Name: In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę wykrywania swoistej dla antygenu cytolizy in vivo w modelu mysim. Technika umożliwia szybką ocenę potencjału cytolitycznego limfocytów T bez konieczności stosowania guzów lub zakażeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez badania NIH (A1R03AI120027 (RN) i 1R21AI20012 (RN)), Institutional Research Grant (RN), start-up grant (RN) i MD Anderson CIC seed grant (RN).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Teksańskiego MD Anderson Cancer Center.
1. Przygotowanie peptydu do szczepionki
<ol>
	<li>Rozpuścić liofilizowany peptyd w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do odpowiedniego stężenia i wirować przez 30 s. 
	UWAGA: Dla hgp10025-33 stężenie końcowe wynosi 1 mg/ml, a dla OVA257-264 stężenie końcowe wynosi 0,5 mg/ml. Należy rozpuścić peptyd przed wstrzyknięciem. Nie przechowywać po rozpuszczeniu.</li>
</ol>
2. Izolacja splenocytów od transgenicznej myszy
UWAGA: Izolacja komórek ze śledziony musi być przeprowadzona w sterylny sposób.
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji transgeniczną mysz OT-1 przy użyciu zatwierdzonej metody uduszenia CO2 i usuń śledzionę. 
	UWAGA: Na tym etapie wykorzystuje się odpowiednią mysz transgeniczną specyficzną dla wybranego peptydu.
	<ol>
		<li>Połóż mysz na prawym boku. Spryskaj lewą stronę myszy 70% etanolem (EtOH). Podciągnij skórę za pomocą kleszczy i przetnij skórę nożyczkami chirurgicznymi; Śledziona będzie widoczna w jamie otrzewnej. Delikatnie rozetnij jamę otrzewnej, aby uzyskać dostęp do śledziony. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdezagregować śledzionę, umieszczając ją w filtrze 70 μm na szalce Petriego z 2 ml pożywki A (PBS z 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS)) i rozbijając śledzionę końcem tłoka.
	<ol>
		<li>Zebrać splenocyty z szalki Petriego i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyj szalkę Petriego 5 ml pożywki A dwukrotnie, aby zebrać wszystkie komórki. Dodać pożywkę A do 25 ml i odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 475 x g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać komórki i ponownie zamieszać w 1 ml/na śledzionę buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 10 ml pożywki A i odwirować w temperaturze pokojowej przy 475 x g. Zawiesić osad w 10 ml pożywki A i usunąć zanieczyszczenia, filtrując zawiesinę komórek przez filtr 70 μm do czystego stożkowego o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Zawiesić komórki w PBS do końcowego stężenia 106 - 1006 komórek/ml. W przypadku zabijania swoistego dla OVA257-264 zawiesić ponownie w 106 komórkach/ml, a w przypadku zabijania swoistego dla hgp10025-33, zawiesić ponownie w 1006 komórek/ml.
	<ol>
		<li>Wirować pozostałe komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w temperaturze 475 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 15 ml zimnego PBS w celu przepłukania komórek. Powtórz krok prania jeszcze raz. Wiruj komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 475 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w zimnym PBS zgodnie z końcową objętością oznaczoną w kroku 2.4.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę jednokomórkową do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i trzymać na lodzie do momentu wstrzyknięcia do myszy biorcy C57/BL6.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie splenocytów od myszy transgenicznych
<ol>
	<li>Umieść mysz odbiorczą C57/BL6 w unieruchomieniu grzbietem do góry. Spryskaj obszar podstawy ogona iniekcji 70% alkoholem izopropylowym. Podać dożylnie 100 μl zawiesiny jednokomórkowej (sekcja 2) do żyły ogonowej za pomocą igły o sile 27 G, skośną stroną skierowaną do góry.</li>
</ol>
4. Administracja COVAX
UWAGA: Jeśli komórki są wstrzykiwane po południu, covax powinien być podawany następnego ranka w ciągu 18 godzin od wstrzyknięcia komórek.
<ol>
	<li>Umieść mysz w przezroczystym pudełku znieczulającym z 1-3% izofluranem. Po całkowitym znieczuleniu myszy przenieś je do stożków nosowych przymocowanych do kolektora w komorze anestezjologicznej. Trzymaj myszy w ryzach grzbietem do góry. 
	UWAGA: Znieczulenie potwierdza się krótkim uszczypnięciem palca u nogi w celu sprawdzenia, czy nie została wywołana reakcja na odstawienie. Prawo federalne ogranicza stosowanie izofluranu na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii.</li>
	<li>Spryskaj obszar podstawy ogona iniekcji 70% alkoholem izopropylowym. Wstrzyknąć podskórnie 100 μl roztworu peptydowego (z sekcji 1) za pomocą igły 27 G ze strzykawką wnikającą na głębokość 4 - 5 mm w okolicę podstawy ogona, stroną ze skosem igły skierowaną do góry. 
	UWAGA: Myszy szczepi się w jednym boku za pomocą wstrzyknięcia podskórnego u podstawy ogona10.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl przeciwciała anty-CD40 (0,5 mg/ml zapasu) bocznie do miejsca wstrzyknięcia szczepionki.</li>
	<li>Ostrożnie nałożyć imikwimod w postaci kremu 50 mg/mysz w miejscach szczepienia. Krem imikwimod należy wcierać w powierzchnię, aż krem przestanie być widoczny i całkowicie się wchłonie.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl 100 000 j.m./ml białka rhIL-2 dootrzewnowo (i.p.) w dolną część brzucha. Obserwuj myszy przez 5 minut po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia. 
	UWAGA: W tym momencie eksperyment jest wstrzymany na 3 dni.</li>
</ol>
5. Izolacja docelowych splenocytów do znakowania za pomocą CFSE
UWAGA: Izolacja komórek ze śledziony musi być przeprowadzona w sterylny sposób.
<ol>
	<li>Poddać eutanazji myszy C57BL/6 zgodnie z zatwierdzoną metodą uduszenia CO2 . Usuń śledzionę (śledziony) jak w kroku 2.1.1. Zdezagregować śledzionę i umyć splenocyty jak w krokach 2.2.1 - 2.2.3. Lizować czerwone krwinki, jak w krokach 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Usunąć komórki do zliczenia za pomocą hemocytometru i obliczyć końcowe stężenie komórek przy 106 komórkach/ml w roztworze znakującym CFSE (opisanym w kroku 7). Wirować pozostałe komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w temperaturze 475 x g. Odessać supernatant.</li>
</ol>
6. Pulsowanie peptydów docelowych splenocytów
UWAGA: Pulsowanie peptydów musi być wykonywane w sterylny sposób.
<ol>
	<li>Zawieś komórki w 106 komórkach / ml w kompletnym pożywce (pożywka RPMI 1640 z 10% FBS, 1% L-glutaminą (L-Gln), 1% penicyliną / streptomycyną (Pen / Strep)). Podziel komórki na 2 probówki (stożkowe 15 ml). Oznacz każdą probówkę jako pulsacyjną lub niepulsacyjną.</li>
	<li>Dodaj peptyd do probówki oznaczonej jako pulsacyjny. W przypadku pulsacji OVA257-264 dodaj 1 μg/ml, a w przypadku pulsacji hgp10025-33 dodaj 2 μg/ml. 
	UWAGA: Komórki bez pulsacji przechodzą taką samą inkubację jak komórki pulsacyjne, tylko bez dodatku peptydu.
	<ol>
		<li>Inkubować komórki + peptyd w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 10 ml kompletnej pożywki (pożywka RPMI 1640 z 10% FBS, 1% L-glutaminą (L-Gln), 1% penicyliną/streptomycyną (Pen/Strep)) do każdej probówki, aby przemyć zarówno pulsacyjne, jak i niepulsacyjne komórki docelowe. Wirować pozostałe komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w temperaturze 475 x g. Odessać supernatant.</li>
</ol>
7. Przygotowanie CFSE do oznaczania docelowych splenocytów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do znakowania CFSE podczas mycia komórek w kroku 6.3; komórki pulsacyjne zostaną oznaczone jako CFSEhi, a komórki bez impulsów jako CFSElo. Przygotuj 1 ml roztworu znakującego CFSE na 106 komórek. 
	UWAGA: CFSE jest wrażliwy na światło i powinien być przez cały czas chroniony przed światłem.
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkęznakowaną CFSE hi, dodając 1 μL/ml CFSE (5 mM roztworu podstawowego) dla końcowego stężenia 5 μM/ml w pożywce RPMI 1640 z 2% FBS.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do znakowania CFSE, dodając 1 μL/ml CFSE (0,5 mM roztwór podstawowy) do końcowego stężenia 0,5 μM/ml Pożywki RPMI 1640 z 2% FBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Znakowanie docelowych splenocytów za pomocą CFSE
UWAGA: Etykietowanie CFSE musi być wykonywane w sterylny sposób.
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić pulsacyjne i niepulsacyjne komórki docelowe (od kroku 6.3) przy 106 komórkach/ml pożywki znakującej CFSE. Ponownie zawiesić komórki pulsacyjne za pomocą przygotowanych pożywekznakujących CFSE hi, a ogniwa bez impulsów za pomocą przygotowanych pożywekdo znakowania CFSE o niskiej etykiecie.</li>
	<li>Mieszaj komórki i podłoża znakujące CFSE przez delikatne odwrócenie lub wirowanie. Nie mieszać przez wirowanie. Inkubować komórki i pożywki znakujące CFSE w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Mieszaj komórki co 5 minut.</li>
	<li>Dodać 10 ml kompletnej pożywki do każdej zawiesiny komórek i wirować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w temperaturze 475 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml zimnego PBS. Wirować komórki w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 475 x g.</li>
	<li>Powtórz krok 8.4.</li>
	<li>Policz komórki i wymieszaj pulsacyjne peptydowe, znakowanehip CFSE z niepulsacyjnymi,CLSE nisko znakowanymi komórkami w stosunku 1: 1 do wstrzyknięcia myszom biorcy. Zachować podwielokrotność 1 x 106 mieszanych komórek do wykorzystania do podstawowej oceny cytometrii przepływowej (sekcja 11). 
	UWAGA: Ostateczna objętość do wstrzykiwań wynosi 100 μl na mysz. Ostateczna liczba komórek to 10e6 komórek. Należy wziąć pod uwagę utratę objętości w strzykawce i igle, którą należy oszacować na 500 μl.</li>
</ol>
9. Wstrzykiwanie komórek docelowych
UWAGA: Utrzymuj komórki oznaczone znakiem CFSE przed światłem przed i w trakcie wstrzyknięcia tak bardzo, jak to możliwe.
<ol>
	<li>Umieść myszy odbiorcy C57BL/6 w unieruchomieniu grzbietem do góry. Spryskaj obszar podstawy ogona iniekcji 70% alkoholem izopropylowym. Podać dożylnie 100 μl zawiesiny jednokomórkowej do żyły ogonowej skośną stroną skierowaną do góry.</li>
</ol>
10. Ponowna izolacja komórek docelowych
UWAGA: Czas wykonania tego kroku jest krytyczny i zależy od cytotoksyczności CTL oraz siły antygenu do stymulacji. W celu oceny zabicia celu impulsowego OVA257-264, komórki należy pobrać 4 - 6 godzin po wstrzyknięciu. Ponieważ komórki znakowane CFSE są wrażliwe na światło, śledziony przetwarzają się w ciemności.
<ol>
	<li>Poddać eutanazji myszy C57BL/6 biorcy zgodnie z zatwierdzoną metodą uduszenia CO2 .</li>
	<li>Usuń śledzionę (śledziony) jak w kroku 2.1.1. Zdezagregować śledzionę i umyć splenocyty jak w krokach 2.2.1 - 2.2.3. Lizować czerwone krwinki, jak w krokach 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforze do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FAC) (1% BSA + PBS) w celu oceny za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
11. Logika bramkowania do określania aktywności CTL za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Wykonaj ocenę aktywności CTL przy użyciu standardowego protokołu cytometrii przepływowej. Pobieraj komórki za pomocą kanału FITC na cytometrze przepływowym z laserem 488 nm do wzbudzenia11.
	<ol>
		<li>Bramka na żywych limfocytach przy użyciu parametrów rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC). Podbramka w żywej bramce limfocytów dla całej populacji CFSE-dodatniej. 
		UWAGA: Wstrzyknięte komórki znakowane CFSE będą stanowić niewielki podzbiór wszystkich limfocytów obecnych w śledzionie. Komórki CSFE-dodatnie powinny pojawiać się jako dwie odrębne populacje na skali logarytmicznej.</li>
		<li>Użyj formatu histogramu, aby określić procent populacji bez impulsów (lewy pik, CFSElo) i pulsacyjnych (prawy pik, CFSEhi). Utrata komórekhi CFSE wskazuje na aktywność CTL specyficzną dla antygenu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li>
<li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+sequestration%2C+dysfunction+and+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li>
<li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li>
<li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż ten protokół jest prosty, istnieje kilka krytycznych kroków, które należy dokładnie wykonać. Przygotowanie COVAX po wstrzyknięciu badanej limfocytu T specyficznej dla antygenu jest konieczne, aby zobaczyć ewentualne zabicie impulsowych celów. Chociaż możliwe jest, że szczepionka COVAX na bazie wody wywołuje ostry stan zapalny, w przypadku przewlekłej fazy zapalnej zastąpienie krótkotrwałego preparatu na bazie wody podejściem opartym na oleju o powolnym uwalnianiu antygenu może przynieść lepsze wyniki<sup class="x...

Istnieje wiele protokołów do oceny potencjału cytolitycznego (CTL) limfocytów T CD8+ lub CD4+. Ocenę tę można łatwo przeprowadzić in vitro w kontrolowanych warunkach1,2,3. Ponadto modele chorób zakaźnych, takie jak LCMV, klasycznie zbadały funkcję CTL poprzez wykorzystanie różnicowo znakowanych komórek docelowych CFSE (ester sukcynimidylowy 5-(i 6)-karboksyfluoresceiny), w których komórki znakowanehi CFSE są pulsowane peptydem, a komórkidocelowe znakowane lo CFSE pozostają niepulsacyjne. Komórki są następnie wstrzykiwane w stosunku 1:1 i oceniane pod kątem utraty celów impulsowych znakowanychznakiem hi CFSE za pomocą cytometrii przepływowej4. Modele szczepionki i odrzucenia wykorzystano również podobne strategie do oceny zabijania in vivo zarówno przez limfocyty T CD8 +, jak i CD4 +, a także komórki NK5,6. Jest to potężny test, ale wymaga użycia czynników zakaźnych, które pobudzają układ odpornościowy przed docelowym wstrzyknięciem.
Ten protokół, z drugiej strony, nie wymaga wcześniejszego zakażenia gospodarza, a zamiast tego wykorzystuje strategię szczepień, aby przygotować układ odpornościowy przed docelowym wstrzyknięciem. Szczepienie to składa się z preparatu peptydowego na bazie wody, który wymaga podania koktajlu immunostymulującego o nazwie covax7, składającego się z agonisty receptora Toll-podobnego 7 (TLR7) (imikwimod w kremie), agonistycznego przeciwciała anty-CD40 i interleukiny-2 (IL-2) prowadzącego do synergicznego połączenia środków immunostymulujących w celu wywołania specyficznego dla peptydu pobudzenia i silnej odpowiedzi immunologicznej. W związku z tym test ten zapewnia szybki odczyt funkcji CTL, ponieważ szczepionka jest podawana wraz z komórkami w celu oceny funkcji zaledwie trzy dni przed wstrzyknięciem komórek docelowych. Ponadto przygotowanie COVAX jest na tyle silne, że zdolność zabijania limfocytów T specyficznych dla antygenu można zaobserwować między 4 a 24 godzinami po wstrzyknięciu.
Głównym ograniczeniem tego protokołu jest określenie in vivo harmonogramu wykrywania zabijania celu, który jest odpowiedni zarówno dla antygenu, jak i testowanej hipotezy. Należy przeprowadzić staranną ocenę, ponieważ zmiany w sile antygenu, jak również zmiany genetyczne testowane w limfocytach T mogą skutkować różnicową funkcją CTL, która wymagałaby innego czasu wykrywania zabijania celu. Ponadto, podczas gdy odpowiednie stężenie peptydu do szczepienia zostało zoptymalizowane dla ludzkiego antygenu czerniaka glikopeptydu 100 (hgp10025-33) i albuminy jaja kurzego257-264 (OVA257-264)8,9, zastosowanie innego modelu antygenu, który może być bardziej odpowiedni dla danego badania, wymagałoby dalszej walidacji. Ze względu na przewidywane różnice w zdolności docelowych antygenów do stymulowania funkcji efektora CTL w połączeniu z COVAX jako adiuwantem, optymalizacja stężenia dawki IL-2 i częstotliwości dawkowania może być niezbędna do osiągnięcia pożądanego celu. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na szybką ocenę funkcji zabijania in vivo i może być dostosowany do dowolnego antygenu.

<table><tbody><tr><td>6 do 12 tygodniowe samice myszy C57BL/6&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>C57 Czarne 6 myszy</td></tr><tr><td>OT-1 6-12 tygodniowe samice myszy&nbsp;</td><td>Jackson Labs</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp10025&ndash; 33&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA 257&ndash; 264&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL Imikwimod</td></tr><tr><td>krem 5%&nbsp;</td><td>Fougera</td><td>51672-4145-6</td><td>Aldara Krem</td></tr><tr><td>mAb specyficzny dla CD40&nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>klon białka FGK4.5</td></tr><tr><td>rhIL-2&nbsp;</td><td>Hoffman LaRoche Inc</td><td>136</td><td>Rekombinowane ludzkie białko IL-2</td></tr><tr><td>70% alkohol izopropylowy Przygotowanie&nbsp;</td><td>Kendall</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td> płodowy bufor do lizy <td>RBC w surowicy bydlęcej</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>penicylina/streptomycyna</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td>5-(i 6)-karboksyfluoresceina dioctan sukcynimidylu ester</td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml MCT z podziałką naturalną&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>probówka do mikrowirówek</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Fisher</td><td>BP8201500</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 27 BD</td><td></td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów t przy użyciu modelu szczepienia

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Obecne metodologie zabijania specyficznego dla antygenu są ograniczone do stosowania in vitro lub wykorzystywane w modelach chorób zakaźnych. Nie ma jednak protokołu przeznaczonego specjalnie do pomiaru zabijania swoistego dla antygenu bez infekcji. Protokół ten został opracowany i opisuje metody przezwyciężenia tych ograniczeń, umożliwiając wykrywanie specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej przez limfocyty T CD8 + in vivo. Osiąga się to poprzez połączenie modelu szczepienia z tradycyjnym testem uśmiercania docelowego znakowanym CFSE. Ta kombinacja pozwala badaczowi bezpośrednio i szybko ocenić potencjał CTL specyficzny dla antygenu, ponieważ test nie jest zależny od wzrostu guza lub infekcji. Ponadto odczyt opiera się na cytometrii przepływowej, a więc powinien być łatwo dostępny dla większości badaczy. Głównym ograniczeniem badania jest określenie osi czasu in vivo, która jest odpowiednia dla testowanej hipotezy. Różnice w sile antygenu i mutacjach w limfocytach T, które mogą powodować różnicową funkcję cytolityczną muszą być dokładnie ocenione w celu określenia optymalnego czasu na pobranie i ocenę komórek. Odpowiednie stężenie peptydu do szczepienia zostało zoptymalizowane dla hgp10025-33 i OVA257-264, ale dalsza walidacja byłaby potrzebna dla innych peptydów, które mogą być bardziej odpowiednie dla danego badania. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na szybką ocenę funkcji zabijania in vivo i może być dostosowany do dowolnego antygenu.

Przed wstrzyknięciem komórek docelowych znakowanych CFSE, mieszaninę komórek w stosunku 1:1 analizuje się za pomocą cytometru przepływowego w celu określenia częstotliwości bazowej zarówno dla komórek docelowych CFSEhi , jak i CFSElo. Rysunek 1A przedstawia strategię bramkowania służącą do wykrywania zmian w populacjach CFSE; wstępna brama jest tworzona z wykorzystaniem parametrów FSC i SSC. Następnie całkowita populacja...

Celem tego protokołu jest umożliwienie wykrywania in vivo specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej w modelu mysim.

In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest umożliwienie detekcji swoistej dla antygenu odpowiedzi cytotoksycznej przeciwko komórce docelowej in vivo w modelu mysim. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania z zakresu immunologii, takie jak wystarczalność i detekcja swoistej dla antygenu cytolizy komórek docelowych w zaatakowanym układzie odpornościowym oraz sposób, w jaki można ją modyfikować poprzez manipulację limfocytami T w celu wzmocnienia ich funkcji in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona badaczowi na bezpośrednią i szybką ocenę potencjału cytolitycznego swoistego dla antygenu, ponieważ test nie zależy od wzrostu guza ani infekcji.Procedury te zaprezentują Cara Haymaker oraz Yared Hailemichael z Zakładu Onkologii Medycznej Czerniaka. Po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, należy spryskać podstawę ogona przeznaczoną do iniekcji 70% izopropanolu. Używając igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do strzykawki, z otworem igły skierowanym do góry, należy wprowadzić igłę na głębokość od czterech do pięciu milimetrów w obszarze podstawy ogona i wstrzyknąć 100 µl wcześniej przygotowanego roztworu peptydów.Następnie, bocznie w stosunku do miejsca iniekcji szczepionki, wstrzyknij 100 µL przeciwciała anty-CD4D. Ostrożnie nanieś 50 mg na mysz kremu z imikimodem na miejsca szczepienia. Wcieraj krem w skórę, aż przestanie być widoczny i zostanie całkowicie wchłonięty.Następnie wstrzyknij domięśniowo, w dolnej części brzucha, 100 µL rekombinowanego ludzkiego białka rhIL-2 w stężeniu 100 000 IU/mL. Po wyizolowaniu splenocytów z myszy i lizie erytrocytów, zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadź pulsowanie peptydami, najpierw resuspendując komórki w pożywce kompletnej do stężenia 10⁶ komórek/mL. Podziel komórki do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 mL i oznacz je jako pulsowane lub niepulsowane.W celu stymulacji OVA 257–264, należy dodać 1 µg/mL peptydu do probówki oznaczonej jako „pulsed”. Następnie inkubować komórki stymulowane i nestymulowane w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Do obu probówek (stymulowanych i nestymulowanych) dodać 10 mL kompletnej pożywki, aby wypłukać komórki docelowe.Następnie wirować pozostałe komórki przy 475 x g w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie odessać nadsącz. Przygotować pożywkę do wysokiego znakowania CSFE, dodając 1 µL na 1 mL CSFE do RPMI 1640 z 2% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 5 µM na 1 mL. Następnie przygotować pożywkę do niskiego znakowania CSFE, dodając 1 µL na 1 mL CSFE do RPMI 1640 z 2% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 µM na 1 mL.Aby oznakować docelowe splenolocyty, resuspender 10⁶ komórek na mililitr komórek poddanych impulsowi w przygotowanym medium CSFE do wysokiego oznakowania, a 10⁶ komórek na mililitr komórek niepoddanych impulsowi w medium CSFE do niskiego oznakowania. Pomieszać zawiesiny komórkowe poprzez delikatne odwracanie lub wirowanie. Następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 15 minut, ponownie mieszając komórki co pięć minut.Następnie do każdej zawiesiny komórkowej należy dodać 10 milliliters pożywki kompletnej i odwirować komórki przy 475 x g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie należy odessać nadsącz i użyć 10 milliliters zimnego PBS do ponownego zawieszenia komórek. Komórki należy wirować przy 475 x g i 4 degrees Celsius przez pięć minut, a następnie powtórzyć przemywanie PBS.Policz komórki i zmieszaj komórki z wysokim poziomem znakowania CFSE poddane pulsacji peptydem z komórkami o niskim poziomie znakowania CFSE niepoddanymi pulsacji w stosunku 1:1 w celu wstrzyknięcia myszom biorczym. Odstaw alikvot 1×10⁶ zmieszanych komórek do wykorzystania w bazowej ocenie cytometrycznej. Po wstrzyknięciu i ponownym wyizolowaniu komórek docelowych, zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadź ocenę aktywności CTL, stosując standardowy protokół cytometrii przepływowej, nabywając komórki w kanale FITC z wykorzystaniem lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia.Przed wstrzyknięciem komórek docelowych znakowanych CSFE, mieszaninę komórek w stosunku 1:1 poddano analizie na cytometrze przepływowym, aby określić bazową częstotliwość występowania komórek docelowych CSFE high oraz CSFE low. Przedstawiono tutaj strategię bramkowania w celu wykrycia zmian w populacjach CSFE. Pierwszą bramkę wyznaczono przy użyciu parametrów FSC i SSC.Następnie przeprowadzono subgating wszystkich komórek pozytywnych pod kątem CSFE przed oceną zmian w ich częstotliwości, ponieważ populacja ta jest stosunkowo niewielka w porównaniu z nieoznakowanymi endogennymi splenocytami. Przykład względnej częstotliwości populacji CSFE przed wstrzyknięciem przedstawiono tutaj; powinna ona wynosić blisko jeden do jednego. Konieczność primingu covex widoczna jest na tym panelu, gdzie po 24 godzinach od wstrzyknięcia nie zaobserwowano eliminacji komórek docelowych CSFE high pulsowanych antygenem.Rysunek ten obrazuje skuteczne zabijanie komórek docelowych o wysokim etykietowaniu CFSE, które zostały pulsowane antygenem, ponieważ szczyt obserwowany przed wstrzyknięciem był niemal niewykrywalny, a stosunek detekcji drastycznie przesunął się z 50% do 1%. Wreszcie, figura ta pokazuje również kinetykę zabijania komórek docelowych o wysokim etykietowaniu CFSE pulsowanych antygenem poprzez ocenę utraty tej populacji w 6. i 24. godzinie po wstrzyknięciu. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu dwóch do trzech dni, w zależności od funkcji antygenu i limfocytów T.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że znakowanie CFSE musi być jednorodne, a kinetyka odpowiedzi CTL musi zostać oceniona przed przeprowadzeniem analizy. Po zastosowaniu tej procedury można również przeprowadzić inne metody, takie jak ELISA, ELISPOT oraz wewnątrzkomórkowe barwienie w cytometrii przepływowej, aby ocenić zmiany w funkcji efektorowej i odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać funkcję CTL in vivo w przypadku braku infekcji lub nowotworu.

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wiele infekcji wywołuje silną odpowiedź CTL, jednak sporadycznie liczba komórek odpowiadających nie koreluje z kontrolą patogenu1. Jedną z miar jakości CTL jest ich zdolność do specyficznego zabijania2. Oznakowanie komórek docelowych za pomocą CFSE może być wykorzystane do zbadania jakości tej odpowiedzi CTL in vivo3,4.

Swoisty dla antygenu In vivo Test zabijania z użyciem komórek docelowych znakowanych CFSE

Ten film demonstruje test oparty na MoDC na komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów, do pomiaru immunogenności dostępnych na rynku szczepionek. Testy MoDC badają odpowiedzi komórek dendrytycznych na antygeny, patogeny lub leczenie i mogą dostarczyć informacji na temat odpowiedzi immunologicznej, opracowywania szczepionek i badań nad immunoterapią.

Test in vitro oparty na pulsacyjnych komórkach dendrytycznych opartych na szczepionce w celu indukowania proliferacji limfocytów

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Ten manuskrypt opisuje, jak ocenić in vivo immunogenność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek nowotworowych (EVs) za pomocą cytometrii przepływowej. EV pochodzące z nowotworów poddawanych immunogennej śmierci komórek indukowanej leczeniem wydają się szczególnie istotne w nadzorze immunologicznym nad nowotworami. Protokół ten stanowi przykład oceny EV guza immunostymulującego indukowanego oksaliplatyną, ale można go dostosować do różnych ustawień.

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Poznaj metodę wykrywania swoistej dla antygenu cytolizy in vivo w modelu mysim. Technika umożliwia szybką ocenę potencjału cytolitycznego limfocytów T bez konieczności stosowania guzów lub zakażeń.

In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia

Przeglądaj więcej filmów