Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
30 października 2017
Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.
Ogólnym celem tej metody jest skuteczne ukierunkowanie różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki nabłonka barwnikowego siatkówki w jednorodnej warstwie. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na pytania z zakresu badań siatkówki i oczu, takie jak rozwój siatkówki i jak ustalić model choroby komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybsza i bardziej skuteczna niż metody spontaniczne.
Metoda ta wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do kierowania różnicowaniem komórek macierzystych tak, aby stały się niedojrzałe RPE w ciągu 14 dni i dojrzałe funkcjonalne RPE po trzech miesiącach. Części procedury zademonstruje Cassidy Arnold, zastępca dyrektora laboratorium biologii i inżynierii komórek macierzystych na Uniwersytecie Kalifornijskim w Santa Barbara. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj kolonie komórek macierzystych w warunkach wolnych od karmunite, bez surowicy do około 80% konfluencji przed pasażem.
Następnie pokryj 12-dołkową płytkę hydrożelem na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnie z zaleceniami producenta i pozostaw na godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie podnieś objętość pożywki różnicującej siatkówkę i PBS bez wapnia i magnezu potrzebną na dzień zero i podgrzej je w łaźni wodnej do 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj czynniki wzrostu do podgrzanego RDM i doprowadź EDTA do temperatury pokojowej.
W razie potrzeby usuń wszystkie zróżnicowane kolonie za pomocą końcówki pipety P10 w oparciu o morfologię komórek macierzystych, które będą pasażowane w celu różnicowania. Komórki fibroblastyczne między koloniami, a także nieprzezroczyste komórki w koloniach wskazują zróżnicowane komórki, które mają zostać usunięte. Ręczne usuwanie komórek jest jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu, ponieważ rozpoczęcie od całkowicie niezróżnicowanej populacji komórek macierzystych pozwoli na bardziej efektywne wzbogacenie.
Następnie należy przejść z pojedynczej studzienki sześciodołkowej płytki do czterech studzienek z 12-dołkowej płytki, odsysając pożywkę z komórek macierzystych i myjąc studzienki raz dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego PBS. Następnie odessać PBS i przepłukać każdą studzienkę trzy razy jednym mililitrem EDTA na studzienkę. Następnie delikatnie przechyl płytkę i zassaj EDTA.
Nie należy w żaden sposób potrząsać płytką, aby uniknąć przedwczesnego podnoszenia komórek. Po trzecim praniu ponownie dodaj jeden mililitr EDTA i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej w okapie przez trzy do pięciu minut. Nie należy naruszać płytki podczas tej inkubacji.
Następnie odessaj EDTA i dodaj jeden mililitr RDM na studzienkę, która zostanie osadzona, plus 0,5 mililitra dodatkowego podłoża. Na przykład umyj jedną studzienkę sześciodołkowej płytki 4,5 mililitra RDM, aby ułożyć ją na czterech dołkach 12-dołkowej płytki. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie odłączyć komórki.
Rozetrzeć komórki w RDM, pipetując pięć razy w górę i w dół w studzience, a następnie szybko wykonać ten krok, aby zapobiec ponownemu przyczepieniu się do płytki. Umieść w stożkowej tubie. Dysocjuj duże skupiska komórek, ale nie dziel się na zawiesinę pojedynczej komórki.
Rozprowadź komórki równomiernie w pipecie i szybko wykonaj ten krok, aby zapobiec ponownemu przyczepieniu się do płytki. W razie potrzeby użyj mikroskopu świetlnego, aby obserwować wielkość grudek komórek. Następnie wysiewaj komórki na pokrytych ECM, 12-dołkowych płytkach.
Przechyl płytkę do przodu i do tyłu, aby równomiernie rozprowadzić komórki w studzienkach i umieść ją w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 do następnej zmiany pożywki. W tej procedurze pokryj sześciodołkową płytkę ECM o obniżonym współczynniku wzrostu zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostaw na godzinę w temperaturze pokojowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie podnieś potrzebną ilość DPBS i jeden mililitr RDM na studzienkę wzbogacania i podgrzej je do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Doprowadź enzym podobny do trypsyny do temperatury pokojowej i podgrzej wymaganą ilość podłoża podtrzymującego RPE do 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj odczynnik przeciwdrobnoustrojowy i inhibitor ROCK do RSM, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5x przeciwbakteryjnego i 10-mikromolowego inhibitora ROCK.
Używaj tego podłoża przez pierwsze cztery do siedmiu dni, aby poprawić przywiązanie. Następnie odessać zużyte podłoże ze wszystkich studzienek i dodać jeden mililitr na studzienkę podgrzanego RDM bez czynników wzrostu. W razie potrzeby wypreparuj i zeskrob wszystkie komórki inne niż RPE za pomocą końcówki pipety P10 pod mikroskopem preparacyjnym.
Po rozbiorze odessać RDM i wszystkie resztki komórek i umyć je dwukrotnie jednym mililitrem podgrzanego DPBS na studzienkę. Następnie dodaj 0,5 mililitra TDE na dołek 12-dołkowej płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie usunąć komórki z płytki.
Delikatnie rozcieraj zawiesinę enzymu komórkowego, pipetując w górę i w dół trzy do czterech razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę. Następnie rozcieńczyć zawiesinę enzymu komórkowego w stosunku 1 do 10 we wstępnie podgrzanym RSM bez inhibitora ROCK. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 173 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Po pięciu minutach odessać pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w RSM z 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Następnie odcedź komórki za pomocą sitka z nylonowej siatki z porami 40 mikrometrów. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i oblicz stężenie komórek w odcedzonym roztworze.
Następnie wysiewaj komórki na płytkach o zredukowanym czynniku wzrostu, pokrytych ECM raz 10 do pięciu komórek na centymetr kwadratowy w czterech mililitrach RSM z 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Zastąp RSM 10 mikromolowym inhibitorem ROCK 48 godzin po wysiewie komórek i kontynuuj wymianę pożywki co trzy do czterech dni. Przestań dodawać inhibitor ROCK do RSM po czterech do siedmiu dniach.
Pozwól komórkom dojrzewać przez 28 do 35 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 i kontynuuj wymianę RSM co trzy do czterech dni. Pokazano tutaj indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste bezpośrednio przed pasażowaniem w celu różnicowania. Komórki macierzyste są małe i gęsto upakowane w koloniach, które nie wydają się zawierać zróżnicowanych komórek, takich jak fibroblasty między koloniami lub nieprzezroczyste przejścia w koloniach.
Oto niedojrzałe komórki RPE w drugim dniu. Komórki na tym etapie powinny nadal być zlewające się i rozszerzać projekcje w puste przestrzenie między komórkami. Komórki te są przed pobraniem w celu usunięcia wzbogacenia w 14 dniu.
Komórki inne niż RPE są wyświetlane jako łaty lub nieprzezroczyste wstążki. Okrągła łatka zawiera komórki o morfologii fibroblastycznej, podczas gdy nieprzezroczyste plamy są uważane za siatkówkę nerwową. Zdjęcia te pokazują RPE w punkcie zero, pierwszym i trzecim w dniu 30.
W każdym przejściu komórki powinny się zlewać i wydawać się, że mają cechy charakterystyczne dla morfologii pigmentowanego nabłonka siatkówki, w tym jasne brzegi fazowe i wielokątny kształt. Po opanowaniu, techniki pasażowania i wzbogacania można wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, w zależności od skali hodowli komórkowej. Zgodnie z tą procedurą, techniki takie jak kwantyfikacja genów lub białek oraz testy funkcjonalne mogą być stosowane w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące zdolności RPE do wydzielania czynników wzrostu lub zewnętrznych segmentów fagocytozy.
Artykuły opublikowane przez Dave'a Buchholza w 2013 roku i Lindsay Leach w 2015 roku szczegółowo opisują rozwój i optymalizację tej metody. Dostarczyliśmy szczegółową i dokładną demonstrację każdego etapu procedury, aby była ona łatwo dostępna dla badaczy w tej dziedzinie. Miłego eksperymentowania.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu czynników wzrostu i małych cząsteczek. Proces różnicowania pozwala na uzyskanie niedojrzałych komórek RPE w ciągu 14 dni oraz dojrzałych, funkcjonalnych komórek RPE po trzech miesiącach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad siatkówką
- Różnicowanie komórkowe
Wstęp
- Zrozumienie rozwoju siatkówki ma kluczowe znaczenie dla badań nad okiem.
- Tworzenie modeli chorób z wykorzystaniem komórek macierzystych może pomóc w badaniu chorób siatkówki.
- Metoda ta jest szybsza i bardziej wydajna niż metody różnicowania spontanicznego.
- Komórki nabłonka pigmentowego siatkówki odgrywają istotną rolę w zachowaniu zdrowia siatkówki.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu generowania RPE z pluripotencjalnych komórek macierzystych.
- Zwiększenie efektywności procesów różnicowania komórek.
- Stworzenie podstaw dla przyszłego modelowania chorób siatkówki.
Zastosowane metody
- Do kierowania różnicowaniem wykorzystuje się czynniki wzrostu oraz małe cząsteczki.
- Komórki macierzyste są hodowane w warunkach bezwarstwowych i bezsurowiczych.
- Do przyкрепania komórek stosuje się hydrożele oparte na macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Komórki są pasażowane i traktowane specyficznymi pożywkami w celu optymalizacji wzrostu.
Główne wyniki
- Niedojrzałe komórki RPE otrzymuje się w ciągu 14 dni.
- Dojrzałe, funkcjonalne komórki RPE uzyskuje się po trzech miesiącach.
- Protokół wykazuje wyższą wydajność w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Morfologia i adhezja komórek są kluczowe dla skutecznej różnicowania.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia usprawnione podejście do generowania komórek RPE.
- Posiada ona potencjał do rozwoju badań nad chorobami siatkówki.
- Protokół ten może zostać dostosowany do różnych potrzeb eksperymentalnych w biologii komórek macierzystych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia szybką, ukierunkowaną różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych w jednorodne warstwy nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE), rozwiązując kluczowy problem w modelowaniu chorób siatkówki i opracowywaniu terapii. Dzięki ograniczeniu zależności od spontanicznego różnicowania i manualnej dyssekcji, metoda ta poprawia powtarzalność i skalowalność w zastosowaniach przedklinicznych. Metoda ta wspiera wykorzystanie zarówno iPSC, jak i hESC, co ułatwia tworzenie modeli chorobowych in vitro oraz pozwala na wczesne ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych w okulistyce.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie ścieżek rozwoju siatkówki oraz testowanie hipotez terapeutycznych w zdefiniowanym systemie istotnym dla organizmu ludzkiego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójną, jednorodną monowarstwę RPE, co zmniejsza zmienność w badaniach związanych z oddziaływaniem na cel oraz w testach przesiewowych fenotypowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera wczesną ocenę wpływu związków na funkcje RPE, takie jak fagocytoza i sekrecja czynników wzrostu, zwiększając pewność w identyfikacji związków wiodących.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie skalowalnego i powtarzalnego źródła funkcjonalnych komórek RPE, odpowiednich do obrazowania wysokotreściowego oraz testów opartych na biomarkerach.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność ręcznej dyssekcji i etapów wzbogacania, co usprawnia przygotowanie do analiz i skraca czas pracy laboratoryjnej.
- Wartość translacyjna: Kriokonserwacja pośrednich banków komórek umożliwia długoterminowe przechowywanie i wykorzystanie na żądanie, co wspiera wieloośrodkowe kampanie przesiewowe oraz transfer technologii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie dojrzałego, spolaryzowanego RPE z cechami funkcjonalnymi (jasne krawędzie w fazie kontrastowej, morfologia wieloboczna) po trzech miesiącach, co umożliwia analizę fenotypową istotną dla przebiegu chorób.
- Wartość operacyjna: Określone warunki pożywek oraz protokół pasażowania wspierają procesy produkcyjne możliwe do adaptacji w standardach GMP w zastosowaniach terapii komórkowych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia przedkliniczną ocenę punktów końcowych specyficznych dla RPE, takich jak fagocytoza segmentów zewnętrznych i sekrecja VEGF, co jest kluczowe dla oceny bezpieczeństwa i skuteczności terapeutycznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając produkcję RPE pochodzących z komórek macierzystych w celu walidacji celów, opracowania testów oraz redukcji ryzyka mechanistycznego przed optymalizacją wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania oparte na hipotezach dotyczące funkcji nabłonka barzołka siatkówki oraz mechanizmów chorobowych z wykorzystaniem genetycznie zdefiniowanych linii iPSC.
- Przesiewy: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe odczyty komórkowe (np. gęstość komórek, morfologia, testy funkcjonalne) na potrzeby przesiewów związków i walidacji celów.
- Analityka: Umożliwia kwantyfikację białek i genów, testy fagocytozy oraz profilowanie sekrecji w celu porównania warunków doświadczalnych i oceny mechanizmu działania.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłą podaż komórek RPE do podłużnych badań przedklinicznych, łącząc wyniki in vitro z modelami chorobowymi in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Kriokonserwacja banków pośrednich pozwala na ponowne wykorzystanie w różnych projektach, co ogranicza redundantne wysiłki różnicowania i poprawia efektywność zasobów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez dostarczenie zdefiniowanego, pochodzącego od ludzi modelu RPE, który odtwarza kluczowe funkcje nabłonka siatkówki.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany protokół zwiększa powtarzalność w różnych ośrodkach i wśród różnych użytkowników, minimalizując zmienność wydajności różnicowania między partiami.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), umożliwiając wczesną ocenę funkcjonalną związków ukierunkowanych na RPE, co zmniejsza ryzyko niepowodzeń na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów okulistycznych z uwzględnieniem ryzyka dzięki dostarczeniu predykcyjnych, istotnych dla ludzi danych przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, technikach pasażowania oraz w sterylnych praktykach hodowli tkanek.
- Zależność od hydrożeli macierzy pozakomórkowej, zdefiniowanych składów pożywek oraz suplementacji inhibitorem ROCK w celu zapewnienia optymalnej adhezji i przeżywalności.
- Konieczność standaryzowanego przeszkolenia w zakresie manualnej dyssekcji i etapów wzbogacania, aby zapewnić spójne usuwanie populacji innych niż RPE.
- Adaptacja do alternatywnych linii komórek macierzystych może wymagać optymalizacji gęstości siewu i częstotliwości pasażowania.
- Długi czas dojrzewania (do trzech miesięcy) wymaga regularnej wymiany pożywki i stałego dostępu do inkubatora, co wpływa na planowanie przepustowości.
