Obrazowanie na żywo migracji komórek nabłonka piersi po przejściowym wyczerpaniu TIP60

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu wyczerpania określonych genów będących przedmiotem zainteresowania na migrację komórek. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące przerzutów nowotworowych, takich jak migracja komórek rakowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na monitorowanie dynamicznej migracji komórek w czasie rzeczywistym.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy obserwowaliśmy zmiany morfologii komórek u pacjenta z TIP60, supresorem guza. Zacznij od wysiewu miliona komórek nabłonka piersi w trzech mililitrach pożywki hodowlanej na 10-centymetrowe naczynie. Dodawać kropla po kropli 20-minutową inkubowaną mieszaninę SRINA w temperaturze pokojowej do eksperymentalnej hodowli komórkowej.

Ręcznie wstrząśnij obiema szalkami, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone przed umieszczeniem ich w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po sześciu godzinach zastąp supernatanty ośmioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej na naczynie i włóż kultury z powrotem do inkubatora. Następnego ranka zastąp supernatanty trzema mililitrami świeżej pożywki hodowlanej na szalkę i dodaj drugą plamę mieszaniny SIRNA do eksperymentalnej hodowli komórkowej, jak właśnie pokazano, potrząsając szalką, aby upewnić się, że odczynniki są w pełni wymieszane przed powrotem komórek do inkubatora.

Następnie po sześciu godzinach zastąp supernatanty ośmioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i inkubuj kultury przez noc. Trzeciego dnia umyj komórki jeden raz dwoma mililitrami BPS na płytkę i odłącz komórki na obu płytkach z jednym mililitrem tripsonu EDTA na miskę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję za pomocą czterech mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej na płytkę.

Zawiesić komórki przez pipetowanie i przenieść zawiesiny komórek do pojedynczych probówek o pojemności 15 mililitrów. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach pożywki bez surowicy na probówkę. Po zliczeniu rozcieńczyć obie kultury komórkowe do stężenia 600 000 komórek na mililitr i dodać 500 mikrolitrów komórek z każdej kultury do jednego dołka na 24-dołkowej płytce, aby zapewnić 100% konfluencję.

Gdy wszystkie komórki zostaną wysiane, delikatnie potrząśnij płytką w przód iw tył oraz na boki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie, a następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Aby sprawdzić skuteczność knock down interesującego genu, zbierz pozostałe komórki w probówkach zbiorczych za pomocą kolejnego wirowania i wyizoluj RNA z granulek, używając komercyjnego odczynnika zgodnie z instrukcjami producenta do ilościowej oceny PCR w czasie rzeczywistym. Następnego ranka, co najmniej godzinę przed rozpoczęciem obrazowania żywych komórek, włącz mikroskop i kontrolę temperatury.

Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i dopływ dwutlenku węgla na 5%Gdy komora osiągnie 37 stopni Celsjusza, użyj mikroskopii z kontrastem fazowym, aby potwierdzić, że komórki zlewają się i są w pełni przyczepione do dna studzienek. Następnie użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby delikatnie zarysować linię prostą na całej długości środka każdej studzienki i delikatnie umyj wszystkie studzienki pięć razy pożywką wolną od surowicy, aby usunąć oderwane komórki. Po ostatnim myciu dodaj jeden mililitr wolnego podłoża w surowicy do każdego dołka.

Umieść płytkę na stoliku mikroskopowym pod obiektywem o mocy 10 i skieruj emitowane światło na okulary, a nie na kamerę. Ręcznie dostosuj ostrość, aby zlokalizować każdą ranę i komórki wokół niej. Następnie zwróć wyemitowane światło z powrotem do kamery i użyj systemu obserwacji na żywo komórek, aby oznaczyć położenie ran i ustawić warunki czasowe.

Zobrazuj komórki dla odpowiedniego okresu eksperymentu, a następnie otwórz pierwszy film avi w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania i otwórz wtyczkę m track j. Kliknij kartę dodawania, aby dodać ścieżkę dla pojedynczych komórek i wybierz jedną komórkę na końcu frontu inwazyjnego i jedną komórkę, która może migrować samodzielnie. Śledź ruch wybranych komórek na filmie za pomocą mtrackJ, aby śledzić ich ruch.

Następnie kliknij zakładkę pomiaru, aby zmierzyć odległość ruchu komórki i zapisać filmy ze ścieżkami w formacie avi. Po wyczerpaniu TIP60 komórki nabłonka piersi są bardziej mezenchymalne w porównaniu z komórkami kontrolnymi hodowanymi. Rzeczywiście, ekspresja TIP60, a także ekspresja cząsteczki adhezyjnej komórek nabłonka, znacznie się zmniejsza po leczeniu siTIP60.

Z drugiej strony, ekspresja specyficznych genów napędzających przejście nabłonkowe do mezenchymalnego zwiększa się po wyczerpaniu TIP60. Obrazowanie na żywo kultur komórkowych po podaniu rany wykazało szybszą migrację komórek leczonych siTIP60 w porównaniu z hodowlami siControl, ze znacznym wzrostem odsetka migrujących komórek obserwowanym w odpowiedzi na wyczerpanie TIP60. Co więcej, komórki siControl poruszają się jako arkusz, podczas gdy w kulturach siTIP60 obserwuje się więcej ruchów pojedynczych komórek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać techniki obrazowania żywych komórek do monitorowania dynamicznych zmian migracji komórek.