Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej

Oligodendrocyty mielinizujące sprzyjają szybkiemu rozprzestrzenianiu potencjału czynnościowego i przetrwaniu neuronów. Opisano tutaj protokół specyficznej dla oligodendrocytów ekspresji białek fluorescencyjnych w organotypowych wycinkach mózgu z późniejszym obrazowaniem poklatkowym. Ponadto przedstawiono prostą procedurę wizualizacji niebarwionej mieliny.

Ogólnym celem tej transdukcji wirusa i zapisu poklatkowego jest wizualizacja ruchu mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie oligodendrocytów. Na przykład to, jak oligodendrocyty i ich organelle reagują na zmiany w lokalnym środowisku. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza szczegółowych informacji na temat struktury oligodendrocytów i dynamiki organelli w preparacie, w którym obecne są wszystkie różne komórki mózgowe, a oligodendrocyty wytwarzają zwartą mielinę. Transdukcja oligodendrocytów w kulturach plastrowych w siódmym dniu in vitro. Najpierw narysuj 1,3 mikrolitra rozcieńczonego AAV na plasterek. Upewnij się, że zewnętrzna strona końcówki pipety jest sucha, trzymaj pipetę nad korą mózgową tak blisko, jak to możliwe, nie dotykając plasterka końcówką pipety i powoli wypychaj roztwór z pipety. Gdy roztwór dotknie plasterka, przesuń końcówkę pipety po korze mózgowej, aby rozprowadzić roztwór na całym obszarze kory. Gdy wszystkie plastry w jednym naczyniu zostaną przetransdukowane, włóż naczynie z powrotem do inkubatora, a następnie powtórz proces na innych szalkach. Zbadaj wycinki pod kątem ekspresji markerów fluorescencyjnych i zobrazuj wycinki, gdy poziomy ekspresji markerów fluorescencyjnych są wystarczające, a plasterki wyglądają zdrowo. Rozpocznij ustawianie kąpieli obrazowej od użycia plasteliny do przymocowania igieł strzykawkowych zgiętych pod kątem 45