Name: Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Poznaj metodę oceny zdolności retencyjnej wapnia i obrzęku mitochondriów w komórkach SH-SY5Y. Protokół wykorzystuje spektroskopię fluorescencyjną do badania dysfunkcji mitochondrialnej w kontekście metabolizmu energetycznego komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z grantu Wybitnego Naukowca z Shandong (JQ201421) oraz granty z NSFC (81371226).

1. Izolacja mitochondriów
UWAGA: Wszystkie roztwory i urządzenia powinny być wstępnie schłodzone do 0 - 4 °C i trzymane na lodzie.
<ol>
	<li>Wysiew: około 3 x 106 komórek SH-SY5Y na 10 cm naczynie do hodowli komórkowej. Hodowla komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 U/ml)-streptomycyną (100 μg/ml). Utrzymywać przez noc w inkubatorze zawierającym 5%CO2 w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Do każdego testu izolacji potrzebne są co najmniej 1 - 2 x 107 komórek SH-SY5Y.</li>
	<li>Usuń pożywkę i umyj komórki około 1 ml lodowatego PBS w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych 3 razy.</li>
	<li>Dodaj nowy 1 ml lodowatego PBS do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych i zeskrob przylegające komórki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podczas wirowania przygotować 5 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego (250 mM sacharozy, 10 mM kwasu HEPES(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanosulfonowego), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) uzupełnionego 50 μl roztworu podstawowego inhibitorów proteazy (100x stężenie; 1 tabletka wolna od EDTA rozpuszczona w 500 μl ddH2O).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego. Inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Lizować zawieszone komórki za pomocą szklanego homogenizatora (15 - 25 uderzeń) ręcznie w górę iw dół na lodzie. 
	UWAGA: Upewnij się, że podczas homogenizacji komórek nie ma pęcherzyków. Policz nienaruszone komórki i odsłonięte jądra pod mikroskopem wizualnie i potwierdź, że nastąpiło >90% pęknięcia komórek.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń (jąder i pozostałych nienaruszonych komórek).</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść sklarowany osad do nowej probówki i odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający mitochondria za pomocą 1 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego.</li>
	<li>Odwirować roztwór przez 15 minut w temperaturze 14 000 x g 4 °C w celu wytrącenia mitochondriów.</li>
	<li>Otrzymany osad mitochondriów musi być przechowywany na lodzie i ponownie zawieszony w pożywkach o pojemności 50 - 100 μl KCl (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM glutaminianu, 5 mM jabłczanu i 2 μM rotenonu, pH 7,4) zgodnie z objętością osadu przed jakimkolwiek testem.</li>
	<li>Użyj 5 μl roztworu mitochondrialnego, aby zmierzyć stężenie białka mitochondrialnego za pomocą standardowego testu BCA, mierząc OD562 za pomocą czytnika płytek13.</li>
</ol>
2. Określenie zdolności retencji mitochondriów Ca2+ 
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę KCl i dodać wiążący Ca2+ zielony barwnik fluorescencyjny do końcowego stężenia 0,5 μM przed eksperymentem.</li>
	<li>Przenieść 1 ml izolowanych mitochondriów (0,4 mg/ml) w pożywce KCl zawierającej 0,5 μM Ca2+ wiążącego zielony barwnik fluorescencyjny do każdej studzienki 6-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować mitochondria i zielony barwnik fluorescencyjny wiążący Ca2+ na 6-dołkowej płytce w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem otoczenia przez 1 minutę. Dodać 4 μl podwielokrotności 20 mM roztworu CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM glutaminianu, 5 mM jabłczanu, pH 7,4) do każdej 6-dołkowej płytki przy użyciu automatycznego ustawienia dozowania w celu wprowadzenia 200 nmol Ca2 + / mg białka mitochondrialnego.</li>
	<li>Użyj spektrometru fluorescencyjnego, aby monitorować zmiany fluorescencji co 3 s przez 2 minuty przy długości fali wzbudzenia 506 nm i długości fali emisji 531 nm. Płytka wyposażona jest w wytrząsanie z prędkością 600 obr./min przez 3 s pomiędzy odczytami sterowanymi programowo (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Dodać dodatkowe 4 μl podwielokrotności 20 mM roztworu CaCl2 do każdej studzienki i monitorować zmiany fluorescencji co 3 sekundy przez 2 minuty. Powtarzaj ten krok, aż fluorescencja wzrośnie z czasem. 
	UWAGA: Mitochondria są prowokowane z dodatkiem Ca2+, na co wskazuje zwiększona fluorescencja zapisu. Kiedy mPTP się otwiera, fluorescencja wzrasta z czasem.</li>
	<li>Zinterpretuj całkowitą ilość Ca2+ dodanego do momentu otwarcia mPTP jako pojemność retencyjną Ca2+.</li>
</ol>
3. Oznaczanie obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca 2+
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę KCl przed eksperymentem.
	<ol>
		<li>Przenieś 1 ml izolowanych mitochondriów (0,4 mg/ml) w pożywce KCl do każdej 6-dołkowej płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 10 μl 20 mM CaCl2 roztworu wodnego (500 nmol/mg białka mitochondrialnego) do białka mitochondrialnego, aby wywołać obrzęk mitochondriów.</li>
	<li>Zapisuj spadek absorbancji przy 540 nm co 3 s na czytniku mikropłytek sterowanym przez oprogramowanie przez 10 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Zmiany fluorescencji są spowodowane napływem substancji rozpuszczonych przez wewnętrzną błonę mitochondriów. 
	UWAGA: Zmniejszona absorbancja przy 540 nm odpowiada obrzękniętym mitochondriom. Jeśli czytnik nie zaobserwuje spadku absorbancji, można przyjąć dłuższy interwał odczytu lub czas odczytu.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+green-5N%2C+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2%2B+concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li>
<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
<li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. Sun nadzorował eksperymenty. Wei Li przeprowadził eksperymenty. Chen Zhang i X. Sun napisali ten artykuł.

Tutaj opisaliśmy prosty i skuteczny protokół testu zdolności zatrzymywania mitochondriów Ca2 + i testu obrzęku mitochondriów wywołanego Ca2 +.
W przypadku izolacji mitochondriów upewnij się, że wszystkie materiały i rurki są na lodzie, zwłaszcza podczas homogenizacji komórek. 0,25% trypsyna-EDTA może być również użyta do odłączenia komórek od naczynia na 5 minut w temperaturze 37 °C. Po 15 - 25 pociągnięciach należy obserwować nienaruszoną błonę komórkową pod mikroskopem ...

Mitochondria są głównymi organami komórkowymi wytwarzającymi prawie 95% ATP wykorzystywanego w komórkach ssaków poprzez fosforylację oksydacyjną. Poinformowano, że sekwestrowane stężenie mikromolowe Ca2+ przez mitochondria, obecność ADP i nieorganiczny fosforan można wykorzystać do fosforylacji ADP do syntezy ATP1. Gdy stężenie cytozolowego Ca2 + przekracza próg, mitochondria mogą szybko pobierać Ca2 + i powoli go wypływać. W ten sposób funkcjonujące mitochondria mogą napływać do zwiększonego cytozolowego Ca2+. Niezależnie od udziału w fosforylacji oksydacyjnej, mitochondrialne Ca2 + biorą również udział w cytozolowych sygnałach wapniowych i aktywują mitochondrialny mechanizm apoptozy poprzez indukowanie otwarcia mPTP w wewnętrznej błonie mitochondrialnej2. Powszechnie uznano, że nieprawidłowe podniesienie wewnątrzkomórkowego Ca2 + może wywołać masywny obrzęk mitochondriów poprzez otwarcie mPTP3. W związku z tym protokół ten ma na celu ocenę funkcji mitochondriów poprzez ilościowe określenie zdolności zatrzymywania mitochondriów Ca2 + i obrzęku mitochondriów wyzwolonego przez Ca2 +.
Ca2+ zdolność zatrzymywania jest miarą zdolności mitochondriów do pobierania cytozolowego wapnia. Mitochondria mogą buforować wolny wapń cytozolowy i regulować procesy komórkowe zależne od wapnia poprzez wychwyt wapnia w postaci nieaktywnych osadów. Upośledzona zdolność zatrzymywania Ca2+ występuje w zjawiskach stresowych związanych z ograniczeniem energii, a nawet chorobami neurodegeneracyjnymi4,5. Izolowane mitochondria lub komórki przepuszczalne digitoniną mogą być wykorzystane do identyfikacji zdolności zatrzymywania Ca2 +, a zwiększona zdolność do akumulacji Ca2 + przez izolowane mitochondria z dodatkiem glutaminianu i jabłczanu nie jest dotknięta procedurą izolacji mitochondriów6. Miareczkowana ilość digitoniny powinna być używana do przenikania błon plazmatycznych różnych typów komórek. Sól heksapotasowa zielonego barwnika fluorescencyjnego wiążącego Ca2 +, wrażliwego na Ca2 + wskaźnika pobudliwości światła widzialnego, jest szeroko stosowana7. Zielony barwnik fluorescencyjny wiążący Ca2+ jest wskaźnikiem o niskim powinowactwie i służy do pokazania, że wewnątrzkomórkowe stężenia wolnego Ca2 + nadal rosną podczas długotrwałych (5 minut) stymulacji8. Metoda ta była mniej czuła niż technika filtra radioaktywnego, ale została znacznie uproszczona. Dodatkowy Ca2 + podnosi fluorescencję zieleni wapniowej, a wychwyt Ca2 + przez mitochondria przywraca fluorescencję do wartości wyjściowej. Sekwencyjne dodawanie Ca2+ dokonywano do momentu, gdy mitochondria nie były w stanie wychwycić pozamitochondrialnego Ca2+ 9. Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych może być używany do ciągłego raportowania fluorescencji zieleni wapniowej.
Po akumulacjiCa2+, mitochondria uległy depolaryzacji, uwolniły Ca2+ do pożywki i zaczęły pęcznieć. Obrzęk mitochondriów wywołany przez Ca2+ służy do wskazania otwarcia mPTP. Mikroskopia elektronowa i spadek absorbancji światła przy 540 nm mogą być wykorzystane do pomiaru obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca2+10,11. Objętość mitochondriów można bezpośrednio określić za pomocą rozpraszania światła pod kątem do przodu12, gdzie spadki absorbancji odzwierciedlają bierne pęcznienie macierzy mitochondrialnej.
Tutaj ilustrujemy metodologię badania zdolności zatrzymywania mitochondriów Ca2+ i obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca2+ w izolowanych mitochondriach z komórek SH-SY5Y.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa SH-SY5Y</td><td>ATCC (Globalne Centrum Zasobów Biologicznych)</td> <td>Numer ATCC: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium green-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+-wiążące całkowite inhibitory proteazy zielonego barwnika fluorescencyjnego</td></tr><tr><td></td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>homogenizator szklany</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>jabłczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty błyskowe Varioskan</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atraktylozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy" s zmodyfikowana pożywka Eagle</td><td>Hyclon</td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L glukozy, L-glutamina, bez pirogronianu sodu</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Hycon</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>penicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclon</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 10 cm</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

test zdolności retencyjnej mitochondriów ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany ca2+

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Produkcja ATP przez fosforylację oksydacyjną jest podstawową funkcją mitochondriów. Mitochondria u wyższych eukariontów również uczestniczą w cytozolowym buforowaniu Ca2 +, a produkcja ATP w mitochondriach może być pośredniczona przez wewnątrzmitochondrialne stężenie wolnego Ca2 +. Zdolność retencjiCa2+ można uznać za zdolność mitochondriów do zatrzymywania wapnia w macierzy mitochondrialnej. Nagromadzony wewnątrzkomórkowy Ca2 + prowadzi do przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej, nazywanej otwarciem porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (mPTP), co prowadzi do wycieku cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa. Obrzęk mitochondriów wywołany przez Ca2+ służy do wskazania otwarcia mPTP. Tutaj opisujemy dwa testy w celu zbadania zdolności zatrzymywania Ca2 + i obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca2 + w izolowanych mitochondriach. Po dodaniu określonych ilościCa2+ wszystkie kroki można wykonać w ciągu jednego dnia i zarejestrować za pomocą czytnika mikropłytek. W ten sposób te dwa proste i skuteczne testy można zastosować do oceny funkcji mitochondriów związanych z Ca2 +.

Reprezentatywne wyniki pojemności retencji Ca2+: 
Wyniki wyrażono jako wartości fluorescencji. Po dodaniu kolejnych pulsów Ca2+ (200 nmols/mg białka mitochondrialnego), fluorescencja wzrosła dwukrotnie powyżej poziomu bazowego w momencie otwarcia mPTP. Do izolowanych mitochondriów dodano 5 μM bongkrekatu (BKA), inhibitora indukowanego przez Ca2+ otwarcia mPTP, lub 1 μM atraktylosydy (ATR), aktywatora indukowanego przez Ca2+ otwarcia ...

Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca2+ i wywołanego przez Ca2+ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.

Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest określenie mitochondrialnej pojemności zatrzymywania wapnia podczas indukowanego wapniem obrzęku mitochondriów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad dysfunkcją mitochondriów, taką jak nieprawidłowy metabolizm energetyczny. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i skuteczność.Na początek wysiej około trzech milionów komórek SH-SY5Y na 10-centymetrową szalkę hodowlaną. Usuń pożywkę i przemyj komórki w 10-centymetrowej szalce hodowlanej około jednym mililitrem lodowatego PBS, powtarzając tę czynność trzykrotnie. Dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do 10-centymetrowej szalki hodowlanej i zeskrob przylegające komórki do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Wiruj z prędkością 800 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas wirowania przygotuj pięć mililitrów buforu do izolacji mitochondriów, uzupełnionego o 50 µL roztworu zapasowego inhibitora proteaz. Usuń nadsącz i zawieś ponownie osad w jednym mililitrze buforu do izolacji mitochondriów.Inkubować probówkę 1,5 ml na lodzie przez 30 minut. Następnie zlizować zawieszone komórki za pomocą homogenizatora szklanego, wykonując ręcznie ruchy góra-dół na lodzie. Przenieść homogenat do probówki 1,5 ml.Następnie odwirować z prędkością 1 000 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia resztek komórkowych. Po wirowaniu przenieść nadsącz do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie ponownie odwirować w ten sam sposób. Po przeniesieniu nadsączu do nowej probówki odwirować z prędkością 14 000 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usunąć nadsącz i ponownie zawiesić osad zawierający mitochondria w jednym mililitrze buforu do izolacji mitochondriów. Następnie odwirować roztwór przez 15 minut przy 14 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wytrącić mitochondria. Otrzymany osad mitochondriów należy przechowywać w lodzie i zawiesić ponownie w 50 do 100 mikrolitrów pożywki z chlorkiem potasu, zależnie od objętości osadu przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek testu.Na koniec należy wykorzystać 5 µL roztworu mitochondriów do oznaczenia stężenia białka mitochondrialnego za pomocą standardowego testu BCA, mierząc OD562 przy użyciu czytnika płytek. Przed eksperymentem należy przygotować podłoże z chlorkiem potasu i dodać zielony barwnik fluorescencyjny wiążący wapń do stężenia końcowego 0,5 µM. Aby określić zdolność mitochondriów do zatrzymywania wapnia, należy najpierw przenieść 1 mL wyizolowanych mitochondriów w podłożu z chlorkiem potasu zawierającym 0,5 µM zielonego barwnika fluorescencyjnego wiążącego wapń do każdego dołka płytki sześciodołkowej.Inkubować mitochondria oraz zielony fluorescencyjny barwnik wiążący wapń w płytce sześciodołkowej w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem zewnętrznym przez jedną minutę. Po inkubacji do każdego dołka płytki sześciodołkowej dodać czteromikrolitrowe alikwoty 20 milimolarnego roztworu chlorku wapnia, korzystając z ustawienia automatycznego dozowania, aby wprowadzić 200 nanomoli wapnia na miligram białka mitochondrialnego. Użyć spektrometru fluorescencyjnego do monitorowania zmian fluorescencji co trzy sekundy przez dwie minuty, przy długości fali wzbudzenia 506 nanometrów i długości fali emisji 531 nanometrów.Płytka jest wyposażona w funkcję wytrząsania z prędkością 600 rpm przez trzy sekundy pomiędzy odczytami, sterowaną przez oprogramowanie. Do każdej studni należy dodać dodatkową porcję 4 µL 20 mM roztworu chlorku wapnia, a następnie monitorować zmiany fluorescencji co trzy sekundy przez dwie minuty. Aby określić indukowane wapniem pęcznienie mitochondriów, należy przenieść 1 mL wyizolowanych mitochondriów w medium z chlorkiem potasu do każdej studni płytki sześciodołkowej.Następnie do białka mitochondrialnego należy dodać 10 µL 20 mM wodnego roztworu chlorku wapnia, aby wywołać obrzęk mitochondriów. Przy użyciu czytnika mikropłytek sterowanego programowo należy rejestrować spadek absorbancji co trzy sekundy przez 10 minut przy długości fali 540 nm. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki pojemności zatrzymywania wapnia przez mitochondria w obecności bongkrekicu, inhibitora otwierania indukowanego wapniem poru przejścia przepuszczalności mitochondrialnej (MPTP), atraktylosidu, aktywatora otwierania MPTP indukowanego wapniem, oraz kontroli ujemnej.Zgodnie z oczekiwaniami, wydolność w grupie traktowanej bongkrekicyną jest znacznie wyższa niż w grupie traktowanej atraktylosydą. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki obrzęku mitochondriów indukowanego wapniem dla bongkrekicyny, atraktylosydy oraz kontroli bez traktowania. Zmniejszenie absorbancji monitorowanej przy 540 nanometrach wskazuje na wystąpienie obrzęku mitochondriów.Wyniki sugerują, że BKA może hamować otwieranie MPTP, podczas gdy ATR może ułatwiać jego otwieranie. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu pięciu godzin. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu wszystkich roztworów w lodzie.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Ten film opisuje test oparty na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach. Test analizuje sygnał fluorescencyjny wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego w celu zbadania kinetyki mitochondrialnego wychwytu wapnia i przeciążenia wapniem.

Mitochondrialny test wychwytu wapnia: metoda pomiaru wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach oparta na czytniku płytkowym

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Ten film przedstawia procedurę oceny zdolności mitochondriów do zatrzymywania wapnia poprzez monitorowanie zmian fluorescencji w czasie rzeczywistym w miarę wychwytu wapnia przez mitochondria. Ten test jest przydatny do badania funkcji mitochondriów i procesów związanych z wapniem, w tym apoptozy i chorób neurodegeneracyjnych.

Oznaczanie zdolności zatrzymywania wapnia w izolowanych mitochondriach

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

W tej pracy opisujemy zmodyfikowany protokół badania strumienia mitochondrialnego substratu oddechowego za pomocą rekombinowanej perfringolizyny O w połączeniu z respirometrią opartą na mikropłytkach. Dzięki temu protokołowi pokazujemy, jak metformina wpływa na oddychanie mitochondrialne dwóch różnych linii komórek nowotworowych.

Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Poznaj metodę oceny zdolności retencyjnej wapnia i obrzęku mitochondriów w komórkach SH-SY5Y. Protokół wykorzystuje spektroskopię fluorescencyjną do badania dysfunkcji mitochondrialnej w kontekście metabolizmu energetycznego komórek.

Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca²⁺ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca²⁺

Przeglądaj więcej filmów