Name: Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Dowiedz się, jak indukować laserowe uszkodzenie siatkówki u Danio rerio i monitorować odpowiedź komórek glejowych Müllera w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala badać mechanizmy regeneracji nerwowej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Martinowi Zinkernagelowi, doktorowi nauk medycznych, doktorowi medycyny i dr Miriam Reisenhofer za jej naukowy wkład w stworzenie modelu oraz Federice Bisignani za doskonałą pomoc techniczną.

Wszystkie eksperymenty są zgodne z Oświadczeniem o wykorzystaniu zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) i respektują odpowiednie przepisy władz rządowych.
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Utrzymuj szczep TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebry 167 (AB) w wieku od 6 do 9 miesięcy w standardowych warunkach w wodzie o temperaturze 26,5 °C i 14/10 h cyklu jasnego/ciemnego18.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami w zaangażowanych instytucjach dotyczących eksperymentów na zwierzętach po uzyskaniu zgody władz rządowych.</li>
</ol>
2. Odwracalne znieczulenie ogólnoustrojowe
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy soli metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (trikainy), rozpuszczając 400 mg proszku trikainy w 97,9 ml wody w zbiorniku i 2,1 ml 1 M soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS). Doprowadzić do pH 7,0 za pomocą 1 M Tris (pH 9) i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do jednego miesiąca. 
	UWAGA: Trikaina powinna być przygotowywana w wodzie takiej jak naturalne warunki życia zwierzęcia, najlepiej należy używać oryginalnej wody ze zbiornika.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy w stosunku 1:25 w wodzie w zbiorniku i natychmiast zużyć.</li>
	<li>Umieść danio pręgowanego na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 50 ml roztworu znieczulającego, aż staną się nieruchome i nie będą reagować na bodźce zewnętrzne (około 2 - 5 minut, w zależności od wagi i wieku).</li>
	<li>Przenieś każdą rybę ręcznie do wykonanego na zamówienie silikonowego uchwytu na szpilki do obróbki laserowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	OSTROŻNOŚĆ! Ryby mogą pozostać znieczulone na zewnątrz zbiornika tylko do 10 minut.</li>
	<li>Aby odwrócić znieczulenie po zabiegu i/lub obrazowaniu, umieść danio pręgowanego w pojemniku zawierającym wodę w zbiorniku.</li>
	<li>Aby wspomóc regenerację, stwórz przepływ świeżej wody w zbiorniku przez skrzela, przesuwając danio pręgowanego w przód iw tył w wodzie.</li>
</ol>
3. Laserowe uszkodzenie ogniskowe siatkówki
UWAGA: Laser diodowy o długości fali 532 nm jest używany do tworzenia ogniskowych uszkodzeń świetlnych siatkówki danio pręgowanego. Eksperymentalna konfiguracja lasera umożliwia ustalenie powtarzalnego ogniskowego uszkodzenia siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych.
<ol>
	<li>Ustaw moc wyjściową lasera: 70 mW; średnica anteny: 50 μm; czas trwania impulsu: 100 ms. 
	OSTROŻNOŚĆ! Stosowanie światła laserowego wymaga odpowiedniego zabezpieczenia osobistego i oznakowania terenu.</li>
	<li>Przed zabiegiem nanieść miejscowo 1 - 2 krople 2% hydroksypropylometylocelulozy do oka i użyć soczewki lasera do dna oka o średnicy 2,0 mm, aby skupić wiązkę celującą laserem na siatkówce. 
	OSTROŻNOŚĆ! Krople hydroksypropylometylocelulozy są lepkie i mogą powodować problemy z oddychaniem, jeśli dostanie się na skrzela.</li>
	<li>Umieść cztery plamki laserowe wokół nerwu wzrokowego na lewym oku i użyj prawego, nieleczonego oka jako kontroli wewnętrznej.</li>
</ol>
4. Obrazowanie in vivo morfologii siatkówki
<ol>
	<li>W dniu 0 wizualizuj siatkówkę danio pręgowanego bezpośrednio po indukcji laserowej, nie reanimując ich ze znieczulenia. We wszystkich innych punktach czasowych należy zastosować znieczulenie ogólne (patrz punkt 2: Odwracalne znieczulenie ogólnoustrojowe). Umieść unieruchomionego danio pręgowanego na specjalnie wykonanym silikonowym uchwycie na szpilkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, B.1).</li>
	<li>Aby uzyskać optymalne obrazy, należy przyciąć dostępną w handlu hydrożelową soczewkę kontaktową pasującą do oka danio pręgowanego (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, grubość środka = 0,4 mm) za pomocą dziurkacza. Wypełnij wklęsłą powierzchnię soczewki metylocelulozą i umieść ją na rogówce.</li>
	<li>Wyposaż system OCT w bezdotykową soczewkę lampy szczelinowej 78D.</li>
	<li>Ustaw ostrość obrazu w podczerwieni (IR) w trybie IR + OCT (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A), aby uwidocznić dno oka i wykonaj zdjęcia w podczerwieni, klikając przycisk "Acquire" (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B), aby zlokalizować plamki laserowe na siatkówce za pomocą oprogramowania systemu.</li>
	<li>Wizualizuj trójwymiarowy przekrój warstw siatkówki w trybie IR + OCT i rób zdjęcia, klikając przycisk "Acquire" (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Obserwuj stopień uszkodzenia zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL) (patrz Sekcja 3: Laserowe uszkodzenie ogniskowe siatkówki) na tych obrazach.</li>
	<li>Aby odwrócić znieczulenie po zabiegu i/lub obrazowaniu, umieść danio pręgowanego w pojemniku zawierającym wodę w zbiorniku.</li>
	<li>Aby wspomóc regenerację, stwórz przepływ świeżej wody w zbiorniku przez skrzela, przesuwając danio pręgowanego w przód iw tył w wodzie.</li>
	<li>Wykonaj podobne obrazowanie in vivo morfologii siatkówki w 1., 3., 7., 14. i 6. tygodniu.</li>
</ol>
5. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
<ol>
	<li>Eutanazji zegnało przez zanurzenie w zimnym (4 °C) roztworze znieczulającym na lodzie na co najmniej 10 minut i natychmiastowe wyłuszczenie oczu za pomocą małych zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Utrwalić całe oczy w 4% paraformaldehydzie (PFA) w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze 4 °C przez 20 godzin, a następnie odwodnić próbki w serii alkoholi o stopniowanej zawartości alkoholu (ksylen 100% przez 5 minut dwa razy, etanol 100% przez 5 minut dwa razy, etanol 96% przez 3 minuty dwa razy i etanol 70% 3 minuty raz). 
	OSTROŻNOŚĆ! PFA może działać drażniąco na oczy, nos i górne drogi oddechowe. PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi i podejrzewa się zagrożenie dla rozrodczości.</li>
	<li>Zanurz próbki w parafinie, wytnij odcinki 5 μm na poziomie głowy nerwu wzrokowego i zamontuj je na szkiełkach podstawowych.</li>
	<li>Zabarwić odparafinowane skrawki 0,1% kwaśnym roztworem hematoksyliny przez 5 minut i zanurzyć szkiełka dwukrotnie w wodzie destylowanej po zanurzeniu szkiełek w mieszaninie kwasu solnego (2 ml 25% HCl w 250 ml wody destylowanej) i mieszaninie amoniaku (2 ml 25% amoniaku w 250 ml wody destylowanej). Zabarwić skrawki wodnym roztworem eozyny G 0,5% przez 3 minuty po wytworzeniu się hematoksyliny, barwiąc wodą z kranu przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Zamontuj odwodnione szkiełka w podłożu montażowym z żywicy akrylowej i obserwuj szkiełka pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
6. Immunohistochemia dla aktywacji MC
<ol>
	<li>Podgrzewać odparafinowane skrawki w buforze do odzyskiwania antygenu (Tris-EDTA + 0,05% detergentu niejonowego, pH 9,0) przez 3 minuty w odpowiednim parowarze lub kuchence mikrofalowej przez 10 - 15 minut i myć trzykrotnie TBS po 5 minut.</li>
	<li>Zakreśl skrawki silikonowym pisakiem i dodaj 100 μl roztworu blokującego (TBS + 10% koziej normalnej surowicy + 1% albuminy surowicy bydlęcej, pH 7,6) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Barwienie przeciwciałem poliklonalnym królika przeciwko kwasowemu białku fibrylarnemu fibrylarnemu (GFAP) i mysim przeciwciałem monoklonalnym syntetazy antyglutaminy (GS), oba w rozcieńczeniu 1:200 (40 μl na próbkę). Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj trzy razy za pomocą TBS + 0,1 % Tween 20 przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Zakończ wizualizację z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi. W protokole tym wykorzystano kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG H&L zielone dla GFAP i kozie przeciwciało anty-mysie IgG H&L jaskrawoczerwone dla GS, oba w rozcieńczeniu 1:500 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka z medium montażowym zawierającym DAPI i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+Pigmentosa%3A+Genes+and+Disease+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa.+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).</li>
<li>Strettoi, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4688370/">A Survey of Retinal Remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 494(2015).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+mutations+in+retinitis+pigmentosa+and+their+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications.</a> Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).</li>
<li>Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+photoreceptor+cell+death+in+inherited+retinal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations.</a> BioEssays. 23, 605-618 (2001).</li>
<li>Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+activation%2C+proliferation+and+migration+following+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury.</a> Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).</li>
<li>Newman, E., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M%C3%BCller+cell%3A+a+functional+element+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Müller cell: a functional element of the retina.</a> Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).</li>
<li>Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+neurogenesis+in+the+retinal+ciliary+marginal+zone+of+homeothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates.</a> Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).</li>
<li>Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+M%C3%BCller+cells+occurs+during+retinal+degeneration+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats.</a> Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).</li>
<li>DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Regeneration+Following+OCT-Guided+Laser+Injury+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).</li>
<li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+M%C3%BCller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
<li>Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+neurogenic+potential+of+M%C3%BCller+gial+cells+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).</li>
<li>Xia, X., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Neurogenic+Potential+of+Mammalian+M%C3%BCller+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia.</a> Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Riepe, R. E., Norenburg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cell+localisation+of+glutamine+synthetase+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina.</a> Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).</li>
<li>Derouiche, A., Rauen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+of+L-glutamate%2FL-aspartate+transporter+%28GLAST%29+and+glutamine+synthetase+%28GS%29+immunoreactions+in+retinal+glia%3A+evidence+for+coupling+of+GLAST+and+GS+in+transmitter+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance.</a> J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).</li>
<li>Bignami, A., Dahl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radial+glia+of+M%C3%BCller+in+the+rat+retina+and+their+response+to+injury.+An+immunofluorescence+study+with+antibodies+to+the+glial+fibrillary+acidic+%28GFA%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein.</a> Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).</li>
<li>Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).</li>
<li>Cameron, D. A., Carney, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mosaic+patterns+in+the+native+and+regenerated+inner+retina+of+zebrafish%3A+implications+for+retinal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly.</a> J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Dev Biol. 6, 36(2006).</li>
<li>Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+as+a+noninvasive+method+to+assess+damaged+and+regenerating+adult+zebrafish+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).</li>
<li>Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+with+OCT+and+histology+of+photocoagulation+lesions+in+patients+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits.</a> Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).</li>
<li>Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+regeneration+of+photoreceptor+from+M%C3%BCller+glia+after+retinal+degeneration+in+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat.</a> Vision Res. (2), 223-234 (2008).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (80), e51017(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Regeneracja/zwyrodnienie siatkówki u danio pręgowanego badano różnymi podejściami, takimi jak śmierć komórek za pośrednictwem cytotoksyn22, uraz mechaniczny23 i uraz termiczny24. Zastosowaliśmy laser diodowy o długości fali 532 nm, aby uszkodzić siatkówkę danio pręgowanego. W związku z tym nasz model ma kilka zalet. Na przykład, szybko stworzyliśmy dobrze zdefiniowany obszar urazu zlokalizowany w zewnętrznej siatkówce, a konkretnie w warstwie PR. Co ...

Wzrok jest prawdopodobnie najważniejszym zmysłem człowieka, a jego upośledzenie ma duży wpływ społeczno-ekonomiczny. W świecie uprzemysłowionym choroby zwyrodnieniowe siatkówki odpowiadają za większość utraty wzroku i ślepoty w populacji dorosłych1. Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) jest najczęstszą dziedziczną przyczyną ślepoty u osób w wieku od 20 do 60 lat, dotykającą około 1,5 miliona osób na całym świecie2,3. Jest to niejednorodna rodzina dziedzicznych zaburzeń siatkówki charakteryzujących się postępującą utratą fotoreceptorów (PR), a następnie degeneracją nabłonka barwnikowego siatkówki, a następnie glejozą i przebudową neuronów wewnętrznych4. Przebieg choroby można wytłumaczyć stopniową utratą dwóch typów komórek PR, zwykle zaczynając od pręcików, które są odpowiedzialne za widzenie achromatyczne w słabym świetle, oraz czopków, które są niezbędne do widzenia kolorów i ostrości wzroku5. Pojedynczy defekt genu wystarczy, aby spowodować RP. Do tej pory ponad 130 mutacji w ponad 45 genach powiązano z chorobą6. Prowadzi to do różnych fenotypów choroby i jest jednym z powodów, dla których terapia genowa nie daje się uogólnić, a zatem jest skomplikowanym podejściem terapeutycznym. Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania nowych ogólnych podejść terapeutycznych do leczenia zwyrodnień siatkówki w chorobach powodujących ślepotę.
Zwyrodnienie siatkówki często wiąże się z utratą PR; dlatego śmierć komórek PR jest cechą charakterystyczną procesów zwyrodnieniowych w siatkówce7. Wykazano już, że śmierć komórki PR stymuluje aktywację i proliferację komórek glejowych Müllera (MC)8. MC, główny typ komórek glejowych w siatkówce kręgowców, był kiedyś uważany za nic innego jak "klej" między neuronami siatkówki. W ostatnich latach wiele badań wykazało, że MC działają jako coś więcej niż tylko wsparcie strukturalne9. Wśród różnych funkcji, MC uczestniczą również w neurogenezie i naprawie10. Rzeczywiście, w odpowiedzi na czynniki dyfuzyjne z degenerującej się siatkówki, MC znacznie zwiększają ekspresję kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP). W związku z tym znakowanie GFAP może być stosowane jako marker aktywacji MC jako wtórnej odpowiedzi na uszkodzenie siatkówki i zwyrodnienie11.
Ostatnio opracowaliśmy nowatorską adaptację ogniskowego urazu, używając lasera do wywołania zwyrodnienia siatkówki u danio pręgowanego (Danio rerio). Uraz ogniskowy jest korzystny dla badania pewnych procesów biologicznych, takich jak migracja komórek do uszkodzonego miejsca i dokładny czas zdarzeń, które mają miejsce podczas regeneracji siatkówki12. Co więcej, danio pręgowany stał się ważny w badaniach wizualnych ze względu na podobieństwa między jego układem wzrokowym a innymi kręgowcami. Ogólne cechy morfologiczne i histologiczne siatkówki ludzkiej i teleostowej wykazują niewiele różnic. W związku z tym siatkówki ludzi i danio pręgowanego zawierają te same główne klasy komórek zorganizowane w ten sam warstwowy wzór, w którym fotoreceptory wyczuwające światło zajmują najbardziej zewnętrzną warstwę, podczas gdy neurony projekcyjne siatkówki, komórki zwojowe, znajdują się w najbardziej wewnętrznej warstwie neuronalnej, bliżej soczewki. Interneurony siatkówki, komórki amakrynowe, dwubiegunowe i poziome, lokalizują się pomiędzy warstwami fotoreceptorów i komórek zwojowych13. Co więcej, siatkówka danio pręgowanego jest zdominowana przez czopki, a więc bliższa siatkówce człowieka niż np. intensywnie badana siatkówka gryzoni. Fascynującą różnicą między teleostem a ssakami jest trwała neurogeneza siatkówki ryb i regeneracja siatkówki po uszkodzeniu. U danio pręgowanego MC mogą deróżnicować i pośredniczyć w regeneracji uszkodzonej siatkówki14,15. U kurczaków MC mają również pewną zdolność do ponownego wejścia w cykl komórkowy i odróżnicowania. Po uszkodzeniu siatkówki u dorosłych ryb, MC przyjmują pewne cechy komórek progenitorowych i macierzystych, migrują do uszkodzonej tkanki siatkówki i wytwarzają nowe neurony16. Profilowanie ekspresji genów MC ssaków ujawniło nieoczekiwane podobieństwa do progenitorów siatkówki, a dowody na wewnętrzny potencjał neurogenny MC w siatkówce kurczaka, gryzonia, a nawet człowieka rosną17. Niemniej jednak nie wiadomo jeszcze, dlaczego reakcja regeneracyjna u ptaków i ssaków jest niższa w porównaniu z silną reakcją u ryb. Dlatego zrozumienie endogennych mechanizmów naprawczych u danio pręgowanego może sugerować strategie stymulowania regeneracji siatkówki u ssaków i ludzi. Wykorzystanie endogennego mechanizmu naprawczego MC jako narzędzia terapeutycznego w leczeniu pacjentów ze zwyrodnieniem siatkówki miałoby wyjątkowy wpływ na nasze społeczeństwo.
Tutaj przedstawiamy kroki niezbędne do zastosowania modelu degeneracji/regeneracji w badaniach okulistycznych. Skupiliśmy się najpierw na wywołaniu ogniskowego uszkodzenia w siatkówce neurosensorycznej, następnie na obrazowaniu zdarzeń rozwijających się w miejscu urazu, a na końcu na wizualizacji zajęcia sąsiednich MC. Ogólny protokół jest stosunkowo łatwy do wykonania i otwiera szeroką gamę możliwości późniejszej oceny siatkówki.

<table><tbody><tr><td>Kwaśny roztwór hematoksyliny</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Dania</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe DAPI</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna G roztwór wodny 0,5%</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Szwajcaria</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królicza IgG H& L Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Life Technologies, Zug, Szwajcaria</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG H& L Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, Szwajcaria</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Kozia normalna surowica</td><td>Dako, Glostrup, Dania</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Hydrożelowe soczewki kontaktowe</td><td>Johnson & Johnson AG, Zug, Szwajcaria</td><td>n.a.1-Day</td> <td>Acuvue Wilgotna</td></tr><tr><td>hydroksypropylometyloceluloza 2%</td><td>OmniVision, Neuhausen, Szwajcaria</td><td>n.a.Methocel</td> <td>2%</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoesan metanosulfonian</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>A5040</td><td>Tricaine, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Niemcy</td><td>n.d.532</td> <td>nm Laser</td></tr><tr><td>Mouse przeciwciało monoklonalne anty-GS</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT System obrazowania</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Niemcy</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Niemcy</td><td>n.a.Wersja</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-GFAP</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, USA</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy uchwyt na szpilki</td><td>Huco Vision AG Szwajcaria</td><td>n.a.</td> <td>Odpowiednio wycięte ręcznie z silikonowej maty szpilkowej tacki do sterylizacji.</td></tr><tr><td>Lampa szczelinowa BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Szwajcaria</td><td>n.a.Adapter</td><td></td></tr> <tr><td>do lampy szczelinowej</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, USA</td><td>n.d.Szkiełka</td><td></td></tr> <tr><td>Superfrost Plus</td><td>Gehard Menzel GmbH, Brunszwik, Niemcy</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain</td><td>KIT, Karlsruhe, Niemcy</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Bezdotykowa soczewka lampy szczelinowej 78D</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, USA</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka laserowa dna oka</td><td>Instrumenty okularowe, Bellevue, WA, USA</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, Wielka Brytania</td><td>Parowiec</td> <td>R2100-EU</td></tr></tbody></table>

aktywacja komórek glejowych müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Fascynującą różnicą między teleostem a ssakami jest dożywotni potencjał siatkówki teleost do neurogenezy i regeneracji siatkówki po poważnych uszkodzeniach. Badanie szlaków regeneracji u danio pręgowanego może przynieść nowe informacje w celu opracowania innowacyjnych strategii leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki u ssaków. W tym artykule skupiliśmy się na indukcji ogniskowej zmiany na zewnętrznej siatkówce u dorosłych danio pręgowanego za pomocą lasera diodowego o długości fali 532 nm. Zlokalizowany uraz pozwala na zbadanie procesów biologicznych, które zachodzą podczas zwyrodnienia i regeneracji siatkówki bezpośrednio w miejscu uszkodzenia. Za pomocą nieinwazyjnej optycznej koherentnej tomografii (OCT) byliśmy w stanie określić lokalizację uszkodzonego obszaru i monitorować późniejszą regenerację in vivo. Rzeczywiście, obrazowanie OCT daje wysokiej rozdzielczości, przekrojowe obrazy siatkówki danio pręgowanego, dostarczając informacji, które wcześniej były dostępne tylko w przypadku analiz histologicznych. W celu potwierdzenia danych z OCT w czasie rzeczywistym wykonano skrawki histologiczne i zbadano odpowiedź regeneracyjną po indukcji uszkodzenia siatkówki za pomocą immunohistochemii.

OCT w czasie rzeczywistym: Aby przeanalizować rolę MC w naprawie siatkówki, zastosowano model uszkodzenia laserowego indukującego wyraźnie odgraniczoną strefę uszkodzenia w siatkówce danio pręgowanego. Miejsce uszkodzenia obrazowano za pomocą OCT in vivo po raz pierwszy (Dzień 0) w ciągu 60 minut po urazie (Rysunek 3). Aby skompensować optykę oka ryby, na rogówce umieszczono specjalnie wykonaną soczewkę kontaktową. Bezpośrednio po za...

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów degeneracji/regeneracji siatkówki u kręgowców. Protokół ten opisuje metodę wywoływania miejscowego urazu zakłócającego zewnętrzną siatkówkę przy minimalnym uszkodzeniu wewnętrznej siatkówki. Następnie monitorujemy in vivo morfologię siatkówki i odpowiedź glejową Müllera przez cały okres regeneracji siatkówki.

Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak monitorować zmiany komórkowe in vivo po ogniskowym, indukowanym laserem uszkodzeniu siatkówki u Danio pręgowanego. Model ten może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regeneracji siatkówki, takie jak zmiany morfologiczne, kinetyka oraz rodzaje zaangażowanych komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że poprzez wywołanie ogniskowego uszkodzenia można badać procesy biologiczne bezpośrednio w miejscu urazu.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat regeneracji siatkówki u Zebrafish, można ją również zastosować do badania mechanizmów naprawczych w różnych modelach zwierzęcych. Przygotować roztwór zapasu środka znieczulającego, rozpuszczając 400 milligrams proszku trikainy w 97.9 millimeters wody akwariowej oraz 2.1 millimeters jednego molarnego TBS. Dostosować pH do 7.0 za pomocą jednego molarnego TRIS o pH 9.Aby przygotować roztwór roboczy, rozcieńczyć roztwór zapasowy trikainy w wodzie z akwarium w stosunku 1:25 i przenieść 50 mililitrów do szalki Petriego. Następnie umieścić Zebrafish w roztworze anestetyka na od dwóch do pięciu minut, aż staną się nieruchome i przestaną reagować na bodźce zewnętrzne. Każdą ry

mller-glia-cell-activation-laser-induced-retinal-degeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje procedurę wywoływania zwyrodnienia siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych za pomocą uszkodzenia laserowego. Laser celuje w komórki fotoreceptorowe w siatkówce, wywołując śmierć komórki i proces zwyrodnieniowy. To uszkodzenie aktywuje komórki glejowe Müllera (MG), prowadząc do ich odróżnicowania w komórki progenitorowe komórek macierzystych, które pomagają w regeneracji siatkówki.

Modelowanie zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego za pomocą ogniskowego urazu laserowego

Źródło: Lahne, M., et.al. Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek migracji jądrowej gleju Mullera w eksplantatach siatkówki danio pręgowanego osadzonych w agarozie po uszkodzeniu fotoreceptorów wywołanym światłem. Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) uwalniany przez uszkodzone fotoreceptory aktywuje komórki glejowe Mullera,...

Obrazowanie żywych komórek migracji jądrowej gleju Mullera podczas regeneracji siatkówki danio pręgowanego

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Opisano wiele protokołów uszkodzeń światłem, które uszkadzają fotoreceptory i w konsekwencji wywołują reakcję regeneracji siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych. Protokół ten opisuje ulepszoną metodę, która może być stosowana u zwierząt pigmentowanych i która uszkadza zdecydowaną większość fotoreceptorów pręcików i czopków w całej siatkówce.

Nowy paradygmat uszkodzeń spowodowanych światłem do wykorzystania w badaniach nad regeneracją siatkówki u dorosłych danio pręgowanych

Tutaj pokazujemy ilościowe określenie de- i regeneracji siatkówki oraz jej wpływu na funkcje wzrokowe za pomocą N-metylo-N-nitrozourea u dorosłego danio pręgowanego. Utrata ostrości wzroku i zmniejszenie liczby fotoreceptorów wiązały się z proliferacją w wewnętrznej warstwie jądrowej. Całkowita regeneracja morfologiczna i funkcjonalna nastąpiła po 30 dniach od pierwszego zabiegu.

Zwyrodnienie i regeneracja siatkówki wywołane przez metylonitromocznik (MNU) u danio pręgowanego: charakterystyka histologiczna i funkcjonalna

Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.

Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Ten protokół opisuje metodologię genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu transgenicznego modelu danio pręgowanego. Dostosowanie protokołu w celu włączenia modulacji szlaku sygnałowego za pomocą związków farmakologicznych jest bardzo szczegółowe. Opracowano platformę MATLAB do ilościowego określania regeneracji RPE na podstawie pigmentacji, która została zaprezentowana i omówiona.

Ablacja za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu oraz platforma MATLAB (RpEGEN) do badania regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

Dowiedz się, jak indukować laserowe uszkodzenie siatkówki u Danio rerio i monitorować odpowiedź komórek glejowych Müllera w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala badać mechanizmy regeneracji nerwowej in vivo.

Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów