Name: Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 8 s
Description: Poznaj protokół mikroiniekcji CRISPR/Cas9 do zarodków suma kanałowego Ictalurus punctatus w celu edycji genów. Metoda została zweryfikowana poprzez wygaszenie genów immunologicznych TICAM1 i RBL.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez USDA-NIFA award 2015-67015-23488 dla Rogera Cone. Autorzy dziękują dr Ronaldowi Phelpsowi za opis kryteriów selekcji stad lęgowych w filmie. Ahmed Elaswad i Karim Khalil chcieliby podziękować Egipskiemu Biuru Kultury i Edukacji w Waszyngtonie za sfinansowanie ich badań doktoranckich.

Ten eksperyment został przeprowadzony w Jednostce Badawczej Genetyki Ryb, Centrum Badawczym Rybołówstwa E. W. Shell, Auburn University, AL. Wszystkie protokoły eksperymentalne użyte w tym eksperymencie zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Auburn (AU-IACUC) przed rozpoczęciem eksperymentu. Listę sprzętu i materiałów użytych w tym eksperymencie można znaleźć w Tabeli Materiałów. Poniżej przedstawiono kroki i procedury przygotowania i mikroiniekcji jednokomórkowych zarodków suma kanałowego, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
1. Selekcja stada czerwiowego i tarło
<ol>
	<li>Wybierz zdrowe stado lęgowe sumów kanałowych ze szczepu lub linii genetycznej, która Cię interesuje. Samce i samice suma kanałowego powinny wykazywać dobre drugorzędowe cechy płciowe.</li>
	<li>Wybierz samce, które mają szeroką, muskularną głowę, która jest szersza niż reszta ich ciała, z dobrze rozwiniętą brodawką narządów płciowych. Ciemny kolor, blizny i rany po walkach terytorialnych są również oznakami gotowości seksualnej. Wybierz samice, które mają głowy węższe niż reszta ciała i miękki, wyczuwalny, dobrze zaokrąglony brzuch. Dla dokładności i uniknięcia stresowania ryb podczas początkowego obchodzenia się, przestań karmić samice na 2-3 dni przed sprawdzeniem ich gotowości do tarła.</li>
	<li>Z rybami obchodzić się szybko, ale ostrożnie. Aby zmniejszyć stres związany z obsługą, wszystkie procedury wymagające obchodzenia się z samicami należy wykonywać podczas trzymania ryb w workach tarłowych (oczko o rozmiarze 32 mm).</li>
	<li>Tuż przed wstrzyknięciem hormonu w celu wywołania owulacji zmierz masę ciała samic.</li>
	<li>Zawieś worki tarłowe z samicami w środku w zbiorniku przepływowym z ciągłym przepływem wody i odpowiednim napowietrzeniem.</li>
	<li>W aseptyce należy załadować implantatora wyposażonego w igłę 14 G implantem 85 μg/kg analogu hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRHa). Przed wstrzyknięciem przepłukać miejsce wstrzyknięcia (mięśnie grzbietowe) 0,9% jałowym roztworem soli fizjologicznej. Włóż implanter pod kątem 45° i zwolnij implant. Wyjąć igłę i przetrzeć miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym uprzednio 70% etanolem.</li>
	<li>Umieść worek tarłowy w zbiorniku retencyjnym tak, aby ryba była całkowicie zanurzona w wodzie 15-20 cm poniżej powierzchni wody. Odpowiednie napowietrzenie (powyżej 5 ppm rozpuszczonego tlenu) i dobra jakość wody są ważne dla owulacji wysokiej jakości jaj</li>.
	<li>Przewiduj czas owulacji na podstawie temperatury wody, korzystając z relacji stodogodzina (h)35. Czas reakcji w stopniach h = czas między wstrzyknięciem hormonu a owulacją (h) * temperatura wody (°C). Na przykład, przy czasie reakcji stopnia h wynoszącym 900-1000, oczekuje się, że samica pojawi się w ciągu 36-40 godzin od wstrzyknięcia hormonu w temperaturze 25 °C. Zwykle pierwsze sprawdzenie jaj odbywa się po około 36 godzinach od wstrzyknięcia hormonu, a następnie w odstępie 4 godzin.</li>
	<li>Aby sprawdzić owulację, delikatnie unieś torbę tarłową nad powierzchnię wody, szukając jaj, które są przyczepione w torbie tarłowej. Zobaczenie co najmniej 10 jaj wskazuje, że ta samica ma owulację i jest gotowa do ręcznego rozbierania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie nasienia
UWAGA: Nasienie można przygotować na kilka godzin przed spodziewanym czasem owulacji.
<ol>
	<li>Poddaj mężczyzn eutanazji poprzez uderzenie w głowę bez znieczulenia, ponieważ znieczulenie może mieć negatywny wpływ na ruchliwość plemników.</li>
	<li>Zbierz jądra na małą szalkę, usuń wszelkie tkanki i umyj je 50 ml 0,9% soli fizjologicznej, aby usunąć krew, jeśli to konieczne. Dobrze rozwinięte jądra są białe z wieloma wypustkami kosmkowymi ( <silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Określ wagę jąder.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór plemnika do zapłodnienia komórki jajowej, przenieś jądra do środka siatki o długości 100 cm2 100 μm za pomocą kleszczy. Złóż siatkę z jądrami w środku, zmiażdż jądra i przefiltruj plemniki do probówki o pojemności 50 ml. Można to zrobić, wywierając nacisk na jądra wewnątrz siatki na krawędź rurki zbiorczej za pomocą kciuka. Użyj 0,9% roztworu soli fizjologicznej, aby przepłukać plemniki z siatki do probówki zbiorczej. Roztwór soli fizjologicznej można dodać do 10 ml/g jąder.</li>
	<li>Określ stężenie plemników, sprawdź ruchliwość i żywotność. 
	UWAGA: Stężenie można określić, licząc plemniki w znanej rozcieńczonej objętości mleka za pomocą hemocytometru. Alternatywnie, gęstość plemników można oszacować, oceniając gęstość optyczną mleka za pomocą spektrofotometru. W tej metodzie absorpcja przy długości fali 505 nm jest porównywana z wykresem kontrolnym, który został wcześniej przygotowany do absorpcji różnych stężeń plemników36. Ruchliwość plemników można sprawdzić pod mikroskopem jako czas od aktywacji plemnika do ustania ruchu plemników (zwany czasem trwania ruchliwości)37. Żywotność plemników można określić, barwiąc plemniki selektywnymi barwnikami, takimi jak błękit trypanowy, który barwi tylko niezdolne do życia plemniki, podczas gdy żywotne plemniki pozostaną niezabarwione. Jednak w przypadku tych procedur mikroiniekcji nie jest to konieczne, jeśli jądra są dobrze rozwinięte.</li>
	<li>Przechowywać nasienie w 0,9% soli fizjologicznej z kroku 2.5 w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 24 godzin po przygotowaniu.</li>
</ol>
3. Pobieranie i zapłodnienie komórek jajowych
<ol>
	<li>Nałóż bardzo cienką warstwę tłuszczu warzywnego na czystą, suchą miskę tarłową o średnicy 20 cm.</li>
	<li>Umieść samicę w roztworze znieczulającym zawierającym 100 ppm buforowanego sulfonianu metanu trikainy z wodorowęglanem sodu (pH roztworu końcowego powinno wynosić 7,0), aż ryba zostanie całkowicie znieczulona38. 
	UWAGA: Sulfonian metanu trikainy może działać drażniąco w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij rybę z torby tarłowej i zanurz ją w 0,9% soli fizjologicznej, aby zmyć roztwór znieczulający. Całkowicie osusz rybę czystym ręcznikiem, unikając usuwania warstwy śluzu z powierzchni ciała ryby.</li>
	<li>Nałóż tłuszcz warzywny na obszar wokół otworu wentylacyjnego, w tym płetwy brzuszne, aby zapobiec przyczepianiu się jaj podczas ręcznego strippingu.</li>
	<li>Ręcznie rozbieraj jaja do natłuszczonej miski tarłowej, delikatnie naciskając na jajniki. Dobre jaja powinny swobodnie płynąć, mieć złocistożółty kolor i mieć minimalne lub żadne grudki lub skrzepy krwi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Unikaj kontaktu jaj z wodą przed zapłodnieniem, ponieważ woda może stymulować zamykanie mikropyli.</li>
	<li>Aby zapłodnić jaja do mikroiniekcji, przenieś 200–300 jaj do natłuszczonej szalki tarłowej. Natłuszczone plastikowe etykiety na rośliny mogą być używane jako łyżka do przenoszenia jaj do natłuszczonej szalki tarłowej. Dodaj 1-2 ml roztworu nasienia (z kroku 2.5) do komórek jajowych i delikatnie wymieszaj. Stosunek plemników do komórki jajowej powinien wynosić około 11 000 plemników / komórkę jajową.</li>
	<li>Dodaj słodką wodę do jaj, aby aktywować plemniki i jaja. Dodaj tyle wody, aby lekko przykryć jajka. Delikatnie obracaj jajka przez 30 sekund. Zapłodnienie powinno nastąpić w ciągu 1–2 minut. Ważne jest, aby zapłodnić jaja, które są ułożone w jednej warstwie. Jaja sumów przylegają do siebie, co utrudnia mikrowstrzykiwanie wielu warstw zarodków.</li>
	<li>Dodaj więcej słodkiej wody do zapłodnionych jaj i pozwól im stwardnieć przez 10–15 minut.</li>
	<li>Przykryj miskę tarłową zawierającą pozostałe niezapłodnione jaja mokrym ręcznikiem, aby zapobiec wysuszeniu i nawożeniu przez kilka godzin. Zapłodnienie może odbywać się w sposób rozłożony w czasie, na przykład jedna partia 200–300 komórek jajowych może być zapładniana co 30–60 minut, aby zapewnić ciągłe dostarczanie zarodków na jednym etapie komórkowym do mikroiniekcji i kontrolować zarodki bez iniekcji. Unikaj kontaktu mokrego ręcznika z jajkami, ponieważ jajka mogą przylegać do mokrego ręcznika, utrudniając ich usunięcie. W tym protokole jaja zapłodnione w ciągu 2–3 godzin po strippingu były skutecznie mikroiniekowane i odnosiły podobne sukcesy jak jaja zapłodnione bezpośrednio po strippingu.</li>
</ol>
4. Ciągnięcie i ładowanie igły
<ol>
	<li>Przeciągnij kapilarnę ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm do 2 igieł (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Przechowuj igły w papierowym pudełku z kawałkiem gąbki, w którym wykonano kilka nacięć. Aby uniknąć złamania igły, średnica gąbki powinna być mniejsza niż długość trzpienia igły.</li>
	<li>Otwórz końcówkę igły, łamiąc mały kawałek najcieńszego obszaru igły za pomocą ostrego przedmiotu. Alternatywnie otwórz igłę, ściskając najcieńszy obszar końcówki kleszczami pod mikroskopem.</li>
	<li>Przygotować roztwór do wstrzykiwań, mieszając gRNA z białkiem Cas9. Inne rodzaje RNA lub białka mogą być również wstrzykiwane za pomocą tej samej procedury. W tym protokole gRNA zostały zaprojektowane tak, aby celować w dwa geny związane z odpornością suma kanałowego, gen cząsteczki adaptacyjnej zawierającej domenę toll / interleukiny 1 (TICAM1) i gen lektyny wiążącej ramnozę (RBL) i przygotowane zgodnie z Shah i wsp. z wykorzystaniem polimerazy Taq o wysokiej wierności32,39. Celami genomowymi dla gRNA były 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' dla genu TICAM 1 (<silna klasa = "xfig" >Figura 4) i 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' dla eksonu 1 genu RBL z podkreśloną sekwencją motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6).
	<ol>
		<li>BLAST kieruje cele RNA względem sekwencji genomu suma kanałowego i wybiera te, które nie mają potencjalnych miejsc poza celem.</li>
		<li>Dodaj czerwień fenolową, aby zabarwić mieszankę białek gRNA/Cas9 do jednej trzeciej całkowitej objętości.</li>
		<li>Dostosuj końcowe stężenie mieszanki białek gRNA/Cas9 wodą wolną od nukleaz tak, aby każdemu zarodkowi wstrzyknięto 50 nL zawierające około 2,5 ng gRNA i 7,5 ng białka Cas9. Przed użyciem inkubować mieszaninę przez 10 minut na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą mikroładowarki załaduj 5–10 μl mieszaniny gRNA/Cas9 do igły iniekcyjnej, wkładając mikroładowarkę do trzpienia igły i powoli usuwając mieszaninę, jednocześnie chowając końcówkę mikroładowarki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza w środku.</li>
	<li>Przymocuj igłę do uchwytu mikropipety i upewnij się, że jest ona szczelnie podłączona, a następnie przymocuj uchwyt do mikromanipulatora. Zapewnij swobodny, stabilny ruch. Zastosować ciśnienie do mikroiniekcji, otwierając butlę z azotem i regulując regulator ciśnienia. 
	UWAGA: Na objętość wstrzyknięcia może mieć wpływ ciśnienie, średnica otworu igły i czas trwania wstrzyknięcia. Aby określić objętość do wstrzyknięcia, należy wstrzyknąć do kropli oleju mineralnego umieszczonej na hemocytometrze. W razie potrzeby ciśnienie, czas wstrzyknięcia i średnicę igły można dostosować w celu zwiększenia lub zmniejszenia objętości wstrzyknięcia. Wstrzyknąć wielokrotnie do oleju mineralnego, aby zapewnić stałą objętość.</li>
</ol>
5. Mikroiniekcja zarodków sumów
<ol>
	<li>Nałóż bardzo cienką warstwę tłuszczu warzywnego na czystą 100 mm szalkę Petriego.</li>
	<li>Za pomocą natłuszczonej plastikowej etykiety na rośliny przenieś 50–100 jaj z szalki do nawożenia na szalkę Petriego i przykryj je roztworem Holtfretera (tabela materiałów). Ułóż jajka względem siebie w jednej warstwie. To wyrównanie powinno utrzymać jaja na miejscu podczas procesu mikroiniekcji.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego z jajkami na stoliku mikroskopu i przytrzymaj ją jedną ręką. Opuść igłę drugą ręką (<silna klasa="xfig">Rysunek 3), aż przebije kosmówkę i żółtko jednym płynnym ruchem. Końcówka igły powinna znajdować się jak najbliżej blastodysku przed podaniem materiału do wstrzykiwań.
	<ol>
		<li>Wcisnąć pedał, aby wprowadzić materiał do wstrzykiwań do żółtka. Jeśli blastodysk nie jest wyraźnie widoczny, materiał do wstrzykiwań można rozprowadzić w różnych miejscach w żółtku. Aby to zrobić, igła jest wprowadzana do drugiego końca żółtka, a następnie wciskanie pedału i wyjmowanie igły odbywa się jednocześnie, aby rozprowadzić materiał do wstrzykiwania przez różne obszary żółtka. Do żółtka zarodków suma kanałowego można wstrzyknąć do 50 nanolitrów, jednak ilość białka gRNA/Cas9 musi być zoptymalizowana dla każdego genu, aby osiągnąć najlepsze wyniki w zakresie szybkości mutacji i przeżywalności zarodka32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wycofaj igłę płynnie, aby nie uszkodzić jajka. Przesunąć szalkę Petriego, aby wstrzyknąć kolejne jajo zgodnie z tą samą procedurą. Należy unikać przesuwania szalki Petriego podczas wstrzykiwania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórki jajowej lub złamanie igły. Usuń jaja, które są pęknięte lub uszkodzone w wyniku mikroiniekcji. Iniekcję można rozpocząć po 15–20 minutach od zapłodnienia i kontynuować tak długo, aż zarodki są jeszcze w fazie jednokomórkowej (do około 60-90 minut po zapłodnieniu).</li>
	<li>Umieść wstrzyknięte zarodki z powrotem w roztworze Holtfretera z 10 ppm doksycykliny i ciągłym delikatnym napowietrzaniem przez 6-7 dni, aż do wyklucia40. Zmieniaj roztwór codziennie i usuwaj martwe zarodki.</li>
</ol>
6. Wykrywanie mutacji
<ol>
	<li>Losowo zbierz kilka wstrzykniętych zarodków po 72 godzinach od zapłodnienia, usuń żółtko i wyekstrahuj genomowe DNA. Do grupy kontrolnej należy włączyć 3–5 zarodków bez wstrzyknięć. 
	UWAGA: Genomowe DNA można wyekstrahować z zarodków po usunięciu skorupek jaj i materiału żółtkowego za pomocą trawienia proteinazy K i wytrącania etanolu32.</li>
	<li>Amplifikuj segment DNA flankujący cele genomowe dla gRNA każdego genu, w którym spodziewane są mutacje, używając polimerazy Taq o wysokiej wierności32. W przypadku TICAM 1 do amplifikacji 750 pz użyto starterów 5'GCTGCTGAATGTCTGATGATG 3' (do przodu) i 5'GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (do tyłu), podczas gdy do wzmocnienia RBL użyto starterów 5'TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (do przodu) i 5'AGAGATTAGTCACACATTATT 3' (do tyłu) (do przodu) i 5' do amplifikacji segmentu 375 pz z genu RBL.
	<ol>
		<li>Użyj następującej reakcji PCR: do 20 μl wody klasy PCR; 1x bufor reakcyjny enzymu Taq o wysokiej wierności z MgCl2, 0,2 mM mieszaniny dNTP, 0,4 μM dla każdego startera do przodu i do tyłu tego samego zestawu, 100-300 ng genomowego DNA i 1,25 jednostki mieszanki enzymów Taq o wysokiej wierności. Przeprowadzić warunki cykliczne PCR: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 minuty; 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 55 s dla TCAM i 40 s dla RBL, przedłużenia w temperaturze 72 °C przez 1 min/kb; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykryj zmutowane zarodki za pomocą metody wykrywania mutacji, takiej jak sekwencjonowanie oczyszczonych produktów PCR, test wykrywania mutacji geodewody, test mobilności heterodupleksowej, utrata miejsca rozpoznawania enzymu restrykcyjnego lub jakakolwiek inna metoda wykrywania mutacji, która jest odpowiednia dla celu. W tym protokole wykrywaj zmutowane zarodki za pomocą testu wykrywania mutacji geodezyjnych dla TICAM 1 i utraty miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego SapI, a także sekwencjonowania oczyszczonych produktów PCR dla genu RBL.</li>
	<li>Aby zidentyfikować zmutowane allele, klonuj produkty PCR i wektory sekwencyjne z poszczególnych kolonii. Zmutowane allele przedstawione w <silna klasa="xfig">Rycina 4 i <silna klasa="xfig">Figura 6 pochodziły z wstrzykniętych zarodków. Produkty PCR z sześciu mikrowstrzykniętych i 3 kontrolnych zarodków dla każdego genu połączono w dwóch oddzielnych probówkach, jednej dla zarodków z mikrowstrzyknięciem, a drugiej dla zarodków kontrolnych, szybko klonowanych i zawierających 86 wektorów dla TICAM 1 i 48 wektorów dla genu RBL, w tym 8 reakcji sekwencjonowania z 3 kontrolnych zarodków bez wstrzyknięcia dla każdego genu.</li>
	<li>Aby zidentyfikować różne zmutowane allele, porównaj sekwencje ze zmutowanych zarodków z sekwencją typu dzikiego za pomocą dowolnego narzędzia do dopasowywania sekwencji DNA, takiego jak BLAST lub T-COFFEE.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodków suma kanałowego w celu uzyskania nokautu genu. Wstrzyknięcie białka CRISPR/Cas9 do żółtka jest znacznie prostsze, oszczędza czas i nie wymaga intensywnego szkolenia w porównaniu z mikrowstrzykiwaniem blastodysku zarodka jednokomórkowego, co jest powszechną techniką transferu i edycji genów u ryb30,42. Obecny protokół okazał się skuteczny w indukowaniu indeli w genach TICAM 1 i RBL suma kanałowego. Te nieza...

Mikroiniekcja jest powszechną techniką laboratoryjną używaną do dostarczania niewielkiej ilości substancji, takich jak DNA, RNA, białko i inne makrocząsteczki do komórek lub zarodków przez szklane naczynia włosowate1. Mikroiniekcja jest wykonywana przy użyciu specjalnego zestawu sprzętu, w tym mikrowtryskiwacza, mikromanipulatora i mikroskopu2. Technika ta została wykorzystana przez naukowców do genetycznej modyfikacji wielu organizmów poprzez generowanie transgeników, nokautów genów i terapii genowej, w celu zrozumienia dynamiki składników wewnątrzkomórkowych3,4,5.
Sum kanałowy (Ictalurus punctatus) jest najpopularniejszym gatunkiem suma w akwakulturze i rybołówstwie rekreacyjnym w Stanach Zjednoczonych. Istnieje rosnąca potrzeba badania genomiki funkcjonalnej suma kanałowego, a sekwencjonowanie pełnego genomu suma kanałowego zwiększa użyteczność najnowszych osiągnięć w narzędziach do edycji genomu6,7. Zrozumienie funkcji genów nie tylko wzbogaciłoby badania prowadzone na sumach, ale mogłoby również doprowadzić do bardziej skutecznych programów doskonalenia genetycznego w celu wzmocnienia przemysłu sumowego. Po zidentyfikowaniu genów krytycznych dla danej cechy zainteresowania, można je wykorzystać do genetycznego ulepszenia produkcji sumów poprzez edycję genomu w celu wygenerowania korzystnych alleli, selekcji dla tych alleli, tłumienia szkodliwych alleli, przenoszenia korzystnych alleli poprzez transgenezę lub pewną kombinację tych opcji. Połączenie najlepszych genów dla różnych komercyjnie korzystnych cech różnych gatunków w jednej rybie znacznie poprawiłoby produktywność i rentowność operacji produkcji ryb8.
Nokaut genów to bezpośrednia metoda badania funkcji genów in vivo. Mutacje na poziomie DNA będą dziedziczone przez przyszłe pokolenia, co ułatwi badanie ich skutków w różnych pokoleniach. Opracowano różne narzędzia do edycji genomu, w tym nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) oraz system regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych/białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9)9,10,11,12.
System CRISPR/Cas9 to potężne, wydajne narzędzie, które zostało użyte do edycji sekwencji genomowego DNA, w tym nokautu genów u ryb, poprzez kontrolowane przez RNA rozszczepienie DNA specyficzne dla miejsca5,13. System składa się z przewodnika RNA (gRNA), który określa docelową sekwencję w genomie oraz enzymu endonukleazy DNA, Cas9. System CRISPR/Cas9 może być zaprojektowany tak, aby był ukierunkowany na dowolną sekwencję w genomie, co ma kilka zalet w porównaniu z ZFN i TALEN: (1) niższy koszt, (2) łatwiejsza inżynieria, (3) bardziej specyficzne wiązanie przewodnika RNA z sekwencją docelową i zmniejszone mutacje poza celem, (4) wiele sekwencji może być ukierunkowanych na różne gRNA w tym samym czasie, (5) wysoki wskaźnik mutagenezy w genach, które nie mogą być zmutowane przez TALEN, oraz (6) poprawiono szybkość transmisji mutacji w linii zarodkowej nawet 6-krotnie w porównaniu z ZFN i TALENs14,15,16,17,18.
Główną alternatywną metodą mikroiniekcji jest elektroporacja, w której impulsy elektryczne są stosowane do zarodków lub komórek w celu zwiększenia przepuszczalności błony i pobierania cząsteczek biologicznych19,20. Za pomocą elektroporacji wygenerowano kilka transgenicznych ryb, takich jak medaka (Oryzias latipes), danio pręgowany (Danio rerio), łosoś chinook (Oncorhynchus tshawytscha), sum kanałowy, dorada (Sparus sarba) i karp pospolity (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
Elektroporacja została użyta do dostarczenia plazmidowego DNA, RNA i białka Cas9 do nokautowania genów. W komórkach ssaków plazmidowe DNA Cas9 / gRNA, Cas9 mRNA / gRNA i kompleksy białko Cas9 / gRNA były dostarczane za pomocą elektroporacji, a wskaźniki mutagenezy były najwyższe przy użyciu kompleksów białko Cas9 / gRNA dla większości testowanych warunków elektroporacji 27. U strunowca puchacza (Ciona intestinalis) konstrukty wykazujące ekspresję TALEN-ów zostały elektroporowane do zapłodnionych jaj w celu wywołania nokautu wielu genów28. ZFN eksprymujące konstrukty plazmidowe zostały poddane elektroporacji w celu wyeliminowania hormonu luteinizującego w kanale catfish29. Jednak po wprowadzeniu do komórki konstrukty plazmidowe będą musiały zostać przepisane na RNA i przetłumaczone na funkcjonalne białka, zanim będą mogły celować w pożądaną sekwencję DNA, co prawdopodobnie opóźniłoby czas mutagenezy w porównaniu z mikroiniekcją RNA / białka. W miarę rozwoju zarodka opóźniona mutageneza zwiększa mozaikowość założycieli, którym wstrzyknięto zastrzyk. Ponadto jest mało prawdopodobne, aby ekspresja transgeniczna osiągnęła poziom ekspresji możliwy przy mikroiniekcji, co obniża skuteczność mutagenezy.
Jako sposób na wprowadzenie narzędzi do edycji genomu do komórek, mikroiniekcja ma kilka zalet w porównaniu z elektroporacją. Cząsteczki edytujące genom mogą być niezawodnie wprowadzane do komórek lub zarodków za pomocą mikroiniekcji30. Potrzeba mniej materiału iniekcyjnego. Łatwo jest określić ilość wtryskiwanego materiału. Można osiągnąć wyższe wskaźniki mutacji z niskim mozaicyzmem u ryb założycielskich, co poprawiłoby transmisję mutacji do F1 w linii zarodkowej. Mniej ryb założycielskich musi być analizowanych w celu wytworzenia pierwszego pokolenia, ze względu na wyższy wskaźnik mutacji. W elektroporacji należy przeanalizować więcej ryb założycielskich, co zwiększy koszty. Jednak przeżywalność zarodków z mikrowstrzyknięciem suma kanałowego jest niższa niż w przypadku zarodków poddanych elektroporacji, chociaż można to przezwyciężyć poprzez wstrzyknięcie większej liczby zarodków31,32. U sumów kanałowych przeżywalność zarodków z mikrowstrzyknięciem żółtka wahała się od 16 do 55%, w zależności od docelowych genów i dawki białka gRNA/Cas932.
Regularne mikrowstrzykiwanie zarodków sumów jest technicznie wymagające i czasochłonne, jednak dla zarodków sumów kanałowych przedstawiono szybki i skuteczny protokół mikroiniekcji białka CRISPR/Cas9. Protokół ten wymaga mniej czasu i wiedzy specjalistycznej, ponieważ roztwór białka CRISPR/Cas9 jest wstrzykiwany do żółtka zarodków jednej komórki. Setki zapłodnionych komórek jajowych można wstrzyknąć w ciągu 1 godziny (mniej więcej tyle czasu potrzebnego do wystąpienia pierwszego podziału komórkowego). Aby potwierdzić słuszność protokołu, u sumów kanałowych wyeliminowano dwa geny związane z podatnością na choroby: gen cząsteczki adaptera zawierającego domenę receptora toll/interleukiny 1 (TICAM1) oraz gen lektyny wiążącej ramnozę (RBL). TICAM 1 bierze udział w szlaku sygnałowym inicjowanym przez receptor toll-podobny (TLR) 3. U suma kanałowego TICAM 1 został znacznie podwyższony po prowokacji bakteryjnej Edwardsiella ictaluri, podczas gdy został obniżony u suma niebieskiego, gatunku odpornego na E. ictaluri33. RBL odgrywa ważną rolę we wczesnym zakażeniu Flavobacterium columnare, czynnikiem wywołującym chorobę kolumnową, w której stwierdzono ostrą i silną regulację w górę u szczepu suma kanałowego podatnego na columnaris w porównaniu ze szczepem odpornym na columnaris34.

<table><tbody><tr><td>Implant Reproboost</td><td>Center of Marine Biotechnology</td><td></td><td>Analog hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRHa) do indukcji owulacji u samic suma kanałowego</td></tr><tr><td>TRICAINE-S</td><td>Western Chemical. Inc.</td><td></td><td>Do uspokojenia ryb hodowlanych podczas wstrzykiwania hormonów i usuwania jaj</td></tr>.<tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0,5%, sterylny filtrowany</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>213709</td><td>Do wizualizacji jaj podczas mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Mikroiniektor</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp;</td><td>Model MPPI-3</td><td>Do dostarczania materiału iniekcyjnego do zarodków</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp;</td><td>Model MM33&nbsp;</td><td>Do trzymania i kontrolowania ruchu igły iniekcyjnej.</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Do ładowania roztworu do wstrzykiwań do igieł do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz igieł</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td>Do wyciągania igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Cas9 białko</td><td>PNA Bio Inc.&nbsp;</td><td>CP01</td><td>Rekombinowane białko Cas9 ze Streptococcus pyrogenes.</td></tr><tr><td>Rozwiń system PCR High FidelityPLUS</td><td>&nbsp; Roche Diagnostics, USA</td><td></td><td>Do PCR i amplifikacji matryc DNA do stosowania w preparacie gRNA</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>o średnicy zewnętrznej 1 mm (OD), do wytwarzania igieł do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Do przytrzymywania zarodków podczas mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Crisco</td><td>The J.M. Smucker Company</td><td></td><td>Tłuszcz warzywny do powlekania patelni tarłowych i szalek Petriego.&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór Holtfretera</td><td>Home Made</td><td></td><td>59 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 0,76 mM CaCl2, 1,67 mM MgSO4 do inkubacji mikrowstrzykniętych zarodków do wyklucia.</td></tr><tr><td>Hykulan doksycykliny USP (monohydrat)</td><td>Letco Medical</td><td>690904</td><td>Antybiotyk dodawany do roztworu Holtfretera w ilości 10 ppm w celu zapobiegania infekcjom bakteryjnym.</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja białka crispr/cas9 do suma kanałowego, ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Kompletny genom suma kanałowego, Ictalurus punctatus, został zsekwencjonowany, co prowadzi do większych możliwości badania funkcji genów suma kanałowego. Nokaut genów został wykorzystany do badania tych funkcji genów in vivo. Zgrupowany, regularnie rozmieszczony system krótkich powtórzeń palindromicznych/białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) jest potężnym narzędziem wykorzystywanym do edycji sekwencji genomowego DNA w celu zmiany funkcji genów. Podczas gdy tradycyjne podejście polegało na wprowadzaniu mRNA CRISPR/Cas9 do zarodków jednokomórkowych poprzez mikroiniekcję, może to być powolny i nieefektywny proces u sumów. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodków suma kanałowego białkiem CRISPR/Cas9. Krótko mówiąc, pobrano komórki jajowe i plemniki, a następnie przeprowadzono sztuczne zapłodnienie. Zapłodnione jaja przeniesiono na szalkę Petriego zawierającą roztwór Holtfretera. Objętość wstrzyknięcia skalibrowano, a następnie prowadzące RNA/Cas9 ukierunkowane na gen cząsteczki adaptera zawierającego domenę receptora toll/interleukiny 1 (TICAM 1) i gen lektyny wiążącej ramnozę (RBL) zostały mikrowstrzyknięte do żółtka zarodków jednokomórkowych. Nokaut genu zakończył się sukcesem, ponieważ indele zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie DNA. Przewidywane zmiany sekwencji białek spowodowane tymi mutacjami obejmowały przesunięcie ramki odczytu i skrócone białko z powodu przedwczesnych kodonów stop.

Aby zademonstrować wydajność protokołu mikroiniekcji, przeprowadzono mikroiniekcję gRNA zaprojektowanych do celowania w gen cząsteczki adapterowej zawierającej domenę receptora toll/interleukiny 1 (TICAM1) oraz gen lektyny wiążącej ramnozę (RBL) u suma kanałowego.
TICAM 1 
Sekwencjonowanie DNA wektorów z poszczególnych kolonii pochodzących z puli sklonowanych produktów PCR ujawniło indukowane mutacje typu i...

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół mikroiniekcji do edycji genów w zarodkach sumów kanałowych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. W tym protokole przewodnikowe RNA i białko Cas9 zostały mikrowstrzyknięte do żółtka jednokomórkowych zarodków. Protokół ten został zweryfikowany poprzez wyeliminowanie dwóch genów związanych z odpornością suma kanałowego.

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, zarodków Ictalurus punctatus w celu edycji genów. Opracowanie niezawodnego i wydajnego protokołu ukierunkowanej edycji genów u suma kanałowego ma kluczowe znaczenie dla badań nad genomiką funkcjonalną. Zwłaszcza po wzbogaceniu zasobów genomowych o sekwencjonowanie genomu suma kanałowego.Poniżej przedstawiamy szczegółowy protokół edycji genomu CRISPR/Cas9 u suma kanałowego. Protokół ten został opracowany i zweryfikowany poprzez ukierunkowanie na dwa geny związane z odpornością suma kanałowego. Domena receptora Toll / interleukiny-1 zawierająca cząsteczkę adapterową lub gen TICAM1 oraz lektynę wiążącą ramnozę lub gen RBL.Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w jednostce badawczej genetyki ryb w EW Shell Fisheries Research Center na Uniwersytecie Auburn w Alabamie. Selekcja stada lęgowego i tarło. Wybierz zdrowe stado lęgowe sumów kanałowych ze szczepu lub linii genetycznej, którą chcesz edytować.Samce i samice suma kanałowego powinny wykazywać dobre drugorzędowe cechy płciowe. Wybierz samce, które mają szeroką, muskularną głowę, która jest szersza niż reszta ciała z dobrze rozwiniętą brodawką narządów płciowych. Ciemny kolor i

microinjection-crisprcas9-protein-into-channel-catfish-ictalurus

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Ten protokół opisuje podejście ułatwiające precyzyjną edycję w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Przedstawiono proces fenotypowania, aby zademonstrować możliwość zastosowania tych technik do modelowania wariantu genu związanego z zespołem wydłużonego odstępu QT.

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Ten protokół przedstawia zoptymalizowane podejście do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Wirus związany z adenowirusem (AAV) służy do dostarczania matrycy naprawy DNA, a elektroporacja służy do dostarczania odczynników CRISPR-Cas9 w celu zakończenia procesu edycji genomu w zarodku 2-komórkowym.

CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych

Poznaj protokół mikroiniekcji CRISPR/Cas9 do zarodków suma kanałowego Ictalurus punctatus w celu edycji genów. Metoda została zweryfikowana poprzez wygaszenie genów immunologicznych TICAM1 i RBL.

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

Przeglądaj więcej filmów