Name: Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Naucz się metody otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej bez drogiego sprzętu. Technika ta dostarcza ilościowych i trójwymiarowych informacji strukturalnych całych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Serdecznie dziękujemy Shigeo Kita za cenne sugestie i dyskusję. Dziękujemy również Johnowi i Sumire Ecksteinom za krytyczną lekturę manuskryptu.

UWAGA: Próbki użyte w tym badaniu to mikroorganizmy, szybko zamrożone propanem w ciekłym azocie, zamrożone podstawione acetonem zawierającym 2% tetratlenku osmu i zatopione w żywicy epoksydowej1,2,3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.
1. Przygotowanie filmu wspierającego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-3)
UWAGA: Folia nośna Formvar w kolorze srebrnym jest przygotowywana metodą odlewania na szkle19.
<ol>
	<li>Dodaj 100 ml 1,5% Formvaru w dichlorku etylenu do aparatu do produkcji Formvaru (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). Zanurzyć połowę szkiełka podstawowego (76 mm x 26 mm x 1,3 mm) w roztworze Formvar w górnej kolumnie aparatu, przeciskając roztwór z powietrzem przez "a" za pomocą gumowej kulki19.
	<ol>
		<li>Spuść roztwór z kolumny, otwierając trójdrogowy kran i wypuszczając powietrze przez "b" w celu zmniejszenia ciśnienia. Wyjmij szkiełko z aparatu i wysusz na powietrzu, aby utworzyć film na powierzchni szkiełka. Użyj żarówki, aby przyspieszyć suszenie folii Formvar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zeskrobaniu czterech krawędzi folii ze szkiełka za pomocą żyletki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2a) i wdychaniu na szkiełko, aby ułatwić oddzielenie folii od szkiełka20, spuń folię na wodzie, zanurzając szklane szkiełko powoli w wodzie pod niskim kątem poziomym (około 10°, <silna klasa="xfig">Rysunek 2b).</li>
	<li>Zbierz folię Formvar z wody za pomocą aluminiowego stojaka (30 mm x 25 mm x 3 mm) z otworami (o średnicy 4 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3a). Trzymaj stojak z folią Formvar w eksykatorze do czasu użycia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3b).</li>
</ol>
2. Przycinanie bloku próbki za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania i żyletki 21 pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Upewnij się, że na powierzchni bloku znajdują się komórki, obserwując końcówkę bloku za pomocą mikroskopu świetlnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 4a).</li>
	<li>Zamontuj blok próbki w uchwycie (uchwycie bloku) i zamontuj uchwyt na etapie przycinania21 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4b). Ten etap przycinania ma mechanizm podświetlający z tyłu próbki.</li>
	<li>Przytnij blok do rozmiaru 0,7 mm x 1,0 mm (rysunki 4c, 5d). Ponieważ żywica epoksydowa jest bardzo twarda, najpierw przytnij bloki za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania. Ultradźwiękowe ostrze do przycinania to nowo wprowadzona maszyna, a bloki można łatwo przycinać. Następnie przytnij blok dalej za pomocą żyletki. Odetnij jedno ramię, aby zaznaczyć kierunek cięcia (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 5d, <silna klasa="xfig">Rysunek 8).</li>
</ol>
3. Przycinanie bloku próbki za pomocą diamentowego noża za pomocą mikrotomu (<silna klasa="xfig">Rysunek 5)
<ol>
	<li>Umieść uchwyt blokowy próbki w uchwycie próbki ultramikrotomu. Umieść próbkę pod kątem 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara w stosunku do rzeczywistej pozycji, gdy wykonywane jest seryjne cięcie ultracienkie (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 5d).</li>
	<li>Wytnij powierzchnię bloku diamentowym nożem do przycinania (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 5d). Ustaw krawędź noża diamentowego równolegle do powierzchni bloku próbki i przyciąć minimalną powierzchnię próbki, aby nie stracić żadnej próbki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5d). 
	UWAGA: Ten krok ma na celu wygładzenie powierzchni próbki. Część powierzchni próbki smukłej części pozostaje nienaruszona (dlatego ta część nie świeci jak lustro, <silna klasa="xfig">Rysunek 5d), aby nie stracić żadnej części próbki do seryjnego cięcia. Dzieje się tak, ponieważ próbka jest odsłonięta na powierzchni bloku.</li>
	<li>Umieść lustro (Mesa cut, M) na stoliku noża, aby monitorować cięcie bloku próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 5c).</li>
	<li>Przytnij lewą krawędź (staje się to górną stroną, <silna klasa="xfig">Rysunek 5d, próbki w przekroju seryjnym) bloku za pomocą noża do przycinania, obracając stolik noża o 30° w lewo (<silna klasa="xfig">Rysunek 5a).</li>
	<li>Przyciąć powierzchnię bloku w odległości około 100 μm od lewej krawędzi próbki (staje się to dolną stroną próbki w przekroju seryjnym, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 5d), obracając stolik noża o 30° w prawo (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 5b). 
	UWAGA: Sekcje seryjne zostaną wycięte z cienkiej części próbki o wymiarach około 90 nm x około 1 mm. Duża część zostanie wykorzystana do regulacji powierzchni próbki i krawędzi noża tak, aby były równoległe. Po ustawieniu powierzchni próbki tak, aby była równoległa do krawędzi noża, duża część zostanie usunięta za pomocą żyletki. Przecinając górną i dolną stronę próbki za pomocą mikrotomu, obie strony próbki stają się gładkie i dokładnie równoległe do siebie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5d), co jest konieczne, aby uzyskać proste i nieprzerwane odcinki wstążki.</li>
</ol>
4. Dostosowanie powierzchni próbki i krawędzi noża tak, aby były zwrócone równolegle do siebie 21
<ol>
	<li>Wyjmij nóż do przycinania i obróć blok próbki o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara.</li>
	<li>Ustaw ultracienki nóż do cięcia na etapie noża.</li>
	<li>Wyreguluj powierzchnię próbki i krawędź noża tak, aby były skierowane równolegle do siebie, wykorzystując dużą część powierzchni próbki. 
	UWAGA: Duża część próbki służy do regulacji, ponieważ powierzchnia tnąca cięcia seryjnego jest tak mała, co utrudnia regulację powierzchni próbki i krawędzi noża tylko za pomocą tej części, szczególnie w kierunku pionowym. W ten sposób użycie dużej części próbki ułatwia regulację.</li>
</ol>
5. Rozprowadzanie roztworu neoprenu na bloku próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 6)
<ol>
	<li>Aby umieścić uchwyt na próbkę dokładnie w tej samej pozycji, co pozycja pierwotna, nałóż taśmę na uchwyt i uchwyt uchwytu mikrotomu i przyciąć na granicy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6a).</li>
	<li>Wyjmij próbkę z mikrotomu i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 6b). Odetnij dużą część próbki żyletką, pozostawiając smukłą część, z której zostaną uzyskane sekcje seryjne.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura upuść około 1 μl 0,5% roztworu neoprenu (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 6b) na próbkę, która ma być użyta do seryjnego cięcia, aby boki sekcji były przyklejone. Przykryj całą próbkę roztworem neoprenu. Nadmiar roztworu neoprenu należy natychmiast wchłonąć za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej umieszczonego w pobliżu próbki. Uzyskanie wstęgi sekcji jest niezbędne do robienia zdjęć seryjnych sekcji komórek, a klej neoprenowy jest bardzo przydatny do sklejania sekcji.</li>
	<li>Przygotuj siatki 3-szczelinowe (rozmiary szczelin: środek, 0,4 mm x 2,2 mm, obie strony 0,2 mm x 2,2 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 6c) do zbierania odcinków szeregowych poprzez zginanie uchwytu kratek pod kątem 60°, traktowanie siatek 0,5% roztworem neoprenu i nadanie siatek hydrofilowości przez wyładowanie jarzeniowe22.</li>
</ol>
6. Tworzenie sekcji szeregowych (Rysunek 7-9)
<ol>
	<li>Umieść uchwyt bloku próbki z powrotem w mikrotomie w tej samej pozycji, co 5.1 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6a), wyrównując zaklejone części. Dzięki temu czoło bloku i krawędź noża są idealnie równoległe do siebie. Następnie zbliż nóż do próbki.</li>
	<li>Napełnij łódź z nożem wodą.</li>
	<li>Przykryj mikrotom plastikową osłoną, aby zapobiec przepływowi powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 7). 
	UWAGA: Przepływ powietrza podczas ultracienkiego cięcia i pobierania skrawków często powoduje problemy. Plastikowa osłona ma trzy otwory: jeden otwór jest przeznaczony na soczewki lornetki, a pozostałe dwa otwory są przeznaczone na ramiona, aby umożliwić obsługę, gdy osłona jest założona. Drewniany podłokietnik służy do umieszczania ramion podczas wykonywania delikatnych prac, takich jak pobieranie odcinków szeregowych z siatkami. Drewniany podłokietnik jest umieszczony na innych stołach niż stół do mikrotomów (<silna klasa="xfig">Rysunek 7, strzałki), aby nie przenosić wibracji rąk operatora na mikrotom</li>.
	<li>Rozpocznij cięcie próbki przy grubości przekroju 200 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 8). Ustawienie na grubość 200 nm pozwoli zaoszczędzić czas na zbliżeniu noża do powierzchni próbki.</li>
	<li>Po wycięciu pierwszego przekroju ustaw grubość przekroju na 70 nm (Rysunek 8).</li>
	<li>Gdy liczba odcinków szeregowych osiągnie 20 (dokładnie po tym, jak wstęga osiągnie około 1,8 mm; liczba sekcji zmienia się w zależności od szerokości sekcji), ustaw grubość sekcji na 10 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 8), kontynuując cięcie. 
	UWAGA: Ponieważ mikrotom nie może ciąć odcinków o grubości 10 nm, nie pojawia się żadna nowa sekcja, a poprzednio przycięte odcinki zostają oddzielone od krawędzi noża. Ważne jest, aby uzyskać oddzielone grupy sekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 9) do wybierania odcinków szeregowych, aby uniknąć trudności w ręcznym rozdzielaniu sekcji za pomocą pary pasm włosów. Ponieważ pole widzenia w transmisyjnym mikroskopie elektronowym wynosi 2,0 mm, odcinki powinny mieć co najwyżej 1,8 mm długości.</li>
	<li>Ustaw grubość przekroju na 60 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 8). Spowoduje to wytworzenie odcinków o długości fali 70 nm (<klasa silna="xfig">Rysunek 8), ponieważ maszyna doda poprzednie 10 nm grubości.</li>
	<li>Ustaw grubość przekroju z powrotem na 70 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 8) i kontynuuj cięcie, aż uzyskasz odcinki o długości 1,8 mm.</li>
	<li>Powtarzaj 6.6-6.8, aż uzyskasz pięć odcinków o długości 1,8 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 9). Zwykle wykonujemy pięć grup sekcji, ponieważ w transmisyjnym mikroskopie elektronowym dostępnym w naszym laboratorium jest pięć uchwytów na próbki, ale pięć nie jest limitem.</li>
</ol>
7. Wybieranie sekcji szeregowych (Rysunek 10-12)
<ol>
	<li>Umieść 'Pętlę trzymającą sekcję'23 (Wewnętrzna średnica pętli: 5,0 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 10a) na trzeciej grupie sekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 10b). 
	UWAGA: Konieczne jest pobranie sekcji w kolejności ich przekrojenia, aby zrobić zdjęcia w odpowiedniej kolejności. Ponieważ jednak na łodzi nożowej znajduje się pięć grup sekcyjnych, często mylenie się, które grupy są które. Umieszczając pętlę na trzeciej grupie, staje się jasne, że dwie grupy znajdujące się w pobliżu operatora to pierwsza i druga, a dwie odległe od operatora to czwarta i piąta grupa (<silna klasa="xfig">Rysunek 10b). Zapobiegnie to pomyleniu zamówienia.</li>
	<li>Umieść 'Pętlę podnoszącą powierzchnię wody'23 (WSRL, średnica wewnętrzna pętli: 4.0 mm) (Rysunek 11a) na stoliku noża (<silna klasa="xfig">Rysunek 11b). WSRL będzie stabilnie stał na stoliku noża, ponieważ jest wyposażony w magnes na dole.
	<ol>
		<li>Umieść pętlę WSRL tuż nad sekcjami szeregowymi, przesuwając jej wałek i uchwyt. Opuść pętlę WSRL na powierzchnię wody tak, aby pętla otaczała sekcje.</li>
		<li>Dociśnij pętlę w dół, przekręcając w dół, tak aby powierzchnia wody podniosła się pod wpływem napięcia powierzchniowego (rysunki 11c-d). Przesuń sekcję na środek pętli, umieść ją na wierzchołku wody i dostosuj kierunek sekcji za pomocą pasma włosów21.</li>
		<li>Podnieś grupy sekcji, dotykając ich gołą siatką szczelinową, która jest trzymana przez pęsetę i trzymana równolegle do powierzchni wody (<silna klasa = "xfig">Rysunek 11d). Ważne jest, aby sekcje najpierw dotykały siatki, a nie wody, aby umieszczać sekcje dokładnie na środku siatki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 11d).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kratki z sekcjami wraz z niewielką kroplą wody na folii nośnej Formvar16 (Rysunek 12) i usuń nadmiar wody za pomocą bibuły filtracyjnej. 
	UWAGA: Marszczenie folii nośnej jest często problemem, gdy odcinki są zbierane za pomocą siatki z folią nośną, ponieważ membrana (sekcje) stykają się bezpośrednio z membraną (folią nośną). Problem powstawania zmarszczek na folii nośnej jest znacznie zmniejszony poprzez umieszczenie siatki nośnej przekroju wraz z niewielką kroplą wody na folii nośnej Formvar16.</li>
</ol>
8. Sekcje barwienia16, 24 (Rysunek 13)
<ol>
	<li>Po całkowitym wyschnięciu sekcji oderwij folię Formvar z okolic kratek i usuń kratki, na których znajdują się sekcje.</li>
	<li>Ustaw kratki w rowku probówki do barwienia16 w odpowiedniej kolejności (Rysunek 13), a następnie zabarwić sekcje octanem uranylu i cytrynianem ołowiu24. 
	UWAGA: Wzdłuż długiej osi rurki wyciętej żyletką znajduje się rowek o głębokości 0,6 mm. Rurka jest przydatna do zapobiegania przypadkowemu pęknięciu folii nośnych podczas używania pęsety, ponieważ bezpośrednie obchodzenie się z kratkami nie jest konieczne podczas procesu barwienia i prania16.</li>
</ol>
9. Obserwacja odcinków szeregowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 14)
<ol>
	<li>Ustaw 5 siatek w uchwycie na wiele próbek we właściwej kolejności (<silna klasa="xfig">Rysunek 14a), orientując długą oś szczeliny siatki prostopadle do osi uchwytu próbki. Uchwyty (groty strzałek) kratek nie muszą być przecinane, ponieważ "mocowniki siatki" nie będą dotykać uchwytów.</li>
	<li>Zamocuj siatki za pomocą 'grid-fixers' (<silna klasa="xfig">Rysunek 14b) i włóż uchwyt próbki do transmisyjnego mikroskopu elektronowego. 
	UWAGA: Często przydatne jest wykonywanie zdjęć wszystkich sekcji komórek w małym powiększeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 15), aby znaleźć interesujące mikroorganizmy lub komórki w dobrym stanie, bez zanieczyszczeń i z dobrą fiksacją, przed zrobieniem zdjęć komórki docelowej.</li>
	<li>Rób zdjęcia komórek docelowych we wszystkich sekcjach komórek w dużym powiększeniu.</li>
</ol>

<ol><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis%3A+an+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis%3A+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li>
<li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=17883841">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li>
<li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans%3A+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li>
<li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li>
<li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li>
<li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4309607/">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109(2015).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryote+or+eukaryote%3F+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li>
<li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/cytologia/78/4/78_333/_article">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://protistology.jp/journal/jjp47/JJP47YAMAGUCHI.pdf">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/myco/65/2/65_81/_article/-char/ja/">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li>
<li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li>
<li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast%2C+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. <a target="_blank" href="http://microscopy.or.jp/english/">Guide Book for Electron Microscopy</a>. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).</li>
<li>Hayat, M. A. Support films. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19822298860">Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application</a>. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216(2000).</li>
<li>Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. <a target="_blank" href="http://microscopy.or.jp/english/">Guide Book for Electron Microscopy</a>. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).</li>
<li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+hydrophilicity%2Fhydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+%28Super+support+film%29+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li>
<li>Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).</li>
<li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/plmorphol1989/17/1/17_1_57/_article/-char/ja/">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li>
<li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://homes.mpimf-heidelberg.mpg.de/~mhelmsta/pdf/2006%20Hayworth%20Kasthuri%20Schalek%20Lichtman%20MicroscMicroanal.pdf">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).</li>
<li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329(2004).</li>
<li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda nie wymaga drogiego sprzętu. Wymaga jedynie aluminiowego stojaka (rysunek 3), kratek z trzema szczelinami (rysunek 6c), pętli przytrzymujących sekcje (rysunek 10a), pętli podnoszącej powierzchnię wody (rysunek 11a) i rurki do barwienia (rysunek 13). Obecna metoda ma wiele cech. Duża część próbki służy do regulacji powierzchni próbki i krawędzi noż...

Właściwa technika seryjnego ultracienkiego cięcia jest niezbędna do trójwymiarowego badania komórek i komponentów komórek na poziomie mikroskopii elektronowej. Zbadaliśmy dynamikę korpusu bieguna wrzeciona w cyklu komórkowym komórek drożdży i ujawniliśmy zmiany morfologiczne ich ultrastruktury podczas cyklu komórkowego i czasu duplikacji1,2,3,4,5. W 2006 roku ukuliśmy nowe słowo "strukturom", łącząc "strukturę" i "-om", i zdefiniowaliśmy je jako "ilościową i trójwymiarową informację strukturalną całej komórki na poziomie mikroskopii elektronowej" 6, 7.
Przez analizę strukturomu, która wymaga techniki seryjnego ultracienkiego cięcia, odkryto, że komórka drożdży Saccharomyces cerevisiae i Exophiala dermatitidis miała około 200 000 rybosomów7, 8, komórka Escherichia coli miała 26 000 rybosomów9, komórka Mycobacterium tuberculosis miała 1 700 rybosomów10 a bakterie spiralne Myojin miały tylko 300 rybosomów11. Informacje te są przydatne nie tylko do oszacowania tempa wzrostu każdego organizmu, ale także do identyfikacji gatunków9.
Dalej, analiza strukturomu doprowadziła do odkrycia nowego organizmu; Parakaryon myojinensis został znaleziony w głębokim morzu u wybrzeży Japonii, którego struktura komórkowa była pośrednia między prokariotami a eukariontami12,13,14,15. Obecnie technika seryjnego ultracienkiego cięcia jest uważana za tak trudną, że jej opanowanie zajęłoby dużo czasu. W tym badaniu opracowaliśmy niezawodną metodę, dzięki której każdy może bez trudu wykonać seryjne ultracienkie cięcie.

<table><tbody><tr><td>Aparatura do produkcji form</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>652</td><td>szer. 180 x gł. 180 x wys. 300 mm</td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka-76</td><td></td> <td>x 26 x 1,3 mm</td></tr><tr><td>Aluminiowy stojak z otworami 4 mm</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>658</td><td>szer. 30 x gł. 25 x wys. 3 mm, Patrz ten artykuł</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon Co. Ltd., </td><td></td><td>Tokyo-SMZ 645</td></tr><tr><td>Oświetlenie LED do mikroskopu stereoskopowego</td><td>Nikon Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokyo-SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Etap przycinania</td><td>Sunmag Co.Ltd.,</td> <td>Tokio-Wyposażony</td> <td>w mechanizm przechylania, Zapoznaj się z tym</td></tr><tr><td>papierem Oświetlenie LED do przycinania stage</td><td>Sunmag Co.Ltd.,</td> <td>Tokio-Zapoznaj</td> <td>się z tym artykułem</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowe ostrze do przycinania</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>5240</td><td>EM-240, Patrz ten papier</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy do przycinania</td><td>Diatome Co. Ltd., Szwajcaria-45</td><td></td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy do ultracienkich przekrojów</td><td>Diatome Co. Ltd., Szwajcaria-45</td><td></td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń-Ultracut</td><td></td> <td>S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems, Vienna-Mirror</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0.5% roztwór z neoprenu W Nisshin</td><td>EM Co. Ltd., Tokio</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Specjalna 3-szczelinowa siatka niklowa</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>2458</td><td>Zapoznaj się z tym artykułem</td></tr><tr><td>Specjalna 3-szczelinowa siatka miedziana</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>2459</td><td>Patrz ten artykuł</td></tr><tr><td>Pętla do trzymania sekcji</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>526</td><td>Patrz ta praca</td></tr><tr><td>Pętla podnosząca powierzchnię wody</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>527</td><td>Patrz ten dokument</td></tr><tr><td>Rurka do barwienia</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>463</td><td>Patrz ten dokument</td></tr><tr><td>Uchwyt na wiele próbek</td><td>JEOL Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokio-EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokijski</td><td></td> <td>transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr></tbody></table>

metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Obserwacja komórek i składników komórek w trzech wymiarach przy dużym powiększeniu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej wymaga przygotowania seryjnych ultracienkich przekrojów próbki. Chociaż przygotowanie seryjnych ultracienkich odcinków jest uważane za bardzo trudne, jest to raczej łatwe, jeśli zastosuje się odpowiednią metodę. W tym artykule przedstawiono krok po kroku procedurę bezpiecznego uzyskiwania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów. Kluczowymi punktami tej metody są: 1) wykorzystanie dużej części próbki i dostosowanie powierzchni próbki i krawędzi noża tak, aby były równoległe do siebie; 2) cięcie odcinków szeregowych w grupy i unikanie trudności w rozdzielaniu odcinków za pomocą pary pasm włosów podczas pobierania grupy odcinków szeregowych na siatki szczelinowe; 3) używać "pętli przechowywania sekcji" i unikać mylenia kolejności grup sekcji; 4) należy użyć "pętli podnoszącej powierzchnię wody" i upewnić się, że sekcje są umieszczone na wierzchołku wody i że najpierw dotykają siatki, aby umieścić je w żądanej pozycji na rusztach; 5) użycie folii nośnej na aluminiowym stojaku i ułatwienie odzyskiwania odcinków na kratkach oraz uniknięcie marszczenia się folii nośnej; oraz 6) użyć rurki do barwienia i unikać przypadkowego zerwania folii nośnej pęsetą. Ta nowa metoda umożliwia bezproblemowe uzyskiwanie seryjnych ultracienkich przekrojów. Metoda umożliwia analizę struktur komórkowych mikroorganizmów w wysokiej rozdzielczości w 3D, co nie jest możliwe do osiągnięcia przy użyciu metody automatycznego ultramikrotomu z taśmą oraz seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z blokiem lub skupioną wiązką jonów.

W niniejszym protokole do pobierania serii skrawków wykorzystano siatki trószczelinowe. Siatki te są wykonane z niklu lub miedzi. Seria skrawków jest umieszczana na środkowej szczelinie. Szczeliny po obu stronach są niezbędne do obserwacji skrawków podczas ich pobierania za pomocą siatki. Aby utrzymać siatki równolegle do serii skrawków podczas ich podnoszenia pincetą (Rysunek 11d), uchwyt jest zgięty (Rysunek 6c, prawo). Krótki ...

To badanie przedstawia niezawodne i łatwe procedury uzyskiwania seryjnych ultracienkich odcinków mikroorganizmu bez drogiego sprzętu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest bezpieczne i łatwe wykonywanie seryjnych ultracienkich przekrojów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, dostarczając ilościowych i trójwymiarowych informacji strukturalnych o całej komórce na poziomie mikroskopii elektronowej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykonania seryjnego cięcia ultracienkiego bez użycia kosztownej aparatury, przy jednoczesnym uzyskaniu obrazów o wysokiej rozdzielczości.Aby rozpocząć procedurę, należy oczyścić powierzchnię szkiełka przedmiotowego. Następnie zanurz jedną połowę szkiełka w 1,5% roztworze Formvaru w górnej kolumnie aparatury do tworzenia błon wspierających z Formvaru, wypychając roztwór powietrzem przez kurek trójdrożny za pomocą gumowej gruszki. Odlej roztwór z kolumny, otwierając kurek trójdrożny i wypuszczając powietrze w celu obniżenia ciśnienia.Następnie wyjmij szkiełko przedmiotowe z aparatury i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, aby na jego powierzchni utworzyła się błona. Za pomocą żyletki zeskrob brzegi błony z czterech krawędzi szkiełka. Po zaparowaniu szkiełka oddechem w celu ułatwienia oddzielenia błony, zdejmij ją, powoli zan

a-method-for-obtaining-serial-ultrathin-sections-microorganisms

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Źródło: Lutz, D., et.al.  Ocena parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019). Ten film demonstruje przygotowanie i analizę za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wycinka mózgu szczeniaka myszy. Protokół rozpoczyna się od tkanki utrwalonej tetratlenkiem osmu w żywicy, a następnie precyzyjnego przycinania w celu wyizolowania obszaru zainteresowania i ultramikrotomii w celu...

Analiza ultrastrukturalna wycinka mózgu myszy z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek o niskiej liczbie komórek do analizy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Opisujemy techniki utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii mikroorganizmów. W przygotowanych próbkach za pomocą mikroskopii można uwidocznić podstrukturę biofilmu i wzorce ekspresji reporterowej.

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Prosty i wszechstronny protokół do pozyskiwania trójwymiarowych szczegółów miejsc kontaktu błony między organellami w hepatocytach z wątroby lub komórek w innych tkankach.

Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Naucz się metody otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej bez drogiego sprzętu. Technika ta dostarcza ilościowych i trójwymiarowych informacji strukturalnych całych komórek.

Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów