Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Ogólnym celem tej metody jest skonstruowanie kompleksowych bibliotek przewodnikowych RNA z oczyszczonego DNA z dowolnego źródła. Biblioteki gRNA to kolekcje plazmidów używane w badaniach przesiewowych opartych na CRISPR. Metoda CORALINA wykorzystuje trawienie enzymatyczne oczyszczonego DNA w celu sklonowania powstałych fragmentów do szkieletu biblioteki przewodnika RNA.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wytwarza ona wszystkie możliwe przewodnikowe RNA z sekwencji wejściowej i jest bardzo opłacalna. Chociaż ten film pokazuje ochronę biblioteki CORALINA przed sztucznym chromosomem bakteryjnym, metoda ta może być w zasadzie zastosowana do każdego rodzaju wejściowego DNA z dowolnego organizmu. Optymalizacja trawienia nukleazy mikrokokowej musi być przeprowadzana dla każdej nowej partii nukleazy mikrokokowej.

Dla każdej reakcji należy skonfigurować następujące ustawienia. Jeden mikrolitr 10x bufor nukleazy mikrokokowej, 1x albumina surowicy bydlęcej, jeden mikrogram docelowego DNA, jeden mikrolitr nukleazy mikrokokowej i woda do 10 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Natychmiast dezaktywuj enzym, dodając jeden mikrolitr 500 milimolowych EGTA. Dodać bufor próbki z barwnikiem ładującym żel do próbek DNA i załadować jeden mikrogram DNA na studzienkę do 20% żelu poliakrylamidowego. Załaduj odpowiednią drabinę DNA do wymiarowania.

Uruchom żel w buforze do pracy 1x TBE przy napięciu 150 woltów przez około 1,5 godziny lub do momentu, gdy dolny przód barwnika dotrze do dolnego końca żelu. Zabarwić żel za pomocą ultraczułego barwnika kwasem nukleinowym i uwidocznić w świetle UV. W tym przykładzie optymalne stężenie nukleazy mikrokokowej do trawienia DNA do wielkości od 20 do 30 par zasad wynosiło 10 jednostek.

Użyj tego optymalnego stężenia nukleazy mikrokokowej do trawienia od 10 do 12 mikrogramów docelowego DNA w taki sam sposób, jak pokazano w przypadku reakcji optymalizacyjnych. Po oddzieleniu fragmentów DNA za pomocą PAGE, użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć żel obok pasa znacznika i zabarwić tylko część żelu zawierającą drabinę świeżym buforem do biegania 1x TBE zawierającym ultraczułe barwienie kwasem nukleinowym. Wizualizuj drabinę DNA i użyj żyletki, aby wyciąć fragmenty DNA strawione przez nukleazę mikrokokową w zakresie wielkości od około 18 do 30 par zasad.

Przenieś plasterek żelu do probówki mikrowirówkowej. Pozostałą część żelu zabarwić barwnikiem kwasu nukleinowego, jak pokazano wcześniej. Wystaw żel na działanie światła UV i uzyskaj obraz jako zapis etapu wycinania żelu.

Rozpocznij tę procedurę od użycia sterylnej końcówki pipety, aby zmiażdżyć wycięty plasterek żelu o ściankę probówki mikrowirówkowej. Dodać dwie objętości żelu buforu do solubilizacji PAGE i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza na obrotowej platformie przez 16 godzin. Następnego dnia odwirować próbkę w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez jedną minutę.

Przenieść supernatanty do nowej probówki do mikrowirówki, uważając, aby nie przenieść żadnych pokruszonych kawałków żelu. Dodać 0,5 objętości buforu do rozpuszczania PAGE do granulki żelu, odwirować i powtórzyć wirowanie. Połączyć supernatanty i wyekstrahować fragmenty DNA przy użyciu standardowej metody ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, jak opisano w protokole tekstowym.

Równolegle z izolacją fragmentów DNA amplifikować łączniki z przewodnikowego wektora ekspresji RNA za pomocą standardowego PCR. Aby zapewnić klonowanie kierunkowe, łączniki są następnie trawione odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Uruchom trawienie enzymu restrykcyjnego łączników na jednoprocentowym żelu agarozowym.

Wytnij odpowiednie prążki i oczyść DNA z wyciętych kawałków żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Zestaw do stępiania DNA służy do końcowej reakcji naprawy. Dodaj następujące składniki do probówki do mikrofuge.

10 mikrolitrów oczyszczonego DNA, 1,5 mikrolitra 10x buforu tępiącego, 1,5 mikrolitra jednej milimolowej mieszanki dNTP, 1,4 mikrolitra wody i 0,6 mikrolitra enzymu stępiającego. Inkubować w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie podgrzać i aktywować enzym przez inkubację w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Dodać 85 mikrolitrów wody i przeprowadzić oczyszczanie reakcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Ustaw reakcję ligacji o objętości 14 mikrolitrów, używając równych molowych ilości strawionych i naprawionych fragmentów nukleazy mikrokokowej oraz sekwencji łącznikowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po translacji nacięcia produkt ligacji jest amplifikowany metodą PCR. Aby oddzielić fragmenty nukleazy mikrokokowej z prawidłowo dołączonymi pięcioma i trzema pierwszymi łącznikami od fragmentów z dwoma pięcioma pierwszymi lub dwoma trzema pierwszymi łącznikami, połącz wszystkie 15-cyklowe reakcje PCR, dodaj barwnik ładujący DNA i uruchom na 0,8% żelu agarozowym.

Wytnij wystające prążki na 869 par zasad i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Określ ilościowo ilość DNA za pomocą spektrofotometru. Następnie sklonuj amplifikowane fragmenty PCR do przewodnikowego wektora ekspresji RNA przez montaż Gibsona, jak opisano w protokole tekstowym.

Aby rozpocząć tę procedurę, podwielokrotną oczyszczoną wstawkę wektorową konstruuje się w sterylnych i wstępnie schłodzonych probówkach PCR i utrzymuje na lodzie. Schłodzić kuwety do elektroporacji o szczelinie milimetrowej na lodzie. Dodać 25 mikrolitrów świeżo przygotowanych komórek TG1 bezpośrednio do jednej porcji DNA i natychmiast przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji.

Przesuń lub dotknij kuwety, aby upewnić się, że mieszanka komórek i DNA jest rozprowadzona na całej długości komory kuwety bez uwięzionego powietrza lub pęcherzyków. Umieść kuwetę w komorze szkiełka i uruchom odpowiedni program elektroporacji. Natychmiast dodaj 475 mikrolitrów temperatury pokojowej 2TY do kuwety.

Przenieś elektroporowane bakterie do 50-mililitrowej probówki. Powtórz poszczególne elektroporacje, zbierz wszystkie komórki przekształcone za pomocą jednej biblioteki w jednej 50-mililitrowej probówce i udokumentuj całkowitą objętość. Aby oszacować całkowitą liczbę kolonii dla całej biblioteki, należy umieścić określoną niewielką ilość bakterii przekształconych za pomocą biblioteki na 10-centymetrowej płytce agarowej z odpowiednim doborem antybiotyków.

Aby zmniejszyć objętość pozostałych bakterii, należy odwirować około 4 000 g przez 10 minut lub do momentu, gdy utworzy się widoczna paleta i supernatant stanie się klarowny. Usunąć wszystkie z wyjątkiem kilku mililitrów supernatantu i ponownie zawiesić komórki. Umieść bakterie na płytkach do testów biologicznych pokrytych agarem 2TY zawierających odpowiedni wybór antybiotyków.

Rozprowadzić odpowiednią objętość kontrolnej reakcji elektroporacji pUC19 na dodatkowym 10-centymetrowym naczyniu agarowym z odpowiednim doborem antybiotyków. Inkubuj płytki agarowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia policz liczbę kolonii na kontrolowanych płytkach, aby oszacować jednostkę tworzenia kolonii na mikrogram DNA dla bakterii, a także złożoność biblioteki.

Na koniec zeskrob bakterie z płytki w celu ekstrakcji plazmidowego DNA. Po oczyszczeniu żelu 1/6 oczyszczonych fragmentów nukleazy mikrokokowej załadowano na 20% żel PAGE, aby potwierdzić pomyślny wybór rozmiaru i oczyszczenie. Amplikony łącznikowe zostały wytrawione enzymami restrykcyjnymi, aby zapewnić ligację łączników na fragmentach trawionych przez nukleazę mikrokokową we właściwej orientacji.

Lewa strona tego reprezentatywnego obrazu żelu pokazuje pięć pierwszych i trzech pierwszych łączników przed i po trawieniu odpowiednio z HindIII i SacII, co wskazuje na całkowite trawienie łączników do przewidywanych 637 par zasad i 295 par zasad. Prawa strona obrazu żelu dokumentuje wycięcie strawionych fragmentów łącznika. Udaną ligację łączników z fragmentami DNA analizowano za pomocą PCR ze zwiększoną liczbą cykli PCR.

Uwzględnione kontrole to kontrola bez szablonu wykorzystująca kontrolkę bez szablonu z poprzedniego kroku translacji nicka jako dane wejściowe oraz kontrola bez fragmentu nukleazy mikrokokowej. Tylko próbki, w których fragmenty nukleazy mikrokokowej zostały połączone z DNA łącznikowym, wytworzyły oczekiwany amplikon 869 par zasad. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zachować złożoność biblioteki i wykonać inne reakcje kontrolne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak wygenerować przewodnikową bibliotekę RNA dla ekranów opartych na CRISPR, siekając DNA na małe kawałki i klonując je do szkieletu wektora biblioteki.