Name: Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę przygotowania iniekcyjnych hydrożeli na bazie chitozanu z wykorzystaniem dynamicznej chemii iminowej. Technika ta umożliwia regulację właściwości mechanicznych materiału i zastosowanie w trójwymiarowej hodowli komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauki Chin (21474057 i 21604076).

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Podczas wykonywania eksperymentów chemicznych należy stosować odpowiednie zasady bezpieczeństwa, w tym używać dygestorium i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice ochronne, fartuch laboratoryjny itp.). Protokół wymaga standardowych technik obchodzenia się z komórkami (sterylizacja, odzyskiwanie komórek, pasażowanie komórek, zamrażanie komórek, barwienie komórek itp.).
1. Przygotowanie hydrożeli
<ol>
	<li>Synteza difunkcjonalizowanego glikolu polietylenowego zakończonego fazami benzaldehydu (DF PEG)
	<ol>
		<li>Wstępne suszenie polimeru PEG
		<ol>
			<li>Zważyć 4,00 g PEG (MW 4,000, 1,00 mmol), przenieść do kolby okrągłodennej (250 ml) i dodać toluen (100 ml). 
			Uwaga: Inne PEG-i o różnej masie cząsteczkowej mogą działać w tworzeniu hydrożelu, ale prowadzą do różnej sztywności.</li>
			<li>Podgrzej roztwór za pomocą opalarki (lub płyty grzejnej o temperaturze około 40 °C), aby pomóc rozpuścić wszystkie polimery. Po rozpuszczeniu wszystkich polimerów użyj parownika, aby usunąć wszystkie rozpuszczalniki. Powtórz ten proces rozpuszczania i suszenia dwa razy, aby uzyskać wysuszone polimery PEG. 
			UWAGA: Należy to robić w dygestorium z zachowaniem szczególnej ostrożności. Toluen jest łatwopalny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Reakcja terminacji benzaldehydu PEG
		<ol>
			<li>Dodać mieszadło magnetyczne i tetrahydrofuran (THF, 100 ml) do kolby i rozpuścić PEG za pomocą mieszadła. Dodawać kolejno 4-karboksybenzaldehyd (0,90 g, 6,0 mmol) i 4-dimetyloaminopirydynę (0,07 g, 0,6 mmol) do roztworów, aby całkowicie rozpuścić wszystkie ciała stałe.</li>
			<li>Dodać N,N'-dicykloheksylokarbodimid (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) do roztworu i dodać do kolby rurkę suszącą wypełnioną bezwodnym CaCl2. Utrzymywać reakcję pod mieszaniem w temperaturze pokojowej (~ 20 °C) przez około 12 godzin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Proces po reakcji
		<ol>
			<li>Po zakończeniu reakcji odfiltrować białe ciała stałe wytworzone w roztworze przez próżnię. Wlać roztwór do zimnego eteru dietylowego (500 ml) mieszając, aby wytrącić białe ciała stałe. Zbierz wszystkie białe ciała stałe przez filtr i wysusz je w dygestorium.</li>
			<li>Ponownie rozpuść białe ciała stałe w THF, odfiltruj wszelkie nierozpuszczalne białe ciała stałe, wlej roztwór do świeżego zimnego eteru dietylowego, aby wytrącić białe ciała stałe i wysusz. Powtórz ten proces dwa do trzech razy, a następnie umieść białe ciała stałe w piecu do suszenia próżniowego (20 °C, 0,1 mbar), aby całkowicie je wysuszyć. Zebrać biały proszek jako produkt końcowy: DF PEG zakończony benzaldehydem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hydrożeli
	<ol>
		<li>Zważ różne ilości DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol; 0,22 g, 0,055 mmol; 0,44 g, 0,110 mmol) w probówce (10 ml), dodaj wodę dejonizowaną (5,0 ml) i użyj mieszadła wirowego lub magnetycznego, aby pomóc rozpuścić polimer.</li>
		<li>Rozpuść chitozan glikolowy (0,495 g, 6,18 x 10-3 mmol) w wodzie dejonizowanej (15,0 ml) w probówce (50 ml) i użyj wiru przez kilka minut do homogenizacji roztworu chitozanu (3 % wag.).</li>
		<li>Dodawać kolejno roztwór chitozanu glikolowego (0,2 ml, 3 ml wag.) i roztwory DF PEG (0,2 ml) do probówki (2,0 ml). Użyj wiru, aby jednorodnie wymieszać roztwory, aby w ciągu kilku minut utworzyć hydrożele. Postępuj zgodnie ze stosunkami podanymi w Tabeli 1, aby uzyskać hydrożele o różnej wytrzymałości mechanicznej. 
		Uwaga: Użyj metody odwracania rurki, aby określić, czy hydrożel już się uformował.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizy reologiczne
	<ol>
		<li>Analizy reologiczne należy przeprowadzić na reometrze rotacyjnym z równoległą płytką stalową (średnica: 20 mm). Do testu żelowania rozprowadzić roztwór chitozanu glikolu (0,2 ml, 3% wag.) na dolnej płytce. Następnie równomiernie rozsypać kroplami roztwory wodne DF PEG (0,2 ml, 2% wag.) na powierzchnię roztworu chitozanu i szybko wymieszać pipetą. Opuść górną płytę i rozpocznij testowanie.</li>
		<li>W celu przeprowadzenia testu sztywności hydrożelu należy pociąć hydrożel na okrąg (średnica: 20 mm) i zmierzyć wartości modułu akumulacyjnego (G') w porównaniu z analizami częstotliwości przy 1% odkształceniu. Typowe wartości G' przy 6,3 rad s−1 podano w tabeli 1. 
		Uwaga: Przeprowadzić analizy reologiczne hydrożelu 0,5 godziny po utworzeniu hydrożelu, aby zapewnić dynamiczną stabilizację wiązania hydrożelu.</li>
		<li>Aby przetestować właściwości samonaprawiające hydrożelu, pokrój hydrożel na kawałki i zbierz kawałki razem, aby samonaprawić się do integralnego kawałka. Następnie wytnij kawałek hydrożelu, aby utworzyć okrąg (średnica: 20 mm) i umieść go na reometrze w celu przeprowadzenia analizy reologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 3D Hodowla komórek w hydrożelach
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów żelujących hydrożel
	<ol>
		<li>Zważyć DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) w sterylnej probówce (4,0 ml), dodać pożywkę do hodowli komórkowych (RPMI-1640, 2,0 ml) i użyć wiru lub mieszadła, aby pomóc rozpuścić polimer w celu uzyskania roztworu polimeru (20% wag.). Załaduj roztwór do strzykawki (10,0 ml), a następnie wysterylizuj go, przepuszczając przez mikronowy filtr zatrzymujący bakterie (0,22 μm).</li>
		<li>Zważyć chitozan glikolowy (0,165 g, 2,06 x 10-3 mmol) w sterylnej probówce (15,0 ml), dodać pożywkę do hodowli komórkowych (RPMI-1640, 4,0 ml) i odwirować, aby pomóc rozpuścić polimer w celu otrzymania roztworu chitozanu glikolowego (4,0% wag.). Załaduj roztwór do strzykawki (10,0 ml) i przefiltruj go za pomocą filtra zatrzymującego bakterie 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek w hydrożelach 
	UWAGA: Wszystkie procedury związane z komórkami należy wykonywać w kapturze do hodowli tkankowej. Wymagana jest podstawowa wiedza na temat techniki sterylnej.
	<ol>
		<li>Przygotowanie zawiesiny komórek
		<ol>
			<li>Hodowla komórek L929 w pożywce RPMI-1640 uzupełniona 10% FBS, 5% penicyliny (10 ml) na szalce Petriego (średnica 10 cm) i inkubacja w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zmieniaj podłoże codziennie przed użyciem.</li>
			<li>Zebrać komórki L929 za pomocą PBS zawierającego trypsynę (0,025 w/v%) i EDTA (0,01% w/v), następnie odwirować (70 x g, 5 min) i ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI-1640 (1,0 mL). Zliczanie komórek należy przeprowadzić przy użyciu standardowej obsługi tablicy do liczenia krwi. Ponownie zawieś komórki, aby dostosować stężenie komórek do ~ 3,75 × 106 komórek/ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Enkapsulacja komórek w hydrożelach
		<ol>
			<li>Wymieszać zawiesiny komórek L929 (0,4 ml, 3,75 x 106 komórek mL-1) z roztworem chitozanu glikolowego (0,4 ml) w probówce (4,0 ml) za pomocą wiru. Odmierzyć pipetą roztwór chitozanu L929/glikol (0,8 ml) do środka konfokalnej szalki Petriego (średnica 2,0 cm). Odpipetować roztwory DF PEG (0,2 ml) do tego samego naczynia i delikatnie odpipetować, aby wymieszać roztwór i wywołać tworzenie hydrożelu. 
			Uwaga: Oceń tworzenie się hydrożelu, przechylając szalkę Petriego.</li>
			<li>W przypadku bezpośredniej hodowli komórkowej dodaj dodatkowe ilości pożywki hodowlanej RPMI-1640 (1,0 ml) na wierzch hydrożelu. Umieść hydrożele osadzone w komórkach (1,0 ml, 1,5% wag. glikol-chitozan, 4,0% wag. DF PEG, 1,5 × 106 komórek mL-1) w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) i zmieniaj pożywkę każdego dnia. Przygotuj się do obrazowania komórek w 1., 3., 5. i 7. dniu po enkapsulacji komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku post-hodowli komórek 3D w hydrożelach po wstrzyknięciu, należy przygotować hydrożel wypełniony komórkami (1,0 ml, patrz krok 2.2.2) w strzykawce (10,0 ml, igła 48 G). Po uformowaniu się hydrożelu należy powoli wstrzyknąć hydrożel na szalkę Petriego w celu obrazowania konfokalnego. Dodaj dodatkową ilość pożywki hodowlanej (1,0 ml) na wierzch hydrożelu i zmieniaj go codziennie. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) i przygotować do obrazowania. 
		UWAGA: Należy sprawdzić i postępować zgodnie z protokołem bezpiecznej obsługi strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza żywotności komórek
	<ol>
		<li>Obserwacja konfokalna
		<ol>
			<li>Przepłukać hydrożele PBS (1,0 ml) dwa razy. Roztwory dioctanu fluoresceiny (FDA, 0,5 ml, 0,05 mg/ml) i jodku propidyny (PI, 0,5 ml, 0,08 mg/ml) barwić hydrożele roztworami dioctanu fluoresceiny (FDA, 0,05 ml/mL) i jodku propidyny (PI, 0,5 ml, 0,08 mg/ml) przez 15 min. Po zabarwieniu usuń wszystkie rozpuszczalniki.</li>
			<li>Obserwuj hydrożele za pomocą mikroskopu konfokalnego pod długościami fal wzbudzenia 488 nm i 543 nm, aby uwidocznić odpowiednio żywe i martwe komórki. Przeprowadź stosy Z przez każdą głębokość hydrożeli o każdej głębokości 2 μm, aby sprawdzić równomierny rozkład komórek w całym tekście. 
			Uwaga: FDA barwi żywe komórki, podczas gdy PI barwi martwe komórki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hydrożel (1,0 ml) rozkładać kwasem octowym (HAc, 3 v%, 1,0 ml) przez 5 min i pipetować do probówki (4,0 ml). Zebrać komórki za pomocą wirówki (70 x g, 5 min) i ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych RPMI-1640 (1,0 ml). Wykonaj liczenie komórek za pomocą tablicy do liczenia krwi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li>
<li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+Formation+and+Patterning+of+Hydrogels+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications.</a> J. Vis. Exp. (115), (2016).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%223D+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).</li>
<li>Breslin, S., O’Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/255762985_Facilely_prepared_inexpensive_and_biocompatible_self-healing_hydrogel_A_new_injectable_cell_therapy_carrier">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/TB/c4tb01705f#!divAbstract">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li>
<li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid.+Surface.+B%22%5BJournal%5D)">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li>
<li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Injectable%2C+Self%E2%80%90Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li>
<li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c7py00112f#!divAbstract">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/CC/c2cc34745h#!divAbstract">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c6py01704e#!divAbstract">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li>
<li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li>
<li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hydrożel przedstawiony w tym protokole (ryc. 1) składa się z dwóch głównych składników: naturalnego chitozanu glikolu polimerowego i syntetycznego żelatora polimerowego zakończonego aldehydem DF PEG, które są materiałami biokompatybilnymi. Syntezę DF PEG przedstawiono przy użyciu jednoetapowej reakcji modyfikacji. PEG o masie cząsteczkowej 4 000 został wybrany w tym protokole ze względu na rozpuszczalność, efektywność modyfikacji, a także sztywność hydrożelu. Przygotowano serię hydrożeli o r...

Hydrożele to usieciowane materiały polimerowe o dużej zawartości wody i miękkich właściwościach mechanicznych, które były używane w wielu zastosowaniach biomedycznych1,2. Hydrożele mogą zapewniać miękkie i wilgotne środowisko, które jest bardzo podobne do fizjologicznego otoczenia komórek in vivo. Dlatego hydrożele stały się jednym z najpopularniejszych rusztowań do hodowli komórkowych 3D3,4. W porównaniu z hodowlą komórek na szalce Petriego 2D, hodowla komórkowa 3D szybko się rozwinęła, oferując mikrośrodowisko naśladowane przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM), w którym komórki mogą się kontaktować i składać w celu proliferacji i różnicowania5. Dodatkowo, hydrożele zawierające naturalne polimery mogą zapewnić biokompatybilne i sprzyjające środowisko dla komórek do namnażania się i różnicowania3. Hydrożele pochodzące z polimerów syntetycznych są preferowane ze względu na ich proste i przejrzyste składniki, które wykluczają złożone wpływy, takie jak białka pochodzenia zwierzęcego lub wirusy. Spośród wszystkich kandydatów na hydrożele do hodowli komórkowych 3D, zawsze preferowane są hydrożele, które są łatwe do przygotowania i mają stałe właściwości. Ważna jest również możliwość dostosowania właściwości hydrożelu do różnych wymagań badawczych6.
Tutaj wprowadzamy łatwe przygotowanie hydrożelu na bazie glikolu i chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej, która staje się wszechstronną platformą hydrożelową do hodowli komórek 3D7. W tej metodzie stosuje się dobrze znany, biokompatybilny chitozan glikolowy do ustanawiania ram sieci hydrożelu. Jego grupy aminowe reagują z glikolem polietylenowym zakończonym benzaldehydem jako żelatorem polimerowym, tworząc dynamiczne wiązania iminowe jako wiązania krzyżowe hydrożeli8. Dynamiczne wiązania iminowe mogą tworzyć się i rozkładać odwracalnie i reagować na otoczenie, nadając hydrożelom mechanicznie regulowane sieci usieciowane9,10,11. Ze względu na wysoką zawartość wody, biokompatybilne materiały i regulowaną wytrzymałość mechaniczną, hydrożel jest z powodzeniem stosowany jako rusztowanie dla komórek L929 w hodowli komórek 3D12,13. Protokół tutaj szczegółowo opisuje procedury, w tym syntezę żelatora polimerowego, przygotowanie hydrożelu, osadzanie komórek i hodowlę komórek 3D.
Hydrożel wykazuje również kilka innych cech ze względu na dynamiczne powiązania krzyżowe imin, w tym jego wielozadaniowość na różne bodźce biologiczne (kwas/pH, pochodna witaminy B6 pirydoksal, białko papaina, itp.), co wskazuje, że hydrożel może być indukowany do rozkładu w warunkach fizjologicznych8. Hydrożel jest również samoregenerujący się i można go wstrzykiwać, co oznacza, że hydrożel może być podawany za pomocą minimalnie inwazyjnej metody iniekcji i zyskać przewagę w dostarczaniu leków i komórek14,15. Dodając dodatki funkcjonalne lub specjalne, wstępnie zaprojektowane żelatory polimerowe, hydrożel jest kompatybilny z uzyskaniem określonych właściwości, takich jak magnetyczność, temperatura, pH itp.16,17, które mogą spełniać szeroki zakres wymagań badawczych. Właściwości te ujawniają potencjalną zdolność hydrożelu do bycia wielokrotnymi nośnikami do wstrzykiwań dla leków i komórek zarówno w badaniach biomedycznych in vitro, jak i in vivo.

<table><tbody><tr><td>Chitozan glikolowy</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>39280-86-9</td><td>90% stopień deacetylacji</td></tr><tr><td>4-karboksybenzaldehyd</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>619-66-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>N, N'-dicykloheksylokarbodimid</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>538-75-0</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Chlorek wapnia bezwodny</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>10043-52-4</td><td>96%</td></tr><tr><td>4-dimetyloamiopryidyna</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>1122-58</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Glikol polietylenowy</td><td>Odczynnik chemiczny Sino-pharm</td><td>5254-43-7</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sino-pharm Odczynnik chemiczny</td><td>109-99-9</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Toluen</td><td>Sino-pharm Odczynnik chemiczny</td><td>108-88-3</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Eter etylowy</td><td>Odczynnik chemiczny Sino-pharm</td><td>60-29-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sino-pharm Odczynnik chemiczny</td><td>64-19-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Bezwodny CaCl2</td><td>Odczynnik chemiczny Sino-pharm</td><td>10043-52-4</td><td>99%</td></tr><tr><td>Dioctan fluoresceiny</td><td>Sigma</td><td>596-09-8</td><td>99%</td></tr><tr><td>Jodek propidyny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td>94%</td></tr><tr><td>RPMI-1640 pożywka hodowlana</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>0,25%</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0,01 M</td></tr><tr><td>Penicylina roztwór streptomycyny</td><td>Hyclon</td><td></td><td>10 000 U / ml</td></tr><tr><td>Reometr</td><td>TA Instrument</td><td></td> Mikroskop konfokalny <td>AR-G2</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3-kanałowy</td></tr><tr><td>L929 Komórki</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC klon 929; Komórka L, L929, pochodna parownika szczepu L</td></tr><tr><td></td><td>EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>48-głowowa igła</td><td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td><td></td><td>48-guage</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopowe</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opalarka</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&nbsp;</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3d

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Protokół przedstawia łatwą, efektywną i wszechstronną metodę przygotowania hydrożeli na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Hydrożel wytwarza się przez zmieszanie roztworów chitozanu glikolowego ze zsyntetyzowanym żelatorem polimerowym zakończonym benzaldehydem, a hydrożele uzyskuje się skutecznie w ciągu kilku minut w temperaturze pokojowej. Poprzez różne proporcje między chitozanem glikolowym, żelatorem polimerowym i zawartością wody uzyskuje się wszechstronne hydrożele o różnym czasie żelowania i sztywności. Po uszkodzeniu hydrożel może odzyskać swój wygląd i moduł, ze względu na odwracalność dynamicznych wiązań aminowych jako usieciowań. Ta samonaprawiająca się właściwość umożliwia wstrzykiwanie hydrożelu, ponieważ po procesie wstrzykiwania można go samoleczyć z wyciśniętych kawałków do integralnego hydrożelu luzem. Hydrożel jest również wieloraźny w odpowiedzi na wiele bodźców bioaktywnych ze względu na różne stany równowagi dynamicznych wiązań aminowych. Ten hydrożel został potwierdzony jako biokompatybilny, a mysie komórki fibroblastów L929 zostały osadzone zgodnie ze standardowymi procedurami, a proliferację komórek można było łatwo ocenić w procesie hodowli komórek 3D. Hydrożel może stanowić regulowaną platformę dla różnych badań, w których korzystne jest fizjologiczne naśladowanie środowiska 3D dla komórek. Wraz ze swoimi wieloreaktywnymi, samoregenerującymi się i wstrzykiwalnymi właściwościami, hydrożele mogą być potencjalnie stosowane jako wiele nośników dla leków i komórek w przyszłych zastosowaniach biomedycznych.

Schematyczny przebieg niniejszego protokołu przygotowania hydrożelu i jego zastosowania w 3D kulturze komórkowej przedstawiono na Rysunku 1. Informacje dotyczące składu i proporcji hydrożeli przygotowanych o różnej wytrzymałości mechanicznej podsumowano w Tabeli 1. Właściwości samoregeneracji i reologii hydrożelu, obrazujące jego sztywność poprzez test modułu zachowawczego w funkcji częstotliwości, przedstawiono na Rysunku 2. Obrazy konfokalne o...

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przygotowanie wstrzykiwalnego hydrożelu chitozanowego do trójwymiarowej hodowli komórkowej, przeznaczonego do końcowego zastosowania w terapiach leczniczych. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na pytania z dziedziny hydrożeli samonaprawialnych, takie jak sposób wytwarzania samonaprawialnego hydrożelu poprzez całkowite zanurzenie oraz sposób jego wykorzystania w 3D hodowli komórkowej. Przewagą tej techniki jest możliwość przygotowania biokompatybilnego hydrożelu samonaprawialnego w bardzo prosty sposób oraz możliwość zastosowania go do 3D hodowli komórkowej.Ten hydrożel jest również wstrzykiwalny, dzięki czemu może być wykorzystany jako nośnik w terapii komórkowej. Teraz pan Yongsan Li pokaże Państwu, jak przygotować ten hydrożel oraz jak przeprowadzić 3D hodowlę komórek z jego wykorzystaniem. Yongsan Li jest doktorantem w naszym laboratorium.Aby przygotować hydrożele, należy najpierw zsyntetyzować DF PEG. W dygestorium odważić cztery gramy PEG o masie cząsteczkowej 4 000 do kolby okrągłodennej i dodać 100 mililitrów toluenu. Następnie, w celu rozpuszczenia polimerów, należy podgrzać roztwór.Po rozpuszczeniu wszystkich polimerów należy użyć ewaporatora w celu usunięcia wszystkich rozpuszczalników. Następnie proces mieszania w toluenie i jego odparowywania należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie, aby przygotować suche polimery PEG. W dalszej kolejności polimery należy rozpuścić w 100 mililitrach DHF przy użyciu mieszadła magnetycznego.Następnie rozpuścić 0,9 g 4-karboksybenzaldehydu w roztworze. Potem rozpuścić w roztworze 0,07 g dimetylaminopirydyny. Teraz dodać 1,25 g DCC w rurce suszącej wypełnionej bezwodnym chlorkiem wapnia.Następnie należy mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez około 12 godzin. Następnego dnia należy użyć 500 mililitrów zimnego eteru dietylowego, aby wytrącić białe osady, a następnie zebrać je za pomocą filtracji próżniowej. Roztwór należy odrzucić, a osady wysuszyć w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.Następnie rozpuścić białe ciało stałe w 100 mililitrach THF. Przed przejściem do kolejnego etapu należy odfiltrować wszelkie nierozpuszczalne białe osady. Teraz wytrącić rozpuszczone substancje stałe, stosując świeży, zimny dietylowy eter.Następnie należy zastosować filtrację próżniową w celu zebrania ciał stałych i pozostawić je do ponownego wyschnięcia. Powtórzyć ten proces dwa do trzech razy, a następnie umieścić białe ciało stałe w suszarce próżniowej w celu jego całkowitego wysuszenia. Powstały biały proszek jest produktem końcowym: DF PEG z końcową grupą benzaldehydową.Aby enkapsulować komórki w hydrożelu do hodowli, najpierw rozpuścić 0,44 g DF PEG w dwóch mililitrach pożywki do wzrostu komórek w probówce o pojemności czterech mililitrów. Mieszać mieszaninę na wirówce typu vortex do uzyskania 20% roztworu wagowego. Następnie wysterylizować roztwór.Napełnić 10-mililitrową strzykawkę i przepuścić zawartość przez filtr bakteriobłonowy o rozmiarze porów 0,22 µm. Następnie wymieszać 0,165 g glikolu-chitozanu z czterema mililitrami pożywki do hodowli komórkowych, używając wiertaka typu vortex, aby przygotować 4% wagowo roztwór chitozanu. Następnie wysterylizować roztwór, używając kolejnego filtra bakteriobłonowego o rozmiarze porów 0,22 µm.Następnie należy zebrać komórki, na przykład komórki L929, używając trypsyny. Zebrane komórki należy przemyć, a następnie zawiesić w pożywce w stężeniu 3,75 miliona komórek na mililitr. W kolejnym kroku komórki są wysiewane do macierzy 3D.Precyzyjne przestrzeganie tych kroków jest kluczowe dla osiągnięcia sukcesu. Teraz wymieszaj 0,4 milliliters zawiesiny komórkowej z 0,4 milliliters roztworu chitosanem za pomocą wierzchołka wirówki (vortex). Pipetą przenieś tę mieszaninę na środek szalki Petriego o średnicy dwóch centymetrów, a następnie nanieś pipetą 0,2 milliliters roztworu DF PEG do szalki.Następnie należy delikatnie pipetować w celu zaindukowania tworzenia hydrożelu. Formowanie hydrożelu należy ocenić, przechylając naczynie i obserwując lepkość roztworu. Aby przetestować możliwość wstrzyknięcia enkapsulowanych komórek, należy przygotować taką samą mieszaninę w strzykawce o pojemności 10 ml.Następnie, po uformowaniu się hydrożelu, powoli wypchnij go przez igłę o rozmiarze 48G do szalki Petriego. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do mieszaniny hydrożelu i komórek w szalce, a następnie przenieś szalkę do inkubatora w celu hodowli. Co drugi dzień wymieniaj pożywkę, pokrywając nią trójwymiarową (3D) hodowlę komórek w hydrożelu.Aby przygotować komórki zamknięte w hydrożelach do obrazowania, najpierw dwukrotnie przemyj hydrożele jednym mililitrem PBS. Następnie zabarw hydrożele roztworem fluoresceinowego diacetylnianu oraz roztworem jodku propidyny. Nanieś 0,5 mililitra obu roztworów na hydrożel i inkubuj go przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Po krótkiej inkubacji z roztworami barwiącymi odessaj wszystkie rozpuszczalniki. Następnie poddaj hydrożele obserwacji przy użyciu mikroskopii konfokalnej, stosując wzbudzenie przy 488 nanometrach w celu wizualizacji żywych komórek oraz wzbudzenie przy 543 nanometrach w celu wizualizacji martwych komórek. Pozyskaj stosy obrazów z przekrojami o grubości dwóch mikronów, aby potwierdzić rozmieszczenie komórek w hydrożelu.Komórki L929. Typowa linia komórkowa z myszy o sztywności tkanki w środowisku in-vivo wynoszącej około 5 600 Pa została zamknięta w hydrożelu. Ich żywotność pozostawała bardzo wysoka przez cały proces hodowli, a komórki osiągnęły znaczną gęstość.Po siedmiu dniach hodowli w hydrożelu liczba komórek wzrosła o 200%. Hydrożele, które zostały naniesione na naczynie hodowlane za pomocą igły o rozmiarze 48G, mogły ulec samoregeneracji, odtwarzając zintegrowany hydrożel po około jednej godzinie. Po siedmiu dniach hodowli komórki te również gwałtownie proliferowały. Odnotowano dowody na zdarzenia podziału komórkowego, w których niektóre komórki wydawały się podzielone na dwie.Test żywotności (live-dead assay) wykazał bardzo wysoką przeżywalność, co potwierdziło skuteczną proliferację komórek w hydrożelu 3D po wstrzyknięciu. Tempo proliferacji tych komórek po siedmiu dniach hodowli wynosiło około 3/4 tempa proliferacji komórek niewstrzykniętych. Zatem, mimo że siły ścinania podczas wstrzykiwania wywierają mierzalny negatywny wpływ, wstrzyknięte komórki nadal wykazywały dość wysoką zdolność do proliferacji.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak przygotować samogojący się hydrożel, jak wykorzystać go do trójwymiarowej (3D) hodowli komórkowej oraz w jaki sposób dostarczyć komórki za pomocą tego hydrożelu. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje mniej niż jedną godzinę. Stosując opisaną procedurę, można przeprowadzić inne metody, takie jak wstrzykiwanie in-vivo w terapii komórkowej lub dostarczaniu leków.

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli sferoidów komórek ludzkiego więzadła przyzębia (PDL) za pomocą filmów chitozanowych. Hodowla trójwymiarowych (3D) sferoid komórkowych stanowi alternatywę dla konwencjonalnego systemu hodowli polistyrenowych do hodowli tkankowych (TCPS).

Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu

Obecny protokół opisuje nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych. Wielkość tych mikrożeli może być precyzyjnie kontrolowana i mogą one wykazywać pęcznienie zależne od pH, ulegać degradacji in vivo i być naładowane cząsteczkami terapeutycznymi, które uwalniają się z czasem w sposób ciągły, co czyni je bardzo istotnymi dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Wytwarzanie mikrożeli chitozanowo-genipinowych o kontrolowanej wielkości i wolnych od emulsji do zastosowań w inżynierii tkankowej

Poznaj metodę przygotowania iniekcyjnych hydrożeli na bazie chitozanu z wykorzystaniem dynamicznej chemii iminowej. Technika ta umożliwia regulację właściwości mechanicznych materiału i zastosowanie w trójwymiarowej hodowli komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Przeglądaj więcej filmów