Name: Obrazowanie na żywo migracji komórek nabłonka piersi po przejściowym wyczerpaniu TIP60 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo migracji komórek nabłonka piersi MCF10A po wyczerpaniu TIP60. Technika ta umożliwia dynamiczną analizę ruchu komórek w czasie rzeczywistym w badaniach nad metastazą nowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Jha za ich pomocną dyskusję i komentarze. S.J. był wspierany przez granty z National Research Foundation Singapore i Ministerstwa Edukacji Singapuru w ramach inicjatywy Research Centers of Excellence dla Cancer Science Institute of Singapore (R-713-006-014-271), National Medical Research Council (CBRG-NIG; BNIG11nov001 oraz CS-IRG; R-713-000-162-511), Fundusz Badań Akademickich Ministerstwa Edukacji (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. i C.Y.T. były wspierane przez stypendium podyplomowe przyznane przez Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną MCF10A: Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM)/F12 (1:1) firmy Dulbecco z 5% surowicą końską, 20 ng/ml nabłonkowym czynnikiem wzrostu, 0,5 mg/ml hydrokortyzonu, 100 ng/ml toksyny i 10 μg/ml insuliny.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę bez surowicy: DMEM/F12 (1:1) z 20 ng/ml nabłonkowego czynnika wzrostu, 0,5 mg/ml hydrokortyzonu, 100 ng/ml toksyny i 10 μg/ml insuliny.</li>
	<li>Użyj następującej sekwencji siRNA: 
	siControl: 
	Do przodu: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' 
	Rewers: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' 
	siTIP60: 
	Do przodu: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' 
	Rewers: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>Użyj 10-centymetrowych naczyń do hodowli komórkowych i 24-dołkowych płytek.</li>
</ol>
2. Przejściowe wyczerpanie TIP60 za pomocą siRNA
<ol>
	<li>W dniu 1 należy podać 15 μl odczynnika do transfekcji (np. Lipofectamine RNAiMAX) i 2 ml zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM) i wymieszać je odpowiednio z 10 μl każdego siRNA (zapas 10 μM).</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Wysiew 1 x 106 komórek MCF10A wraz z 3 ml pożywki hodowlanej w naczyniu o średnicy 10 cm. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę siRNA kropla po kropli do 10 cm naczynia.</li>
	<li>Wstrząsnąć naczyniem, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone przed umieszczeniem go w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 6 godzinach inkubacji zastąpić pożywkę zawierającą siRNA 8 ml świeżej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>W dniu 2 przygotuj kolejną partię mieszanin siRNA i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Odessać 8 ml pożywki dodanej w dniu 1 i zastąpić ją 3 ml świeżej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodaj drugą partię mieszaniny siRNA do naczyń kropla po kropli. Wstrząśnij naczyniami, aby upewnić się, że odczynniki są całkowicie wymieszane przed włożeniem ich do inkubatora.</li>
	<li>Po 6 godzinach zastąp pożywkę zawierającą siRNA 8 ml świeżej pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
3. Komórki nasienne do badania gojenia ran
<ol>
	<li>W dniu 3 należy wyrzucić pożywkę i raz przemyć komórki 2 ml buforowanego roztworem soli fizjologicznej (PBS). Odrzuć bufor PBS.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki traktowane siControl i siTIP60, dodając 1 ml 1x buforu trypsyna-EDTA do płytki. Włóż go z powrotem do inkubatora na 20 minut.</li>
	<li>Dodać 4 ml kompletnej pożywki hodowlanej do każdej płytki, ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 200 g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki wolnej od surowicy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek 6 x 105 komórek/ml zarówno dla siControl, jak i siTIP60; upewnić się, że komórki są dobrze wymieszane. Dodaj 500 μl zawiesiny komórkowej do jednego dołka 24-dołkowej płytki, aby zapewnić 100% zgrywkę. Wysiewaj od 5 do 6 dołków każdy dla siControl i siTIP60.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij talerzem w przód i w tył, a następnie z boku na bok, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Unikaj ruchów okrężnych. Pozostaw płytkę w inkubatorze na 24 godziny.</li>
	<li>Zbierz pozostałe komórki, aby sprawdzić skuteczność powalania TIP60. W tym celu należy odwirować pozostałą zawiesinę komórek o masie 200 g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Wyizoluj RNA za pomocą komercyjnego odczynnika, postępując zgodnie z protokołem producenta, i przystąp do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, aby ocenić skuteczność knockdownu.</li>
</ol>
4. Stwórz ranę
<ol>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem kontrastu fazowego, aby upewnić się, że komórki są w pełni połączone. Obserwuj komórki pod mikroskopem (powiększenie 4x, 10x i 20x), aby upewnić się, że komórki są w pełni przyczepione, że utworzyła się zlewająca się monowarstwa komórek. 
	UWAGA: ogniwa siControl zwykle przyczepiają się lepiej niż ogniwa siTIP60. Jest to oczekiwane, ponieważ wyczerpanie TIP60 sprawia, że komórki są bardziej mezenchymalne20. W tym przypadku używany jest zwykły stacjonarny mikroskop z kontrastem fazowym światła białego.</li>
	<li>Aby wytworzyć ranę, delikatnie podrapaj prostą linię w poprzek środka studzienki za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl; długość powstałej rany jest taka sama jak średnica studzienki. Powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych studzienek. Do każdego dołka należy użyć nowej końcówki do pipety.</li>
	<li>Delikatnie umyj każdą studzienkę 5 razy za pomocą pożywki bez surowicy, aby usunąć oderwane komórki.</li>
	<li>Dodaj 1 ml pożywki bez surowicy do każdego dołka i przystąp do obrazowania żywych komórek.</li>
</ol>
5. Konfiguracja obrazowania żywych komórek
<ol>
	<li>Włącz mikroskop i regulator temperatury co najmniej 1 godzinę przed ustawieniem obrazowania żywych komórek, aby upewnić się, że temperatura w komorze osiągnie 37 °C.</li>
	<li>Włącz dopływ dwutlenku węgla (CO2 ) przed rozpoczęciem obrazowania żywych komórek. Ustaw stężenie CO2 na 5%.</li>
	<li>Umieść 24-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i wybierz soczewkę obiektywu o 10-krotnym powiększeniu do obrazowania. Skieruj emitowane światło na okulary zamiast na aparat i dostosuj ostrość, aby zlokalizować ranę i komórki wokół niej. 
	UWAGA: W tym przypadku zastosowano światło białe z kontrastem fazowym.</li>
	<li>Użyj systemu obserwatora żywych komórek, aby oznaczyć położenie rany w każdym dołku. 
	UWAGA: Zautomatyzowany etap systemu obrazowania żywych komórek pozwala na akwizycję obrazu w wielu pozycjach. Zdjęcia są wykonywane w każdej oznaczonej pozycji raz na interwał.</li>
	<li>Ustaw warunek czasowy: 1 h interwał i 72 h czas trwania; zgodnie z tym ustawieniem system będzie robił zdjęcia w każdej zaznaczonej pozycji co godzinę przez 72 h. Ustaw dowolny żądany przedział czasu i okres monitorowania. 
	UWAGA: W tym przypadku najlepszy jest czas trwania 72 godzin, ponieważ komórki te zaczynają obumierać po 72 godzinach w pożywce bez surowicy.</li>
</ol>
6. Śledzenie ruchu pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Eksportuj dane po 72 godzinach. Eksportuj dane zarówno jako obrazy w formacie JPEG, jak i jako filmy w formacie AVI. 
	UWAGA: Jest to ważne, ponieważ oprogramowanie ImageJ rozpoznaje filmy tylko w formacie AVI. Na filmie można wyraźnie zaobserwować różne prędkości migracji komórek między komórkami siTIP60 i siControl.</li>
	<li>Otwórz wideo AVI w oprogramowaniu ImageJ.</li>
	<li>Otwórz wtyczkę MTrackJ (wtyczkę należy pobrać i zainstalować osobno): Wtyczki > MtrackJ.</li>
	<li>Dodaj ścieżkę dla pojedynczych komórek wybranych z filmu, klikając kartę "Dodaj" na pasku narzędzi MtrackJ. Wybierz komórkę na końcu frontu inwazyjnego i komórkę, która może migrować samodzielnie (migracja jednokomórkowa). Śledź ruch wybranych komórek na filmie i śledź je za pomocą MtrackJ.</li>
	<li>Zmierz odległość ruchu, klikając zakładkę "zmierz" na pasku narzędzi. 
	UWAGA: W tym przypadku prawie żadna komórka w siControl nie poruszała się jako pojedyncze komórki, co utrudniało pomiar ruchu pojedynczej komórki, podczas gdy wiele komórek siTIP60 poruszało się jako pojedyncze komórki. Jednak ruch komórek zlokalizowanych na froncie inwazyjnym można nadal śledzić i obliczać zarówno w komórkach siControl, jak i siTIP60.</li>
	<li>Zapisz wideo ze ścieżkami w formacie AVI.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja zdolności migracji komórek
<ol>
	<li>Do kwantyfikacji wybierz obrazy w godzinie 0 i obrazy w godzinie "n", gdzie "n" odnosi się do punktu czasowego, w którym komórki siTIP60 lub siControl całkowicie zamknęły ranę. 
	UWAGA: W tym przypadku wybrano 48 godzin, ponieważ rany w komórkach siTIP60 były prawie całkowicie zamknięte.</li>
	<li>Określ ilościowo migrację procentową za pomocą ImageJ, korzystając z następującego wzoru: (obszar rany w 0 h - obszar rany w "n" h) / obszar rany w 0 h x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li>
<li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li>
<li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Rvb1%2FTip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60%2FNuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li>
<li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions+of+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li>
<li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control%3A+many+tricks+in+one+HAT%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li>
<li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li>
<li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li>
<li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration%2C+metastasis%2C+and+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li>
<li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li>
<li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li>
<li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+EDD1%2FUBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wiadomo, że w procesie migracji komórek komórki mogą poruszać się w postaci przylegających arkuszy; luźne grona; lub pojedyncze, izolowane komórki. Tryb i dynamika inwazji komórek może się różnić w zależności od stanu, a fenotyp może się zmienić w ciągu kilku godzin. Tradycyjny test gojenia się ran opiera się na zdjęciach migawkowych wykonanych z mikroskopu w długim odstępie czasu, takim jak 12 lub 24 godziny. Utrudnia to uchwycenie dynamiki zamykania się rany i wzorca ruchów komórek.
Z drugie...

HIV-Tat-interactive białko 60 kDa (TIP60) to acetylotransferaza lizynowa, która może acetylować zarówno białka histonowe, jak i niehistonowe1,2. Stwierdzono, że jego funkcje mają wpływ na wiele szlaków sygnałowych, w tym transkrypcję, naprawę uszkodzeń DNA i apoptozę1,3,4,5,6,7,8. Co więcej, TIP60 jest często regulowany w dół w nowotworach, a jego obniżenie jest skorelowane z przerzutami raka i słabymi wskaźnikami przeżycia9,10,11,12,13,14. Przerzuty nowotworowe są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Jest to proces wieloetapowy, a początkowy etap przerzutów obejmuje migrację i inwazję komórek nowotworowych do sąsiednich tkanek15,16. Aby to zrobić, komórki nowotworowe muszą najpierw odłączyć się od pierwotnej masy nowotworowej, albo w postaci kolektywnie atakującego arkusza komórek, albo jako oderwane pojedyncze komórki17. Podczas tego procesu komórki nowotworowe często przechodzą przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT), co powoduje zmiany w morfologii i zdolności adhezji komórek17,18.
Opracowano kilka technik do badania zdolności migracji i inwazji komórek nowotworowych in vitro. Wśród nich test gojenia się ran jest najbardziej wydajny i ekonomiczny19. Po pierwsze, metoda ta polega na utworzeniu sztucznej luki na zlewającej się monowarstwie komórek, umożliwiając w ten sposób komórkom migrację i zamknięcie luki. Po drugie, obrazy luk mogą być rejestrowane na początku i na końcu eksperymentu. Na koniec stosuje się porównanie zamykania luki w celu określenia szybkości migracji komórek. Mikroskop z kontrastem fazowym jest zwykle używany do rejestrowania obrazów do konwencjonalnych testów gojenia się ran. Kolejną zaletą testu gojenia się ran jest to, że częściowo przypomina on migrację komórek nowotworowych in vivo. Podobnie jak w przypadku przerzutów nowotworowych in vivo, migracja komórek w testach gojenia się ran wykazuje zarówno zbiorową migrację arkuszy nabłonka, jak i migrację oderwanych pojedynczych komórek.
Wiadomo jednak, że migracja komórek jest dynamiczna i istnieje potrzeba dokumentowania ruchu komórek w czasie rzeczywistym. Na przykład konwencjonalny test gojenia się ran nie pozwala badaczowi na analizę ruchu pojedynczej komórki. Z drugiej strony, komórki hodowane do testów gojenia się ran są często głodne surowicy, aby zahamować proliferację komórek. Ma to na celu wykluczenie możliwości zamknięcia luki z powodu proliferacji komórek. Niemniej jednak nadal będzie występować pewna proliferacja i śmierć komórki, a obrazy z kontrastem fazowym wykonane przed i po eksperymencie nie są w stanie ich rozróżnić.
Technika obrazowania żywych komórek rozwiązuje to ograniczenie konwencjonalnych testów gojenia ran. Korzystając z mikroskopu do obrazowania na żywo w połączeniu z inkubatorem CO2 i odpowiednią kontrolą temperatury, naukowcy mogą zmierzyć wielkość luki i tempo jej zamykania w czasie, śledząc ruch aktywnie migrujących komórek znajdujących się na końcach frontu inwazyjnego. W związku z tym wdrożenie obrazowania żywych komórek w celu monitorowania migracji komórek nie tylko zapewni lepszą wizualizację migracji komórek, ale także umożliwi rozróżnienie między migracją komórek a proliferacją komórek, zapewniając w ten sposób bardziej wiarygodną analizę migracji komórek.
W tym badaniu, komórki nabłonka piersi MCF10A zostały użyte do zademonstrowania kombinacji testu gojenia ran i obrazowania żywych komórek w celu zbadania roli TIP60 w migracji komórek. Wyczerpanie TIP60 powoduje zwiększenie zdolności migracyjnych w komórkach MCF10A.

<table><tbody><tr><td>Komórka MCF10A</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317TM</td><td>Pożywka dla komórek nabłonka piersi</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>Pożywka hodowlana MCF10A</td></tr><tr><td>Nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Suplementy do pożywek hodowlanych MCF10A</td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8052</td><td>Suplementy do pożywek</td></tr> <tr><td>hodowlanych MCF10AHydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0888</td><td>Suplementy do pożywek hodowlanych MCF10A</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1882</td><td>Suplementy do pożywek hodowlanych MCF10A</td></tr><tr><td>Surowica domowa</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Suplementy do pożywek hodowlanych MCF10A</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Do MCF10A odłączyć od płytki</td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Opti-MEM o zmniejszonej pożywce surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Do mieszaniny siRNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>56532</td><td>Odczynnik transfekcyjny</td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Do ekstrakcji mRNA</td></tr><tr><td>iScript Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>Do cDNA generacja</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5125</td> Do szybkiego systemu PCR w <td>czasie rzeczywistym qPCR</td></tr><tr><td>7500 Biosystems</td><td></td><td></td><td>Mechaniczna maszyna do qPCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>10-centymetrowa szalka</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td>Do eksperymentu Knockdown</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td>Do oznaczania gojenia ran</td></tr><tr><td>siControl siRNA</td><td>Self zaprojektowany</td><td>Samodzielnie zaprojektowany</td><td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td></tr><tr><td>siTIP60 siRNA</td><td>Samodzielnie zaprojektowany</td><td></td><td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td></tr><tr><td>Obserwator żywych komórek</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Zeiss Obserwator odwróconych komórek do eksperymentów</td><td></td> z żywymi komórkami</tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo migracji komórek nabłonka piersi po przejściowym wyczerpaniu tip60

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Test gojenia ran jest skuteczny i jest jednym z najbardziej ekonomicznych sposobów badania migracji komórek in vitro. Tradycyjnie obrazy są wykonywane na początku i na końcu eksperymentu za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym, a zdolności migracyjne komórek są oceniane przez zamknięcie ran. Jednak ruch komórek jest zjawiskiem dynamicznym, a konwencjonalna metoda nie pozwala na śledzenie ruchu pojedynczej komórki. Aby ulepszyć obecne testy gojenia się ran, wykorzystujemy techniki obrazowania żywych komórek do monitorowania migracji komórek w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala nam określić szybkość migracji komórek w oparciu o system śledzenia komórek i zapewnia wyraźniejsze rozróżnienie między migracją komórek a proliferacją komórek. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie obrazowania żywych komórek w testach gojenia się ran w celu zbadania różnych zdolności migracyjnych komórek nabłonka piersi, na które wpływa obecność TIP60. Ponieważ ruchliwość komórek jest bardzo dynamiczna, nasza metoda zapewnia więcej wglądu w procesy gojenia się ran niż migawka zamknięcia rany wykonana za pomocą tradycyjnych technik obrazowania stosowanych do oznaczania gojenia ran.

Ogólny schemat testu migracji komórek opartego na obrazowaniu żywych komórek 
Rysunek 1A przedstawia schemat tego protokołu. Komórki MCF10A przetransfekowane za pomocą siControl wykazywały typową morfologię nabłonkową. Po usunięciu TIP60 komórki MCF10A wykazywały większy charakter mezenchymalny w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Rysunek 1B).
<stro...

Tutaj prezentujemy monitorowanie migracji komórek w czasie rzeczywistym w teście gojenia ran przy użyciu komórek nabłonka piersi MCF10A zubożonych w TIP60. Implementacja technik obrazowania żywych komórek w naszym protokole pozwala nam analizować i wizualizować ruch pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym i w czasie.

Obrazowanie na żywo migracji komórek nabłonka piersi po przejściowym wyczerpaniu TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja wpływu wyciszenia specyficznych genów zainteresowania na migrację komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące przerzutowania nowotworów, takie jak mechanizmy migracji komórek rakowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość monitorowania dynamicznej migracji komórek w czasie rzeczywistym.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy obserwowaliśmy zmiany w morfologii komórek po wyciszeniu TIP60, białka supresorowego nowotworów. Należy rozpocząć od wysiania jednego miliona komórek nabłonkowych piersi w trzech mililitrach pożywki hodowlanej na szalkę 10 centymetrów. Do badanej hodowli komórkowej należy dodawać kroplami mieszaninę SRINA inkubowaną przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Ręcznie potrząśnij obiema szalkami, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone, a następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po sześciu godzinach zastąp nadsącz ośmioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej na szalkę i wprowadź hodowle z powrotem do inkubatora. Następnego ranka zastąp nadsącz trzema mililitrami świeżej pożywki hodowlanej na szalkę i dodaj drugą porcję mieszaniny SIRNA do eksperymentalnej hodowli komórkowej, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, potrząsając szalką, aby zapewnić pełne wymieszanie odczynników przed powrotem komórek do inkubatora.Następnie po sześciu godzinach należy zastąpić naddatki ośmioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i inkubować hodowle przez noc. Trzeciego dnia komórki należy przemyć jednokrotnie dwiema mililitrami BPS na płytkę, a następnie odkleić komórki z obu płytek za pomocą jednego mililitra trypsyny EDTA na naczynie, inkubując przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu inkubacji reakcję należy przerwać, dodając cztery mililitry pełnej pożywki hodowlanej na płytkę.Resuspendować komórki poprzez pipetowanie i przenieść zawiesiny komórkowe do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml. Zebrać komórki przez wirowanie i resuspendować osady w 5 ml medium bezsurowiczego na każdą probówkę. Po policzeniu rozcieńczyć obie kultury komórkowe do stężenia 600 000 komórek na ml i dodać 500 µL komórek z każdej kultury do jednego dołka płytki 24-dołkowej, aby zapewnić 100% konfluencji.Po wysianiu wszystkich komórek, delikatnie potrząśnij płytką w przód i w tył oraz na boki, aby zapewnić równomierny rozkład, a następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Aby sprawdzić wydajność wyciszenia wybranego genu, zbierz pozostałe komórki do probówek zbiorczych za pomocą kolejnego wirowania i wyizoluj RNA z osadów, używając komercyjnego odczynnika zgodnie z instrukcjami producenta w celu przeprowadzenia ilościowej analizy qPCR w czasie rzeczywistym. Następnego dnia rano, co najmniej godzinę przed rozpoczęciem obrazowania żywych komórek, włącz mikroskop oraz system kontroli temperatury.Ustaw temperaturę na 37 °C oraz dopływ dwutlenku węgla na 5%. Gdy komora osiągnie 37 °C, użyj mikroskopii fazokontrastowej, aby potwierdzić, że komórki są konfluentne i w pełni przytwierdzone do dna studni. Następnie, używając końcówki do pipety 200 µL, delikatnie zadrap cały odcinek wzdłuż środka każdej studni, a następnie delikatnie przemyj wszystkie studnie pięciokrotnie pożywką bez surowicy, aby usunąć oderwane komórki. Po ostatnim płukaniu dodaj 1 mL pożywki bez surowicy do każdej studni.Umieść płytkę na stole mikroskopu pod obiektywem 10x i skieruj emitowane światło do okularów zamiast do kamery. Ręcznie dostrój ostrość, aby zlokalizować każdą ranę oraz komórki wokół niej. Następnie skieruj emitowane światło z powrotem do kamery i użyj systemu obserwacji żywych komórek, aby zaznaczyć położenie ran i ustawić warunki czasowe.Wykonaj obrazowanie komórek dla odpowiedniego okresu eksperymentalnego, następnie otwórz pierwszy plik wideo w formacie avi w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania i uruchom wtyczkę mTrackJ. Kliknij kartę add, aby dodać ścieżkę dla pojedynczych komórek, a następnie wybierz jedną komórkę na czole frontu inwazyjnego oraz jedną komórkę zdolną do samodzielnej migracji. Śledź ruch wybranych komórek na wideo za pomocą mTrackJ, aby wyznaczyć trajektorie ich przemieszczania się.Następnie kliknij kartę pomiaru (measure), aby zmierzyć dystans przemieszczenia komórek, i zapisz filmy wraz z torami ruchu w formacie avi. Po wyczerpaniu zapasów TIP60 komórki nabłonka piersi wykazują większy charakter mezenchymalny w porównaniu z komórkami kontrolnymi w hodowli. Rzeczywiście, ekspresja TIP60, jak i ekspresja cząsteczki adhezyjnej komórek nabłonkowych, ulega znacznemu zmniejszeniu po zastosowaniu siTIP60.Z drugiej strony, ekspresja specyficznych genów sterujących przejściem epitelialno-mezenchymalnym wzrasta po wyciszeniu TIP60. Obrazowanie na żywo hodowli komórkowych po wykonaniu testu rany wykazuje szybszą migrację komórek traktowanych siTIP60 w porównaniu z hodowlami siControl, przy czym w odpowiedzi na wyciszenie TIP60 zaobserwowano znaczący wzrost odsetka migrujących komórek. Ponadto komórki siControl przemieszczają się jako płat, podczas gdy w hodowlach siTIP60 obserwuje się częściej ruch pojedynczych komórek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania techniki obrazowania żywych komórek do monitorowania dynamicznych zmian w migracji komórek.

live-imaging-breast-epithelial-cell-migration-after-transient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj opisujemy metodę długoterminowej mikroskopii poklatkowej do długotrwałego śledzenia pojedynczych komórek w odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe.

Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

W tym artykule opisujemy protokół opisujący metodę in vivo do pomiaru dynamicznej niestabilności mikrotubul w komórkach raka piersi opornych na docetaksel (MCF-7TXT). W tej metodzie stosuje się system obrazowania mikroskopii dekonwolucyjnej do wykrywania ekspresji tubuliny GFP w komórkach docelowych.

Obrazowanie na żywo w celu zbadania dynamicznej niestabilności mikrotubul w raku piersi opornym na taksany

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Zgłaszamy technikę pozwalającą na obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka (GBM) atakujących tkankę mózgową kręgowców. Sprzężenie ortotopowego wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek GBM do przezroczystego mózgu danio pręgowanego z obrazowaniem przyżyciowym o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar dynamiki cytoszkieletu podczas inwazji raka in situ.

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania na żywo migracji komórek nabłonka piersi MCF10A po wyczerpaniu TIP60. Technika ta umożliwia dynamiczną analizę ruchu komórek w czasie rzeczywistym w badaniach nad metastazą nowotworową.

Obrazowanie na żywo migracji komórek nabłonka piersi po przejściowym wyczerpaniu TIP60

Przeglądaj więcej filmów