Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak monitorować zmiany komórkowe in vivo po ogniskowym, wywołanym laserowo uszkodzeniu siatkówki u danio pręgowanego. Model ten może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regeneracji siatkówki, takie jak zmiany morfologiczne, kinetyka, a także typy zaangażowanych komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że wywołując uraz ogniskowy, procesy biologiczne mogą być badane bezpośrednio w miejscu urazu.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regeneracji siatkówki danio pręgowanego, może być również stosowana do badania mechanizmu naprawy w różnych modelach zwierzęcych. Przygotuj podstawowy roztwór środka znieczulającego, rozpuszczając 400 miligramów proszku trikainy w 97,9 milimetrach wody w zbiorniku i 2,1 milimetra jednego molowca TBS. Dostosuj do pH 7,0 za pomocą jednego trzonowca Tris przy pH 9.

Aby przygotować roztwór roboczy, rozcieńczyć roztwór podstawowy tricainy od 1 do 25 w wodzie w zbiorniku i przenieść 50 mililitrów na szalkę Petriego. Następnie umieść danio pręgowanego w roztworze znieczulającym na dwie do pięciu minut, aż staną się nieruchome i nie będą reagować na bodźce zewnętrzne. Przenieś każdą rybę ręcznie do specjalnie wykonanego silikonowego uchwytu na szpilki do leczenia laserowego.

Odpowiednie znieczulenie ma kluczowe znaczenie dla dobrego samopoczucia zwierzęcia i powodzenia zabiegu. Dlatego świeżo przygotowany roztwór tricainy ma kluczowe znaczenie, a czas wyjścia z wody nie powinien znacznie przekraczać 10 minut. Ustaw moc wyjściową lasera wybieranego w technologii 532 nanometrów na 70 miliwatów, czas trwania impulsu na 100 milisekund, a średnicę anteny na 50 mikronów.

Następnie nałóż jedną lub dwie krople 2% hydroksypropylometylocelulozy na oko. Podczas nakładania metylokomórki na oko upewnij się, że lepki roztwór nie dostanie się do skrzeli. Następnie użyj 2-milimetrowej soczewki laserowej dna oka, aby skupić wiązkę celowniczą lasera na siatkówce.

Umieść cztery plamki laserowe wokół nerwu wzrokowego na lewym oku i użyj prawego, nieleczonego oka jako kontroli wewnętrznej. Natychmiast po indukcji laserowej umieść jeszcze znieczulonego danio pręgowanego na specjalnie wykonanym silikonowym uchwycie na szpilkę w obszarze obrazowania. Aby uzyskać optymalne obrazy, należy wyciąć dostępną w handlu hydrożelową soczewkę kontaktową tak, aby pasowała do oka danio pręgowanego za pomocą dziurkacza.

Wypełnij wklęsłą powierzchnię soczewki metylocelulozą, a następnie umieść ją na rogówce. Wyposaż system optycznej koherentnej tomografii w bezdotykową soczewkę lampy szczelinowej 78D. Ustaw ostrość obrazu w podczerwieni w trybie IR plus OCT, aby uwidocznić dno oka.

Następnie zrób zdjęcia w podczerwieni, klikając przycisk pozyskiwania, aby zlokalizować plamki laserowe na siatkówce. Następnie zwizualizuj trójwymiarowy przekrój warstw siatkówki w trybie IR plus OCT i zrób zdjęcia, klikając przycisk pozyskiwania. Obserwuj stopień uszkodzenia zewnętrznej warstwy jądrowej na tych obrazach.

Aby odwrócić znieczulenie po leczeniu i obrazowaniu, umieść danio pręgowanego w pojemniku zawierającym wodę w zbiorniku. Aby wspomóc regenerację, stwórz przepływ świeżej wody w zbiorniku przez skrzela, przesuwając danio pręgowanego w przód iw tył w wodzie. Bezpośrednio po zabiegu laserowym rozlany sygnał hiperrefleksyjny został zlokalizowany w zewnętrznej siatkówce.

Rozciągał się od pigmentowanego nabłonka siatkówki do zewnętrznej warstwy splotowatej. Rozproszony sygnał hiperrefleksyjny jest nieobecny w siatkówce z kontrolnego oka bez uszkodzenia. Podobny rozproszony sygnał hiperrefleksyjny wykryty pierwszego dnia po urazie.

Po trzecim dniu ten rozproszony sygnał stał się bardziej zorganizowany i gęsty. Był on konsekwentnie obserwowany w zewnętrznej warstwie jądrowej, rozciągając się do warstwy fotoreceptorów. Po pierwszym tygodniu nastąpił znaczny spadek średniej wielkości zmiany i wykryto tylko niewielki sygnał hiperrefleksyjny.

Począwszy od 14 dnia aż do ostatniego badanego punktu czasowego, plamki laserowe nie były już widoczne na obrazach w podczerwieni i OCT, a morfologia siatkówki jest porównywalna ze stroną kontrolną, widoczną tutaj. Barwienie H&E wykorzystano do zbadania zakresu i kinetyki zwyrodnienia i regeneracji siatkówki. Na tym obrazie przedstawiono sekcję kontrolną.

To zdjęcie pokazuje barwienie H&E trzy dni po urazie, kiedy widoczna jest maksymalna utrata fotoreceptorów. Przeprowadzono immunohistochemię w celu uwidocznienia markerów komórek glejowych, syntetazy glutaminy w kolorze czerwonym i kwaśnego białka fibrylarnego gleju w kolorze zielonym. Ten obraz pokazuje kontrolną siatkówkę, w której występuje bardzo mała zielona fluorescencja, co wskazuje na GFAP.

Sygnał GFAP był regulowany w górę w trzecim dniu po urazie, podczas gdy sygnał czerwonej syntetazy glutaminy pozostał niezmieniony. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia fotonowa, a także analiza komórkowa i molekularna w celu zbadania udziału komórek molekularnych w endogennych mechanizmach naprawczych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać ogniskowe uszkodzenie siatkówki danio pręgowanego i monitorować in vivo następujące procesy zwyrodnieniowe i regeneracyjne.