Name: Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj protokół różnicowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich komórek macierzystych pluripotencjalnych przy użyciu czynników wzrostu i małych cząsteczek. Ta metoda generuje dojrzałe RPE w ciągu trzech miesięcy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Garland Initiative for Vision, California Institute for Regenerative Medicine (CIRM; granty DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 i TG2-01151), The Vermont Community Foundation, The Breaux Foundation oraz Foundation Fighting Blindness Wynn-Gund Translational Research Acceleration Program.

1. Przygotowanie odczynników na dzień 0 do dnia 14 protokołu
<ol>
	<li>Przygotuj następujące składniki pożywki:
	<ol>
		<li>Przygotuj 100 ml pożywki do różnicowania siatkówki (RDM), dodając 1 ml 100x suplementu N2, 2 ml 50x suplementu B27 i 1 ml 100x aminokwasu endogennego (NEAA) do 96 ml zmodyfikowanej mieszanki pożywki egzogennej i składników odżywczych F12 9 (DMEM/F12) firmy Dulbecco.</li>
		<li>Przygotować 10 ml 1 M nikotynamidu (NIC), rozpuszczając 1.221 g NIC w 8 ml sterylnej wody, wirując i doprowadzając objętość do 10 ml sterylną wodą. Sterylny przefiltrować roztwór.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj następujące czynniki wzrostu i małe cząsteczki:
	<ol>
		<li>Rozpuść rekombinowaną mysią nogginę, ludzki inhibitor szlaku sygnałowego Dickkopf WNT 1 (DKK-1) i IGF-1 do 100 μg / ml każdy w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze buforowanym fosforanem (PBS). W razie potrzeby podsycić i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
		<li>Rozpuść zasadę FGF do 10 μg/ml i rekombinowaną ludzką/myszą/szczurzą aktywinę A do 100 μg/ml każdy w 0,1% BSA w PBS. W razie potrzeby podatkować i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.</li>
		<li>Rozpuść SU 5402 (inhibitor kinazy tyrozynowej swoisty dla receptora FGF) i CHIR99021 (kinazę syntazy glikogenu 3, GSK-3β, inhibitor) do 10 mM każdy w dimetylosulfotlenku (DMSO). Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C odpowiednio przez okres do 1 roku lub 6 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na dzień 0 i/lub dzień 14 otrzymać: 1x roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,2 g EDTA na 1 l PBS), 1x PBS -/- (PBS bez wapnia i magnezu, pH 7,4), 1x enzym dysocjacyjny podobny do trypsyny (TDE), DPBS (PBS Dulbecco), podłoże wspomagające RPE (RSM) i dichlorowodorek Y-27632 (stosować przy 10 μM).</li>
</ol>
2. Dzień 0: Dzień pasażu pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu różnicowania
<ol>
	<li>Hoduj kolonie komórek macierzystych w warunkach wolnych od karmowiska, surowicy do około 80% konfluencji przed pasażem. 
	UWAGA: Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat optymalizacji tego kroku.</li>
	<li>Pokryj 12-dołkową płytkę hydrożelem na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECMH) zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podzielić objętość RDM i PBS -/- potrzebną na dzień 0 i ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 37 °C przed dodaniem czynników wzrostu. Doprowadź EDTA do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodaj czynniki wzrostu niezbędne dla dnia 0 do podgrzanego RDM z 10 mM NIC, 50 ng/ml noggin, 10 ng/mL DKK-1 i 10 ng/ml IGF-1. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodaj 100 μl NIC, 5 μl noggin, 1 μl DKK-1 i 1 μl IGF-1 do 10 ml RDM.</li>
	<li>Wybierz, aby usunąć wszystkie zróżnicowane kolonie na podstawie morfologii z komórek macierzystych, które będą pasażowane w celu różnicowania. Użyj końcówki pipety P10, aby ręcznie usunąć zróżnicowane komórki. 
	UWAGA: Komórki fibroblastyczne między koloniami, jak również nieprzezroczyste komórki w koloniach wskazują na zróżnicowane komórki, które mają zostać usunięte. Zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zróżnicowanych komórek.</li>
	<li>Przejść przez pojedynczą studzienkę 6-dołkową płytki do 4 dołków 12-dołkowej płytki (1:4). 
	UWAGA: Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat pasażowania komórek macierzystych na tym etapie.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę z komórek macierzystych z komórek macierzystych i raz umyć studzienki 2 ml wstępnie podgrzanego PBS -/-.</li>
		<li>Odessać PBS -/- i przepłukać każdą studzienkę trzy razy 1 ml EDTA na dołek na płytce 6-dołkowej.</li>
		<li>Delikatnie przechylić płytkę i zassać EDTA. Nie należy w żaden sposób potrząsać płytką, aby uniknąć przedwczesnego podnoszenia komórek.</li>
		<li>Po trzecim praniu dodaj 1 ml EDTA i inkubuj w temperaturze pokojowej w kapturze przez 3-5 minut. Nie należy naruszać płytki podczas tej inkubacji.</li>
		<li>Odessać EDTA i dodać 1 ml RDM na dołek, który zostanie wysiew 0,5 ml dodatkowej pożywki. Na przykład, umyj 1 dołek z płytki 6-dołkowej 4,5 ml RDM, aby ułożyć płytkę na 4 dołkach płytki 12-dołkowej.</li>
		<li>Użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie odłączyć komórki. Zbierz wszystkie komórki w stożkowej probówce i rozdziel komórki w RDM, pipetując w górę iw dół 5 razy. Dysocjuj duże skupiska komórek, ale nie dziel się na zawiesinę pojedynczej komórki. Rozprowadzić komórki równomiernie w pipecie. Wykonaj ten krok szybko, aby zapobiec ponownemu przymocowaniu do płyty.</li>
		<li>Komórki nasienne na 12-dołkowych płytkach pokrytych ECM (1 ml zawiesiny komórek na basenik).</li>
		<li>Przechyl płytkę do przodu i do tyłu, aby równomiernie rozprowadzić komórki w studzienkach. Delikatnie umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do następnej zmiany pożywki.</li>
		<li>Zanotuj dokładny czas. Zmieniaj podłoże o tej samej porze każdego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dzień 1 do 14: Dodanie czynników wzrostu
<ol>
	<li>Dzień 1: Zmień pożywkę we wszystkich studzienkach (1 ml na studzienkę) za pomocą RDM ze składem czynnika wzrostu na dzień 0 (patrz krok 2.4).</li>
	<li>Dzień 2: Zmień pożywkę za pomocą RDM (1 ml na studzienkę) z 10 mM NIC, 5 ng / ml FGF-basic, 10 ng / ml noggin, 10 ng / ml DKK-1 i 10 ng / ml IGF-1. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodać 100 μl NIC, 5 μl FGF-basic, 1 μl noggin, 1 μl DKK1 i 1 μL IGF1 do 10 ml RDM.</li>
	<li>Dzień 4: Zmień pożywkę za pomocą RDM (1 ml na dołek) ze 100 ng / ml aktywiny A, 10 ng / ml DKK-1 i 10 ng / ml IGF-1. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodać 10 μl aktywiny A, 1 μl DKK1 i 1 μl IGF-1 do 10 ml RDM. 
	UWAGA: Obserwuj, że na tym etapie komórki zlewają się.</li>
	<li>Dzień 6: Zmień pożywkę za pomocą RDM (1 ml na studzienkę) ze 100 ng / ml aktywiny A i 10 μM SU 5402. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodaj 10 μl aktywiny A i 10 μl SU 5402 do 10 ml RDM.</li>
	<li>Dni 8, 10 i 12: Zmień pożywkę za pomocą RDM (1 ml na dołek) ze 100 ng/ml aktywiny A, 10 μM SU 5402 i 3 μM CHIR99021. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodaj 10 μl aktywiny A, 10 μl SU 5402 i 3 μl CHIR99021 do 10 ml RDM.</li>
</ol>
4. Dzień wzbogacenia do przejścia 0 RPE
<ol>
	<li>Pokryj 6-dołkową płytkę czynnikiem wzrostu o obniżonym ECMH zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podzielić potrzebną objętość DPBS i 1 ml RDM na studzienkę wzbogacania i ogrzać w łaźni wodnej do 37 °C. Doprowadzić TDE do temperatury pokojowej i ogrzać niezbędną objętość RSM, odczynnika przeciwdrobnoustrojowego i Y-27632 do 37 °C.</li>
	<li>Dodaj odczynnik przeciwdrobnoustrojowy i Y-27632, uzyskując kompozycje odpowiednio 0,5x i 10 μM do RSM. Używaj tego podłoża przez pierwsze 4-7 dni, aby poprawić przywiązanie.</li>
	<li>Odessać zużytą pożywkę ze wszystkich studzienek i dodać 1 ml na studzienkę wstępnie podgrzanego RDM (nie są wymagane czynniki wzrostu).</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ręcznie wypreparuj i zeskrob wszystkie komórki inne niż RPE za pomocą końcówki do pipety P10. 
	UWAGA: Przykłady można znaleźć w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.</li>
	<li>Po rozbiorze odessać RDM i wszystkie resztki komórek. Umyć dwukrotnie 1 ml wstępnie podgrzanego DPBS na studzienkę.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml TDE do dołka na płytce 12-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie usunąć komórki z płytki. Użyj pipety P1000, aby delikatnie rozprowadzić zawiesinę komórki/TDE, pipetując w górę i w dół 3-4 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę ogniwa/TDE w stosunku 1:10 we wstępnie podgrzanym RSM, bez Y-27632. Zawiesinę komórek wirować w temperaturze 173 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w RSM za pomocą 10 μM Y-27632 (1 ml na wzbogaconą studzienkę).</li>
	<li>Odcedź komórki za pomocą sitka z nylonowej siatki z porami 40 μm. Policz liczbę komórek w określonej objętości za pomocą hemocytometru i oblicz stężenie komórek w odcedzonym roztworze.</li>
	<li>Komórki nasienne na czynniku wzrostu zredukowały płytki pokryte ECM przy 1 x 105 komórek/cm2 w 4 ml RSM z 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Wymień RSM na 10 μM Y-27632 48 h po wysiewie komórek i kontynuuj wymianę pożywki co 3-4 dni (np. w poniedziałki i czwartki). Nie wymieniaj 10 μM Y-27632 po 4-7 dniach.</li>
	<li>Pozostawić komórki do dojrzewania przez 28–35 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Kontynuuj wymianę RSM co 3-4 dni (np. w poniedziałki i czwartki).</li>
</ol>
5. Dojrzewanie: Przejście 1 i 2 RPE
UWAGA: objętości są wskazane dla 1 dołka płytki 6-dołkowej lub kolby T75, jak wskazano w nawiasach.
<ol>
	<li>Między 28 a 35 dniem pasażu 0 pokryć 6-dołkową płytkę (kolbę T75) ECMH zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Podzielić potrzebną objętość DPBS i RSM i ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 37 °C. Doprowadzić TDE do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Odessać zużyte podłoże ze studzienek i przemyć każdą studzienkę dwukrotnie 2 ml (10 ml) wstępnie podgrzanego DPBS. 
	UWAGA: Nie używaj 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Odessać DPBS i dodać 1 ml (5 ml) TDE. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut. Po inkubacji obejrzyj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki kurczą się i odłączają.</li>
	<li>Za pomocą skrobaka do komórek o odpowiedniej wielkości delikatnie usunąć komórki z dna studzienki lub kolby.</li>
	<li>Użyj końcówki P1000 (pipeta serologiczna 10 ml), aby delikatnie rozprowadzić zawiesinę komórki/TDE w górę iw dół 3-4 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:10 w RSM. Zarezerwować 2 ml (5 ml) RSM do przepłukania studzienki/kolby i dodać do rozcieńczonej zawiesiny komórek. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby czas ekspozycji na enzym przekroczył 25 minut.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 173 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml (5 ml) RSM</li>
	<li>Odcedź komórki za pomocą sitka z nylonowej siatki z porami 40 μm. Policz liczbę komórek w określonej objętości za pomocą hemocytometru i oblicz stężenie komórek w odcedzonym roztworze.</li>
	<li>Komórki nasienne na płytkach pokrytych ECMH w proporcji 1 x 10 5 komórek/cm2 w 4 ml (15 ml) RSM.</li>
	<li>Pozwól komórkom dojrzeć przez 30 dni. Kontynuuj wymianę RSM co 3-4 dni.</li>
	<li>Powtórz powyższą procedurę (kroki 5.2-5.11) w 30 dniu, aby przejść komórki z przejścia 1 do 2.</li>
</ol>
6. Tworzenie pośredniego banku komórek: Kriokonserwacja przejścia 2 dzień 3-5 RPE
UWAGA: Kriokonserwuj komórki, gdy są subkonkurujące (~50%) i nie odzyskały pigmentu.
<ol>
	<li>Na podstawie liczby komórek oblicz objętość pożywki do kriokonserwacji z 10% DMSO potrzebnej do ponownego zawieszenia komórek w stężeniu 3x106 komórek/ml.</li>
	<li>Wykonaj kroki od 5.2 do 5.8. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do kriokonserwacji z 10% DMSO do 3 x 106 komórek/ml i przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do fiolek kriogenicznych o pojemności 1,2 ml.</li>
	<li>Umieścić fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania przeznaczonym do schładzania w temperaturze -1 °C/min i umieścić w temperaturze -80 °C na noc. Przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Te komórki będą przechodzić 3 po rozmrożeniu. Hoduj komórki jeszcze przez 30 dni przed charakterystyką. Pasaż nasion 3 RPE przy 1,5 x 105 na cm2 po rozmrożeniu. 2,4,6,7</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Making+Stem+Cells+Retinal%3A+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell-Based+Therapies+in+Combination+with+Substrate+for+the+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).</li>
<li>Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4020-8502-4_1">Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).</li>
<li>Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canonical%2F%CE%B2-catenin+Wnt+pathway+activation+improves+retinal+pigmented+epithelium+derivation+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+xeno-free+derivation+of+retinal+pigmented+epithelial+cells+on+a+novel%2C+synthetic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate.</a> Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).</li>
<li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium%3A+A+Comparative+Study+Between+Cell+Lines+and+Differentiation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).</li>
<li>Choudhary, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+Toward+Retinal+Pigment+Epithelium+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-directed%2C+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li>
<li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+efficient+retinal+pigment+epithelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), New York, N.Y. 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+spontaneous+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).</li>
<li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li>
<li>Croze, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibition+Extends+Passage+of+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).</li>
</ol>

Dr Clegg jest współzałożycielem firmy Regenerative Patch Technologies LLC.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda została zoptymalizowana przy użyciu zarówno ludzkich, embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z metody hodowli bez karmy i surowicy. Od czasu początkowej izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w 1998 r. i wyprowadzenia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w 2007 r., opracowano wiele metod hodowli komórek macierzystych 14,15,16,17. Metody te powinny być wystarczające do wytworzenia kolonii komórek macierzystych, które są podatne na to różnicowanie. Nie są znane żadne ograniczenia dotyczące możliwości zastosowania tej metody do prawidłowo uzyskanych i utrzymywanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Najbardziej krytycznymi etapami są pasażowanie komórek macierzystych do dnia 0 różnicowania (krok 2.5) oraz potencjalna potrzeba ręcznego wypreparowania w 14 dniu procesu (krok 4.5). Podczas wybierania w celu usunięcia zróżnicowanych komórek z kolonii komórek macierzystych, zapoznaj się z obrazami w Kent18. Jak wskazano, komórki fibroblastyczne między koloniami i nieprzezroczyste komórki w koloniach wskazują na zróżnicowane komórki, które należy usunąć przed rozpoczęciem tego protokołu18. Tylko niezróżnicowane, ciasno upakowane kolonie o określonych krawędziach powinny być pasażowane w celu różnicowania.
Liczba komórek macierzystych wysianych w studzience (etap 2.6.7) jest skomplikowana przez fakt, że komórki macierzyste nie mogą być rozprowadzone do zawiesiny pojedynczej komórki po pasażowaniu i nie mogą być dokładnie policzone za pomocą hemocytometru. Przybliżenie 80% zlewających się komórek macierzystych jest wskazane do przejścia 1 dołka płytki 6-dołkowej do 4 dołków płytki 12-dołkowej. Różnice między liniami komórek macierzystych, takie jak tempo wzrostu, mogą wpływać na to, jak szybko niedojrzałe RPE osiągają konfluencję między 0 a 4 dniami. Komórki macierzyste będą wytwarzać RPE niezależnie od precyzyjnej konfluencji, ale wydajność komórek będzie negatywnie naruszona, jeśli komórki są zbyt rzadkie na tym etapie. Niedojrzałe komórki RPE powinny być w około 40-50% zlewające się w 1. dniu i prawie 100% zlewające się w 4. dniu. Jeśli komórki nie wytwarzają zlewającej się monowarstwy do 4 lub 6 dnia, protokół należy powtórzyć przy większej gęstości wysiewu w dniu 0. Na przykład, jeśli 1 dołek z płytki 6-dołkowej został przepuszczony do 4 dołków płytki 12-dołkowej w dniu 0, a niedojrzałe RPE nie zlewają się w 100% w dniu 4, zmniejsz wysiew do pasażu 1:3 lub 1:2 w dniu 0 lub pozwól, aby komórki macierzyste stały się bardziej zlewające się przed pasażem. Bardzo ważne jest ustalenie stałej gęstości wysiewu podczas porównywania wielu linii komórkowych.
Etap ręcznej sekcji w 14 dniu jest konieczny tylko wtedy, gdy w hodowli obecne są komórki inne niż RPE (Figura 2C). Od czasu dodania CHIR99021 do protokołu, wiele pluripotencjalnych linii komórek macierzystych wymaga niewielkiej lub żadnej ręcznej sekcji. Niektóre preparaty mają większą częstość występowania plam nerwowych i bardzo ważne jest usunięcie tych komórek. Jeśli RPE nie są zdolne do życia w przejściu od 0 do 3, możliwe jest powtórzenie protokołu różnicowania, zabierając wystarczająco dużo czasu, aby usunąć wszystkie komórki inne niż RPE. Nie zdarza się to często, ale wspomniano tutaj, aby zauważyć, że etap sekcji w 14 dniu można zoptymalizować w razie potrzeby.
Istnieje wiele protokołów różnicowania RPE, które różnią się kosztami, a także metodami hodowli, wydajnością, kwantyfikacją i oceną funkcjonalną, z których te ostatnie zostały dokładnie przeanalizowane2. Preferujemy opisaną tutaj metodę 14-dniową ze względu na jej skuteczność, zdolność adaptacji i możliwość zastosowania do szerokiego zakresu linii komórkowych 4,7,8. Etap kriokonserwacji w tym protokole zapewnia również dużą przewagę w tworzeniu pośredniego banku komórek do wykorzystania w przyszłości, unikając zmienności między partiami w eksperymentach. Zaczynając od zaledwie 4 dołków 12-dołkowej płytki, możliwe jest rozwinięcie do 6-dołkowych płytek w przejściu 0 i kolb T75 w pasażach 1 i 2. W pasażu 2 dnia 3-5, kiedy komórki są nadal subkonfluentne i nie odzyskały pigmentu, możliwe jest kriokonserwowanie dziesiątek milionów komórek, a następnie rozmrożenie dojrzałego RPE, oznaczonego pasażem 3 dzień 30, w celu sprawdzenia ekspresji RNA, ekspresji białka, wydzielania czynnika wzrostu, fagocytozy itp. Ustaliliśmy również protokoły rozszerzające RPE na maksymalnie 13 fragmentów 19.
Patrząc w przyszłość, metoda ta będzie przydatna do modelowania iPSC choroby oka oraz do generowania RPE do terapii komórkowej. Jeśli chodzi o modelowanie choroby iPSC, protokół ten jest obecnie stosowany w laboratorium do wytwarzania RPE z linii skorygowanych za pomocą CRISPR z nieskorygowanymi kontrolami od tego samego pacjenta. Co więcej, protokół ten można dostosować do syntetycznych substratów i warunków wolnych od kseno, które są przydatne do przestrzegania dobrych praktyk produkcyjnych wymaganych w terapii komórkowej.

Nabłonek barwnikowy siatkówki to monowarstwa pigmentowanych komórek, która zapewnia kluczowe wsparcie dla fotoreceptorów. Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pełnią wiele funkcji w widzeniu, w tym absorpcję światła, transport składników odżywczych i jonów, cykl retinoidów, fagocytozę zewnętrznego segmentu fotoreceptora i wydzielanie czynnika wzrostu1. Istnieje wiele dystrofii siatkówki, które wpływają na funkcję RPE i powodują utratę wzroku, w tym zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki. Wytwarzanie RPE z pluripotencjalnych komórek macierzystych może ułatwić badania mające na celu zrozumienie tych chorób oczu i może stanowić nieograniczone źródło RPE w terapiach komórkowych2. W rzeczywistości wiele badań klinicznych jest w toku z wykorzystaniem RPE pochodzącego z pluripotencjalnych komórek macierzystych3.
Ten protokół różnicowania został pierwotnie opisany przez Buchholz4 i był oparty na wcześniej opublikowanej metodzie Clegg5. Procedura naśladuje normalny proces rozwojowy in vivo, aby skierować niezróżnicowane pluripotencjalne komórki macierzyste w kierunku losu RPE poprzez manipulację insulinowymi czynnikami wzrostu (IGF), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF-2; FGF-basic), transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β) i szlaki WNT4,5. Protokół został znacznie ulepszony przez dodanie agonisty szlaku WNT pod koniec protokołu, który dał 97,77% ± 0,1% komórek dodatnich w białku premelanosomowym (PMEL) i został dostosowany do warunków wolnych od kseno-xeno-the6,7. Wykazano, że uzyskane RPE wykazują ekspresję markerów RPE na poziomie transkryptu i białka, wydzielają znane czynniki wzrostu RPE o odpowiedniej polarności i przeprowadzają fagocytozę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów8. Protokół ten jest szybszy i bardziej niezawodny niż "spontaniczne" protokoły różnicowania, które polegają na prostym usunięciu podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów8. Co więcej, dane z sekwencjonowania RNA pokazują, że RPE uzyskane przy użyciu tego protokołu są bardzo podobne do tych uzyskanych przy użyciu bardziej powszechnego podejścia spontanicznego8. Metoda 14-dniowa generuje RPE, które pasują do "5 P" wymienionych przez Mazzoni9 (pigmentowany, spolaryzowany, fagocytarny, postmitotyczny, wielokątny)9. Chociaż procedura ta okazała się powtarzalna w wielu laboratoriach, pragniemy zwrócić uwagę na kilka dodatkowych metod ukierunkowanego różnicowania, które zostały opublikowane w ostatnich latach10,11,12,13.

<table><tbody><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego SterilGARD III z przepływem laminarnym</td><td>Model Baker</td>: <td>SG603A-HE, typ: A2, klasa: 2</td><td>6' Szafa bezpieczeństwa biologicznego Baker z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Kaptur preparacyjny</td><td>Labconco</td><td>Model 3970405</td> laboratoryjny mikroskop sekcyjny z <td>przepływem laminarnym</td></tr> Inkubator CO2 z <tr><td></td><td></td><td>podgrzewanym stopniem</td>z <td></td></tr><tr><td>płaszczem powietrznym</td><td>Nikon</td><td>MCO-17AIC</td><td>37 oC i 5% CO2</td></tr> mikroskop <tr><td>z kontrastem odwróconych faz</td><td>Olympus</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Media Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Czynniki wzrostu i odczynniki </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana noggin myszy</td><td>R& Systemy D</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki DKK-1</td><td>R& Systemy D</td><td>5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany IGF-1</td><td>R& Systemy D</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek/mysz/szczur Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 Inhibitor FGF</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-204308</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Substrates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>zewnątrzkomórkowy hydrożel hydrogel (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-qualified Matrix, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>czynnik wzrostu zredukowany ECMH</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Inne odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (bez wapnia, bez magnezu)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (dysocjacja trypsyna enzym, TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (podłoże wspomagające RPE)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102</td><td>pożywka do kriokonserwacji</td></tr><tr><td>1,2 ml Fiolka kriogeniczna</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (pojemnik do zamrażania)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>pojemnik do zamrażania</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwbakteryjny</td> <td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Inne urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>hodowlana Corning</td><td>CLS3516</td><td>Używana podczas różnicowania.</td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Używana podczas dojrzewania RPE.</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>hodowlana Corning</td><td>CLS3513</td><td>Używana podczas dojrzewania RPE.</td></tr><tr><td>skrobak komórkowy</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>Używany podczas przejść.</td></tr><tr><td>sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Używany podczas przejść przed zliczeniem komórek.</td></tr></tbody></table>

szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Opisujemy solidną metodę kierowania różnicowaniem pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Celem dostarczenia szczegółowego i dokładnego protokołu jest jasne zademonstrowanie każdego kroku i udostępnienie go badaczom w tej dziedzinie. Protokół ten skutkuje jednorodną warstwą RPE przy minimalnym lub zerowym ręcznym rozbiorze. Przedstawiona tutaj metoda okazała się skuteczna w przypadku indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Dodatkowo opisujemy metody kriokonserwacji pośrednich banków komórek, które pozwalają na długotrwałe przechowywanie. RPE wygenerowane przy użyciu tego protokołu mogą być przydatne do modelowania choroby iPSC w naczyniu lub do zastosowań klinicznych.

Metoda ta pozwala na uzyskanie homogennej, pigmentowanej i sześcianowatej warstwy jednowarstwowej RPE. Harmonogram w Rycina 1 odpowiada obrazom przedstawionym w Rycina 2Jak pokazano w Rycina 2Akolonie komórek macierzystych są gęsto upakowane, o wyraźnych krawędziach, bez komórek fibroblastycznych pomiędzy koloniami oraz bez komórek nieprzezroczystych wewnątrz kolonii. Rysunek 2B przedstawia obraz niedojrzałych komórek RPE, które nie tworzą pełnego kontaktu (są subkonfluentne). Jeśli na tym etapie komórki są już konfluentne, nie mogą one wysuwać wypustek, które mają kluczowe znaczenie dla procesu różnicowania. Komórki o zbyt niskim stopniu konfluencji nie będą w stanie utworzyć monowarstwy ani sformować połączeń ścisłych, charakterystycznych dla nabłonka. Szczegółowe informacje na temat optymalizacji stopnia konfluencji przedstawiono w sekcji dyskusji. Rycina 2C przedstawia morfologię dwóch najczęstszych typów obszarów niebędących nabłonkiem barwnikowym siatkówki (non-RPE), które mogą pojawić się podczas tego procesu różnicowania: plamek neuronalnych lub fibroblastycznych. Należy zauważyć, że plamki neuronalne są szczególnie nieprzezroczyste w obserwacji pod mikroskopem stereoskopowym, podczas gdy wyraźnie zarysowane plamki o charakterze fibroblastycznym są pod tym mikroskopem niemal przezroczyste. Pomocne może być zaznaczenie tych obszarów na płytce hodowlanej markerem laboratoryjnym odpornym na etanol, aby łatwiej było je zidentyfikować zarówno pod mikroskopem świetlnym, jak i stereoskopowym. Ryciny 2D-F wykazują charakterystyczne jasne krawędzie, morfologię brukową oraz pigmentację, które świadczą o zdrowej, dojrzewającej hodowli RPE. Rycina 3 obraz o większym powiększeniu, który pokazuje odmienny wygląd w pełni dojrzałego RPE w mikroskopii kontrastowej oraz w jasnym polu. W dniu 30. pasażu 3 komórki są gotowe do charakterystyki opisanej w poprzednich publikacjach, obejmującej ekspresję RNA, ekspresję białek, sekrecję czynników wzrostu oraz fagocytozę2,4,6,7Charakterystyka ta wykazuje, że komórki przedstawione na tych obrazach są nie tylko pigmentowane i sześcienne, ale również fagocytowalne, pomitotyczne i spolaryzowane.
<img alt="Schemat osi czasu procesu hodowli komórkowej z etapami różnicowania i czynników wzrostu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1:. Oś czasu dodawania czynników wzrostu i dojrzewania RPE. Czynniki wzrostu są dodawane do płytek 12-dołkowych od 0 do 14 dnia. Dojrzewające RPE są hodowane na płytkach 6-dołkowych lub w kolbach T75 od dnia wzbogacenia do 30 dni po rozmrożeniu (pasaż 3 dzień 30). Strzałki wskazują enzymatyczne pasażowanie komórek. Oznaczenia (A-E) poniżej osi czasu odpowiadają obrazom na Rycini 2. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa, obrazy hodowli komórkowej przedstawiające wzorce wzrostu komórek w czasie, wyniki eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywna morfologia i konfluencja dojrzewającego RPE. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste bezpośrednio przed pasażowaniem w celu różnicowania (A). Niedojrzałe komórki RPE subkonfluentne w dniu 2 (B) oraz przed wzbogaceniem metodą pick-to-remove w dniu 14; obszary niebędące RPE (wskazane białymi strzałkami) widoczne jako plamy lub nieprzezroczyste „wstążki” (C). RPE w pasażu 0, 1 i 3 w dniu 30 (D, E, oraz F). Pasek skali = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie hodowli komórkowych, panel A pokazuje gęsty wzrost, panel B pokazuje zmniejszoną gęstość komórek, obraz mikroskopowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Dojrzałe RPE w 3. pasażu: dzień 30. Morfologia kostkowa przedstawiona w kontraście fazowym (A) oraz pigmentacja przedstawiona w jasnym polu (B). Pasek skali = 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Ogólnym celem tej metody jest efektywne kierowanie różnicowaniem pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki nabłonka barwnikowego siatkówki w jednorodną warstwę. Metoda ta pomaga w uzyskaniu odpowiedzi na pytania w dziedzinie badań nad siatkówką i okiem, takie jak sposób rozwoju siatkówki oraz kwestia tworzenia modelu choroby w oparciu o komórki macierzyste. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona szybsza i bardziej wydajna niż metody spontaniczne.Metoda ta wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek w celu ukierunkowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzały RPE w ciągu 14 dni oraz w dojrzały, funkcjonalny RPE po trzech miesiącach. Części procedury zaprezentuje Cassidy Arnold, zastępca dyrektora laboratorium biologii i inżynierii komórek macierzystych na UC Santa Barbara. Aby rozpocząć tę procedurę, należy hodować kolonie komórek macierzystych w warunkach bez komórek karmicieli i bez surowicy do osiągnięcia około 80% konfluencji przed pasażowaniem.Następnie pokryj płytkę 12-dołkową hydrożelem na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnie z zaleceniami producenta i pozostaw do stężenia na jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C. Po tym czasie odmierz objętość pożywki do różnicowania siatkówki (RDM) oraz PBS bez wapnia i magnezu niezbędne na dzień zerowy i ogrzej je w kąpieli wodnej do 37 °C. Następnie dodaj czynniki wzrostu do ogrzanej pożywki RDM i doprowadź EDTA do temperatury pokojowej.W razie potrzeby, usuń wszystkie zróżnicowane kolonie za pomocą końcówki pipety P10 na podstawie morfologii z komórek macierzystych, które zostaną poddane pasażowaniu w celu różnicowania. Komórki fibroblastyczne pomiędzy koloniami, jak również nieprzezroczyste komórki wewnątrz kolonii, wskazują na zróżnicowane komórki, które należy usunąć. Ręczne usuwanie komórek jest jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu, ponieważ rozpoczęcie procesu z całkowicie niezróżnicowaną populacją komórek macierzystych pozwoli na bardziej efektywne wzbogacenie.Następnie przenieś zawartość jednej studni płytki 6-dołkowej do czterech studni płytki 12-dołkowej, odsysając pożywkę z komórek macierzystych i jednokrotnie płucząc studnie 2 mL podgrzanego PBS. Następnie odessij PBS i przepłucz każdą studnię trzykrotnie, używając 1 mL EDTA na studnię. Potem delikatnie przechyl płytkę i odessij EDTA.Nie potrząsać płytką w żaden sposób, aby uniknąć przedwczesnego oderwania komórek. Po trzecim przemyciu ponownie dodać 1 mL EDTA i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej w dygestorium przez 3 do 5 minut. Nie zakłócać inkubacji płytki w tym czasie.Następnie odessaj EDTA i dodaj jeden mililitr RDM na każdą studzienkę, która zostanie obsadzona, oraz dodatkowe 0,5 mililitra pożywki. Na przykład, przemyj jedną studzienkę płytki 6-dołkowej 4,5 mililitrami RDM, aby obsadzić cztery studzienki płytki 12-dołkowej. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie odkleić komórki.Rozetrzyj komórki w RDM, pipetując je pięciokrotnie w górę i w dół w dołku; wykonaj ten krok szybko, aby zapobiec ponownemu przywieraniu do płytki. Przenieś zawiesinę do probówki stożkowej. Rozbij duże skupiska komórek, ale nie rozcieraj ich do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.Równomiernie rozprowadzić komórki w pipecie i szybko zakończyć ten krok, aby zapobiec ponownemu przytwierdzeniu do płytki. W razie potrzeby można użyć mikroskopu świetlnego, aby ocenić wielkość aglomeratów komórkowych. Następnie wysiać komórki na płytki 12-dołkowe powleczone ECM.Przechylaj płytkę w przód i w tył, aby równomiernie rozłożyć komórki w dołkach, a następnie umieść ją w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C i 5% CO2 do czasu następnej wymiany pożywki. W tej procedurze pokryj płytkę sześciodołkową ECM o obniżonej zawartości czynników wzrostu zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostaw do utrwalenia na jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.Następnie odmień odpowiednią ilość DPBS oraz jeden mililitr RDM na każdą studzienkę do namnażania i podgrzej je do 37 °C w łaźni wodnej. Pozostaw enzym typu trypsyna do osiągnięcia temperatury pokojowej i podgrzej wymaganą ilość pożywki wspomagającej RPE do 37 °C. Następnie do RSM dodaj odczynnik przeciwdrobnoustrojowy oraz inhibitor ROCK, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5x odczynnika przeciwdrobnoustrojowego i 10 µM inhibitora ROCK.Stosuj to medium przez pierwsze cztery do siedmiu dni, aby poprawić adhezję. Następnie odessaj zużyte medium ze wszystkich dołków i dodaj jeden mililitr na dołek uprzednio ogrzanego RDM bez czynników wzrostu. W razie potrzeby usuń wszystkie komórki inne niż RPE poprzez wycięcie i zeskrobanie ich za pomocą końcówki do pipety P10 pod mikroskopem stereoskopowym.Po sekcji odessać RDM oraz wszystkie resztki komórkowe i przemyć je dwukrotnie 1 ml podgrzanego DPBS na każdą studzienkę. Następnie dodać 0,5 ml TDE do każdej studzienki płytki 12-dołkowej i inkubować w temperaturze 37°C przez pięć minut. Po tym czasie, używając skrobaka do komórek, delikatnie zdjąć komórki z płytki.Delikatnie homogenizuj zawiesinę enzymatyczną komórek, pipetując ją w górę i w dół od trzech do czterech razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę. Następnie rozcieńcz zawiesinę enzymatyczną komórek w stosunku 1:10 w uprzednio ogrzanym RSM bez inhibitora ROCK. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 173g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po pięciu minutach odessać pożywkę z osadu komórkowego i resuspendować komórki w RSM z dodatkiem 10 µM inhibitora ROCK. Następnie przefiltrować komórki, używając nylonowego sitka komórkowego o rozmiarze oczek 40 µm. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i obliczyć ich stężenie w przefiltrowanym roztworze.Następnie wysiej komórki na płytki pokryte ECM z obniżoną zawartością czynników wzrostu w zagęszczeniu 1*10⁵ komórek na cm² w 4 ml RSM z dodatkiem 10 µM inhibitora ROCK. Wymień RSM z 10 µM inhibitorem ROCK 48 godzin po wysianiu komórek, a następnie kontynuuj wymianę pożywki co trzy do czterech dni. Zaprzestań dodawania inhibitora ROCK do RSM po upływie od czterech do siedmiu dni.Pozostawić komórki do dojrzewania przez 28 do 35 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2, kontynuując wymianę RSM co trzy do czterech dni. Przedstawione tutaj indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste znajdują się w stanie bezpośrednio przed pasażowaniem w celu różnicowania. Komórki macierzyste są małe i gęsto upakowane w obrębie kolonii, które nie wykazują obecności komórek zróżnicowanych, takich jak fibroblasty pomiędzy koloniami lub nieprzezroczyste obszary wewnątrz kolonii.Oto niedojrzałe komórki RPE w drugim dniu. Komórki na tym etapie powinny być nadal subkonfluentne i wysyłać wypustki w wolne przestrzenie między komórkami. Komórki te są w stanie przed selekcją w celu usunięcia zanieczyszczeń w dniu 14.Komórki niebędące RPE występują w postaci plam lub nieprzezroczystych wstęg. Okrągła plama zawiera komórki o morfologii fibroblastycznej, natomiast nieprzezroczyste plamy są uznawane za siatkówkę neuronalną. Zdjęcia te przedstawiają RPE w pasażu zero, pierwszym i trzecim w 30. dniu.Przy każdym pasażu komórki powinny być konfluentne i wykazywać cechy charakterystyczne dla morfologii nabłonka barwnikowego siatkówki, w tym jasne krawędzie w kontraście fazowym oraz wieloboczny kształt. Po opanowaniu techniki, pasażowanie i wzbogacanie mogą zostać wykonane w ciągu jednej do dwóch godzin, w zależności od skali hodowli komórkowej. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać techniki takie jak ilościowe oznaczanie genów lub białek oraz testy funkcjonalne, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące zdolności RPE do wydzielania czynników wzrostu lub fagocytozy segmentów zewnętrznych.Prace opublikowane przez Dave'a Buchholza w 2013 roku oraz Lindsay Leach w 2015 roku szczegółowo opisują opracowanie i optymalizację tej metody. Przygotowaliśmy szczegółową i wyczerpującą prezentację każdego etapu procedury, aby była ona łatwo dostępna dla badaczy w tej dziedzinie. Życzymy owocnych eksperymentów.

rapid-directed-differentiation-retinal-pigment-epithelial-cells-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Porównano profile mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS-RPE) oraz płodowego RPE.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Celem tego raportu jest opisanie protokołów pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przy użyciu różnych rozmiarów ciał embrionalnych.

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Tutaj prezentujemy protokół różnicowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych posiadających mutacje pochodzące od pacjenta. Zmutowane linie komórkowe mogą być wykorzystywane do analiz funkcjonalnych, w tym immunoblottingu, immunofluorescencji i patch clamp. To podejście typu "choroba w naczyniu" pozwala uniknąć trudności związanych z uzyskaniem natywnych ludzkich komórek RPE.

Różnicowanie, utrzymanie i analiza ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki: model choroby w naczyniu dla mutacji BEST1

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Obecny protokół opisuje zoptymalizowany system 3D do indukcji siatkówki neuronalnej, który zmniejsza adhezję i fuzję organoidów siatkówki z wysoką powtarzalnością i wydajnością.

Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj protokół różnicowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich komórek macierzystych pluripotencjalnych przy użyciu czynników wzrostu i małych cząsteczek. Ta metoda generuje dojrzałe RPE w ciągu trzech miesięcy.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów