Aktywacja komórek glejowych Müllera w indukowanym laserowo modelu zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak monitorować zmiany komórkowe in vivo po ogniskowym, indukowanym laserem uszkodzeniu siatkówki u Danio pręgowanego. Model ten może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regeneracji siatkówki, takie jak zmiany morfologiczne, kinetyka oraz rodzaje zaangażowanych komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że poprzez wywołanie ogniskowego uszkodzenia można badać procesy biologiczne bezpośrednio w miejscu urazu.

Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat regeneracji siatkówki u Zebrafish, można ją również zastosować do badania mechanizmów naprawczych w różnych modelach zwierzęcych. Przygotować roztwór zapasu środka znieczulającego, rozpuszczając 400 milligrams proszku trikainy w 97.9 millimeters wody akwariowej oraz 2.1 millimeters jednego molarnego TBS. Dostosować pH do 7.0 za pomocą jednego molarnego TRIS o pH 9.

Aby przygotować roztwór roboczy, rozcieńczyć roztwór zapasowy trikainy w wodzie z akwarium w stosunku 1:25 i przenieść 50 mililitrów do szalki Petriego. Następnie umieścić Zebrafish w roztworze anestetyka na od dwóch do pięciu minut, aż staną się nieruchome i przestaną reagować na bodźce zewnętrzne. Każdą rybę przenieść ręcznie do wykonanego na zamówienie silikonowego uchwytu z pinami w celu przeprowadzenia zabiegu laserowego.

Odpowiednie znieczulenie jest kluczowe dla dobrostanu zwierzęcia i powodzenia procedury. Dlatego niezbędne jest zastosowanie świeżo przygotowanego roztworu trikainy, a czas przebywania poza wodą nie powinien znacznie przekraczać 10 minut. Ustaw moc wyjściową lasera z regulacją długości fali na 532 nanometrów na 70 milliwattów, czas trwania impulsu na 100 milisekund, a średnicę wiązki na 50 mikronów.

Następnie należy zakroplić do oka jedną lub dwie krople 2% hydroksypropylometylocelulozy. Podczas podawania metylocelulozy do oka należy upewnić się, że lepki roztwór nie dostanie się do skrzeli. Następnie należy użyć soczewki laserowej do dna oka o średnicy 2 mm, aby skupić wiązkę celowniczą lasera na siatkówce.

Umieść cztery punkty laserowe wokół nerwu wzrokowego w lewym oku, a prawe, nieleczone oko wykorzystaj jako kontrolę wewnętrzną. Bezpośrednio po indukcji laserowej umieść wciąż znieczulonego danio pręgowanego na specjalnie wykonanym silikonowym uchwycie z pinami w obszarze obrazowania. Aby uzyskać optymalne obrazy, wytnij za pomocą dziurkacza komercyjnie dostępną hydrożelową soczewkę kontaktową tak, aby pasowała do oka danio pręgowanego.

Wypełnij wklęsłą powierzchnię soczewki metylocelulozą, a następnie umieść ją nad rogówką. Wyposaż system optycznej koherentnej tomografii w soczewkę do lampy szczelinowej bezdotykowej 78D. Ustaw ostrość obrazu w podczerwieni w trybie IR plus OCT, aby zwizualizować dno oka.

Następnie, klikając przycisk acquire, wykonaj zdjęcia IR w celu zlokalizowania plamek laserowych na siatkówce. Potem, w trybie IR plus OCT, zwizualizuj trójwymiarowy przekrój warstw siatkówki i wykonaj zdjęcia, klikając przycisk acquire. Na obrazach tych oceń stopień uszkodzenia zewnętrznej warstwy ziarnistej.

Aby odwrócić działanie znieczulenia po zabiegu i obrazowaniu, umieść danio pręgowanego w pojemniku z wodą akwariową. Aby wspomóc regenerację, zapewnij przepływ świeżej wody akwariowej przez skrzela, delikatnie przesuwając rybę w wodzie w przód i w tył. Bezpośrednio po zabiegu laserowym w zewnętrznej warstwie siatkówki zlokalizowano rozproszony sygnał hiperrefleksyjny.

Rozciągało się od nabłonka barwnikowego siatkówki do zewnętrznej warstwy splotowatej. Rozproszony sygnał hiperrefleksyjny nie występuje w siatkówce kontrolnego oka bez uszkodzeń. Podobny rozproszony sygnał hiperrefleksyjny wykryto w pierwszym dniu po urazie.

Po trzecim dniu rozproszony sygnał stał się bardziej zorganizowany i gęsty. Był on konsekwentnie widoczny w zewnętrznej warstwie jądrowej, rozciągając się do warstwy fotoreceptorów. Po pierwszym tygodniu odnotowano znaczny spadek średniej wielkości zmiany i wykryto jedynie niewielki sygnał hiperrefleksyjny.

Od 14. dnia aż do ostatniego badanego punktu czasowego plamki laserowe nie były już widoczne w obrazach IR i OCT, a morfologia siatkówki jest porównywalna z osią kontrolną, co pokazano tutaj. Do zbadania zakresu i kinetyki degeneracji oraz regeneracji siatkówki zastosowano barwienie H&E. Na tym obrazie przedstawiono przekrój kontrolny.

Na tym obrazie przedstawiono barwienie H&E trzy dni po urazie, kiedy widoczna jest maksymalna utrata fotoreceptorów. Przeprowadzono immunohistochemię w celu wizualizacji markerów komórek glejowych: syntetazy glutaminowej (kolor czerwony) oraz kwaśnego białka włókienstwa glejowego (kolor zielony). Obraz przedstawia siatkówkę kontrolną, w której występuje bardzo słaba fluorescencja zielona, wskazująca na obecność GFAP.

Sygnał GFAP uległ upregulacji w trzecim dniu po urazie, podczas gdy czerwony sygnał syntetazy glutaminy pozostał bez zmian. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia dwufotonowa oraz analizy komórkowe i molekularne, w celu zbadania udziału komórek molekularnych w endogennych mechanizmach naprawczych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać ogniskowe uszkodzenie siatkówki ryby zebrafish oraz jak monitorować in vivo następujące po nim procesy degeneracyjne i regeneracyjne.