenie ciśnieniem, ostatecznie prowadząc do przerostu serca lub niewydolności serca.

Zmodyfikowana technika poprzecznego zwężenia aorty u myszy

Poznaj minimalnie inwazyjną technikę poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu indukcji przerostu lewej komory. Ta metoda eliminuje potrzebę intubacji i wentylacji, upraszczając procedurę chirurgiczną.

Technika minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu indukcji przerostu lewej komory

Przeglądaj więcej filmów