Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+
1 maja 2018
Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca2+ i wywołanego przez Ca2+ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie zdolności zatrzymywania wapnia przez mitochondria w obrzęku mitochondriów wywołanym wapniem. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu dysfunkcji mitochondriów, takie jak nieprawidłowy metabolizm energetyczny. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo prosta i skuteczna.
Na początek wysiewaj około trzech milionów komórek SH-SY5Y na 10-centymetrową naczynie do hodowli komórek. Usuń pożywkę i umyj komórki około jednym mililitrem lodowatego PBS w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych trzy razy. Dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórek i zeskrob przylegające komórki do nowej 1,5-mililitrowej probówki.
Wirować w temperaturze 800 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas wirowania należy przygotować pięć mililitrów mitochondrialnego buforu izolacyjnego, uzupełnionego 50 mikrolitrami roztworu podstawowego inhibitora proteazy. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą jednego mililitra mitochondrialnego buforu izolacyjnego.
Inkubuj 1,5 mililitrową probówkę na lodzie przez 30 minut. Następnie poddać lizie zawieszone komórki za pomocą szklanego homogenizatora, ręcznie w górę iw dół na lodzie. Przenieś homogenat do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Następnie odwiruj w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć zanieczyszczenia. Po odwirowaniu przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra przed ponownym odwirowaniem, jak poprzednio. Po przeniesieniu supernatantu do nowej probówki, odwirować w temperaturze 14 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający mitochondria z jednym mililitrem buforu do izolacji mitochondriów. Następnie odwiruj roztwór przez 15 minut w temperaturze 14 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby wytrącić mitochondria. Powstały osad mitochondriów musi być przechowywany na lodzie i ponownie zawieszony w 50 do 100 mikrolitrach pożywki z chlorku potasu, w zależności od objętości osadu przed jakimkolwiek testem.
Na koniec użyj pięciu mikrolitrów roztworu mitochondrialnego, aby zmierzyć stężenie białka mitochondrialnego za pomocą standardowego testu BCA, mierząc OD562 za pomocą czytnika płytek. Przygotować pożywkę z chlorkiem potasu i dodać zielony barwnik fluorescencyjny wiążący wapń do końcowego stężenia 0,5 mikromola przed eksperymentem. Aby określić zdolność zatrzymywania wapnia w mitochondriach, najpierw przenieś jeden mililitr izolowanych mitochondriów w pożywce chlorku potasu zawierającej 0,5 mikromolowego barwnika fluorescencyjnego wiążącego wapń do każdej studzienki na płytce sześciodołkowej.
Inkubować mitochondria i zielony barwnik fluorescencyjny wiążący wapń na płytce sześciodołkowej w temperaturze pokojowej, chroniony przed światłem otoczenia przez jedną minutę. Po inkubacji dodać cztery mikrolitrowe podwielokrotności w 20-milimolowym roztworze chlorku wapnia do każdej studzienki na sześciodołkowej płytce, używając automatycznego ustawienia dozowania, aby wprowadzić 200 nanomoli wapnia na miligram białka mitochondrialnego. Użyj spektrometru fluorescencyjnego, aby monitorować zmiany fluorescencji co trzy sekundy przez dwie minuty przy długości fali wzbudzenia 506 nanometrów i długości fali emisji 531 nanometrów.
Płyta wyposażona jest w wytrząsanie z prędkością 600 obr./min przez trzy sekundy między odczytami, sterowane przez oprogramowanie. Dodać dodatkowe cztery mikrolitry podwielokrotności 20-milimolowego roztworu chlorku wapnia do każdej studzienki, a następnie monitorować zmiany fluorescencji co trzy sekundy przez dwie minuty. Aby określić obrzęk mitochondriów wywołany wapniem, przenieś jeden mililitr izolowanych mitochondriów w pożywce chlorku potasu do każdej studzienki na sześciodołkowej płytce.
Następnie dodaj 10 mikrolitrów 20-milimolowego wodnego roztworu chlorku wapnia do białka mitochondrialnego, aby wywołać obrzęk mitochondriów. Za pomocą czytnika mikropłytek sterowanego przez oprogramowanie rejestruj spadek absorbancji co trzy sekundy przez 10 minut przy 540 nanometrach. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki mitochondrialnej zdolności zatrzymywania wapnia przez bongkrekic, inhibitor indukowanych przez wapń mitochondrialnych porów przejściowych przepuszczalności (MPTP), atraktylozydu otwierającego, aktywatora indukowanego wapniem otwarcia MPTP i ślepej próby.
Zgodnie z oczekiwaniami zdolność w leczeniu bongkrekikami jest znacznie wyższa niż w grupie atraktylozydu. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki indukowanego wapniem obrzęku mitochondriów bongkrekiku, atraktylozydu i kontroli bez leczenia. Zmniejszona absorbancja monitorowana przy 540 nanometrach wskazuje na obrzęki mitochondriów.
Wyniki sugerują, że BKA może hamować otwieranie MPTP, podczas gdy ATR może ułatwiać otwieranie MPTP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystkie roztwory znajdowały się na lodzie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje metodę badania zdolności retencji Ca2+ oraz wywołanego przez Ca2+ obrzęku mitochondriów w izolowanych mitochondriach z komórek SH-SY5Y. Protokół jest ukierunkowany na badanie dysfunkcji mitochondriów i nieprawidłowego metabolizmu energetycznego, co jest kluczowe dla zrozumienia energetyki komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Fizjologia mitochondriów
- Neuronauka
Wprowadzenie
- Mitochondria odgrywają kluczową rolę w komórkowym metabolizmie energetycznym.
- Zrozumienie retencji wapnia w mitochondriach jest niezbędne do badania dysfunkcji mitochondrialnych.
- Indukowane wapniem obrzęki mitochondriów mogą wpływać na przeżywalność i funkcje komórek.
- Komórki SH-SY5Y stanowią przydatny model w badaniach neuronów ze względu na ich właściwości dopaminergiczne.
Cel badania
- Ocena zdolności mitochondriów do retencji wapnia.
- Ocena wpływu wapnia na obrzęk mitochondriów.
- Przedstawienie prostej metody badania funkcjonalności mitochondriów.
Zastosowane metody
- Metodyka hodowli komórek SH-SY5Y.
- Izolacja mitochondriów za pomocą protokołów wirowania.
- Pomiar stężenia białek mitochondrialnych przy użyciu testu BCA.
- Spektroskopia fluorescencyjna do monitorowania retencji wapnia oraz pomiary absorbancji do oceny pęcznienia.
- Przewidywany czas trwania eksperymentu wynosi pięć godzin.
Główne wyniki
- Technika ta ujawniła różnice w zdolnościach retencji wapnia pomiędzy badanymi grupami.
- Kwas bongkrekik znacząco hamował otwieranie MPTP, podczas gdy atraktylosyd je promował.
- Obrzęk indukowany wapniem był monitorowany za pomocą pomiarów absorbancji, co wskazywało na reakcje mitochondrialne.
- Wyniki sugerują istotne implikacje dla zrozumienia dynamiki mitochondriów w kontekście homeostazy wapniowej.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza wartościowego protokołu do badania dynamiki wapnia w mitochondriach.
- Umożliwia ono badaczom zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji mitochondriów w różnych kontekstach.
- Wyniki mogą mieć znaczenie dla zdrowia neuronów oraz modeli chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena gospodarki wapniowej w mitochondriach jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w programach badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi i metabolicznymi. Testy te zapewniają ilościowe i powtarzalne odczyty aktywności mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności (mPTP), który jest kluczowym mechanizmem łączącym dysregulację wapnia ze śmiercią komórki. Umożliwiając szybki screening funkcjonalny związków modulujących mPTP, metody te wspierają wczesne ograniczanie ryzyka mechanistycznego i zwiększają pewność predykcyjną w wyborze związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących dysfunkcji mitochondriów w modelach chorób.
- Wartość naukowa: Zapewnia funkcjonalną walidację celów zaangażowanych w homeostazę wapnia i regulację mPTP.
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność prognostyczną poprzez rozróżnienie inhibitorów od aktywatorów otwierania mPTP.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe odczyty fluorescencji i absorbancji odpowiednie dla formatów wysokoprzepustowego screeningu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu przy użyciu izolowanych mitochondriów i kontrolowanego przepływu wapnia.
- Wartość operacyjna: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w badaniach bibliotek związków oraz testowaniu różnych warunków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy zdolność retencji wapnia z istotnymi dla przebiegu choroby fenotypami mitochondrialnymi w modelach neuronalnych.
- Wartość naukowa: Jest zgodna z translacyjnymi strategiami biomarkerów poprzez pomiar funkcjonalnej aktywności mPTP.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka dzięki mechanistycznemu ograniczaniu zagrożeń związanych z bezpieczeństwem mitochondriów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analizy te wpisują się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, w szczególności w przypadku programów koncentrujących się na modulatorach mitochondrialnych lub czynnikach neuroprotekcyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mitochondrialnych szlaków zależnych od wapnia oraz funkcjonalnego zaangażowania celu.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki ilościowemu monitorowaniu w czasie rzeczywistym strumienia wapnia i kinetyki pęcznienia.
- Analityka: Generuje pomiary fluorescencji i absorbancji, które pozwalają na porównanie wpływu związków na próg mPTP.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez ocenę funkcji mitochondriów w modelach komórkowych istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metod oceny wpływu związków na mitochondria w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej wokół mPTP.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne wyniki dzięki detekcji opartej na czytniku mikropłytek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez wczesną identyfikację ryzyk związanych z bezpieczeństwem mitochondrialnym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o funkcjonalne dane mitochondrialne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji mitochondriów i przeprowadzaniu testów przepływu wapnia.
- Zależne od dostępu do wirówek, homogenizatorów oraz czytników mikropłytek z możliwością pomiaru fluorescencji i absorbancji.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów przygotowania mitochondriów oraz ładowania barwników wapniowych w obrębie poszczególnych zespołów.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy zastosowaniu różnych typów komórek lub źródeł tkanek.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak wrażliwość przygotowania mitochondriów na temperaturę i czas.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Isolation of Mitochondria
2:41
Determination of Mitochondrial Ca2 Retention Capacity and Ca2-induced Mitochondrial Swelling
4:33
Results: The Measurement of Ca2 Retention Capacity and Ca2-induced Mitochondrial Swelling
5:30
Conclusion
