Name: Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę CORALINA do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego DNA. To oparte na trawieniu enzymatycznym podejście jest ekonomiczną alternatywą dla syntezy oligonukleotydów w badaniach CRISPR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Dr. Stephanowi Beckowi i Prof. Dr. Magdalenie Goetz za ich wkład, pomoc i wsparcie w rozwoju metody CORALINA, Maximilianowi Wiessbeckowi i Valentinowi Baumannowi za pomocne komentarze. Prace były wspierane przez DFG (STR 1385/1-1).

<ol><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+profiles+to+function+in+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li>
<li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+editing%3A+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li>
<li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Teleskop CORALINA może być wykorzystany do generowania bibliotek gRNA na dużą skalę poprzez kontrolowane trawienie docelowego DNA przez nukleazy i masowe klonowanie powstałych dwuniciowych fragmentów. Wnioskowanie statystyczne wskazuje, że znacznie więcej niż 107 pojedynczych sekwencji gRNA zostało już pomyślnie sklonowanych przy użyciu dostępnego protokołu9. CORALINA może być dostosowana na wiele sposobów. Wybór matrycowego DNA określa region docelowy i maksymalną złożoność generowanej biblioteki. Korzystając z tego protokołu, biblioteki CORALINA zostały wcześniej wygenerowane z ludzkiego i mysiego genomowego DNA9. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki przedstawiają generowanie biblioteki CORALINA z oczyszczonego DNA BAC. Dalszą personalizację można osiągnąć poprzez wybór wektora ekspresji gRNA i sekwencji łącznikowych. Wcześniej testowaliśmy trzy różne pary długości łączników do montażu Gibsona z niewielkimi różnicami w wydajności9.
Ze względu na pochodzenie z DNA trawionego masowo, protospacery gRNA CORALINA zwykle nie mają dokładnie 20 pz długości, ale wykazują rozkład długości ze średnią, która zależy zarówno od parametrów trawienia MNazy, jak i od wielkości wycięcia wykonanego z żeli PAGE. Reprezentatywny przykład pokazany na rysunkach 2B i C przedstawia fragmenty o medianie długości między 19 a 27 pz. Z naszego doświadczenia wynika, że długość fragmentów jest wiernie zachowywana przez generowany protospacergRNA 9. Podczas gdy fragmenty krótsze niż 20 pz powinny być unikane ze względu na wyższy wskaźnik powstających gRNA poza celem, dłuższe fragmenty są prawdopodobnie znacznie mniejszym problemem dla dalszych zastosowań, ponieważ wykazano, że gRNA z protospacerami o długości do 45 pz są nadal funkcjonalne9.
Dwa najbardziej krytyczne etapy w protokole CORALINA to wybór wielkości fragmentów trawionych przez MNazę i etapy klonowania. Generowanie zbyt krótkich fragmentów (np. średnia poniżej 18 pz) lub włączenie zbyt wielu pustych wektorów ekspresji gRNA sprawi, że biblioteka stanie się bezużyteczna. Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować etap trawienia MNazy (Figura 2A), monitorować wycinanie (Figura 2B, C), sprawdzić całkowite trawienie szkieletu wektora gRNA i nie uwzględniać kontroli fragmentów w całym protokole. Należy również zwrócić szczególną uwagę na zachowanie reprezentacji biblioteki gRNA. Jednym z powszechnych wąskich gardeł w generowaniu bibliotek w ogóle jest wydajny transfer plazmidów do bakterii w celu amplifikacji. W związku z tym do uzyskania dużej liczby klonów gRNA niezbędne są duże ilości bakterii o doskonałych kompetencjach i duża liczba indywidualnych zdarzeń elektroporacji.
Nowe strategie produkcji bibliotek gRNA będą konieczne, aby w ciągu najbliższych dziesięcioleci w pełni wykorzystać potencjał podejść do badań przesiewowych opartych na CRISPR. Istnieje znaczne zapotrzebowanie na opłacalne, proste i konfigurowalne metody generowania bibliotek na dużą skalę, co jest warunkiem wstępnym, aby badania przesiewowe były dostępne dla większej liczby systemów modelowych i różnych podejść inżynieryjnych opartych na CRISPR. CORALINA stanowi pierwszy krok w tym kierunku. Potencjalne zastosowania są wielorakie, zwłaszcza do tworzenia obszernych bibliotek genomów, bibliotek pochodnych cDNA mniej popularnych systemów modelowych, wysoce ukierunkowanych bibliotek i zestawów eksperymentalnych, w których różne białka CRISPR (o różnych wymaganiach PAM) są używane w połączeniu.
W przeciwieństwie do innych metod, CORALINA generuje wszystkie możliwe gRNA z wejściowego DNA. Jednak jedną z wad tej metody jest to, że gRNA pozbawione wymaganej sekwencji PAM są również zawarte w bibliotece, co jest cechą wspólną z drugą enzymatyczną metodą generowania biblioteki gRNA, CRISPR-EATING (Tabela 1). Wybór idealnej metody generowania biblioteki gRNA zależy od specyfikacji planowanego eksperymentu przesiewowego, a zwłaszcza od charakteru (geniczny, regulatorowy, międzygenowy) i wielkości regionu docelowego (pojedynczy locus, wiele regionów, cały genom). Dostrzegamy szczególne korzyści z zastosowania CORALINA, gdy ma być analizowana duża liczba regionów niekodujących lub regulatorowych, jeśli istnieją niekompletne lub niewiarygodne informacje o sekwencji (egzotyczne systemy modelowe, mieszaniny gatunków (np. mikrobiomy) lub eksperymentalnie uzyskane dane wejściowe), jeśli łączą się różne endonukleazy CRISPR lub jeśli przeprowadza się analizę nasycenia na krótkim i zdefiniowanym locus (np . reprezentowanym przez BAC).

Adaptacja bakteryjnego systemu CRISPR/Cas9 jako narzędzia do celowania molekularnego spowodowała najnowszą rewolucję w biologii molekularnej. Nigdy wcześniej manipulowanie chromatyną w określonych lokalizacjach genomu nie było tak łatwe. Typowe zastosowania CRISPR obejmują ukierunkowane mutacje genów1, inżynieria genomu2, edycja epigenomu3, aktywacja transkrypcji i wyciszanie genów4. Jedną ze szczególnych zalet systemu CRISPR jest to, że jego zastosowania nie ograniczają się do dobrze zbadanych miejsc kandydujących, ponieważ biblioteki gRNA umożliwiają mniej stronnicze badania przesiewowe. Ułatwiają one odkrywanie funkcjonalnych loci w genomie bez wcześniejszej wiedzy eksperymentalnej. Jednak budowa biblioteki gRNA opiera się obecnie głównie na syntezie oligonukleotydów, a możliwości zakupu bibliotek gRNA, które nie są pochodzenia ludzkiego lub mysiego, nie są regionami docelowymi poza otwartymi ramkami odczytu, są ograniczone. Tak więc, chociaż ekrany CRISPR już okazały się niezwykle potężne5,6,7,8, ich pełny potencjał nie został jeszcze wykorzystany.
Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznych metod generowania gRNA, ostatnio opracowano dwie strategie. Oba opierają się na kontrolowanym trawieniu enzymatycznym docelowego DNA, a nie na niestandardowej syntezie oligonukleotydów. Podczas gdy CORALINA9 wykorzystuje nukleazę mikrokokkową, jedyna obecnie dostępna alternatywna metoda, CRISPR-EATING10, wykorzystuje enzymy restrykcyjne (HpaII, ScrFI, BfaI i MmeI). Co ważne, obie techniki mogą być stosowane do dowolnego wejściowego DNA, które służy jako źródło sekwencji protospacerowych gRNA. Podczas gdy metoda CRISPR-EATING wykorzystuje strategię zmniejszania liczby sklonowanych gRNA, których miejsca docelowe nie są śledzone przez wymagany S.pyogenes PAM (protospacer sąsiedni motyw), generuje ona tylko niewielki ułamek wszystkich możliwych funkcjonalnych gRNA dla danego regionu. Z drugiej strony CORALINA jest w stanie wygenerować wszystkie potencjalne gRNA dla sekwencji źródłowej, ale zawiera również większą część niefunkcjonalnych przewodników. Generowanie bibliotek gRNA poprzez kontrolowaną aktywność nukleazy umożliwia tworzenie kompleksowych bibliotek gRNA dla dowolnego gatunku, dowolnego białka Cas9 lub systemu efektorowego w prosty i opłacalny sposób. Co więcej, CORALINA można dostosować do dostosowywania, ponieważ odpowiednie wybory wejściowe i wektorowe definiują typ, rozmiar i zawartość biblioteki. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół, który można wykorzystać do generowania kompleksowych bibliotek gRNA z różnych źródeł DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), w tym bakteryjnych sztucznych chromosomów (BAC) lub genomowego DNA9. Reprezentatywne wyniki towarzyszące temu protokołowi uzyskano poprzez zastosowanie protokołu CORALINA do DNA BAC.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Inaktywacja</td></tr><tr><td>bufora próbki TBE Mnase Novex o wysokiej gęstości</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; Żele TBE, 20%, 10-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., gotowe 20% żel PAGE</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; TBE Bufor do biegania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGE żelowy bufor do biegania</td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel, sterylny</td><td>VWR&nbsp;</td><td>233-5363&nbsp;</td><td>2.3. Można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>Barwienie kwasem nukleinowym SYBR Green I (1000x koncentrat w DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., dostępne również w Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>Octan sodu 3M, pH5,2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; R1181</td><td>3.6.4., można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8., klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego tępienia&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>octan amomu</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1., można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>octan magnezu</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1., można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>VWR&</td><td>nbsp; MOLEM37465520 (lub Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>redlica Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>skoncentrowane ligazy DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>Długi wzmacniacz Taq 2X Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., można stosować inne równoważne odczynniki</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Podstawa Tris</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>Naziemna Telewizja</td><td>Cyfrowa S.A</td>. <td> DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Sigma</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>Egzonukleaza T5</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Ligaza DNA Taq</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>Kompetentne komórki TG1</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>Kuwety elektroporacyjne o szczelinie 1 mm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.</td></tr> <tr><td>Naczynie do testów biologicznych (polistyren, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp;</td><td>9.4.NaCl</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr>9.3.Baktootrypton<td></td> <td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>w</td></tr><tr><td>całym Micropulserze</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.250</td></tr> <tr><td>ml probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

uniwersalny protokół do produkcji bibliotek grna na dużą skalę z dowolnego źródła dna

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Popularność systemu CRISPR/Cas9 zarówno do inżynierii genomu, jak i epigenomu wynika z jego prostoty i zdolności adaptacyjnych. Efektor (nukleaza Cas9 lub martwe białko fuzyjne dCas9 z nukleazą) jest ukierunkowany na określone miejsce w genomie przez mały syntetyczny RNA znany jako przewodnik RNA lub gRNA. Dwuczęściowy charakter systemu CRISPR umożliwia jego zastosowanie w badaniach przesiewowych, ponieważ biblioteki plazmidów zawierające kasety ekspresyjne tysięcy pojedynczych gRNA mogą być używane do badania wielu różnych miejsc w jednym eksperymencie. 
Do tej pory, sekwencje gRNA do budowy bibliotek były prawie wyłącznie generowane przez syntezę oligonukleotydów, co ogranicza osiągalną złożoność sekwencji w bibliotece i jest stosunkowo kosztowne. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), prostej i opłacalnej metody generowania wysoce złożonych bibliotek gRNA opartej na enzymatycznym trawieniu wejściowego DNA. Ponieważ biblioteki CORALINA mogą być generowane z dowolnego źródła DNA, istnieje wiele opcji dostosowywania, co umożliwia dużą różnorodność ekranów opartych na CRISPR.

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwoliło na wygenerowanie bibliotek gRNA CORALINA z genomowego DNA ludzi i myszy9 oraz DNA z BAC (Rysunek 1). Aby uzyskać fragmenty wejściowego DNA odpowiednie do klonowania do wektorów ekspresyjnych gRNA, należy określić optymalne warunki kontrolowanego trawienia nukleazą. Typowy wynik optymalizacji trawienia nukleazą mikrokokkową przedstawiono na Rysunku 2A. Niedostateczna ilość nukleazy (0,1, 2, 3, 4, 4,5 lub 5 jednostek) nie powoduje powstania zauważalnych produktów w wymaganym zakresie wielkości (10-100 bp), a przy 5,5-7,5 jednostkach otrzymane fragmenty są wciąż średnio zbyt długie. Większe ilości enzymu (50 jednostek) prowadzą do nadmiernej degradacji wejściowego DNA po 10 min. W związku z tym wybrano ilość pośrednią (10 jednostek). Skalę procesu trawienia zwiększono, aby uzyskać wystarczającą liczbę strawionych fragmentów do późniejszej puryfikacji i klonowania (Rysunek 2B). Chociaż zaleca się wybieranie fragmentów DNA według wielkości „na ślepo”, opierając się wyłącznie na drabinie DNA w celu orientacji, aby zminimalizować ekspozycję fragmentów DNA na światło UV, żele można barwić po procesie w celu kontroli jakości trawienia i wycinania. Rysunek 2B przedstawia reprezentatywny przykład żelu PAGE, z którego wycięto fragmenty DNA o wielkości od 20 do 30 bp. Oczyszczone z żelu fragmenty MNase naniesiono na 20% żel PAGE, aby sprawdzić poprawność selekcji wielkości i puryfikacji fragmentów strawionych przez MNase (Rysunek 2C). Niniejszy protokół jest kompatybilny z użyciem dostosowanych sekwencji linkerów, co pozwala na klonowanie fragmentów strawionych przez MNase do wybranych wektorów ekspresyjnych gRNA. W tym przypadku jako szkielet wykorzystano gRNA-PLKO9. Linkery są amplifikowane z wektora ekspresyjnego gRNA przy użyciu standardowej reakcji PCR. Rysunek 2D przedstawia reprezentatywny przykład amplifikowanych sekwencji linkerów, wolnych od dodatkowych, błędnych amplikonów lub amplikonów powstałych bez matrycy. Następnie amplikony linkerów są trawione enzymami restrykcyjnymi, aby zapewnić ligację linkerów do fragmentów strawionych przez MNase w prawidłowej orientacji. Rysunek 2D pokazuje żele agarozowe linkerów 5' i 3' przed i po trawieniu odpowiednio enzymami HindIII i SacII, co wskazuje na całkowite strawienie linkerów do przewidywanych wielkości 637 i 295 bp. Prawa część obrazu żelu dokumentuje wycinanie strawionych fragmentów linkerów. Po ekstrakcji strawionych linkerów z żelu, kolejnym krokiem protokołu jest ligacja linkerów do fragmentów strawionych przez MNase po naprawie końców. Ponieważ sekwencje linkerów są generowane metodą PCR przy użyciu niefosforylowanych starterów, samoligacja linkerów nie powinna zachodzić. Tylko fragmenty DNA strawione przez MNase z naprawionymi końcami dostarczają grup fosforanowych niezbędnych do ligacji. Po translacji nacięć (nick translation), produkt ligacji jest amplifikowany metodą PCR. Aby uniknąć nadmiernego błędu amplifikacji PCR, który mógłby zniekształcić reprezentację sekwencji gRNA w bibliotece, amplifikację ogranicza się do mniej niż 20 cykli łącznie. Po PCR produkty amplifikacji są trudne do wizualizacji na żelach agarozowych. Dlatego przeprowadza się oddzielne kontrolne reakcje PCR z 32 cyklami w celu wykrycia produktów (ale nie są one używane do przygotowania biblioteki). Wyniki tej kontrolnej reakcji PCR przedstawiono na Rysunku 2E. Pozwala to na optymalizację reakcji ligacji i upewnienie się, że reakcje są wolne od artefaktów PCR, które czasami występują w kontrolach bez fragmentów (NFC). Rysunek 2E pokazuje pożądany amplikon (linker 5' + fragment DNA + linker 3', długość: 869 bp) po amplifikacji produktów ligacji przy zastosowaniu ekimolarnych (1:1) stosunków między fragmentami a sekwencjami linkerów.
<img alt="Schemat workflow CRISPR; izolacja DNA, amplifikacja, elektroporacja; przygotowanie biblioteki gRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Sugerowany harmonogram przygotowania biblioteki gRNA. CORALINA oferuje prostą i kosztowo efektywną strategię generowania kompleksowych bibliotek gRNA z wielu różnych źródeł DNA z dowolnego organizmu. Przedstawiony protokół można zrealizować w ciągu jednego tygodnia pracy. Generowanie linkerów można przeprowadzić równolegle z naprawą końców DNA. Przygotowanie bakterii elektrokompetentnych trwa dwa dni i obejmuje etap wzrostu nocnego, dlatego należy je rozpocząć przed przygotowaniem reakcji składania. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy wykazujące fragmentację DNA; jednostki MNase, drabinki bp wizualizowane w eksperymencie z żelem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Kluczowe etapy protokołu. (A) Kontrolowane trawienie DNA z BAC umożliwia generowanie fragmentów o różnych rozmiarach. Przedstawiono tutaj optymalizację trawienia MNase. Oczyszczone DNA z BAC poddano działaniu różnych ilości MNase przez 10 min. 10 U MNase generuje fragmenty DNA o pożądanej długości (20-30 bp). (B) Selekcja rozmiaru fragmentów od 20 do 30 bp poprzez wycięcie z żeli poliakrylamidowych. Oczyszczone DNA z BAC poddano działaniu 10 U MNase przez 10 min. Obraz zarejestrowano po wycięciu fragmentów. (C) Kontrola jakości fragmentów oczyszczonych w żelu. Po oczyszczaniu w żelu 1/6 oczyszczonych fragmentów MNase naniesiono na 20% żel PAGE, aby sprawdzić poprawność selekcji rozmiaru i oczyszczania. (D) Amplifikacja sekwencji linkerów do asemblacji oraz trawienie linkerów enzymami restrykcyjnymi w celu zapewnienia klonowania kierunkowego. Linkery 5' i 3' zostały amplifikowane i przecięte odpowiednio enzymami HindIII i SacII. Włączono kontrole bez matrycy (NTC), aby kontrolować artefakty PCR i zanieczyszczenia DNA. Po lewej: aplikacja próbki analitycznej; po prawej: aplikacja próbki preparatywnej. Obraz zarejestrowano po wycięciu z żelu. (E) Poprawność ligacji linkerów do fragmentów DNA można przeanalizować za pomocą PCR ze zwiększoną liczbą cykli (32) i kontrolować, wykonując kontrole bez matrycy z H2O (NTC) lub używając NTC z poprzedniego etapu translacji nacięć jako substratu (NTC NT). Ważne jest uwzględnienie kontroli bez fragmentów (NFC), która jest amplifikacją z reakcji ligacji i translacji nacięć, z której pominięto fragmenty MNase. Tylko próbki, w których fragmenty MNase zostały połączone z DNA linkerów, dają oczekiwany amplikon (869 bp). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Ogólnym celem tej metody jest stworzenie kompleksowych bibliotek gRNA z oczyszczonego DNA z dowolnego źródła. Biblioteki gRNA to kolekcje plazmidów wykorzystywane w przesiewach opartych na systemie CRISPR. Metoda CORALINA wykorzystuje trawienie enzymatyczne oczyszczonego DNA w celu klonowania powstałych fragmentów do szkieletu biblioteki gRNA.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na otrzymanie wszystkich możliwych gRNA z sekwencji wejściowej i jest ona bardzo kosztowo efektywna. Chociaż w tym filmie zaprezentowano przygotowanie biblioteki CORALINA z bakteryjnego sztucznego chromosomu, metoda ta może w zasadzie zostać zastosowana do dowolnego typu wejściowego DNA z dowolnego organizmu. W przypadku każdej nowej partii nukleazy mikrokokkowej należy przeprowadzić optymalizację trawienia tą nukleazą.Przygotuj poniższe składniki dla każdej reakcji: 1 µL 10x buforu do nukleazy mikrokokkowej, 1x albuminy surowicy bydlęcej, 1 µg docelowego DNA, 1 µL nukleazy mikrokokkowej oraz wodę do osiągnięcia objętości 10 µL. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut.Natychmiast dezaktywuj enzym, dodając 1 µL 500 mM EGTA. Do próbek DNA dodaj bufor do próbek z barwnikiem do ładowania żelu i nanieś 1 µg DNA na każdą studzienkę 20% żelu poliakrylamidowego. Nanieś odpowiedni marker wielkości DNA w celu określenia rozmiaru.Przeprowadź elektroforezę w 1x buforze TBE przy napięciu 150 V przez około 1,5 godziny lub do momentu, gdy dolny front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu. Zbarw żel przy użyciu ultrasensytywnego barwnika do kwasów nukleinowych i wizualizuj w świetle UV. W tym przykładzie optymalne stężenie nukleazy mikrokokowej do trawienia DNA do fragmentów o rozmiarze od 20 do 30 par zasad wynosiło 10 jednostek.Użyj tej optymalnej koncentracji nukleazy mikokokowej do trawienia od 10 do 12 mikrogramów docelowego DNA w ten sam sposób, jak wykazano w reakcjach optymalizacyjnych. Po rozdzieleniu fragmentów DNA za pomocą PAGE, użyj sterylnego skalpela, aby wyciąć żel obok ścieżki markera i zbarw tylko część żelu zawierającą drabinę świeżym 1x buforem TBE do elektroforezy zawierającym ultrasensytywny barwnik do kwasów nukleinowych. Zwizualizuj drabinę DNA i za pomocą żyletki wytnij fragmenty DNA trawione nukleazą mikokokową o rozmiarze w zakresie od około 18 do 30 par zasad.Przenieś wycięty fragment żelu do probówki do mikrowirówki. Pozostałą część żelu zabarw barwnikiem do kwasów nukleinowych, zgodnie z wcześniejszym opisem. Naświetl żel światłem UV i wykonaj zdjęcie w celu udokumentowania etapu wycinania fragmentu żelu.Rozpocznij procedurę, rozgniatając wycięty fragment żelu o ściankę probówki do mikrowirówki za pomocą sterylnego końcówki do pipety. Dodaj bufor do solubilizacji PAGE w ilości odpowiadającej dwukrotności objętości żelu i inkubuj w temperaturze 37 °C na platformie rotacyjnej przez 16 godzin. Następnego dnia odwiruj próbkę w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez jedną minutę.Przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi, uważając, aby nie przenieść żadnych fragmentów rozdrobnionego żelu. Dodaj 0,5 objętości buforu do solubilizacji PAGE do osadu żelowego, wymieszaj w wstrząsarzu typu vortex i powtórz wirowanie. Połącz nadsącze i wyekstrahuj fragmenty DNA, stosując standardową metodę ekstrakcji fenolowo-chloroformowej opisaną w protokole tekstowym.Równolegle z izolacją fragmentów DNA, przeprowadź amplifikację linkerów z wektora ekspresyjnego gRNA za pomocą standardowego PCR. Aby zapewnić klonowanie kierunkowe, linkery poddaje się następnie trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przeprowadź elektroforezę produktów trawienia enzymatycznego linkerów na jednym procentowym żelu agarozowym.Wytnij odpowiednie prążki i oczyść DNA z wyciętych fragmentów żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu. Do reakcji naprawy końców stosuje się zestaw do tępienia końców DNA. Do probówki do mikrowirówki dodaj następujące składniki.10 µL oczyszczonego DNA, 1,5 µL buforu do tępienia 10x, 1,5 µL mieszaniny dNTP o stężeniu 1 mM, 1,4 µL wody oraz 0,6 µL enzymu do tępienia. Inkubować w temperaturze 22 °C przez 30 minut, a następnie podgrzać i aktywować enzym poprzez inkubację w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Dodać 85 µL wody i przeprowadzić oczyszczanie reakcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przygotuj 14 µL reakcji ligacji, używając równomolarnych ilości fragmentów trawionych nukleazą mikrokątkową i naprawionych oraz sekwencji linkerów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po translokacji nacięć produkt ligacji jest amplifikowany metodą PCR. Aby oddzielić fragmenty trawione nukleazą mikrokątkową z prawidłowo przyłączonym linkerem 5' i 3' od fragmentów z dwoma linkerami 5' lub dwoma linkerami 3', połącz wszystkie reakcje PCR po 15 cyklach, dodaj barwnik do ładowania DNA i przeprowadź elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%.Wytnij wyraźny prążek o długości 869 par zasad i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu. Ilość DNA określ za pomocą spektrofotometru. Następnie sklonuj fragmenty amplifikowane metodą PCR do wektora ekspresyjnego gRNA poprzez montaż Gibsona, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym.Aby rozpocząć tę procedurę, należy podzielić oczyszczony konstrukt wkładu wektora na alikwoty do sterylnych i schłodzonych wcześniej probówek PCR i przechowywać je w lodzie. Schłodzić w lodzie kuwety do elektroporacji z przerwą 1 mm. Dodać 25 µL świeżo przygotowanych komórek TG1 bezpośrednio do jednej alikwoty DNA, a następnie niezwłocznie przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji.Krótko stuknij lub opukaj kuwetę, aby upewnić się, że mieszanina komórek i DNA jest rozłożona wzdłuż komory kuwety, bez uwięzionego powietrza lub pęcherzyków. Umieść kuwetę w komorze urządzenia i uruchom odpowiedni program elektroporacji. Natychmiast dodaj do kuwety 475 µL buforu 2TY w temperaturze pokojowej.Przenieś elektroporowane bakterie do probówki o pojemności 50 ml. Powtórz poszczególne elektroporacje, zbierz wszystkie komórki przetransformowane jedną biblioteką do jednej probówki o pojemności 50 ml i zanotuj całkowitą objętość. Aby oszacować całkowitą liczbę kolonii dla całej biblioteki, wysiej określoną niewielką ilość bakterii przetransformowanych biblioteką na 10 cm płytkę agarową z odpowiednim antybiotykiem selekcyjnym.Aby zmniejszyć objętość pozostałych bakterii, wiruj próbkę przy przyspieszeniu około 4 000 g przez 10 minut lub do momentu, aż utworzy się widoczny osad, a nadsącz stanie się przejrzysty. Usuń nadsącz, pozostawiając jedynie kilka mililitrów, a następnie resuspenduj komórki. Wysiej bakterie na szalki do bioanaliz pokryte agarem 2TY z odpowiednim antybiotykiem selekcyjnym.Rozprowadź odpowiednią objętość reakcji elektroporacji kontrolnej pUC19 na dodatnej płytce agarowej o średnicy 10 centymetrów z odpowiednią selekcją antybiotykową. Inkubuj płytki agarowe w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia oblicz liczbę kolonii na płytkach kontrolnych, aby oszacować liczbę jednostek tworzących kolonie na mikrogram DNA dla bakterii, a także złożoność biblioteki.Na koniec zebrać bakterie z płytki w celu ekstrakcji plazmidowego DNA. Po oczyszczaniu w żelu 1/6 oczyszczonych fragmentów nukleazy mikrokokowej naniesiono na żel 20%PAGE, aby potwierdzić prawidłowy dobór rozmiaru i oczyszczanie. Amplikony łączników poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi, aby upewnić się, że łączniki zostały przyłączone do fragmentów trawionych nukleazą mikrokokową w prawidłowej orientacji.Lewa strona tego reprezentatywnego obrazu żelu przedstawia linkery 5' i 3' przed i po trawieniu odpowiednio enzymami HindIII i SacII, co wskazuje na całkowite trawienie linkerów do przewidywanych 637 par zasad i 295 par zasad. Prawa strona obrazu żelu dokumentuje wycięcie strawionych fragmentów linkerów. Pomyślną ligację linkerów z fragmentami DNA przeanalizowano za pomocą PCR z zastosowaniem zwiększonej liczby cykli PCR.Zastosowane kontrole obejmowały kontrolę bez matrycy, w której jako materiał wejściowy wykorzystano kontrolę bez matrycy z poprzedniego etapu translacji nacięć, oraz kontrolę bez fragmentacji nukleazą mikrokokkową. Tylko w próbkach, w których fragmenty nukleazy mikrokokkowej zostały połączone z DNA łącznikowym, uzyskano oczekiwany amplikon o długości 869 par zasad. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu pięciu dni.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie złożoności biblioteki oraz przeprowadzenie innych reakcji kontrolnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak generować bibliotekę gRNA do przesiewów opartych na systemie CRISPR poprzez fragmentację DNA na małe fragmenty i klonowanie ich do wektora szkieletowego biblioteki.

a-universal-protocol-for-large-scale-grna-library-production-from-any

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Genetyczny test reporterowy jest dobrze znanym i potężnym narzędziem do analizowania relacji między sekwencjami DNA a ich aktywnością regulacyjną genów. Sprzężenie potencjalnych elementów regulatorowych z genami reporterowymi, które przenoszą identyfikujące znaczniki sekwencji, umożliwia masową równoległość tych testów.

Masowo równoległe testy reporterowe w hodowanych komórkach ssaków

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Ten artykuł demonstruje szczegółowy protokół izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z materiału zielnikowego, w tym ratowania wyjątkowo niskiej jakości DNA.

Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Zanieczyszczenie podczas sekwencjonowania genomu mikroskopijnych organizmów pozostaje dużym problemem. Tutaj pokazujemy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka z pojedynczej próbki z zaledwie 50 pg genomowego DNA bez amplifikacji całego genomu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Tutaj prezentujemy klonowanie gRNA (STAgR), metodę łatwego multipleksowania wektorów gRNA dla podejść CRISPR/Cas9. STAgR sprawia, że multipleksowanie gRNA jest proste, wydajne i konfigurowalne.

Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR)

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Prezentujemy protokół do modułowego montażu opartego na CRISPR (CRISPRmass), metody wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF u Drosophila przy użyciu publicznie dostępnych zasobów cDNA/ORF. CRISPRmass może być stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidów.

Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Poznaj metodę CORALINA do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego DNA. To oparte na trawieniu enzymatycznym podejście jest ekonomiczną alternatywą dla syntezy oligonukleotydów w badaniach CRISPR.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Przeglądaj więcej filmów