Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem tej procedury jest bezpieczne i łatwe wykonywanie seryjnych ultracienkich przekrojów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, dostarczając ilościowych i trójwymiarowych informacji strukturalnych całej komórki na poziomie mikroskopii elektronowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że seryjne ultracienkie cięcie można wykonać bez drogiej maszyny, a tą metodą można uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości.

Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść powierzchnię szkiełka podstawowego. Następnie zanurzyć połowę szkiełka w 1,5% roztworze Formvar w górnej kolumnie aparatu do produkcji filmu wspomagającego Formvar, przeciskając roztwór z powietrzem przez trójdrożny kran za pomocą gumowej kulki. Spuść roztwór z kolumny, otwierając trójdrogowy kran i wypuszczając powietrze w celu zmniejszenia ciśnienia.

Następnie wyjmij szkiełko z aparatu i wysusz na powietrzu, aby utworzyć film na powierzchni szkiełka. Zeskrob cztery krawędzie folii na szklanym szkiełku żyletką. Po wdychaniu na szkiełko, aby ułatwić oddzielenie folii od szkiełka, należy spłynąć z folii, powoli zanurzając szklane szkiełko w wodzie pod małym kątem poziomym.

Następnie zbierz folię Formvar z wody za pomocą aluminiowego stojaka z otworami. Aby przyciąć blok próbki za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania i żyletki pod mikroskopem stereoskopowym, najpierw upewnij się, że na powierzchni bloku znajdują się komórki, obserwując końcówkę bloku za pomocą mikroskopu świetlnego. Następnie zamontuj blok próbki w uchwycie i zamontuj uchwyt na stoliku do przycinania.

Przytnij bloki do rozmiaru 0,7 na 1,0 milimetra. Jeśli żywica epoksydowa jest bardzo twarda, najpierw przytnij pudełko za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania, a następnie przytnij blok żyletką. Wytnij jedno ramię, aby zaznaczyć kierunek cięcia.

Aby przyciąć blok próbki za pomocą noża diamentowego za pomocą mikrotomu, ustaw uchwyt bloku próbki w uchwycie próbki ultramikrotomu. Wytnij powierzchnię bloku za pomocą diamentowego noża do przycinania. Ustaw krawędź noża diamentowego równolegle do powierzchni bloku próbki i przyciąć minimalną powierzchnię próbki, aby nie zgubić żadnej próbki.

Wytnij lewą krawędź bloku za pomocą noża do przycinania, obracając nóż stage o 30 stopni w lewo. Ta krawędź staje się górną stroną próbki w sekcji szeregowej. Następnie odetnij powierzchnię bloku na około 100 mikronów od lewej krawędzi próbki, obracając stolik noża o 30 stopni w prawo.

Ta krawędź staje się dolną stroną próbki w sekcji seryjnej. Wyjmij nóż do przycinania i obróć blok próbki o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Ustaw ultracienki nóż do cięcia na etapie noża.

Wyreguluj powierzchnię próbki i krawędź noża tak, aby były skierowane równolegle do siebie, wykorzystując dużą część powierzchni próbki. Następnie nałóż taśmę na uchwyt i uchwyt uchwytu mikrotomu i przetnij taśmę na granicy. Wyjmij uchwyt próbki z mikrotomu i umieść go pod mikroskopem stereoskopowym.

Odetnij dużą część próbki żyletką, pozostawiając cienką część, z której zostaną uzyskane sekcje seryjne Spraw, aby boki sekcji przykleiły się za pomocą pipety Pasteura, aby upuść około jednego mikrolitra 0,5% roztworu neoprenu na próbkę, która ma być użyta do seryjnego cięcia. Następnie przykryj całą próbkę roztworem neoprenu. Nadmiar roztworu neoprenu należy natychmiast wchłonąć za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej umieszczonego w pobliżu próbki.

Następnie przygotuj trzy siatki szczelinowe do pobierania sekcji szeregowych. Aby to zrobić, zegnij uchwyt kratek pod kątem 60 stopni i potraktuj kratki 0,5% roztworem neoprenu. Następnie spraw, aby siatki były hydrofilowe przez wyładowanie jarzeniowe.

Umieść uchwyt bloku próbki z powrotem w mikrotomie w tej samej pozycji, wyrównując zaklejone części. Dzięki temu czoło bloku i krawędź noża są idealnie równoległe do siebie. Następnie zbliż nóż do próbki.

Po napełnieniu łódki z nożem wodą przykryj mikrotom plastikową osłoną, aby zapobiec przepływowi powietrza. Rozpocznij cięcie próbki o grubości przekroju 200 nanometrów. Po wycięciu pierwszej sekcji ustaw grubość przekroju na 70 nanometrów.

Gdy liczba sekcji szeregowych osiągnie 20, ustaw grubość przekroju na 10 nanometrów. Ponieważ mikrotom nie może ciąć odcinków o grubości 10 nanometrów, nie pojawia się żadna nowa sekcja, a wcześniej przycięte odcinki zostają oddzielone od krawędzi noża. Następnie ustaw grubość przekroju na 60 nanometrów.

W ten sposób uzyskane zostaną odcinki o długości 70 nanometrów, ponieważ maszyna doda poprzednie 10 nanometrów grubości. Na koniec ustaw grubość przekroju z powrotem na 70 nanometrów i kontynuuj cięcie, aż uzyskasz odcinki o długości 1,8 milimetra. Aby podnieść sekcje szeregowe, najpierw umieść pętlę przytrzymującą sekcję w trzeciej grupie sekcji.

Następnie umieść pętlę podnoszącą powierzchnię wody na stoliku noża. Umieść pętlę WSRL tuż nad sekcjami szeregowymi, przesuwając jej wałek i uchwyt. Opuść pętlę WSRL na powierzchnię wody tak, aby pętla otaczała sekcje.

Wciśnij pętlę w dół, przekręcając w dół, tak aby powierzchnia wody została podniesiona przez napięcie powierzchniowe. Przesuń sekcję do środka pętli. Umieść go na wierzchołku wody i dostosuj kierunek sekcji za pomocą pasma włosów.

Podnieś grupy sekcji, dotykając ich gołą siatką szczelinową, w której pomaga pęseta i jest trzymana równolegle do powierzchni wody. Umieść kratki z sekcjami wraz z niewielką kroplą wody na folii nośnej Formvar. Usuń nadmiar wody za pomocą bibuły filtracyjnej.

Po całkowitym wyschnięciu skrawków rozerwij folię Formvar wokół kratek; i usuń kratki nośne sekcje. Ustaw siatki w rowku probówki barwiącej w odpowiedniej kolejności i zabarwij skrawki octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Ustaw pięć siatek w uchwycie na wiele próbek we właściwej kolejności, ustawiając długą oś szczeliny siatki prostopadle do osi uchwytu na próbki.

Zamocuj siatkę za pomocą mocowników do siatki i włóż uchwyt próbki do transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Przystąp do robienia zdjęć komórek docelowych i wszystkich sekcji komórek w dużym powiększeniu. Pokazany tutaj jest widok w małym powiększeniu pięciu siatek, które zawierają sekcje szeregowe.

Na jednej siatce zamontowano 18-25 sekcji. Należy pamiętać, że sekcje są połączone ze sobą i mają tę samą grubość. Pokazano tutaj seryjne odcinki miogenezy okopikarionowej.

Rysunek przedstawia 12 z 67 pełnych sekcji. Okazało się, że komórka ta ma duży nukleoid składający się z nagich włókien DNA z pojedynczą błoną nukleoidową i endosymbiontami, które przypominają bakterie, ale nie mają mitochondriów. Tak więc organizm ten wydaje się być pośrednią formą życia ewoluującą od prokariota do eukarionta.

Pokazane tutaj są seryjne odcinki Escherichia coli. Rysunek przedstawia 12 pełnych sekcji. Co ciekawe, okazało się, że komórka ta zawiera 21 700 rybosomów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć seryjne ultracienkie sekcje. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.