Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej
23 października 2017
Oligodendrocyty mielinizujące sprzyjają szybkiemu rozprzestrzenianiu potencjału czynnościowego i przetrwaniu neuronów. Opisano tutaj protokół specyficznej dla oligodendrocytów ekspresji białek fluorescencyjnych w organotypowych wycinkach mózgu z późniejszym obrazowaniem poklatkowym. Ponadto przedstawiono prostą procedurę wizualizacji niebarwionej mieliny.
Ogólnym celem tej transdukcji wirusowej i rejestracji time-lapse jest wizualizacja ruchu mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych skrawkach mózgu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad oligodendrocytami, takie jak sposób, w jaki oligodendrocyty i ich organelle reagują na zmiany w lokalnym środowisku. Główną zaletą tej techniki jest dostarczenie szczegółowych informacji o strukturze oligodendrocytów i dynamice organelli w preparacie, w którym obecne są wszystkie rodzaje komórek mózgowych, a oligodendrocyty wytwarzają zwartą mielinę. Przeprowadź transdukcję oligodendrocytów w kulturach skrawków w siódmym dniu in vitro. Najpierw pobierz 1.3 µL rozcieńczonego AAV na jeden skrawek. Upewniając się, że zewnętrzna strona końcówki pipety jest sucha, trzymaj pipetę nad korą tak blisko, jak to możliwe, nie dotykając końcówką skrawka, i powoli wypchnij roztwór z pipety. Gdy roztwór dotknie skrawka, przesuń końcówkę pipety nad korą, aby rozprowadzić roztwór na całej powierzchni kory. Po dokonaniu transdukcji wszystkich skrawków w jednej szalce, przenieś szalkę z powrotem do inkubatora, a następnie powtórz proces w pozostałych szalkach. Sprawdź skrawki pod kątem ekspresji markerów fluorescencyjnych i wykonaj obrazowanie skrawków, gdy poziomy ekspresji markerów fluorescencyjnych będą wystarczające, a skrawki będą wyglądać na zdrowe. Rozpocznij przygotowywanie kąpieli obrazującej, używając plasteliny do przymocowania igieł strzykawkowych zgiętych pod kątem 45
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na dynamice oligodendrocytów, wykorzystując protokół specyficznej dla oligodendrocytów ekspresji białek fluorescencyjnych w organotypowych skrawkach mózgu. Dzięki zastosowaniu obrazowania time-lapse badacze dążą do wizualizacji ruchu mitochondriów w oligodendrocytach oraz zrozumienia ich reakcji na zmiany środowiskowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Mielinizujące oligodendrocyty są kluczowe dla efektywnego przesyłania sygnałów neuronalnych.
- Zwiększają one szybkość propagacji potencjału czynnościowego i wspierają przeżycie neuronów.
- Zrozumienie zachowania oligodendrocytów może dostarczyć cennych informacji na temat funkcjonowania i patologii mózgu.
Cel badania
- Wizualizacja ruchu mitochondriów oligodendrocytów w organotypowym modelu skrawka mózgu.
- Zbadanie reakcji oligodendrocytów na lokalne zmiany środowiskowe.
- Przedstawienie metody wspomagającej ocenę struktury i dynamiki oligodendrocytów.
Zastosowane metody
- W eksperymencie wykorzystano organotypowe skrawki mózgu do obserwacji zachowania oligodendrocytów.
- Transdukcja oligodendrocytów za pomocą wektora wirusowego odbywa się siódmego dnia hodowli in vitro.
- Metoda obrazowania time-lapse pozwala na rejestrację dynamicznych zmian zachodzących w oligodendrocytach.
- W celu zapewnienia jednorodnej transdukcji we wszystkich skrawkach stosowane są precyzyjne techniki pipetowania.
Główne wyniki
- Zastosowane podejście umożliwia szczegółową obserwację ruchu oligodendrocytów oraz dynamiki mitochondriów.
- Oczekuje się, że z danych obrazowych wynikną wnioski dotyczące odpowiedzi strukturalnych oligodendrocytów.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia wizualizację dynamiki oligodendrocytów w odpowiednim modelu.
- Uzyskane wyniki mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji oligodendrocytów oraz ich wpływu na zdrowie neuronów.
Często zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Niniejszy protokół umożliwia wizualizację dynamiki organelli oligodendrocytów w fizjologicznie istotnym modelu skrawka mózgu, co wspiera walidację celów w chorobach demielinizacyjnych. Poprzez powiązanie zachowania mitochondriów z odpowiedziami na bodźce środowiskowe, metoda ta pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki neuroterapeutyczne wpływających na funkcje gleju. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków, umożliwiając bezpośrednią obserwację stanu zdrowia oligodendrocytów oraz interakcji z osłonkami mielinowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez specyficznych dla oligodendrocytów dotyczących reakcji organelli na zmiany w mikrośrodowisku.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje transdukcję za pośrednictwem AAV pod promotorem białka zasadowego mieliny do specyficznego dla typu komórek znakowania, co redukuje efekty poza celem.
- Wartość prognostyczna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez korelację dynamiki mitochondriów ze stanem zdrowia oligodendrocytów w nienaruszonej tkance.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe dane time-lapse dotyczące ruchu mitochondriów, umożliwiając zestandaryzowane odczyty do przesiewania związków.
- Powtarzalność: Przekroje organotypowe zachowują naturalne oddziaływania międzykomórkowe, co poprawia spójność wyników w różnych eksperymentach.
- Skalowalność: Kompatybilność z platformami mikroskopii konfokalnej powszechnie stosowanymi w laboratoriach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio stosowalne w modelach demielinizacji, w których zaistniał stres organelli oligodendrocytów.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki uzyskane in vitro z patofizjologią na poziomie tkankowym poprzez obrazowanie na żywo procesów związanych z mieliną.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala ocenić, czy testowane związki niwelują, czy nasilają dysfunkcję organelli w oligodendrocytach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, w szczególności w ramach programów badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi i demielinizacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących odpowiedzi organelli oligodendrocytów na perturbacje farmakologiczne lub genetyczne.
- Screening: Umożliwia opracowanie analiz pod kątem ruchliwości lub morfologii mitochondriów jako odczytów fenotypowych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki obrazowania (np. prędkość, gęstość, czas trwania ruchu mitochondriów) do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę komórkową z integralnością mieliny za pomocą komplementarnej mikroskopii konfokalnej w odbiciu dla bezznakowania wizualizacji mieliny.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Protokół może zostać dostosowany do innych organelli (np. lizosomów, ER) przy użyciu tego samego szkieletu AAV, co zwiększa użyteczność platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na oligodendrocyty poprzez wizualizację zachowania organelli w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Ustandaryzowany proces transdukcji i obrazowania poprawia powtarzalność wyników w różnych ośrodkach i zespołach.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez wczesne ujawnianie efektów pozacelowych wpływających na kondycję gleju w fazie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ich wpływ na fizjologię oligodendrocytów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie transdukcji wirusowej, hodowli organotypowych przekrojów tkankowych oraz mikroskopii konfokalnej.
- Zależność od dostępności AAV, optymalizacji miana oraz swoistości promotora w celowaniu w oligodendrocyty.
- Konieczność kontroli parametrów środowiskowych (CO2, temperatura) w celu utrzymania żywotności przekrojów podczas obrazowania time-lapse.
- Adaptacja do innych organelli wymaga walidacji sygnałów kierujących do mitochondriów w odniesieniu do alternatywnych sekwencji lokalizacji.
- Ograniczenie ze względu na żywotność przekrojów w czasie oraz potencjalną zmienność wydajności transdukcji pomiędzy preparatami.
