Name: Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa AAV i mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala badać dynamikę organelli w natywnym środowisku komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lindzie Hildegard Bergersen i Magnarowi Bjøråsowi za dostęp do laboratorium komórkowego i sprzętu, pracownikom Janelia Molecular Biology Shared Resource do produkcji plazmidów i wirusów oraz Koenowi Vervaeke za pomoc w pomiarach mocy lasera. Prace te zostały sfinansowane przez Norweskie Stowarzyszenie Zdrowia, Norweską Radę ds. Badań Naukowych, a sprzęt mikroskopowy został sfinansowany przez Norbrain.

<ol><li>Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+oligodendrocyte+processes+during+development+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neursosci%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo.</a> Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).</li>
<li>Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+distribution+of+endoplasmic+reticulum+proteins+and+mitochondria+at+specialized+Ca2%2B+release+sites+in+oligodendrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes.</a> J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+imaging+of+myelin+degradation+reveals+a+calcium-dependent+pathway+in+lyso-PtdCho-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination.</a> J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nat. Med. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+viral+vector+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated viral vector production and purification.</a> Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).</li>
<li>Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+gene+contains+separate+enhancers+for+oligodendrocyte+and+Schwann+cell+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression.</a> J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+and+structure+of+mitochondria+in+oligodendrocytes+and+their+myelin+sheaths%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths.</a> Glia. 64, 810-825 (2016).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).</li>
<li>Macaskill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oligodendrocyte+development+and+myelination+by+glucose+and+lactate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate.</a> J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).</li>
<li>Davison, A. N., Dobbing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+as+a+vulnerable+period+in+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Myelination as a vulnerable period in brain development.</a> Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+neuronal+degeneration+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures.</a> Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Pignataro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Viral+Vectors+Serotype+8+for+Cell-Specific+Delivery+of+Therapeutic+Genes+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System.</a> Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).</li>
<li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticospinal+tract+transduction%3A+a+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Ther. 19, 49-60 (2012).</li>
<li>Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+composition+of+molecular+motors+on+moving+axonal+cargo+using+cargo+mapping+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis.</a> J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisany tutaj protokół tworzenia kultur organotypowych jest zmodyfikowaną wersją18 protokołu opisanego przez De Simoni i Yu (2006)5. Najważniejsze zmiany zostały przedstawione poniżej. Bufor Tris jest dodawany do pożywki hodowlanej, co poprawia przeżywalność wycinków poza inkubatorem podczas transdukcji wirusa i zmiany pożywki komórkowej. Zmianie uległa również procedura sterylizacji konfetti. Podczas gdy inne protokoły sterylizują konfetti przez autoklawowanie, nie zalecam...

Istota biała mózgu składa się z aksonów komórek nerwowych owiniętych mieliną, wyspecjalizowaną przedłużoną błoną plazmatyczną utworzoną przez oligodendrocyty. Mielina jest niezbędna do szybkiej i niezawodnej propagacji potencjału czynnościowego i długoterminowego przeżycia mielinizowanych aksonów, a utrata mieliny może powodować dysfunkcję neurologiczną. Pomimo ich znaczenia, właściwości oligodendrocytów są mniej znane w porównaniu z neuronami i astrocytami. W związku z tym opracowano mniej narzędzi do badania oligodendrocytów.
Obrazowanie na żywo organelli komórkowych, takich jak mitochondria, retikulum endoplazmatyczne (ER) lub różne struktury pęcherzykowe, może być przydatne do badania dynamicznych zmian w organellach w czasie. Tradycyjnie, obrazowanie żywych oligodendrocytów przeprowadzono w monokulturach1,2. Jednak oligodendrocyty w monokulturze nie wykazują zwartej mieliny, a zatem organotypowe lub ostre wycinki mózgu mogą być lepszą opcją podczas badania lokalizacji i ruchu organelli. Lokalizacja małych organelli i białek w osłonce mielinowej może być trudna ze względu na niewielką odległość między mielinowym aksonem a otaczającą go osłonką mielinową. W związku z tym same procedury barwienia immunologicznego pod mikroskopem nie mają rozdzielczości przestrzennej, aby odróżnić organelle w osłonce mielinowej od tych w mielinizowanym aksonie. Można to rozwiązać poprzez transdukcję wirusa z genami białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na organelle, napędzanych przez promotory specyficzne dla typu komórki. Zaletą jest specyficzna dla komórki i rzadka ekspresja, która umożliwia dokładną ocenę lokalizacji i dynamiki organelli. Zwierzęta transgeniczne mogą być również wykorzystywane do osiągnięcia takiej ekspresji specyficznej dla komórek ukierunkowanej na organelle3. Jednak produkcja i utrzymanie zwierząt transgenicznych jest kosztowne i zwykle nie zapewnia rzadkiej ekspresji, którą można osiągnąć metodami wirusowymi.
Opisana tutaj metoda wykorzystuje transdukcję wirusową oligodendrocytów za pomocą mitochondrialnych białek fluorescencyjnych (dsred lub białka zielonej fluorescencji, GFP) napędzanych przez podstawowy promotor białka mieliny (MBP-mito-dsred lub MBP-mito-GFP) do wizualizacji mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu. Ponadto ekspresja innego białka fluorescencyjnego w cytoplazmie (GFP stosowanego razem z mito-dsred lub tdtomato stosowanego z mito-GFP) jest wykorzystywana w celu umożliwienia wizualizacji morfologii komórki, w tym przedziałów cytoplazmatycznych osłonki mielinowej. Protokół zawiera procedurę tworzenia organotypowych wycinków mózgu (zmodyfikowana wersja protokołu opisanego przez De Simoni i Yu, 20064,5). Następnie opisujemy procedurę obrazowania poklatkowego do badania ruchu mitochondriów. W tej procedurze wykorzystuje się pionowy mikroskop konfokalny z ciągłą wymianą podłoża obrazowego, konfigurację, która umożliwia łatwe stosowanie leków lub innych zmian podłoża podczas obrazowania. Procedurę obrazowania poklatkowego można wykonać na dowolnym mikroskopie konfokalnym, z dodatkowym sprzętem do konserwacji żywych plastrów, jak opisano poniżej. Protokół zawiera również kilka wskazówek dotyczących optymalizacji obrazowania i zmniejszenia fototoksyczności.
Na koniec, opisany jest szybki i prosty sposób wizualizacji niebarwionej mieliny za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej (CoRe). Może to być przydatne do identyfikacji osłonki mielinowej podczas obrazowania na żywo. W ostatnich latach opracowano kilka technik obrazowania mieliny bez konieczności barwienia, ale większość z nich wymaga specjalnego sprzętu i specjalistycznej wiedzy6,7,8. Opisana tutaj procedura wykorzystuje właściwości odblaskowe osłonki mielinowej i jest uproszczoną wersją mikroskopii spektralnej konfokalnej odbicia (SCoRe, w której kilka długości fal laserowych jest łączonych w celu wizualizacji mieliny)9. CoRe można wykonać na dowolnym mikroskopie konfokalnym, który jest wyposażony w laser 488 nm i filtr emisyjny pasmowo-przepustowy 470 - 500 nm lub przestrajalny filtr emisyjny.

<table><tbody><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td><td>Igły do wchodzenia i wylotu kąpieli</td></tr><tr><td>Gaz wodorotlenkowy</td><td>AGA</td><td>105701</td><td></td></tr><tr><td>Żarówki do pipet marki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615927</td><td></td></tr><tr><td>Palnik Bunsena (palnik na ciekły propan)</td><td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>Zespół kablowy do sterowników grzałki</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0106&nbsp;</td><td>Regulator temperatury - część termometru</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>CO2 do inkubatora</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe, kwadratowe Corning</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>Do mocowania pod wanną w celu obrazowania na żywo. Uszczelnij klejem lub wazeliną.</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne kleszcze</td><td>Finescience</td><td>11063-07</td><td>Do preparacji</td></tr><tr><td>Diamentowe pióro do rysowania</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane pipety Pasteura 230 mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>Pipety szklane</td></tr><tr><td>Dwustronna żyletka ze stali nierdzewnej</td><td>Mikroskopia elektronowa</td> <td>Sciences#7200</td><td>Żyletka do wibratomu</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>Krążki z bibuły filtracyjnej</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>300,220</td><td>Bibuła filtracyjna służąca do filtracji PFA</td></tr><tr><td>Fun tack</td><td>Loctite</td><td>1270884</td><td>Służy do podłączania/regulacji położenia wlotów i odpływów w wannie</td></tr><tr><td>Ręcznik do rąk C-Fold 2</td><td>Katrin</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>Harfa, płaska do komory RC-41,Warner</td> <td>Instruments</td><td>&nbsp; 64-1418</td><td>Harfa do przytrzymywania konfetti w kąpieli. Przed użyciem odetnij sznurki z plastrami organotypowymi. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES, FW: 260.3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir, Model 1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>Kaptur z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Surowica końska, inaktywowana termicznie</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LCR Membrana, PTFE,&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>FHLC0130</td><td>Konfetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica VT1200</td><td>Leica</td><td>14048142065</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td>MEM-Glutamax z HEPES</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>Mikro łyżka Heyman Typ B</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>62411-B</td><td>Mała, zaokrąglona szpatułka z zaostrzonym końcem do rozwarstwienia</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Millex-GP</td><td>Millipore</td><td>SLGPM33RA</td><td>Filtr strzykawkowy</td></tr><tr><td>Millipore Wkład do hodowli komórek milikomórkowych, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td>Wkładki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Moduł sterowania prędkością Minipuls 3</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>Pompa perystaltyczna do obrazowania na żywo - Część modułu sterującego (podłączyć do głowicy dwukanałowej)</td></tr> <tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>140675</td><td>Płytka hodowlana</td></tr><tr><td>Zawiesina nystatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000&nbsp;</td><td>Obiektyw do zanurzenia w wodzie używany do obrazowania na żywo. (WD=2.5mm), VIS-IR</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, granulowana</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna PC-R</td><td>SiSkiYou</td><td>&nbsp; 15280000E</td><td>Kąpiel do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 140 mm&nbsp;</td><td>Heger</td><td>1075</td><td>Duża szalka Petriego&nbsp;</td></tr><tr><td>szalka Petriego 92x16 mm&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>82.1473</td><td>Średnia szalka Petriego&nbsp;</td></tr><tr><td>Petridish 55x14,2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td><td>Mała szalka Petriego</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>Tabletki PBS</td></tr><tr><td>R2 Dwukanałowa głowica&nbsp;</td><td>GILSON</td><td>F117800</td><td>Pompa perystaltyczna do obrazowania na żywo - Dwukanałowa część głowicy (wymaga modułu sterującego)</td></tr><tr><td>Szpatułki okrągłe/płaskie, stal nierdzewna</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>Duża szpatułka do rozwarstwiania</td></tr><tr><td>Papier ścierny</td><td>VWR</td><td>MMMA63119</td><td>Opcjonalnie, do wygładzania potłuczonego szkła Pipety</td></tr><tr><td>Nożyczki,&nbsp; 17,5 cm</td><td>Finescience</td><td>14130-17</td><td>Duże nożyczki do preparacji</td></tr><tr><td>Nożyczki, 8,5&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>14084-08</td><td>Małe, ostre nożyczki do&nbsp; preparowania</td></tr><tr><td>Pojedyncza krawędź, ostrze klejnotu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>#71972</td><td>Żyletka z pojedynczą krawędzią</td></tr><tr><td>Pojedynczy podgrzewacz roztworu w linii SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>Regulator temperatury - część grzewcza</td></tr><tr><td>Steritop-GP Jednostka filtrująca, 500 ml, 45mm</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>Filtr do sterylizacji </td></tr><tr><td>rozwiązania Super klej precyzyjny</td><td>Loctite</td><td>1577386</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela chirurgicznego nr 22</td><td>Swann Morton Ltd.</td><td>209</td><td>Zaokrąglone ostrze skalpela</td></tr><tr><td>Regulator temperatury TC324B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0100</td><td>Regulator temperatury do obrazowania na żywo (wymaga grzałki roztworu i montażu)</td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z płaszczem wodnym seria II</td><td>Forma Scientific</td><td>78653-2882</td><td>Inkubator</td></tr></tbody></table>

wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Neurony polegają na izolacji elektrycznej i wsparciu troficznym oligodendrocytów mielinowych. Pomimo znaczenia oligodendrocytów, zaawansowanych narzędzi wykorzystywanych obecnie do badania neuronów, naukowcy zajmujący się oligodendrocytami tylko częściowo się zastanowili. Barwienie specyficzne dla typu komórki za pomocą transdukcji wirusa jest użytecznym podejściem do badania dynamiki żywych organelli. W artykule opisano protokół wizualizacji mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu poprzez transdukcję z wirusem związanym z adenowirusem (AAV) przenoszącym geny dla mitochondrialnych ukierunkowanych białek fluorescencyjnych pod kontrolą transkrypcyjną promotora białka zasadowego mieliny. Zawiera protokół tworzenia organotypowych wycinków mózgu myszy koronalnej. Następnie następuje procedura obrazowania poklatkowego mitochondriów. Metody te można przenieść na inne organelle i mogą być szczególnie przydatne do badania organelli w osłonce mielinowej. Na koniec opisujemy łatwo dostępną technikę wizualizacji niebarwionej mieliny w żywych wycinkach za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej (CoRe). CoRe nie wymaga dodatkowego sprzętu i może być przydatne do identyfikacji osłonki mielinowej podczas obrazowania na żywo.

Organotypowe skrawki mózgu, które były hodowane i transdukowane zgodnie z powyższym opisem, wykazały rzadki rozkład oligodendrocytów korowych wykazujących ekspresję mito_dsred i GFP. Immunobarwienie z użyciem przeciwciał przeciwko Olig2 i MBP potwierdziło, że ekspresja była specyficzna dla oligodendrocytów (Rycina 1).
W przypadku obrazowania żywych komórek, przetransdukowane oligodendrocyty rozpozna...

Oligodendrocyty mielinizujące sprzyjają szybkiemu rozprzestrzenianiu potencjału czynnościowego i przetrwaniu neuronów. Opisano tutaj protokół specyficznej dla oligodendrocytów ekspresji białek fluorescencyjnych w organotypowych wycinkach mózgu z późniejszym obrazowaniem poklatkowym. Ponadto przedstawiono prostą procedurę wizualizacji niebarwionej mieliny.

Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Ogólnym celem tej transdukcji wirusowej i rejestracji time-lapse jest wizualizacja ruchu mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych skrawkach mózgu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad oligodendrocytami, takie jak sposób, w jaki oligodendrocyty i ich organelle reagują na zmiany w lokalnym środowisku. Główną zaletą tej techniki jest dostarczenie szczegółowych informacji o strukturze oligodendrocytów i dynamice organelli w preparacie, w którym obecne są wszystkie rodzaje komórek mózgowych, a oligodendrocyty wytwarzają zwartą mielinę. Przeprowadź transdukcję oligodendrocytów w kulturach skrawków w siódmym dniu in vitro. Najpierw pobierz 1.3 µL rozcieńczonego AAV na jeden skrawek. Upewniając się, że zewnętrzna strona końcówki pipety jest sucha, trzymaj pipetę nad korą tak blisko, jak to możliwe, nie dotykając końcówką skrawka, i powoli wypchnij roztwór z pipety. Gdy roztwór dotknie skrawka, przesuń końcówkę pipety nad korą, aby rozprowadzić roztwór na całej powierzchni kory. Po dokonaniu transdukcji wszystkich skrawków w jednej szalce, przenieś szalkę z powrotem do inkubatora, a następnie powtórz proces w pozostałych szalkach. Sprawdź skraw

visualization-live-imaging-oligodendrocyte-organelles-organotypic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy...

Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Źródło: Moye, S. L., et.al.  Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą żółtej jonoforezy Lucyfera. J. Vis. Exp. (2019).  Ten film demonstruje zastosowanie jonoforezy barwnika fluorescencyjnego do badania morfologii astrocytów w utrwalonych wycinkach mózgu. Szczegółowo opisuje przekłuwanie somy astrocytów elektrodą w celu dostarczenia anionowego, hydrofilowego barwnika do cytoplazmy pod prądem o niskim napięciu, umożliwiając barwnikowi dyfuzję i znakowanie somy i gałęzi. Mikroskopia...

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy barwnika fluorescencyjnego w nieruchomym wycinku mózgu myszy

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Aby zająć się mechanizmami demielinizacji i apoptozy neuronów w uszkodzeniach korowych zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, używane są różne modele zwierzęce. Opisujemy tutaj podejście ex vivo polegające na użyciu limfocytów T CD8 + specyficznych dla oligodendrocytów na wycinkach mózgu, co powoduje śmierć oligodendroglialną i neuronalną. Omówiono potencjalne zastosowania i ograniczenia modelu.

Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Poznaj metodę wizualizacji mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa AAV i mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala badać dynamikę organelli w natywnym środowisku komórkowym.

Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów