Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D
September 29th, 2017
Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.
Ogólnym celem tego protokołu jest przygotowanie hydrożelu chitozanowego do wstrzykiwań do trójwymiarowej hodowli komórkowej w celu ostatecznego wykorzystania w leczeniu terapeutycznym. Ta metoda może odpowiedzieć na pytania z zakresu samonaprawiającego się hydrożelu, takie jak jak zrobienie samonaprawiającego się hydrożelu przez całkowite zanurzenie i jak go użyć do hodowli komórek 3D. Moją zaletą tej techniki jest to, że dzięki kompatybilnemu samonaprawiającemu się hydrożelowi można przygotować w bardzo prosty sposób i przy użyciu hodowli komórkowej 3D.
Ten hydrożel jest również do wstrzykiwań, dzięki czemu może być stosowany jako nośnik w terapii komórkowej. Teraz Pan Yongsan Li pokaże Ci, jak zrobić hydrożel i jak przeprowadzić hodowlę komórkową 3D przy użyciu tego hydrożelu. Yongsan Li jest naszym absolwentem w naszym laboratorium.
Aby wytworzyć hydrożele, najpierw zsyntetyzuj DF PEG. W dygestorium odważ cztery gramy PEG o masie cząsteczkowej 4000 do kolby okrągłodennej i dodaj 100 mililitrów toluenu. Następnie, aby rozpuścić polimery, podgrzej roztwór.
Po rozpuszczeniu wszystkich polimerów użyj parownika, aby usunąć wszystkie rozpuszczalniki. Następnie powtórz proces mieszania toluenu i odparowywania go jeszcze dwukrotnie, aby przygotować suche polimery PEG. Następnie za pomocą mieszadła magnetycznego i 100 mililitrów DHF rozpuść polimery.
Następnie rozpuść 0,9 grama 4-karboksybenzaldehydu w roztworze. Następnie rozpuść 0,07 grama dimetyloaminopirymidu w roztworze. Teraz dodaj 1,25 grama DCC do probówki suszącej wypełnionej bezwodnym chlorkiem wapnia.
Teraz pozwól reakcji mieszać się w temperaturze pokojowej przez około 12 godzin. Następnego dnia użyj 500 mililitrów zimnego eteru dietylowego do wytrącenia białych ciał stałych i użyj filtracji próżniowej do zebrania ciał stałych. Wyrzuć substancję rozpuszczoną i wysusz ciała stałe w dobrej wentylacji.
Następnie rozpuść białe ciała stałe w 100 mililitrach THF. Wszelkie nierozpuszczalne białe ciała stałe muszą zostać odfiltrowane przed kontynuowaniem. Teraz wytrącić rozpuszczone ciała stałe za pomocą świeżego zimnego eteru dietylowego.
Następnie użyj filtracji próżniowej, aby zebrać ciała stałe i pozwól im ponownie wyschnąć. Powtórz ten proces dwa do trzech razy, a następnie umieść białe ciała stałe w piecu do suszenia próżniowego, aby całkowicie je wysuszyć. Powstały biały proszek jest produktem końcowym: DF PEG zakończony benzaldehydem.
Aby zamknąć komórki w hydrożelu do hodowli, najpierw rozpuść 0,44 grama DF PEG w dwóch mililitrach pożywki do wzrostu komórek w czteromililitrowej probówce. Zmieszaj mieszaninę do 20% roztworu wagowego. Następnie wysterylizuj roztwór.
Załaduj go do 10-mililitrowej strzykawki i przeciśnij przez filtr zatrzymujący bakterie o grubości 0,22 mikrona. Teraz wymieszaj 0,165 grama glikolu-chitozanu z czterema mililitrami pożywki do hodowli komórkowych, używając wiru, aby uzyskać 4% wagowo roztwór chitozanu. Następnie wysterylizuj roztwór za pomocą innego filtra zatrzymującego bakterie o grubości 0,22 mikrona.
Następnie zbierz komórki, takie jak komórki L929, używając trypsyny. Umyj zebrane komórki i zawieś je ponownie w pożywce w ilości 3,75 miliona komórek na mililitr. W kolejnym kroku komórki są umieszczane w matrycy 3D.
Dokładne wykonanie tych kroków ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia sukcesu. Teraz wymieszaj 0,4 mililitra zawiesiny komórek z 0,4 mililitra roztworu chitozanu za pomocą wiru. Odpipetuj tę mieszaninę na środek szalki Petriego o średnicy dwóch centymetrów i odpipetuj 0,2 mililitra roztworu DF PEG do naczynia.
Następnie należy delikatnie pipetować, aby wywołać tworzenie się hydrożelu. Oceń tworzenie się hydrożelu, przechylając naczynie i obserwując lepkość roztworu. Aby przetestować wstrzykiwalność zamkniętych komórek, przygotuj ten sam preparat w 10-mililitrowej strzykawce.
Następnie, po uformowaniu się hydrożelu, powoli wyrzuć hydrożel przez igłę o rozmiarze 48 do szalki Petriego. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do mieszaniny hydrożelowo-komórkowej na płytce i przenieś płytkę do inkubatora w celu hodowli. Co drugi dzień zmieniaj pożywkę, nakładając na siebie hodowlę komórek hydrożelowych 3D.
Aby przygotować komórki zamknięte w hydrożelach do obrazowania, najpierw przepłucz hydrożele jednym mililitrem PBS dwa razy. Następnie zabarwić hydrożele roztworem dioctanu fluoresceiny i roztworem jodku propidyny. Nałóż 0,5 mililitra obu roztworów na hydrożel i inkubuj hydrożel przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po krótkiej inkubacji z roztworami barwników odessać wszystkie rozpuszczalniki. Teraz obserwuj hydrożele za pomocą mikroskopii konfokalnej, ze wzbudzeniem na 488 nanometrach, aby zobaczyć żywe komórki, i wzbudzeniem na 543 nanometrach, aby zobaczyć martwe komórki. Zbierz stosy obrazów z dwumikronowymi plasterkami, aby zweryfikować rozmieszczenie komórek w hydrożelu.
Ogniwa L929. Typowa linia komórkowa myszy z włókna szklanego o sztywności tkanek w środowisku in vivo wynoszącej około 5 600 paskali została zamknięta w hydrożelu. Ich żywotność była niezwykle wysoka przez cały proces hodowli i osiągnęły niezwykłą gęstość komórek.
Po siedmiu dniach hodowli w hydrożelu liczba komórek wzrosła o 200%Hydrożele, które zostały wydalone na szalkę do hodowli komórkowej za pomocą igły o rozmiarze 48, mogły samoleczyć się, aby po około godzinie przekształcić zintegrowany hydrożel. Po siedmiu dniach w hodowli komórki te również dramatycznie się namnażały. Można znaleźć dowody na zdarzenia rozszczepienia komórek, w których niektóre komórki wydawały się podzielone na dwie części.
Test żywych ciał wykazał bardzo wysoką żywotność, wykazując udaną proliferację komórek w hydrożelu 3D po wstrzyknięciu. Tempo proliferacji komórek wynosiło około 3/4 tempa namnażania się komórek bez wstrzyknięcia po siedmiu dniach hodowli. Tak więc, chociaż siła napierania podczas wstrzykiwania ma wymierny negatywny wpływ, wstrzyknięte komórki nadal były dość proliferacyjne.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak przygotować samonaprawiający się hydrożel i jak używać tego hydrożelu do hodowli komórek 3D oraz jak dostarczyć komórkę za pomocą tego hydrożelu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po najlepszej procedurze można wykonać inną metodę, taką jak wstrzyknięcie in vivo do terapii komórkowej lub dostarczanie leków.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę przygotowywania wstrzykiwanych żeli hydroksypropylometylocelulozowych z wykorzystaniem dynamicznej chemii iminowej. Koncentracja skierowana jest na dostosowanie wytrzymałości mechanicznej żelu do zastosowań w trójwymiarowym hodowli komórek.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Biomateriały
- Żele hydroksypropylometylocelulozowe
- Hodowla komórek
Tło
- Chitosan jest biopolimerem o potencjale w zastosowaniach biomedycznych.
- Wstrzykiwalne żele mogą ułatwiać minimalnie inwazyjne terapie.
- Trójwymiarowe modele hodowli komórek są kluczowe dla badania zachowań komórkowych.
- Właściwości samonaprawcze zwiększają funkcjonalność żeli.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody tworzenia wstrzykiwanych żeli hydroksypropylometylocelulozowych.
- Zbadanie zastosowania tych żeli w trójwymiarowym hodowli komórek.
- Zbadanie właściwości samonaprawczych żeli.
Stosowane metody
- Dynamiczna chemia iminowa do przygotowywania żeli.
- Dostosowania wytrzymałości mechanicznej poprzez zmiany w formule.
- Zastosowanie żeli w trójwymiarowym setupie hodowli komórek.
- Demonstracja procesu przygotowywania przez studenta ukończonego studia.
Główne wyniki
- Żele wykazywały regulowane właściwości mechaniczne.
- Zostało wykazane skuteczne zastosowanie w trójwymiarowym hodowli komórek.
- Potwierdzono właściwości samonaprawcze.
- Metoda okazała się prosta i skuteczna.
Wnioski
- Żele na bazie chitosanu mogą być łatwo przygotowane do zastosowań biomedycznych.
- Te żele są odpowiednie do zastosowań w terapii komórkowej.
- Badanie przyczynia się do rozwoju dziedziny materiałów samonaprawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables the rapid preparation of injectable, self-healing chitosan hydrogels for 3D cell culture, offering a tunable platform that mimics physiological tissue stiffness. The dynamic imine chemistry allows for adjustable gelation kinetics and mechanical properties, supporting reproducible encapsulation of cells such as L929 fibroblasts. This approach addresses early-stage challenges in biomaterial design by providing a versatile, biocompatible system for evaluating cell behavior in a controlled 3D microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular responses in a tunable 3D matrix that mimics native tissue stiffness (~5,600 Pa), supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Facilitates rapid hydrogel formation at room temperature within minutes, allowing high-throughput preparation of standardized 3D culture systems.
- Predictive Value: Self-healing and injectable properties enable assessment of cell resilience under mechanical stress, relevant for delivery-focused target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Hydrogels support live/dead staining and confocal imaging, enabling quantitative viability and proliferation readouts in 3D.
- Reproducibility: Consistent gelation via defined glycol chitosan to benzaldehyde-terminated PEG ratios ensures batch-to-batch uniformity for assay standardization.
- Scalability: Simple mixing and vortex-based preparation allows adaptation to multi-well formats for compound screening in 3D environments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated compatibility with L929 fibroblast encapsulation and sustained proliferation supports use in preclinical models of tissue repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Self-healing after injection (recovery within ~1 hour) reduces concerns about delivery-induced damage, improving confidence in translational potential.
- Biomaterial Platform: Adjustable stiffness and responsiveness to bioactive stimuli allow modeling of disease-relevant microenvironments for preclinical screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early evaluation of cell-material interactions before advancing to in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell proliferation and viability in a defined 3D hydrogel system with tunable mechanical cues.
- Screening: Hydrogel formation is rapid and reagent-efficient, enabling preparation of standardized 3D matrices for compound or genetic perturbation screens.
- Analytics: Compatible with live/dead assays and confocal imaging, providing quantitative, spatially resolved readouts on cell distribution and viability.
- Translational Research: Demonstrated cell proliferation post-injection supports evaluation of delivery strategies in regenerative medicine contexts.
- Enterprise Reuse: The hydrogel platform is reusable across cell types and stimuli, serving as a modular tool for multiple projects in biomaterials and cell therapy research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides a tunable, biomimetic 3D environment that reduces reliance on artificial 2D culture systems, improving physiological relevance.
- Operational Value: Room-temperature gelation, simple mixing, and sterilization via filtration enable rapid, GMP-adaptable preparation without complex equipment.
- Strategic Value: Enables early assessment of delivery-related cell stress, informing go/no-go decisions for cell therapy candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating cell survival and function in injectable, self-healing matrices before in vivo investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer chemistry and sterile technique for synthesis of benzaldehyde-terminated PEG and hydrogel formulation.
- Needs access to standard lab equipment: vortex mixer, syringe filters, centrifuge, and confocal microscopy for validation.
- Standardization of glycol chitosan and DF PEG ratios is critical for reproducible gelation time and stiffness across batches.
- Adaptation to other cell types may require optimization of encapsulation density and crosslinking kinetics.
- While injectable, shear forces during delivery may affect cell viability, necessitating empirical validation for each therapeutic cell type.
